CN110894101A - 一种确定污水处理硝化反硝化生物膜最适保存温度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速启动硝化反硝化生物膜污水处理的方法，属于环境工程技术领域。本发明方法预先将硝化反硝化生物膜培养成熟，置于保存基质中在最适保存温度下进行保存，并基于流式细胞术数小时内快速测定最适保存温度，测试数据经活性恢复后细胞活性状态和性能效果验证可靠，省略了硝化反硝化生物膜重新于生物反应器中接种10‑30d过程。本发明方法能够快速启动硝化反硝化生物膜污水处理，简化硝化反硝化生物膜微生物活性恢复过程，使污水处理厂氨氮和总氮指标短时间内超过90％和80％，同时实现节能降耗的效果，具有非常高的工业化可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速启动硝化反硝化生物膜污水处理的方法，属于环境工程技术领域。
背景技术
随着污水处理排放标准的提高，污水处理厂提标改造工程日益增多，但提标改造工程往往需要占用大量土地，增加投资和建设成本，进而严重影响污水处理厂的节能降耗效果。因此，基于污水处理构筑物，于原址提升污水处理效能的硝化反硝化技术被日益重视和推广应用。污水处理的难点在于氨氮和总氮的达标排放，基于硝化反硝化生长的生物膜根据其生物膜厚度，可以在膜内形成溶解氧浓度梯度，即生物膜表面呈好氧状态，生物膜内部呈缺氧状态，因此，生物膜可实现同步硝化反硝化作用，对污水中氨氮和总氮的去除具有重要意义。
但是工程实例中硝化反硝化生物膜的成膜周期相对较长，(约30-40d)，对水力条件要求较高，如果可以将硝化反硝化生物膜培养成熟并予以保存，则可以有效帮助准备采用硝化反硝化生物膜技术进行提标改造的污水处理厂在较短时间内启动运行，并使污染物达标排放。温度是影响微生物活性最重要的参数，确定最适于硝化反硝化生物膜保存的温度，有助于简化硝化反硝化生物膜微生物活性恢复过程，缩短硝化反硝化生物膜工程化应用启动时间，实现快速启动硝化反硝化生物膜污水处理、节能降耗效果。但现有方法对于最适保存温度的确定需要将硝化反硝化生物膜重新接种于生物反应器中，约需10-30d才能确定硝化反硝化生物膜活性恢复的效果，成为制约硝化反硝化生物膜工程化应用的关键所在。
发明内容
为了简化硝化反硝化生物膜微生物活性恢复过程，快速启动硝化反硝化生物膜污水处理，使污水处理厂氨氮和总氮指标短时间内达到排放标准，同时实现节能降耗的效果。本发明基于流式细胞术对不同温度条件下保存的硝化反硝化生物膜的细胞活性状态进行表征，通过硝化反硝化生物膜活性恢复效果和污泥微生物活性恢复后细胞活性状态，对流式细胞术的表征结果进行验证，最终建立基于流式细胞术的确定硝化反硝化生物膜最适保存温度的方法，为污水处理厂高标准污染物排放与节能降耗运行提供技术支撑。
本发明的发明目的是提供一种快速启动硝化反硝化生物膜污水处理的方法，所述方法是预先将硝化反硝化生物膜培养成熟，置于保存基质中在最适保存温度下进行保存，活性恢复后即可用于污水处理；所述最适保存温度是利用流式细胞术确定。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞术确认最适保存温度是通过对硝化反硝化生物膜的细胞活性状态进行测定，对比不同温度保存的硝化反硝化生物膜与生化反应池中硝化反硝化生物膜的细胞活性状态的测定结果，以最接近生化反应池中硝化反硝化生物膜的细胞活性状态时的保存温度作为最适保存温度。
在本发明的一种实施方式中，所述硝化反硝化生物膜细胞活性状态测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞术确认最适温度的步骤包括：(1)硝化反硝化生物膜测试样液的制备：用缓冲液稀释硝化反硝化生物膜样品，震荡均匀后，过滤、离心，留用上清液，使用预冷磷酸盐缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括39％v/v磷酸二氢钠(0.2mol/L)和61.0％v/v磷酸氢二钠(0.2mol/L)。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6.6～7.0，与硝化反硝化生物膜的稀释比为8～10：1。
在本发明的一种实施方式中，所述硝化反硝化生物膜混合物稀释液经过6～8μm孔径的尼龙膜过滤破碎污泥。
在本发明的一种实施方式中，所述离心速度为5000～10000rpm/min。
在本发明的一种实施方式中，所述样品清液与10x Annexin V Binding Buffer的混合体积比例为1：2～4。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育，之后于流式细胞仪上机检测。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育为10-20min。
在本发明的一种实施方式中，所述保存基质包括：醋酸钠200～300mg/L、氯化铵100～150mg/L，硝酸钾75～85mg/L，磷酸氢二钾20～40mg/L，磷酸二氢钾10～20mg/L，硫酸镁35～45mg/L，氯化钾65～75mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述活性恢复是将硝化反硝化生物膜接种于生物反应器中，以缺氧-好氧工艺为基础，HRT设置为10～15h，硝化反硝化填充比为40％～60％，硝化液回流比例为70％～85％。
本发明有益效果
本发明利用流式细胞术对硝化反硝化生物膜中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，数小时内确认最适保存温度，并通过与硝化反硝化生物膜活性恢复过程的特征指标进行关联性分析验证，建立了基于流式细胞术的快速启动硝化反硝化生物膜污水处理的方法。运用此方法，可以省略确认保存温度过程中的硝化反硝化生物膜重新接种活性恢复步骤，有效帮助准备采用硝化反硝化生物膜技术进行提标改造的污水处理厂缩短硝化反硝化生物膜工程化应用启动时间，维持硝化反硝化生物膜工艺长期稳定运行，并使污染物达标排放，进而实现节能降耗效果，具有很高的可行性。
附图说明
图1为胞外聚合物PN/PS的变化；
图2为氨氮(AN)的去除率；
图3为总氮(TN)的去除率。
具体实施方式
本发明污水处理厂污水包括上游各居民区的生活用水和少部分工业废水，进水年平均值为COD 236mg/L，氨氮30.1mg/L，总氮37.8mg/L，总磷4.5mg/L，硝态氮含量低于1.0mg/L。
实施例1
硝化反硝化生物膜保存培养：
硝化反硝化生物膜的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将污水处理厂生化反应池中的硝化反硝化生物膜取出180个，平均三等份分别置于装有500ml保存基质的1000ml血清瓶中，为保持生物膜的硝化和反硝化能力，保存基质成分如下所示：NaAc 240mg/L，NH4Cl110mg/L，KNO3 80mg/L,K2HPO4 30mg/L，KH2PO4 15mg/L，MgSO4 40mg/L，KCl 70mg/L。保存基质COD 200mg/L，NH4 +-N 30mg/L，NO3 --N 20mg/L,PO4 3--P 8mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
保存的硝化反硝化生物膜细胞状态测试：
于-20℃，4℃和20℃保存的硝化反硝化生物膜在保存超过120d后，用于测定硝化反硝化生物膜细胞状态，流式细胞术细胞状态测试条件如下：
(1)取10ml硝化反硝化生物膜，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，于涡旋仪漩涡震荡2min，使生物膜破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用6μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，取1.5ml置于1.5ml尖底离心管中；
(3)样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷磷酸盐缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
制备样品是过滤孔径的选择尤为重要，孔径过大，会引入更多生物絮体，造成染色不均匀问题，影响最终结果；孔径过小，又无法有效获得生物絮体。
硝化反硝化生物膜细胞状态测试结果如表1所示。污水处理厂生化反应池中硝化反硝化生物膜活细胞比例较高，表明污水处理厂运行效果良好。保存于-20℃的用于测定硝化反硝化生物膜细胞含量最低，死细胞含量最高，表明-20℃不适宜保存硝化反硝化生物膜。保存于4℃的硝化反硝化生物膜其活细胞比例最高，达到68.0％，凋亡晚期细胞和死细胞比例约为19.8％，证明4℃条件可以用于硝化反硝化生物膜的保存。保存温度为20℃时，硝化反硝化生物膜活细胞比例高达59.4％，仅比4℃保存的硝化反硝化生物膜活细胞比例低12.6％，但其的硝化反硝化生物膜其凋亡晚期细胞和死细胞比例约为31.6％，表明20℃的保存条件亦不适于保存硝化反硝化生物膜。因此，初步确定4℃为保存硝化反硝化生物膜的最适温度。
表1保存120d的硝化反硝化生物膜细胞活性状态
| 硝化反硝化生物膜 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 生化反应池 | 85.0±3.2 | 9.7±1.0 | 4.5±0.2 | 0.8±0.2 |
| 保存于-20℃ | 40.7±2.0 | 24.6±1.8 | 23.4±1.5 | 11.3±1.5 |
| 保存于4℃ | 68.0±2.9 | 12.2±1.2 | 12.4±0.9 | 7.4±1.2 |
| 保存于20℃ | 59.4±2.5 | 13.9±1.1 | 17.7±1.0 | 9.0±1.6 |
实施例2保存的硝化反硝化生物膜的活性恢复条件
选用序批式反应器运行方式：取源于不同血清瓶硝化反硝化生物膜，接种于生物反应器(有效容积10.0L)中，用以对硝化反硝化生物膜进行活性恢复。于-20℃，4℃和20℃保存的硝化反硝化生物膜分别置于R1，R2和R3中。生物反应器以anoxic-oxic(AO)工艺为基础，HRT设置为12h，硝化反硝化填充比为50％，硝化液回流比例为80％。
实施例3活性恢复后硝化反硝化生物膜特性
经过活性恢复后，R1，R2和R3中的硝化反硝化生物膜均具有较好的性能。如表2所示，在硝化反硝化生物膜活性恢复后，保存于4℃和20℃温度下硝化反硝化生物膜密度和厚度与保存之前的硝化反硝化生物膜较为接近，只有保存在-20℃的硝化反硝化生物膜密度和厚度略有下降。不同保存温度下硝化反硝化生物膜的生物量均有所降低，但经过活性恢复后，4℃和20℃温度下保存的硝化反硝化生物膜的生物量已达到保存前硝化反硝化生物膜的生物量水平，说明硝化反硝化生物膜重新适应环境，生物量稳定增加。通常生物膜在污水处理中的平均硝化速率和反硝化速率分别为4.5和5.0gNO3 --N/m2·d，污水处理厂驯化的硝化反硝化生物膜达到相同硝化速率和反硝化速率的时间分别需要25和21d。将保存的硝化反硝化生物膜进行活性恢复后，R1中硝化反硝化生物膜达到相同硝化速率和反硝化速率的时间分别需要19和17d，R2中硝化反硝化生物膜达到相同硝化速率和反硝化速率的时间分别需要8和6d，R3中硝化反硝化生物膜达到相同硝化速率和反硝化速率的时间分别需要13和10d。且R1的生物膜厚度L在活性恢复前后均有明显减小，但在R2、R3中均能够保持较高的厚度，使得氧气在生物膜中形成浓度梯度，有利于反硝化进行。说明经活性恢复后的硝化反硝化生物膜均具有较好的脱氮除磷效果，其中保存于4℃条件的硝化反硝化生物膜具有最短的微生物活性恢复时间，较为适宜保存硝化反硝化生物膜。
表2保存和活性恢复后硝化反硝化生物膜的性状
实施例4活性恢复后硝化反硝化生物膜的稳定性
胞外聚合物是硝化反硝化生物膜形成的重要因素，而胞外聚合物中蛋白质类(PN)物质和多糖类(PS)物质的比值(PN/PS)是衡量硝化反硝化生物膜结构稳定的重要指标。在硝化反硝化生物膜活性恢复过程中，其胞外聚合物PN/PS的变化如图1所示。不同保存温度下，PN/PS差别较大，R1中硝化反硝化生物膜PN/PS呈降低趋势，表明保存于-20℃条件的硝化反硝化生物膜稳定性较差，不适宜保存硝化反硝化生物膜；R3中硝化反硝化生物膜PN/PS略微升高，表明保存于20℃条件的硝化反硝化生物膜可维持保存前的稳定状态；R2中硝化反硝化生物膜PN/PS显著升高，可达4.2以上，并趋于稳定，表明保存于4℃条件的硝化反硝化生物膜在活性恢复后其稳定性逐渐升高，适宜于作为硝化反硝化生物膜的保存温度。
实施例5活性恢复后硝化反硝化生物膜对污染物去除效能
经过活性恢复过程后，不同保存温度下的硝化反硝化生物膜对氨氮和总氮的去除率均逐渐升高(图2和图3)，其对氨氮和总氮的去除率分别超过90％和80％。在活性恢复的第8d，R2中的硝化反硝化生物膜对氨氮和总氮的去除效果最好，并一直呈现TN和TP去除率稳定升高的趋势，此结果也同表2中R2内硝化反硝化生物膜最快恢复较高的硝化速率和反硝化速率相对应，说明4℃的条件较为适宜保存硝化反硝化生物膜，在实际应用中具有很高的可行性。
实施例6活性恢复后硝化反硝化生物膜特性与污泥细胞状态相关性
在硝化反硝化生物膜活性恢复后，采用流式细胞术对硝化反硝化生物膜细胞状态进行分析，结果如表3所示。不同保存温度下的硝化反硝化生物膜中活细胞含量与污水处理厂硝化反硝化生物膜中活细胞含量基本一致，说明经过活性恢复后，硝化反硝化生物膜均可发挥污染物去除的作用。其中R2内硝化反硝化生物膜活细胞比例(84.0％±3.0％)最高，且凋亡晚期细胞比例(6.2％±1.5％)和死细胞比例(4.3％±0.3％)最低，说明4℃的保存条件下硝化反硝化生物膜细胞活性最高，较为适宜作为保存硝化反硝化生物膜的条件。
表3活性恢复后硝化反硝化生物膜细胞活性状态
依据Correl相关性分析发现，如表4所述，硝化反硝化生物膜硝化速率与反硝化速率和硝化反硝化生物膜活细胞比例具有极高的相关性，相关系数分别为0.9286和0.9819，表明利用硝化反硝化生物膜活细胞比例作为评价硝化反硝化生物膜活性的方法具有极高的可行性。同时，由于保存的硝化反硝化生物膜中，4℃的保存条件下硝化反硝化生物膜活细胞比例最高，与活性恢复后R2中硝化反硝化生物膜活细胞比例结果相吻合。
表4活性恢复后硝化反硝化生物膜特性与细胞活性状态关联性
因此，确定4℃是保存硝化反硝化生物膜的最适条件，利用流式细胞术可以作为确定硝化反硝化生物膜最适保存温度的依据。流式细胞术操作简便，数据快速易得且准确可靠，亦可省略硝化反硝化生物膜活性恢复过程，对于硝化反硝化生物膜的保存与活性恢复具有重要意义。
对比例
硝化反硝化生物膜保存培养：
硝化反硝化生物膜的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将污水处理厂生化反应池中的硝化反硝化生物膜取出180个，平均三等份分别置于装有500ml保存基质的1000ml血清瓶中，保存基质成分如下所示：NaAc 240mg/L，NH4Cl 110mg/L，KNO3 80mg/L,K2HPO430mg/L，KH2PO4 15mg/L，MgSO4 40mg/L，KCl 70mg/L。保存基质COD 200mg/L，NH4 +-N 30mg/L，NO3 --N 20mg/L,PO43 --P 8mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
保存的硝化反硝化生物膜细胞状态测试：
于-20℃，4℃和20℃保存的硝化反硝化生物膜在保存超过120d后，用于测定硝化反硝化生物膜细胞状态，流式细胞术细胞状态测试条件如下：
(1)取10ml硝化反硝化生物膜，用pH为7.2的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，于涡旋仪漩涡震荡2min，使生物膜破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用6μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，取1.5ml置于1.5ml尖底离心管中；
(3)样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷磷酸盐缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
硝化反硝化生物膜细胞状态测试结果如表5所示。
表5保存120d的硝化反硝化生物膜细胞活性状态(pH 7.2)
| 硝化反硝化生物膜 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 保存于-20℃ | 47.0±2.0 | 14.6±1.5 | 22.5±1.9 | 15.9±1.7 |
| 保存于4℃ | 48.0±2.4 | 15.1±1.1 | 23.5±2.0 | 13.4±1.8 |
| 保存于20℃ | 49.1±2.1 | 14.9±1.1 | 21.7±2.1 | 14.3±1.1 |
由表5结果发现，选用pH为7.2的磷酸盐缓冲液制备的样品进行测试，各保存温度生存状态下的细胞状态比例较为接近，无法获得有益结果用于分析，数据不可靠。
此外，发明人还分别考察了8μm和10μm孔径制得的样品，8μm样品测试结果与验证实验一致，数据可靠；而10μm相应数据不具备分析效力，无法用来确定最适合保存温度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种快速启动硝化反硝化生物膜污水处理的方法，其特征在于，预先将硝化反硝化生物膜培养成熟，置于保存基质中在最适保存温度下进行保存，活性恢复后即可用于污水处理；所述最适保存温度是利用流式细胞术确定。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流式细胞术确认最适保存温度是通过对硝化反硝化生物膜的细胞活性状态进行测定，对比不同温度保存的硝化反硝化生物膜与生化反应池中硝化反硝化生物膜的细胞活性状态的测定结果，以最接近生化反应池中硝化反硝化生物膜的细胞活性状态时的保存温度作为最适保存温度。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述硝化反硝化生物膜细胞活性状态测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流式细胞术确认最适温度的步骤包括：(1)硝化反硝化生物膜测试样液的制备：用缓冲液稀释硝化反硝化生物膜样品，震荡均匀后，过滤、离心，留用上清液，使用预冷磷酸盐缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液，包括39％v/v0.2mol/L磷酸二氢钠和61.0％v/v 0.2mol/L磷酸氢二钠。
6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.6～7.0，与硝化反硝化生物膜的稀释比为8～10：1。
7.根据权利要求4和5所述方法，其特征在于，所述过滤是选用6～8μm孔径的尼龙膜。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述保存基质包括：醋酸钠200～300mg/L、氯化铵100～150mg/L，硝酸钾75～85mg/L，磷酸氢二钾20～40mg/L，磷酸二氢钾10～20mg/L，硫酸镁35～45mg/L，氯化钾65～75mg/L。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活性恢复是将硝化反硝化生物膜接种于生物反应器中，以缺氧-好氧工艺为基础，HRT设置为10-15h，硝化反硝化填充比为40％-60％，硝化液回流比例为70％-85％。
10.权利要求1-4所述方法在污水处理中的应用。
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