CN110891572B - 用于医学的mpo抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及MPO抑制剂的新治疗用途和涉及其的治疗方法。

Description

用于医学的MPO抑制剂
本说明书涉及用于治疗雄性不育的化合物以及治疗雄性不育的方法。
在本说明书中显然是先前公开的文件的列表或讨论不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
在世界范围内，不育影响着大约15％试图生育的育龄夫妇；这粗略地相当于约4850万对夫妇。雄性不育是50％的不育问题的影响因素，并且据报道，雄性不育在所有病例的约20％-30％中是不育的唯一原因。这些数字可能代表性不足，因为在许多国家中，对雄性不育的评估和报告可能被少报。
雄性不育可由多种病症引起，其中一些是容易鉴定和纠正的，例如导管阻塞和低促性腺素性功能减退症。其他病症是不可逆的，例如病毒性睾丸炎继发的双侧睾丸萎缩。对于那些没有可鉴定原因但在分析中确实表现出异常精液状况的男性(正如许多患者的情况那样)，这种病症被称为特发性雄性不育。权威WHO标准定义了精液样品，这些标准是在不育调查中对雄性进行评估时常规采用的(表1)。雄性因素不育通常被定义为相隔1周和4周收集的两次精液分析中至少一个样品的精子浓度和/或运动性和/或形态的改变。多达90％的雄性不育病例是由于精子浓度、形态或功能异常引起的，而没有可鉴定原因；这有时被称为特发性少弱畸精子症。在这个群组中，氧化应激被认为是造成精子损伤的重要因素。图1示意性地显示了氧化应激在雄性不育中的作用。
氧化应激(OS)反映了活性氧(ROS)与内源性抗氧化剂产生之间的不平衡，并且当存在过量的ROS时，会对细胞和组织造成损害。美国的流行病学数据表明，过量的ROS是造成雄性因素不育的主要原因；30％-40％的不育男性在他们的精浆中ROS水平升高。精子特别容易受到OS的侵害，因为它们的细胞膜富含多不饱和脂肪酸(PUFA)，使其易于脂质过氧化。这导致细胞内三磷酸腺苷(ATP)的快速损失，引起轴丝损伤、精子存活率降低和精子形态中段缺陷增加，所有这些都导致精子活动力降低。此外，精子在细胞内抗氧化酶的保护方面存在固有的缺陷，并且与大多数细胞类型不同，精子在DNA损伤检测和修复方面的能力是有限的。
表1.WHO精液分析标准
ROS是由精子本身和多形核白细胞(PMN)(例如中性粒细胞)产生的，这些多形核白细胞在精子发生过程中与睾丸和附睾内的精子共存，并且通常在源自前列腺和精囊的精浆中发现。PMN可产生和释放的ROS比精子多约1000倍，并且因此可能是特发性雄性不育中OS的主要来源。与活化的中性粒细胞共同孵育的精子显示出随着中性粒细胞数量的增加，活动力的浓度相关的降低。中性粒细胞占雄性生殖道中发现的PMN总数的约60％，并且在被活化时，产生超氧化物和过氧化氢作为其氧化爆发的一部分。另外，中性粒细胞含有大量的血红素酶髓过氧化物酶(MPO)，其利用产生的过氧化氢以产生次氯酸和其他高反应性氧化剂。这些氧化剂对人体细胞是有害的，并且因此有可能损害精子并改变其存活率和功能。在年轻的健康男性中，精液髓过氧化物酶水平升高与精子浓度降低有关。另外，已经证明髓过氧化物酶在中性粒细胞胞外捕网形成作用(NETosis)期间在中性粒细胞胞外捕网(NET)形成中起着不可或缺的作用。人的精子可以触发从中性粒细胞释放NET，然后NET牢固地附着在精子上，从而将其固定。已显示，用4-氨基苯甲酸酰肼(一种临床前工具MPO抑制剂)处理中性粒细胞可显著减少精子触发的NET形成。据我们所知，迄今为止尚未进行过使用MPO抑制剂来治疗不育雄性的研究。
对于经历特发性不育的男性，目前的治疗方案始于生活方式建议，例如戒烟、戒酒、优化体重、最大程度地减少睾丸暴露于热和环境毒素。可选择非处方口服维生素和基于抗氧化剂的补充剂。已经进行了多项临床试验以评估这些疗法的有效性。但是，其中许多有效性都是很小的，它们在一起表现出明显的方法和临床异质性，并且总的来说，它们显示出混合的结果。最近的一项荟萃分析得出结论，在不育男性中使用口服抗氧化剂可以改善精子质量和妊娠率。但是，需要对抗氧化剂的个体和组合进行足够强有力的试验，以指导临床实践。如果尽管采取了这些措施，夫妇仍然无法怀孕，则可以使用辅助生殖技术，例如胞浆内精子注射(ICSI)或IVF。这些技术是侵入性的、昂贵并且不是普遍适用的。
因此，显然需要用于治疗雄性不育、以及尤其是特发性雄性不育的新选择。鉴于当前尚未建立疗效的“标签外(off-label)”疗法，这是尤其明显的。本说明书的目的是提供用于治疗雄性不育的新疗法。
鉴于氧化应激在特发性雄性不育中的普遍存在，髓过氧化物酶在中性粒细胞介导的有效的氧化剂的产生中的作用以及显示出MPO在精子触发的中性粒细胞胞外捕网形成作用中的作用的新兴数据，我们认为MPO抑制剂可能作为用于治疗或预防雄性不育、以及特别是用于治疗特发性雄性不育的治疗剂。
因此，在第一方面，本说明书提供了一种髓过氧化物酶(MPO)抑制剂，其用于治疗或预防雄性不育。用于使用的MPO抑制剂可用于治疗特发性雄性不育。用于使用的MPO抑制剂可预防性地用于由于鉴定到其精液样品中活性氧水平的升高和/或归因于氧化应激继发的精子功能障碍而被鉴定为倾向于患有特发性雄性不育的受试者。
在第二方面，本说明书提供了一种在有需要的雄性患者中治疗或预防不育的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的MPO抑制剂。有需要的雄性患者通常将是患有特发性雄性不育的患者，或者是被鉴定为倾向于患有特发性雄性不育的受试者。
在第三方面，本说明书提供了一种髓过氧化物酶抑制剂或其药物上可接受的盐或溶剂化物，其用于制备用于治疗或预防雄性不育的药物。
在第四方面，本说明书提供了一种包含髓过氧化物酶抑制剂或其药物上可接受的盐或溶剂化物的药物组合物，其用于治疗或预防雄性不育，特别是用于特发性雄性不育。
在第五方面，提供了一种药剂盒，其包含含有髓过氧化物酶抑制剂或其药物上可接受的盐或溶剂化物的药物组合物，以及该药物组合物用于治疗或预防特发性雄性不育的使用说明书。
在本文和以上描述的优选方面，有需要的雄性患者是患有特发性雄性不育的患者，或者在预防的情况下，是被鉴定为倾向于患有特发性雄性不育的患者。
在本文和以上描述的优选方面，雄性患者是人。本发明还提供了髓过氧化物酶抑制剂在非人类陆地哺乳动物(例如犬科、猫科、牛科、马科、猪科、骆驼科和鹿科中的成员)中用于治疗雄性不育的用途。
在以上给出的方面的实施例中，施用用于使用、用于治疗方法、用于制备药物或在药物组合物中提供的髓过氧化物酶抑制剂以抑制精子触发的中性粒细胞胞外捕网形成作用。在此类实施例中，患者可能已经通过分析其精子样品进行了筛选治疗，并且发现表现出氧化应激诱导的对精子的损伤的证据，例如精子计数量/浓度低、精子活动力降低、精子DNA片段化的证据、在特发性雄性不育情况下存在不育白细胞精液症或存在高程度的精液中性粒细胞胞外捕网形成作用。
在以上给出的方面的实施例中，施用用于使用、用于治疗方法、用于制备药物或在药物组合物中提供的髓过氧化物酶抑制剂以通过抑制活性氧和/或下游活性氧介导的产物的产生来抑制氧化应激。因此，用于使用或用于治疗方法的MPO抑制剂可用于抑制活性氧次卤酸如次氯酸以及其他MPO介导的产物(包括但不限于3-氯酪氨酸和3-硝基酪氨酸)的产生。
额外地或替代地，例如在六个月或更长的时间内未能使可育伴侣受孕后，可以将该需要治疗的患者诊断为患有特发性雄性不育。在预防性干预的情况下，可以通过分析精子特征或其他生理参数来分析有需要的患者患特发性雄性不育的倾向，例如，在精子样品中具有一定分布的标志物/特征的患者，这些标志物/特征表明氧化应激诱导的精子功能障碍、或异常高水平的精液氧化应激(例如总抗氧化能力降低、活性氧升高或脂质过氧化增加)、或在亚正常雄性生育力情况下的精液白细胞精液症(根据WHO定义)、或高程度的精液中性粒细胞胞外捕网形成作用。
在以上给出的方面的实施例中，提供了一种在鉴定为特发性不育患者的有需要的雄性受试者中恢复生育力的方法，该方法包括给予治疗有效量的MPO抑制剂。在一个实施例中，治疗特发性雄性不育的方法或恢复特发性雄性不育患者的生育力的方法，包括给予治疗有效量的MPO抑制剂以抑制氧化应激诱导的对精子的损害并预防精子触发的中性粒细胞胞外捕网形成作用。
用于使用、用于治疗方法、用于制备药物或在药物组合物中提供的髓过氧化物酶抑制剂可以选自任何已知的MPO抑制剂。在以上方面的优选实施例中，MPO抑制剂选自WO2006062465 A1、WO 2008152420 A1和/或WO 2016087338 A1中所述的MPO抑制剂。
在实施例中，髓过氧化物酶抑制剂是3-[[(2R)-四氢呋喃-2-基]甲基]-2-硫代-7H-嘌呤-6-酮(AZD5904)、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在实施例中，髓过氧化物酶抑制剂是1-(2-异丙氧基乙基)-2-硫代-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4(5H)-酮、或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在实施例中，髓过氧化物酶抑制剂是具有式(I)的化合物
其中
R1是H、F、Cl或CF3；
R2是H、CH3或C2H5；并且
R3是H、CH3、C2H5、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丙基甲基、环丁基、环丁基甲基或环戊基；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施例中，具有式(I)的化合物选自：
1-{2-[(1R)-1-氨基丙基]-4-氯苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-[2-(1-氨基乙基)-4-氯苄基]-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(1R)-1-氨基乙基]-4-氯苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(1S)-1-氨基乙基]-4-氯苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{4-氯-2-[1-(甲基氨基)乙基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{4-氯-2-[(乙基氨基)甲基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-[2-(氨基甲基)-4-氯苄基]-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{4-氯-2-[(甲基氨基)甲基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-(2-{[(环丁基甲基)氨基]甲基}苄基)-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(环丁基氨基)甲基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(环戊基氨基)甲基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-(2-{[(2-甲基丙基)氨基]甲基}苄基)-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(丙-2-基氨基)甲基]苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-[2-(氨基甲基)-4-(三氟甲基)苄基]-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；
1-{2-[(甲基氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苄基}-2-硫代-1，2，3，5-四氢-4H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-酮；以及
其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在其中上述具有式(I)的化合物的列表中指定了具有式(I)的化合物的单个对映异构体的绝对构型(R或S)的情况下，R2所连接的碳原子是所讨论的立构中心(手性中心)。
如文中及上文所述，用于治疗雄性不育、用于治疗雄性不育的方法、用于制备用于治疗雄性不育的药物的方法或用于治疗雄性不育的药物组合物中的4-氨基苯甲酸酰肼从本文描述的所有方面和实施例中被具体地放弃。
术语“药学上可接受的”用于指明物体(例如盐、溶剂化物、剂型、稀释剂或载体)适合用于患者。药学上可接受的盐的实例列表可以发现于：Handbook of PharmaceuticalSalts：Properties，Selection and Use[药用盐手册：特性、选择和使用]，P.H.Stahl和C.G.Wermuth编著，Weinheim/Zürich：Wiley-VCH/VHCA，2002。
本说明书中描述的化合物和盐可以以溶剂化形式和未溶剂化形式存在。例如，溶剂化形式可以是水合形式，如半水合物、一水合物、二水合物、三水合物或其替代量。本发明涵盖髓过氧化物酶抑制剂(例如具有式(I)的化合物)的所有此类溶剂化和非溶剂化形式。
术语“疗法(therapy)”旨在具有其通常含义：处理疾病，以便完全或部分缓解其症状中的一种、一些或全部，或以便针对潜在病理进行纠正或补偿。术语“疗法(therapy)”还包括“预防(prophylaxis)”，除非有相反的具体指示。术语“治疗(therapeutic)”和“在治疗上(therapeutically)”应以相应的方式解释。
术语“预防(prophylaxis)”旨在具有其通常含义，并包括防止疾病发展的初级预防、和继发性预防(其中该疾病已经发展并且由此患者被暂时或永久保护，以对抗疾病的加重或恶化或者对抗与疾病相关的新症状的发展)。根据本说明书，被鉴定为倾向于患有特发性雄性不育并因此适用于预防治疗的受试者(即，需要预防的受试者)通常被认为是被鉴定为在其精液样品中具有升高水平的活性氧和/或具有可归因于氧化应激继发的精子功能障碍的患者。在一些实施例中，对特发性雄性不育倾向的鉴定可以源自对生活方式因素的组合的分析，诸如吸烟、饮酒、体重以及睾丸暴露于热和环境毒素。
术语“治疗”(treatment)与“疗法”(therapy)同义地使用。类似地，术语“治疗”(treat)可视为“施加疗法”(applying therapy)，其中“疗法”(therapy)如文中所定义。
术语“治疗有效量”是指在本文的任何实施例中所描述的髓过氧化物酶抑制剂的量，该量有效地在受试者中提供“疗法”或在受试者中“治疗”疾病或障碍。
髓过氧化物酶抑制剂及其药学上可接受的盐或溶剂化物可以作为药物组合物施用，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
因此，在一个实施例中，提供了一种药物组合物，其包含髓过氧化物酶抑制剂，例如3-[[(2R)-四氢呋喃-2-基]甲基]-2-硫代-7H-嘌呤-6-酮、1-(2-异丙氧基乙基)-2-硫代-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4(5H)-酮或具有式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。这些组合物可采用适合于以下的形式：口服(例如作为片剂、锭剂、硬或软胶囊剂、水性或油性悬浮液、乳剂、可分散粉剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂)，局部使用(例如作为乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、或者水性或油性溶液或悬浮液)，通过吸入施用(例如作为细碎粉末或液体气雾剂)，通过吹入施用(例如作为细碎粉末)或肠胃外施用(例如作为用于静脉内、皮下或肌内给药的无菌水性或油性溶液)，或作为用于直肠给药的栓剂。组合物可以使用本领域熟知的常规药物赋形剂通过常规程序获得。因此，用于口服的组合物可含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。在一些优选的实施例中，MPO抑制剂将口服施用。在一些优选的实施例中，MPO抑制剂将以缓释形式施用，例如口服缓释形式或皮下缓释形式。
在一个实施例中，提供了一种用于治疗雄性不育的药物组合物，其包含髓过氧化物酶抑制剂，例如具有式(I)的化合物、3-[[(2R)-四氢呋喃-2-基]甲基]-2-硫代-7H-嘌呤-6-酮(AZD5904)或1-(2-异丙氧基乙基)-2-硫代-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4(5H)-酮或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
髓过氧化物酶抑制剂通常以范围为2.5-5000mg/m2动物体表面积、或大约0.05-100mg/kg的单位剂量施用给温血动物，并且这通常提供治疗有效剂量。单位剂型如片剂或胶囊剂通常含有例如0.1-500mg的活性成分。日剂量将必然随所治疗的宿主、具体的施用途径、共施用的任何治疗、以及正在治疗的疾病的严重性而变化。因此，治疗任何具体患者的执业医生可以确定最佳剂量。
为了检验MPO抑制剂可能适合治疗特发性雄性不育的假设，如下详述，对在邓迪内维尔医院(Ninewells Hospital in Dundee)参加辅助受孕组(ACU)的患者同意下收集的诊断性男科样品进行了一系列离体研究。进行实验以评估如下所述的精子活动力和功能的各种参数。
为了更好地理解本发明，参考以下附图：
图1示意性地描绘了氧化应激在雄性不育中的作用
图2是示出可从临床获得的关于每个测试患者的男科相关基线信息(年龄、原发性/继发性不育和不育的时长)的简述的表格。计数数字为百万/毫升(M/ml)，WHO参考值为浓度15M/ml，前进32％，形态学4％，白细胞1M/ml)。
图3a是条形图，其显示了整个数据集(n＝29)对于活动力、前进活动力、快速活动力、平均路径速度(VAP)、直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)和横向头部位移(ALH)在零时和24小时孵育后CASA测量值之间的百分比差异。测量了三个条件；仅作为对照的精子(左栏，a)，精子及活化的中性粒细胞(比率3∶1)和媒介物对照(中间栏，b)，以及精子及活化的中性粒细胞(比率3∶1)加上3μM AZD5904(右栏，c)。Kruskal-Wallis检验显示AZD5904呈积极趋势，但对每个测量参数均未达到统计学显著性(P＞0.1)。误差条代表平均值的标准误差。
图3b是线形图，其显示了前11名受试者(图2中以蓝色突出显示)从基线到孵育后2h和24小时的总体精子活动力的绝对变化，这些受试者的基线精子参数的异常比接下来的18名所研究的受试者更明显。测量了三个条件；仅作为对照的精子(a)，精子及活化的中性粒细胞(比率3∶1)和媒介物对照(b)，以及精子及活化的中性粒细胞(比率3：1)加上3μMAZD5904(c)。AZD5904与媒介物治疗组之间的双尾学生t检验显示了统计趋势：P＝0.09。
图4显示了对于整个数据集(n＝29)的Kremer穿透测定的累积结果，结果表示为与对照(仅精子)的比率。误差条代表平均值的标准误差。学生T检验分析显示，AZD5904治疗组在1cm处发现的精子明显多于未用药物的组。P＝0.02
图5显示了四个“反应者”受试者在两个小时的时间点上的Kremer穿透测试数据实例。数据表示为与对照(仅精子)的比率。条上方的值是指1cm处的实际精子量；最上面的数字是指测试条件(媒介物或AZD5904)而括号中的数字是对照计数。沿X轴的R数字是指匿名患者编号。至少0.25的变化被认为是个体的有意义的差异。
图6显示了来自29位患者及在如下体外治疗条件下的平均MDA染色：仅精子(a)，精子+中性粒细胞+媒介物对照(b)，精子+中性粒细胞+AZD5904(药物)(c)和精子+4mM H2O2(d)。精子及4mM H2O2的染色结果明显高于其他条件(P＜0.01)。误差条代表平均值的标准误差。
材料和方法
实验设计
对获得的每个精液样品进行了一系列的5个测试(图2)。该方法用于评估精子活动力和功能的各种参数。在数据收集之前对方法进行验证，以确保结果的可靠性和可重复性。
研究受试者/样品收集
在邓迪内维尔医院参加辅助受孕组(ACU)的雄性同意下，收集多余诊断性男科样品(N＝29)。
材料
·非获能性介质(pH 7.4)：1.8mM CaCl2、5.4mM KCl、0.8mM MgSO4.7H2O、116.4NaCl、1mM NaH2PO4.2H2O、5.55mM D-葡萄糖、2.73mM丙酮酸钠、41.75mM乳酸钠、25mMHEPES、0.3％BSA。
·获能性介质(pH 7.4)：1.8mM CaCl2、5.4mM KCl、0.8mM MgSO4.7H2O、116.4mMNaCl、1mM NaH2PO4.2H2O、5.55mM D-葡萄糖、2.73mM丙酮酸钠、25mM乳酸钠、26mM碳酸氢钠、0.3％BSA。
·sEBSS(pH 7.4)：1.01mM NaH2PO4、5.4mM KCl、0.8mM MgSO4.7H2O、5.5mM C6H12O6、2.5mM丙酮酸钠、19mM乳酸钠、25mM碳酸氢钠、15mM HEPES、1.8mM CaCl2.2H2O、118.4mMNaCl、0.3％BSA。
精液样品制备
禁欲最少2天和最多7天后，通过自慰将精液样品收集到无菌塑料容器中。精液样品在ACU现场产生，并允许液化30min(37℃)。在样品制备之前，从每个样品中收集20μL未加工精液，并用10μL这一精液在干净的载玻片上制备精液涂片(检查白细胞)。每个样品制作两个载玻片，用锡箔纸包裹，并保存在-20℃冰箱中直至需要。然后如前所述，通过Percoll密度梯度离心(DGC)制备精液样品(Tardif S，Madamidola OA，Brown SG，Frame L，Lefievre L，Wyatt PG，等人Human Reproduction[人类繁殖]2014；29：102123-2135)。然后将每个梯度的最大2mL未加工精液小心地铺在顶部。然后将梯度以300g离心20min。将仅包含精液的最顶层收集到1.5mL Eppendorf管中。然后将该层以17x106x g离心20min，以沉淀精液层中的所有细胞和碎片，从而仅收集精液。然后收集上清液，并再次以17,000x g离心20min。收集上清液，并保存在-20℃冰箱中直至需要。收集来自80％DGC级分的沉淀，并在4mL非获能性介质中以300g洗涤10min。然后丢弃上清液。收集沉淀，重悬于1mL sEBSS溶液中并孵育(37℃)进行精子功能分析。
中性粒细胞分离
从志愿者供体收集血液样品到包含EDTA的真空采血管中以阻止凝血(ZambranoF，Carrau T，Garner U，Seipp A，Taubert A，Felmer R，等人Fertility and Sterility[生育与不育]2016；106(5)：1053-1060)。将血液与Histopaque 1119(英国西格玛(Sigma，UK))以1∶1.2的比例混合到15mL falcon管中(Zambrano等人，2016)。然后将其以800g离心20min。此后，丢弃上清液，并且将沉淀转移到新的falcon管中。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将该试管填充至15mL，并以300g离心10min。首先通过将2mL 10X PBS添加到18mLPercoll中以创建100％的储备液来制备Percoll梯度。然后将其用1XPBS稀释，以创建5种4mL Percoll梯度储备液，浓度为65％、70％、75％、80％和85％。接下来，将2mL每种梯度浓度在15mL falcon中叠放在另一个梯度上，85％在管底部并且65％在顶部。离心10min后，再次丢弃上清液，并且用PBS将沉淀重悬至4mL。接下来，将2mL血液小心地铺在密度梯度的顶部，并以800g离心20min。丢弃最顶层，并且收集70％-80％层并将其转移到新的falcon管中。然后用PBS将试管填充至15mL，并以300g离心10min。丢弃上清液，并且将沉淀收集并在2mL红细胞裂解缓冲液中洗涤。重复该步骤，直到沉淀不再变成红色，每次都丢弃上清液。最后，将沉淀重悬于1mL sEBSS中，并置于37℃培养箱中。
用AZD5904或媒介物治疗精子
在100％DMSO中配制10mM药物储备溶液。然后使用sEBSS作为稀释剂将其连续稀释至3μM的工作浓度，并保存在4℃下。然后将药物或媒介物添加至中性粒细胞中，并置于37℃水浴中10min。然后将中性粒细胞添加到精子安全的5mL聚苯乙烯圆底管(Falcon)中的精子中，比率为约1∶3。以最终浓度1μg/ml添加酵母聚糖以活化中性粒细胞，并在37℃下孵育2小时。为活动力评估、流式细胞术和Kremer测定准备了四个条件：仅精子，精子+中性粒细胞+媒介物，精子+中性粒细胞+AZD5904(药物)和精子+4mM(最终浓度)过氧化氢(H2O2；损伤的阳性对照)。
活动力评估
使用Hamilton-Thorn CASA系统评估精子活动力。对于每种条件，在至少四个不同的视野中总共计数200个细胞。当样品的活动力很低时，至少计数100个细胞。在与中性粒细胞共孵育开始时(时间0)、2h后和24h后评估活动力参数。对于每个样品在每个时间点上，活动力表示为在时间0和2h后之间的百分比差异以及时间0后和24h后的百分比差异。
Kremer穿透测定
Kremer穿透测试评估了精子细胞穿透和游过粘性介质的能力。该测试也称为精子宫颈粘液穿透测试。宫颈粘液替代品是用溶解在获能性介质中的1％甲基纤维素制成的。将溶液在37℃ 5％CO2培养箱中充气20min。然后将扁平毛细管(Rectangle Boro Tubing，CM科学公司(CM Scientific))放置在甲基纤维素溶液中另外的20min，以允许该介质沿毛细管向上流动。孵育2h后，将每种条件下的100μL等分到新的精子安全管中。然后用橡皮泥封闭每个试管的一端，并且然后将一个试管以开口端首先置于每种测试条件下。将每个含有毛细管的精子安全管在37℃和5％CO2下孵育1小时。1h后，取出毛细管，并手动计数1em标记处的细胞数。结果表示为与对照(仅精子)的比率。
流式细胞术
与活化的中性粒细胞孵育2h后，从所有4种条件中取出50μL等分试样，并转移到1.5mL Eppendorf管中。将H2O2用作阳性对照。从仅有精子的试管中取出仅用于第二抗体对照的额外等分试样。将细胞(仅第二抗体试管除外)与抗丙二醛(MDA)抗体(ab27642，abcam公司，剑桥)以1：50的工作比率在37℃下孵育0.5h(Moazamian R，Polhemus A，ConnaughtonH，Fraser B，Whiting S，Gharagozloo P，Aitken RJ.Mol Hum Reprod[分子人类生殖]2015；21(6)：502-15)。然后将试管以300g离心5min以将细胞沉淀，并且丢弃上清液。然后将细胞用sEBSS洗涤两次，并且每次丢弃上清液。然后将荧光标记的山羊抗兔第二抗体(赛默飞世尔英国(Thermofisher，UK))以1∶50的比率添加到所有条件中，并将试管在37℃下孵育10min。将细胞沉淀并如上所述洗涤两次。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于250μL sEBSS溶液中，并转移到新的精子安全管中。然后在BD LSRFortessa细胞分析仪中使用预先验证的流式细胞术程序评估10,000个细胞在每种条件下MDA染色的水平。由于技术误差，无法使用流式细胞术来评估单个样品。
白细胞计数
从冰箱中取出精液涂片，并放入装有Giemsa May-Grünwald溶液(在蒸馏水中按1∶20稀释)的coplin罐中放置5min。然后将载玻片在PBS中洗涤1.5min。接下来，将载玻片放入新鲜的Giemsa May-Grünwald中20min，然后用蒸馏水洗涤。在计数之前，允许它们风干。从每个样品的两个载玻片上取平均数。记录与400个精子在同一视野中计数的白细胞数目，并根据WHO 2010推荐的方法使用精子浓度计算样品白细胞浓度(Cooper TG，Noonan E，vonEckardstein S，Augur J，Baker HWG，Behre HM，等人Human Reproduction Update[人类生殖学前沿]，2010；16(3)：231-245)。
结果
患者人口统计
图2的表格表示了可从临床获得的关于每个测试患者的男科相关基线信息(年龄、原发/继发性不育和不育的时长)的简述。还记录了原始和经处理的精子参数以及白细胞计数。
表格更详细地显示了年龄、夫妇尝试受孕的时长(不育的时长)和患者的不育状况(原发或继发性)。使用Hamilton-Thorne CASA系统在密度梯度离心之前(原始)和之后(经处理)测量精液参数，原始计数除外，其由男科医师按照WHO手册(World HealthOrganization.(2010).WHO laboratory manual for the examination and processingof human semen，5th ed.Geneva：World Health Organization世界卫生组织(2010).[人体精液检查和处理的WHO实验室手册]，第五版，日内瓦：世界卫生组织)手动评估。红色文字是指参数均低于根据WHO 2010的正常值的任何样品。白细胞计数是指未制备的精液样品中发现的白细胞浓度。R数字是指匿名患者编号。
活动力评估
在进行男科调查的当天从患者收集精液样品，并记录活动力参数。每个样品在24小时内均进行三种测试条件；仅精子，精子及中性粒细胞(比率3∶1)加上媒介物对照，以及精子及中性粒细胞(比率3∶1)加上3μM AZD5904。在时间为零、孵育2小时后和24小时后测量活动力。图3a表示时间为零和孵育24小时后精液参数之间的百分比差异。Kruskal-Wallis试验表明，AZD5904治疗在减少总体精子活动力损害方面，向大约30％的有益相对效应大小的趋势并不显著(对于每个测量参数，p＞0.01)。为了可视化随时间变化的活动力差异，对基线精子参数异常更为明显的研究的前11名受试者，还将总活动力、快速前进和前进活动力的数据绘制为线状图表。图3b显示了受测试患者的活动力随时间的差异(N＝11)。
Kremer穿透测定
还使用Kremer穿透测试评估了每个研究受试者的精子样品穿透粘性介质的能力(N＝29)。图4显示了精子及活化的中性粒细胞加上媒介物、以及精子及活化的中性粒细胞加上AZD5904的群组平均结果。结果表明，与媒介物对照相比，用AZD5904治疗的那些样品穿过粘性介质的精子穿透得到了改善。学生T检验分析表明，与未用药物组相比，药物治疗组中1cm处发现的精子显著更多(p＝0.02)。对AZD5904治疗的个体反应存在差异，29位受试者中有15位示出了AZD5904后精子穿透的临床相关改善。图5显示了AZD5904治疗阳性反应者的四个实例。
流式细胞术
孵育2小时后，使用流式细胞术测量MDA水平(N＝29)。孵育2小时后，测量了4种条件；仅精子(对照)，精子及中性粒细胞(比率3∶1)加上媒介物对照，精子及中性粒细胞(比率3∶1)加上3μM AZD5904(药物)，以及精子和4mM H2O2。图6显示了所有4种条件下的平均MDA染色。单因素方差分析(one-way ANONA)显示，精子和4mM H2O2的染色显著高于其他测试条件(P＜0.01)。
结果分析
选择AZD5904作为代表性的MPO抑制剂，是因为其在男性中的广泛临床前资料以及在其中观察到的良好安全性。预期用该代表性的MPO抑制剂获得的结果也能用其他有效的、选择性的MPO抑制剂获得，例如但不限于WO 2006062465 A1(其公开了1-(2-异丙氧基乙基)-2-硫代-2，3-二氢-1H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4(5H)-酮(也称为AZD3241)、WO2008152420 A1和/或WO 2016087338 A1(其描述了本文具体公开的具有式(I)的化合物)所述的化合物。
更详细地讲，AZD5904是一种有效的人MPO不可逆抑制剂(IC50为140nM)，在小鼠和大鼠中具有相似效力。与紧密相关的乳过氧化物酶和甲状腺过氧化物酶相比，它具有10至19倍的选择性；与广泛的系列的其他酶、离子通道和受体相比，则＞70倍。在分离的人类中性粒细胞中，1μM使PMA刺激的HOCl抑制＞90％。在大鼠中，约5μM的血浆浓度减少了从原位酵母聚糖活化的腹膜中性粒细胞的谷胱甘肽磺酰胺体内形成(HOCl与谷胱甘肽的反应产物)。将AZD5904以高达1200mg的单剂量(1400mg缓释，ER，制剂)和高达325mg TID的多剂量(600mg BID服用10天，ER制剂)口服施用给健康志愿者。在五项1期研究中，总共向181名受试者给药。尚未鉴定出显然药物相关不良事件。
在本申请中描述的涉及MPO抑制剂对精子特性的活性的测试中获得的结果(在附图中给出)说明代表性的MPO抑制剂(AZD5904)对获得自患有特发性雄性不育的受试者的精子有影响。总共测试了29位受试者的精子样品。虽然单个结果显示出一定程度的变异性，总的来说，并且尽管样品量较小(初步研究)，但数据显示，相比于媒介物，将AZD5904施用于与活化的人中性粒细胞共同孵育24小时后的人精子，总体精子活动力有积极的改善趋势。
Kremer穿透测试是一种特别有用的测试，可用于评估药物对精子活动力的影响。这是因为它评估了精子穿透和游过与女性生殖道中发现的粘度相似的介质的能力，精子可以自然地在体内游过该女性生殖道(Ivic A，Onyeaka H，Girling A，Brewis IA，Ola B，Hammadieh H等人Human Reproduction[人类繁殖]2002；17(1)：143-149)。精子穿透测试提供了关于精子功能状态的客观、定量和可再现的信息，并且已示出是生育力的有价值的标志，尤其是在雄性因素不育中(参见Eggert-Krause W，Gerhard I，Tilgen W，RunnebaumB.Fertil Steril[生育与不育]1989；52：1032-1040；Eggert-Krause W，Leinhos G，Gerhard I，Tilgen W，Runnebaum B.Fertil Steril[生育与不育]1989；51：317-323；Polansky FF和Lamb EJ.Fertil Steril[生育与不育]1989；51(2)：215-28；Ola B，AfnanM，Papaioannou S，Sharif K，Bjorndahl L，Coomarasamy A.Hum Reprod[人类繁殖]2003；18(5)：1037-46)。使用甲基纤维素和获能性介质制成的该研究中使用的宫颈粘液替代品已被认为是人类宫颈粘液的合适替代品(Ivic等人，2002；Tang S，Garrett C，BakerHW.Human Reprod[人类繁殖]1999；14(11)：2812-7)。这项初步研究的结果表明，将与活化的中性粒细胞共孵育的精子治疗2小时后，与媒介物相比，AZD5904治疗可在统计学上显著改善精子穿透(p＝0.02)。在个体受试者水平上，AZD5904在刚刚超过50％的受试患者(评估的29名患者中15名反应者)中提供了临床上相关的有益效果，而另外8名受试者表现出较小的改善。尝试鉴定与AZD5904治疗阳性反应相关的表型或人口统计因素，但样品量太小而不允许这样。涉及大量受试者的进一步工作正在进行中。
虽然尚需建立MPO抑制改善精子特性的精确作用机制，但在24小时孵育后，活动力测试的差异更加明显。
综上所述，对上述公开的MPO抑制剂治疗特发性雄性不育潜力的初步研究的结果表明，在24小时后总体精子活动力和仅2小时后精子穿透的改善方面，用MPO抑制剂体外治疗人类精子与保护精子免受中性粒细胞介导的损害的有益作用的强烈趋势相关。在29名受试者中，有15名被认为在Kremer穿透测试中的改善具有临床重要性，而总体MPO抑制剂治疗在Kremer测试中导致了精子穿透的统计学上显著的改善。这些结果为MPO抑制剂(例如AZD5904)可用于治疗特发性雄性不育的主张提供了有力的支持。正在进行扩展研究以证实在这些初步研究中获得的结果。

Claims (5)

1.3-[[(2R)-四氢呋喃-2-基]甲基]-2-硫代-7H-嘌呤-6-酮或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗或预防雄性不育的药物的用途
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗特发性雄性不育。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述药物用于治疗人类患者。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述药物用于治疗非人类陆地哺乳动物。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述药物用于抑制氧化应激诱导的精子损伤和/或预防精子触发的NETosis。
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