CN110891428B - 用于从植物材料中分离蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，其中天然和功能性蛋白质分离物可成功地从植物材料例如含油种子、豆类和扁豆中获得。这可以通过对植物材料进行适当的预处理，随后使用水性溶剂在温和以及非破坏性条件下萃取蛋白质，随后使用新型GRAS有机溶剂组合进行分级、浓缩和进一步纯化的方法来实现。

Description

用于从植物材料中分离蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及用于从植物材料例如含油种子中萃取、纯化和分离蛋白质的方法，涉及蛋白质分离物以及通过所述方法可获得的蛋白质分离物。本发明还涉及蛋白质分离物和通过所述方法可获得的蛋白质分离物在食品中的用途。
背景技术
迫切需要为不断增长的人类群体提供足够营养质量的食物，这些食物以对环境无害的方式和从经济和技术的观点来看可行的方式生产。
预期这种需求将在未来几十年中增长，因为到2050年全球人口预计将超过90亿人。
增加肉类(特别是红肉)的产量可能不是解决该问题的最佳方式，因为众所周知，在利用自然资源(如耕地和水)，在向大气排放温室气体以及在水流被抗生素、生长激素污染等方面，农业产业对环境产生了巨大的负面影响，甚至无意中将这些潜在有害物质散布在家畜生产的食物中。
营养专家们一致认为，通过食用来自植物材料而非动物来源的蛋白质可以更好地满足人类对蛋白质摄入的需求。然而，源自植物材料的蛋白质的固有问题是，在其天然存在形式中，如在种子、豆类、水果和谷物中，它们通常包埋在包含纤维、多糖、脂肪、脂质、微量营养素以及抗营养因子如酚类化合物、植酸类等复合基质中。为了用作食品配方中的成分，这些蛋白质需要从原始材料中萃取并以纯化的或至少浓缩的形式分离。此外，在许多食品应用中，重要的是这些蛋白质保持其天然功能特性，例如溶解性、与脂肪和油形成稳定乳液的能力、形成稳定泡沫的能力等。
现有技术公开了这样的方法，其中对植物材料进行一系列步骤，包括依次使用水性溶剂和有机溶剂以获得蛋白质分离物。
WO02/060273A1涉及使用搅拌装置用水从向日葵粉中萃取蛋白质，随后使用乙醇沉淀可溶性蛋白质。
WO2011/057407A1公开了用于从油菜籽(rapeseed)/芥花籽(canola)获得蛋白质浓缩物和分离物的方法。公开了一种方法，其中将乙醇加入到具有水的蛋白质混合物中，并且其中可溶性蛋白质从溶液中沉淀。
在WO2013/013949A1中，公开了用于从油饼分离蛋白质的蛋白质分离方法，其包括以下步骤：(a)用水溶液萃取蛋白质，(b)浓缩，和(c)添加水溶性的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮，以获得蛋白质沉淀物。通过提供未加工植物蛋白源在水中的悬浮液并在STR型装置中搅拌该悬浮液来进行蛋白质的萃取。通过干燥来自水和水溶性溶剂的混合物的沉淀物来实现蛋白质的分离。
发明内容
虽然这些前述方法提供了从抗营养因子如酚类化合物中分离和纯化蛋白质的方法，但是它们没有解决除去(大量)非极性组分和杂质如植物材料(例如含油种子及其油饼)中的油、脂肪和脂质的问题。当传递到最终的蛋白质分离物时，这些杂质将使产物不太稳定并且在储存时更容易变质。较高的脂肪含量也会降低蛋白质产品的功能特性，例如溶解性以及与脂肪形成稳定乳液的能力。
本发明的目的是提供一种从植物材料，优选植物原材料(raw plant material，原植物材料)中，特别是从含有大量油、脂肪和/或脂质的植物材料中分离纯化或至少浓缩形式的蛋白质的方法。
本发明的另一个目的是提供一种从所述植物材料中分离纯化的或至少浓缩形式的蛋白质的方法，其中蛋白质的天然功能特性在该方法中得以保留，使得所得蛋白质分离物适于人类消费。
本发明的另一个目的是提供从所述植物材料中分离纯化形式或至少浓缩形式的蛋白质的经济上可行的方法。
本发明通过提供一种可规模化和经济可行的方法解决了上述目的，其中天然和功能性蛋白质分离物可成功地从植物材料，优选植物原材料(例如含油种子、豆类和扁豆)中获得，所述植物材料含有大量的油、脂肪和/或脂质。这可以通过对植物材料进行适当的预处理，随后使用水性溶剂在温和以及非破坏性条件下萃取蛋白质，随后使用新型GRAS有机溶剂组合进行分级、浓缩和进一步纯化的方法来实现。换言之，使用现有技术中已知的萃取、分级和浓缩技术制备水溶液中的蛋白质浓缩物，随后用至少两种其他溶剂以顺序施加的溶剂的极性递减的顺序替换水性萃取溶剂，其中：
i)用于初始萃取步骤的第一水性溶剂的主要组分是水；
ii)第二溶剂的主要组分属于在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇的组；以及
iii)第三溶剂的主要组分是非极性溶剂，其属于可与第二溶剂混溶但在室温下仅部分与第一溶剂混溶的有机酯的组。
因此，本发明的第一方面涉及用于从植物材料制备蛋白质分离物的方法，其中所述植物材料包含基于干重10-50wt％的蛋白质，所述方法包括以下步骤：
a)压碎(crush)或粉碎(comminute)植物材料以产生固体饼；
b)使用基于第一溶剂的总重量包含至少90wt％的水的第一溶剂来萃取步骤a)中获得的固体饼，以获得第一固体级分和第一液体级分的混合物；
c)将第一液体级分与第一固体级分分离；
d)由步骤c)中获得的第一液体级分制备蛋白质浓缩物，其中基于蛋白质浓缩物的总重量，蛋白质浓缩物包含50-90wt％的水，其中蛋白质溶解在第一溶剂中和/或其中蛋白质存在于第二固体级分中，其中基于浓缩物的总干重，浓缩物中的蛋白质含量为至少40wt％；
e)向步骤d)中获得的蛋白质浓缩物中添加第二溶剂，其中基于第二溶剂的总重量，第二溶剂包含至少90wt％的在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇；
f)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤e)中获得的混合物分离成第二液体级分和第三固体级分，其中基于第三固体级分的总干重，第三固体级分的蛋白质含量为至少60wt％；
g)向步骤f)中获得的第三固体级分中添加第三溶剂，基于第三溶剂的总重量，所述第三溶剂包含至少90wt％的具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯，其中具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯在室温下与第一溶剂至少部分混溶并且与第二溶剂完全混溶，其中选择第三溶剂的量使得整个液相不会分离成不同的液相；
h)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤g)中获得的混合物分离成第三液体级分和第四固体级分，其中基于第四固体级分的总干重，第四固体级分的蛋白质含量为至少90wt％；以及
i)将步骤h)中获得的第四固体级分经受选自由真空干燥、喷雾干燥、过热蒸汽干燥及其组合组成的组的技术，以获得蛋白质分离物，其中基于蛋白质分离物的总干重，蛋白质含量为至少90wt％。
优选植物材料是植物原材料。本发明还涉及蛋白质分离物，基于干物质，其包含至少70wt％的天然植物性蛋白质、小于1wt％的碳水化合物(仅糖(simple sugars))、小于0.2wt％、优选小于0.15wt％、更优选小于0.1wt％的酚类化合物，并且不含具有6个或更多个碳原子的有机或矿物溶剂。
本发明还涉及通过上文定义的方法可获得的蛋白质分离物。
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的或通过如上文所定义的方法可获得的蛋白质分离物在食品中的用途。
附图说明
图1描绘了实施例中使用的ALSEOS 7L系统的示意图，其中(1)代表第一溶剂，(2)代表圆柱形过滤元件，100μm金属丝网，0.1m2，(3)代表粉碎的原始材料，(4)代表ALSEOS柱，ID 0.1m，H 1m，和(5)代表滤液(＝粗萃取物，＝第一液体级分)。
图2描述了实施例1和2中所描述的本发明方法的示意图。
图3a-3c分别描述了对应于在实施例的试验1a、1b和1c中获得的蛋白质分离物的SEC色谱图。
图4.如实施例3所描述的本发明方法的示意图。
定义和缩写
本文所用的术语“粉(meal)”是指粉末形式的植物材料，例如面粉，所述植物材料通过用有机或矿物溶剂例如己烷萃取这些油和脂质，随后通过用水蒸汽烘烤除去所述溶剂，从而基本上不含油和脂质。本文所用的术语“矿物溶剂(mineral solvent)”是指通过裂化、精炼和/或精馏方法由化石沉积物如石油或烟煤获得的溶剂。本文所用的术语“植物材料”具有其常规含义，并且是指源自植物的材料，包括蔬菜、水果、种子、豆类和谷物。本文所用的术语“植物原材料”具有其常规含义，并且是指可以通过根据本发明的加工转化为新的和有用的产物(例如含有最初存在于植物原材料中的蛋白质的蛋白质分离物)的未加工的植物材料。本文所用的术语“室温”是18-25℃的温度。
缩写‘GRAS溶剂’表示‘一般公认安全(Generally Regarded As S afe)’并且根据以下标准属于类别3的溶剂：Guidance for Industry,Q3C-Tables and List,U.S.Department of Health and Human Services,Food and Drug AdministrationCenter for Drug Evaluation and Research(CD ER),Center for BiologicsEvaluation and Research(CBER),February 2012,ICH,Revision 2。在这方面，请参考https://www.fda.gov/downloads/dr ugs/guidances/ucm073395.pdf。
缩写‘TFF’表示‘切向流过滤’。缩写‘EAI’和‘ESI’分别表示‘乳化活性指数’和‘乳化稳定性指数’。缩写‘STR’表示‘搅拌釜反应器’。缩写‘ALSEOS’表示‘油籽的含水低剪切萃取’。缩写‘CV’、‘G’、‘rpm’、‘TMP’、‘DW’和‘NS’分别表示‘柱体积’、‘重力’、‘每分钟转数’、‘跨膜压力’、‘干重’和‘氮溶解度’。缩写‘EA’表示乙酸乙酯。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了用于从植物材料制备蛋白质分离物的方法，其中基于干重，所述植物材料包含10-50wt％的蛋白质，所述方法包括以下步骤：
a)压碎或粉碎植物材料以产生固体饼；
b)使用基于第一溶剂的总重量包含至少90wt％的水的第一溶剂萃取步骤a)中获得的固体饼，以获得第一固体级分和第一液体级分的混合物；
c)将所述第一液体级分与所述第一固体级分分离；
d)由步骤c)中获得的第一液体级分制备蛋白质浓缩物，其中基于蛋白质浓缩物的总重量，蛋白质浓缩物包含50-90wt％的水，其中蛋白质溶解在第一溶剂中和/或其中蛋白质存在于第二固体级分中，其中基于浓缩物的总干重，浓缩物中的蛋白质含量为至少40wt％，优选至少50wt％；
e)向步骤d)中获得的蛋白质浓缩物中添加第二溶剂，其中基于所述第二溶剂的总重量，所述第二溶剂包含至少90wt％的在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇；
f)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤e)中获得的混合物分离成第二液体级分和第三固体级分，其中基于第三固体级分的总干重，第三固体级分的蛋白质含量为至少60wt％；
g)向步骤f)中获得的第三固体级分中添加第三溶剂，基于所述第三溶剂的总重量，所述第三溶剂包含至少90wt％的具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯，其中具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯在室温下与第一溶剂至少部分混溶并且与第二溶剂完全混溶，其中选择第三溶剂的量使得整个液相不会分离成不同的液相；
h)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤g)中获得的混合物分离成第三液体级分和第四固体级分，其中基于第四固体级分的总干重，第四固体级分的蛋白质含量为至少90wt％；
i)使步骤h)中获得的第四固体级分进行选自由真空干燥、喷雾干燥、过热蒸汽干燥及其组合组成的组的技术操作以获得蛋白质分离物，其中基于蛋白质分离物的总干重，蛋白质含量为至少90wt％。
优选地，基于干重包含10-50wt％蛋白质的植物材料是植物原材料。基于干重包含10-50wt％蛋白质的植物材料优选选自由以下组成的组：蔬菜、水果、种子、豆类、谷物及其组合。
在更优选的实施方式中，基于干重包含10-50wt％蛋白质的植物材料选自由以下组成的组：含油种子，包括油菜籽、芥花籽、向日葵、红花和棉籽；豆类(pulse)，包括大豆和其他豆类；豆科植物(legume)和豌豆，包括鹰嘴豆，红色、绿色、黄色和棕色扁豆，及其组合。
在甚至更优选的实施方式中，基于干重包含10-50wt％蛋白质的植物材料选自由以下组成的组：含油种子，包括油菜籽、芥花籽、向日葵种子、亚麻籽、红花种子、棉籽及其组合。
在最优选的实施方式中，基于干重包含10-50wt％蛋白质的植物材料是属于芸苔科(family brassica)和甘蓝型油菜(Brassica napus)或芥菜(Brassica juncea)物种的油菜籽。
植物材料，特别是植物原材料，例如含油种子如油菜籽、芥花籽、向日葵、红花、棉籽等，豆类如大豆和其他豆子，豆科植物和豌豆如鹰嘴豆，红、绿、黄和棕色扁豆等，具有如下共同特征：它们天然蛋白质含量的大部分属于称为白蛋白和/或球蛋白的蛋白质类，即它们可溶于含有阳离子如NH4 +、Li+、Na+、K+、Mg+2、Ca+2和/或阴离子如Cl-、SO4 -2、SO3 -2、HSO3 -等的无机盐的水和/或水溶液中。除了蛋白质之外，这些植物材料通常还含有其他类型的化合物，这些化合物根据植物材料的类型以不同的比例存在。所述其他化合物通常是糖类(多糖、寡糖、单糖)、淀粉、植酸类(phytates)、酚类化合物、纤维组分、非蛋白质氮化合物等。可存在于植物材料中的一类值得注意且独特的成分包括脂质，例如脂肪、油、磷脂、糖脂等，其特征在于在其分子结构中具有非极性部分的共同特征，该分子结构由具有4-28个碳原子数的脂肪酸组成。
本领域技术人员将理解，在根据本发明的教导进行加工之前，可以对完整种子、豆类或谷物形式的植物材料进行预选和/或干法分级如脱皮(即除去荚果和种子外皮)。在可以通过干法分级除去的部分中的蛋白质含量显著低于为了获得蛋白质分离物而将进行进一步加工的部分中的蛋白质含量的情况下，这种操作可能是特别有利的。
因此，在优选的实施方式中，如上定义的方法包括在步骤a)之前对植物材料进行预选和/或干法分级，优选脱皮的步骤，其中植物材料包括完整种子、豆类或谷物。
通常，对于含油种子和大豆，存在于植物材料中的部分脂肪、油和脂质可以通过机械手段如挤出或冷压榨从植物材料中萃取以产生含油种子饼，或者所述脂肪、油和脂质可以通过化学方法萃取，如在非极性且亲脂性溶剂如己烷中萃取。在采用己烷萃取的常规方法中，通常采用蒸汽和高温以在特意设计的脱溶装置/烘烤步骤中从粉中除去己烷残留物。由于存在于粉中的蛋白质的部分和不可逆变性以及相关功能性质(例如溶解度和/或与脂质形成稳定乳液的能力)的丧失，这种处理可能对粉中蛋白质的质量具有不利影响。
在一个优选的实施方式中，在步骤a)之前使用机械手段，优选使用冷压榨将植物材料至少部分脱脂。优选地，在使用机械手段的脱脂步骤中既不使用有机溶剂也不使用矿物溶剂。
如果植物材料含有大量的脂肪、油和/或脂质，则如上定义的方法的优点是最显著的。因此，在优选的实施方式中，植物材料基于干重包含至少5wt％，更优选至少10wt％，甚至更优选至少15wt％的脂肪、油和脂质。
在一个非常优选的实施方式中，植物材料未加热到高于75℃的温度。
如上所指出的，进行植物材料的压碎或粉碎。这是促进植物材料在用于萃取的第一水性溶剂中的分布和悬浮的必要步骤。通过这样做，促进了压碎或粉碎的植物材料和用于萃取的第一溶剂之间有效质量转移的条件。
在优选的实施方式中，步骤b)中的第一溶剂是水或包含盐和任选地包含其他添加剂的水溶液。
从压碎或粉碎的植物材料中萃取蛋白质到第一溶剂中的方法可以通过任何适合于促进第一溶剂的悬浮或分散固相与连续液相之间的质量转移的技术完成，例如：
a)在STR中混合；
b)使作为填充床固定的压碎或粉碎的植物材料与渗透通过填充床的第一溶剂接触；
c)通过将压碎或粉碎的植物材料悬浮在向上流动的第一溶剂中使其接触；或者
d)通过使压碎或粉碎的植物材料在重力和/或离心力的作用下沉降在第一溶剂中而使其与第一溶剂接触。
本领域技术人员理解，所有这些使压碎或粉碎的植物材料与第一溶剂接触的方法和机制可分为两个不同的类别，其特征在于在接触装置中产生的剪切量。在低剪切操作模式中，例如在填充床、膨胀床或流化床中，或者在重力沉降过程中，在接触装置中的剪切力和速度梯度处于这样的低水平，使得压碎或粉碎的植物材料的完整性被基本上保持并且压碎或粉碎的植物材料和第一溶剂之间的质量转移主要通过可溶性组分从压碎或粉碎的植物材料扩散到停滞或平缓流动的第一溶剂中来控制，而不溶性组分如纤维和脂质主要保持完整并停留在固体基质中。相反，当采用高剪切操作模式时，例如在STR中，其中由于搅拌引起的剪切速率可以大大超过100l/s，特别是在搅拌器附近，由于速度梯度和/或搅拌装置产生的湍流的破坏作用，压碎或粉碎的植物材料通常难以保持完整性。实际上，压碎或粉碎的植物材料的颗粒可以进行破碎，随后将构成组分如细颗粒和脂质释放到液相中。这些细粒和脂质的释放可能对萃取步骤下游的工艺具有负面影响。在高剪切装置中蛋白质和脂质的共萃取也可导致微乳液的形成，其中蛋白质、脂质、固体细粒和抗营养因子将被包埋在油脂样无定形体中，这给处理器造成了严重的问题并且使得蛋白质的分级、纯化和分离的方法不可行。因此，在优选的实施方式中，步骤b)中的蛋白质萃取在低剪切条件下进行。
从悬浮或分散在第一溶剂中的压碎或粉碎的植物材料中萃取蛋白质可以以间歇、半连续或完全连续的操作模式进行。给定足够量的接触时间，通常2-8h，更优选4-6h，很大一部分蛋白质将从压碎或粉碎的植物材料中释放并且将溶解到第一溶剂中，产生第一液体级分(也称为‘粗萃取物’)和含有未溶解的残余材料的第一固体级分。
第一液体级分可以通过选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术与第一固体级分分离。
任选地，第一液体级分在与第一固体级分分离之后可以使用过滤装置如自清洁过滤器或深度过滤器进行另一固-液分离步骤，或者第一液体级分可以在圆盘堆叠式离心机或类似装置中进行离心分离，目的是除去可能存在于第一液相中的固体细粒和/或脂质。从第一液体级分获得的这种中间液相被称为‘澄清萃取物’。
如上文所定义的，将粗萃取物或澄清萃取物形式的第一液体级分在步骤d)中进行浓缩步骤以制备蛋白质浓缩物。该浓缩步骤优选包括超滤、蒸发或其组合。在本发明的一个实施方式中，第一液体级分在步骤d)中在具有中空纤维型过滤膜、陶瓷膜或螺旋卷绕膜的TFF装置中进行超滤，所述过滤膜的开口尺寸(截留尺寸)足够小以保留存在于第一液相中的通常为6-20kD的蛋白质物质，同时对于存在于第一液体级分中的其他溶质如肽、多糖、寡糖、糖类、酚类化合物、植酸类和盐是可渗透的。在该超滤浓缩步骤之后，优选进行利用新鲜水或包含盐的水溶液(任选地包含另外的添加剂)的浓缩物(超滤渗余物)的渗滤步骤来产生具有改进纯度的蛋白质浓缩物，所述浓缩物包含至少10wt％的溶解或沉淀的固体，其中蛋白质浓缩物中的蛋白质含量基于浓缩物的总干重为至少40wt％，优选至少50wt％，并且其中基于蛋白质浓缩物的总重量，蛋白质浓缩物包含50-90wt％的水。
本领域技术人员将理解，TFF环中的第一液体级分加工成蛋白质浓缩物可能由于浓度效应、pH效应或由于离子强度变化的效应而引起第二固体级分的沉淀。如果发生这种情况，可以将含有超过40％干重的蛋白质的第二固体级分加入到第一液体级分的蛋白质浓缩物中。然后根据本发明加工该蛋白质浓缩物，得到蛋白质分离物。任选地，将步骤d)中获得的蛋白质浓缩物在真空下进行蒸发以除去过量的水。
本领域技术人员将理解，第二固体级分也可以由第一液体级分通过改变第一液体级分的pH或离子强度，甚至在TFF步骤之前制备，其中属于球蛋白类的较大蛋白质将沉淀，而属于白蛋白类的较小蛋白质将保留在溶液中。随后可以通过合适的技术如过滤、沉降或优选离心分离将主要包含球蛋白蛋白质的第二固体级分与第一液体级分分离，产生第二固体级分的湿饼和第一液体级分的上清液。同样在这种情况下，固液分离后第二固体级分中的蛋白质含量基于干重将大于40wt％，并且第二固体级分的湿饼中的水含量将在50-90wt％的范围内。第二固体级分的湿饼可以随后根据本发明进行加工以产生蛋白质分离物。
基于第二溶剂的总重量，添加到步骤d)中获得的蛋白质浓缩物中的第二溶剂包含至少90wt％的在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇。
在优选的实施方式中，在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇具有0.8-0.4的相对极性。各种溶剂的相对极性值公开于：Solvents and Solvent Effects in OrganicChemistry,Wiley-VCH Publishers,3rd ed.,2003，其通过引用并入本文。水的相对极性为1。
在更优选的实施方式中，在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇选自由甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇及其组合组成的组。加入第二溶剂将影响液相的极性，并且可能改变蛋白质的溶解度，从而诱导蛋白质的沉淀，并且还可能改变蛋白质与其他组分和杂质如糖类、酚类化合物和/或异黄酮之间相互作用的性质，使得这些杂质可以从蛋白质中解离，并且可以在随后的固-液分离步骤中从蛋白质分离物中除去。因此，第二溶剂的加入和第一溶剂的置换可能促进蛋白质的有效分离以及蛋白质分离物与其天然形式的所述蛋白质相关的杂质的纯化，当蛋白质溶解或沉淀在第一(水性)溶剂中时，所述杂质不易于除去。因为本发明的目的是提供用于人类食品的蛋白质分离物，所以合适的第二溶剂的选择取决于功能性以及健康和安全问题。由于上述限制，在室温下与水混溶的具有1-5个碳原子的醇的最优选选择是乙醇。乙醇通常用于食品工业并且被认为是GRAS溶剂。
在该方法的步骤e)中使用的第二溶剂的量将由蛋白质在第一溶剂中的浓度、蛋白质在第一溶剂和第二溶剂的混合物中的溶解度以及与第二溶剂相关的变性效应决定。在优选的实施方式中，第二溶剂的量将使得第一溶剂与第二溶剂的重量比达到1：10-1：1，优选1：3-2：3。
在添加第二溶剂之后，产生混合物，其中蛋白质主要作为沉淀的固体级分存在，并且其中在液相中发现可溶性化合物如糖类、酚类化合物、异黄酮和其他杂质。如果存在，脂肪和脂质将主要与固体级分结合。
在步骤f)中使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术从混合物中分离固体级分，以获得第三固体级分和第二液体级分，其中基于第三固体级分的总干重，第三固体级分的蛋白质含量为至少60wt％。如本领域技术人员将理解的，第三固体级分包含在该方法中使用的痕量溶剂如水和水溶性醇。第三固体级分还可以含有脂肪和脂质的残留物，其与蛋白质共萃取并且在该方法的其他步骤中不被除去。
本领域技术人员将进一步理解，在分离第三固体级分之后，为了进一步改善蛋白质分离物的纯度，可以使用额外的洗涤步骤，由此可以将新鲜部分的第二溶剂或第二溶剂与水的混合物添加至第三固体级分，接着是选自由以下组成的组的合适的固-液分离步骤：过滤、沉降、离心分离及其组合。
基于第三溶剂的总重量，在步骤g)中加入的第三溶剂包含至少90wt％的具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯，其中具有至多5个碳原子的所述非极性且亲脂性有机酯与第一溶剂至少部分混溶并且在室温下与第二溶剂完全混溶，其中优选选择第三溶剂的量使得整个液相不会分离成不同的液相。在优选的实施方式中，第三溶剂的量将使得第二溶剂与第三溶剂的重量比达到1：10-1：1，优选1：5-1：2。第三溶剂的加入将影响液相的极性，并且将改变油、脂肪和脂质的溶解度，并且还可以改变蛋白质和非极性杂质之间相互作用的性质，使得它们可以从蛋白质解离并且可以在随后的固-液分离步骤中被除去。因此，当蛋白质在第一和/或第二溶剂中溶解或沉淀时，第三溶剂的加入和第一和第二溶剂的置换促进了蛋白质的有效分离以及蛋白质分离物与天然形式的所述蛋白质相关的不适于除去的杂质的纯化。
在优选的实施方式中，在室温下与第一溶剂至少部分混溶并且与第二溶剂完全混溶的具有至多5个碳原子的非极性且亲脂性有机酯的相对极性小于0.4。
因为本发明的目的是提供用于人类食品的蛋白质分离物，所以合适的第三溶剂的选择取决于功能性以及健康和安全问题。由于这些限制，这种非极性溶剂的最优选选择是乙酸乙酯。乙酸乙酯通常用于食品工业并且被认为是GRAS溶剂。
使用过滤、沉降或离心分离将步骤g)中获得的固-液混合物分离成第三液体级分和第四固体级分。由于通过第三溶剂的作用去除脂质和其他非极性杂质，进一步提高了蛋白质的纯度，因此，基于第四固体级分的总干重，第四固体级分的蛋白质含量超过90wt％。
本领域技术人员将理解，在分离第四固体级分之后，为了进一步改进纯度和/或进一步从第四固体级分中除去第一溶剂和第二溶剂的残留物，可以使用另外的洗涤步骤，由此可以将新鲜部分的第三溶剂加入到第四固体级分中，随后进行选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的合适的固-液分离步骤。
在步骤i)中将为浸泡在第三溶剂中的蛋白质分离物的第四固体级分进行选自由真空干燥、喷雾干燥、过热蒸汽干燥及其组合组成的组的技术，以获得蛋白质分离物，其中蛋白质含量基于蛋白质分离物的总干重为至少90wt％。
在优选的实施方式中，步骤i)中获得的蛋白质分离物中第三溶剂的残留量低于食品管理局所要求的可接受水平，通常低于1000ppm，优选低于100ppm，甚至更优选低于20ppm。
使用如上文所定义的第三溶剂(例如乙酸乙酯)的优点是其高挥发性和低蒸发潜热(368kJ/kg)，该蒸发潜热显著低于水)的蒸发潜热(2260kJ/kg)和乙醇的蒸发潜热(841kJ/kg)，这意味与仅使用第一溶剂或第二溶剂或其组合的方法相比，除去该方法中使用的溶剂的残留物将需要较少的能量，并且可以降低蛋白质在干燥过程中暴露的温度。已知蛋白质对高温作用敏感，并且例如可以在喷雾干燥过程中严重变性。例如，据报道，高达70％的乳清蛋白可以在喷雾干燥过程中变性。在这方面，参考Md.Amdadul Haque,2015,Drying and Denaturation of Proteins in Spray Drying Process,https://www.researchgate.net/publication/275100415。
用第三溶剂代替第一溶剂和第二溶剂的另一个优点是即使在高温下，植物蛋白在非极性亲脂性溶剂如酯如乙酸乙酯中的变性程度低。在这方面，参考D.Fukushima,1969,Denaturation of soy proteins by organic solvents,http://www.aaccnet.org/publications/cc/backissues/1969/Documents/Chem46_156.pdf。
使用亲脂性GRAS溶剂(例如乙酸乙酯)从蛋白质分离物中除去脂肪和脂质的残留物带来了另外的优点，因为它使得在从植物材料(例如含油种子)生产食品级蛋白质分离物的过程中不再使用来自矿物油的有害溶剂(例如己烷)。这也意味着消除了工业上目前用于从粉中除去己烷残留物的常规步骤，所述步骤通常涉及使用蒸汽和高温，该步骤显著限制了粉中存在的蛋白质的可萃取性和功能性。
在非常优选的实施方式中，如上文所定义的方法中使用的溶剂基本上由GRAS溶剂组成。
在另一个非常优选的实施方式中，如上定义的方法在不使用具有6个或更多个碳原子的有机或矿物溶剂如己烷的情况下进行。
本发明的方法不需要使用极端条件，例如高温或pH的重大变化。相反，蛋白质在整个过程中暴露的温度优选保持在0-50℃的范围内，更优选10-20℃，并且pH优选保持在5-8的范围内。
在一个优选的实施方式中，在如上文所定义的方法的步骤i)中获得的蛋白质分离物包含基于干物质至少95wt％的植物性蛋白质。
在另一个优选的实施方式中，在如上定义的方法的步骤i)中获得的蛋白质分离物包含基于干物质至少95wt％的植物性蛋白质，表现出大于75％的氮溶解度(NS)和大于20m2/g的以乳化活性指数(EAI)表示的乳液形成能力。
在另一个优选的实施方式中，在如上定义的方法的步骤i)中获得的蛋白质分离物包含基于干物质至少70wt％的天然植物性蛋白质。
在本发明的第二方面，提供了一种蛋白质分离物，其包含基于干物质至少70wt％的天然植物性蛋白质、小于1wt％的碳水化合物(仅糖)、小于0.2wt％、优选小于0.15wt％、更优选小于0.1wt％的酚类化合物，并且不含具有6个或更多个碳原子的有机或矿物溶剂。
在优选的实施方式中，蛋白质分离物包含基于干物质至少95wt％的植物性蛋白质，表现出大于75％的氮溶解度(NS)和大于20m2/g的以乳液活性指数(EAI)表示的乳液形成能力。
在本发明的第三个方面，提供了一种可通过上文定义的方法获得的蛋白质分离物。
在优选的实施方式中，如上文所定义的蛋白质分离物或通过如上文所定义的方法可获得的蛋白质分离物包含基于干物质小于2wt％、优选小于1.5wt％、更优选小于1wt％的脂肪、油和脂质。
在第四方面，本发明涉及如上文所定义的蛋白质分离物或通过如上文所定义的方法可获得的蛋白质分离物在食品中的用途。
因此，已经参考上面讨论的某些实施方式描述了本发明。应当认识到，这些实施方式易受到本领域技术人员公知的各种修改和替换形式的影响。
此外，为了适当地理解本文件及其权利要求，应当理解，动词‘包括’及其变化形式以其非限制性含义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，除非上下文清楚地要求存在一个且仅存在一个元件，否则通过不定冠词‘一个’或‘一种’提及元件不排除存在一个以上元件的可能性。因此，不定冠词‘‘一个’或‘一种’通常是指‘至少一个’。
实施例
实施例1
进行三轮试验(1a、1b和1c)，其中从油菜籽粉中制备蛋白质分离物。
在试验1a中，使用自制的低温烘烤的油菜籽粉。通过脱脂、干燥和烘烤在工艺温度<70℃冷压榨的油菜籽饼来制备该油菜籽粉。油菜籽饼获自Grupa Wilmar Marek Wilczyński SKA。在Soxhlet装置中在70℃用己烷进行脱脂。脱脂后，将油菜籽在室温下干燥16h。在下一步骤中，干燥的油菜籽用蒸汽在90℃(材料温度)下烘烤1h，然后在60℃下干燥24h。
在试验1b中，使用从Grupa Wilmar Marek Wilczyński SKA获得的在工艺温度<70℃冷压榨的油菜籽饼。
在试验1c中，使用从外部供应商获得的商业高温(约130℃)烘烤的油菜籽粗粉。
试验1a、1b和1c如下进行：
1.在每次实验之前，将油菜籽粉或饼在研磨机中粉碎和筛分，以产生具有所需粒度(低于1000μm)的油菜籽固体饼。参见表3油菜籽固体饼的特性。
2.将如此预处理的粉碎的油菜籽固体饼加入到第一溶剂中，该第一溶剂是盐的水溶液(2wt％NaCl和0.1wt％Na2SO3)，并使用桨叶温和地均化以获得悬浮液。第一溶剂与预处理的粉碎油菜籽的重量比为4(精确量参见表1)。
3.将悬浮液装载到ALSEOS柱中，该柱预先装有高达其体积5％的第一溶剂。当填充了柱的整个工作空间(柱体积，CV)时，第一溶剂开始在柱上流动。图1给出了ALSEOS 7L系统的示意图。在WO2016/093698A2中解释了ALSEOS的工作原理，其通过引用并入本文。
4.通过蠕动泵控制第一溶剂向ALSEOS装置的流动和滤液(＝粗萃取物，＝第一液体级分)从ALSEOS装置的流出。将粗萃取物(第一液体级分)收集在单独的容器中。总共收集到约23L粗萃取物。精确量和工艺参数参见表1。萃取期间不调节pH。
5.在随后的步骤中，对粗萃取物取样并分析干物质含量、总蛋白质含量和脂肪含量。粗萃取物的特性参见表3。
6.将步骤4)中获得的粗萃取物的等分试样离心(4000g，30min，10℃)以从澄清的萃取物中分离脂质残留物(如果存在的话)作为顶部轻相和固体碎片残留物作为重沉淀相存在。离心分离后，澄清的萃取物作为水相存在。离心澄清萃取物(第一液体级分)的特性参见表3。
7.将离心分离后的步骤6)中获得的澄清萃取物装载到TFF(切向流过滤)系统中以便进行UF(超滤)步骤(聚砜膜，过滤器表面积：0.042m2，截留值：0.1μm，交叉TMP＝1.5bar)，以产生主要包含十字花科蛋白质(cruciferin protein)的蛋白质浓缩物和含有能够通过膜的蛋白质级分的超滤渗透物(UF permeate)。超滤蛋白质浓缩物(渗余物)和超滤渗透物的特性参见表3。
8.将步骤7)中获得的蛋白质浓缩物用第二溶剂在STR(体积5L，搅拌下添加时间10-15min，温度2-8℃，然后在磁力搅拌器搅拌下孵育10min)中进行纯化步骤，所述第二溶剂为96vol％的乙醇(由Honeywell Specialty Chemicals Seelze GmbH提供)。以等于蛋白质浓缩物重量的1.85倍的量施加第二溶剂。随后通过离心分离(4000g，30min，10℃)将混合物分离，得到第三固体级分(粗)和第三液体级分(粗)。
9.随后，通过将第二溶剂和水的混合物添加到STR(体积5L，搅拌下加入时间10-15min，温度为2-8℃，随后在磁力搅拌器搅拌下温育10min)的第三固体级分中，使用第二溶剂(混合物的70vol％)和水(混合物的30vol％)的混合物(液体与固体的重量比为5：1)对步骤8)中获得的第三固体级分(粗产物)进行额外的洗涤步骤。随后通过离心分离(4000g，30min，10℃)将混合物分离，得到洗涤的第三固体级分和第三液体级分。
10.随后用第三溶剂对步骤9)中获得的经洗涤的第三固体级分进行纯化步骤，所述第三溶剂为乙酸乙酯(CAS：141-78-6，供应商：Stanlab J.，纯度等级：分析试剂等级)，通过向STR中洗涤过的第三固体级分中加入第三溶剂(体积5L，搅拌下加入时间10-15min，温度2-8℃，然后在磁力搅拌器搅拌下温育10min)，以液体与固体的重量比为1：5进行。随后通过离心分离(4000g，30min，10℃)将混合物分离，得到第四固体级分(粗)和第四液体级分(粗)。
11.随后根据步骤10)中所描述的步骤，使用第三溶剂对步骤10)中获得的第四固体级分(粗)进行另外的洗涤步骤。随后通过离心分离混合物(4000g，30min，10℃)，得到洗涤的第四固体级分和第四液体级分。
12.随后将步骤11)中获得的经洗涤的第四固体级分在烘箱中的托盘上于40℃下干燥过夜，用研钵中的研杵研磨并筛分以产生粉末形式的蛋白质分离物。
13.分析步骤12)中获得的蛋白质分离物的干物质、蛋白质、脂肪、碳水化合物(仅糖)、多酚类化合物和植酸类含量(参见表4)。还测试了步骤12)中获得的蛋白质分离物的功能性质，例如氮溶解度和乳化活性(参见表4)。此外，评估蛋白质分离物中的氨基酸组成(参见表5)。此外，进行大小排阻层析以评估存在的蛋白质组分的分子大小。图3a、3b和3c分别描述了在试验1a、1b和1c中获得的蛋白质分离物的SEC色谱图。使用SEC，高分子量多肽(峰1，ca.100min)与低分子量多肽(峰2，ca.140min)分离。将含高分子量多肽的蛋白质十字花科蛋白140-150kDa(7S)作为峰1洗脱以及将残余油菜籽蛋白(级分：26-28kDa)作为峰2洗脱。对蛋白质分离物的结构、氨基酸组成和分子大小的进一步检查表明，获得的蛋白质分离物的主要蛋白质组分具有148+/-10kD的分子大小，对应于Svedberg等级的7S分类，这表明获得的蛋白质分离物的主要蛋白质组分是天然十字花科蛋白的亚基，该十字花科蛋白是十字花科植物中的一种贮藏蛋白，属于球蛋白类。图2给出了该方法的示意图。
表1.试验1a-1c中工艺条件和参数设置总结
表2.油菜籽原始材料-物理化学特性
表3.工艺步骤和中间体的物理化学特性
表4.蛋白质分离物-物理化学特性和功能特性
表5.蛋白质分离物-氨基酸组合物
/>
*含硫，**碱性，***外源性，
表6实施例1中使用的主要设备
结论
试验1a、1b和1c中使用的油菜籽原始材料的NS％不同。商用油菜籽粉的NS％最低(25％)(试验1c)，以及冷压榨油菜籽饼的NS最高(59.9％)(试验1b)。
油菜籽原始材料NS％测定值与ALSEOS萃取单元获得的蛋白质回收率相对应；对于商用油菜籽粉(试验1c)，萃取步骤的蛋白质回收率最低(21.0％)，而对于冷压榨油菜籽饼，蛋白质回收率最高(63％)。
所有蛋白质分离物的脂肪含量均小于1％。
冷压榨油菜籽饼(试验1b)中的脂肪含量为20％，并且在蛋白质分离物中的脂肪含量小于1％，这表明该方法能够在不使用有害溶剂、高温和pH的极端变化的情况下有效地除去脂肪，同时保留对食品应用配方至关重要的功能特性，例如在水溶液中的溶解度以及与油和脂质形成乳液的能力。
菜籽原始材料的质量对所得蛋白质分离物的性质有显著影响。在试验1b中获得了具有最高NS％(82.2％)和EAI(24.3m2/g)的蛋白质分离物，其中原始材料是冷压榨油菜籽饼。
实施例2
根据应用下述方案的本发明方法进行了四轮试验(2a、2b、2c和2d)，其中从四种不同来源制备蛋白质分离物。
在试验2a中，使用未加工的(未脱脂的)大豆。在试验2b中，使用从Grupa WilmarMarek Wilczyński SKA获得的在工艺温度<70℃下冷压榨的油菜籽饼。在试验2c中，使用从当地市场获得的商用向日葵饼。在试验2d中，使用从当地市场获得的未加工的红色扁豆种子。在所有上述试验中，将植物材料研磨并通过1mm筛进行筛分。
实施例2中使用的植物原材料的物理化学特性示于表7中。该方法包括7个主要工艺步骤，如下所述。关于这些步骤的重要参数和工艺信息如下所示。
1.萃取
a)萃取介质：水，2％NaCl，0.1％Na2SO3
b)温度：15℃
c)萃取pH：天然
d)萃取物目标体积：14kg(2CV)
e)目标介质流速：3.5kg/h，如果无法达到，可调节
f)萃取时间：4h
2.离心分离
a)时间30min
b)温度4℃
c)相对离心力4000G
3.UF/DF
a)截留膜：10kDa
b)材料纤维：PS
c)膜面积：0.12m2
d)纤维i.d.1mm，盒长(cartridge)33cm，Cat.No.GE UFP-10-E-5A
4.EtOH步骤1
a)96％EtOH-1,85x量的UF/DF浓缩物(w/w)
b)加料时间-10min
c)温育时间-10min
5.EtOH步骤2
a)70％EtOH-5x湿蛋白质沉淀
b)加料时间-10min
c)孵育时间-10min
6.EA步骤
a)EtOH步骤2之后，EA-乙酸乙酯-5x湿蛋白质沉淀
b)加料时间-快速，一次剂量
C)孵育时间-30min
7.干燥
a)时间：24-48h
b)温度：50℃
c)真空干燥器中的压力：10mbar
图2给出了该方法的示意图。
表8中给出了应用于试验2a-2d中的最重要的工艺参数的总结。表9中示出了试验2中获得的蛋白质分离物的物理化学特性和功能特性。
表7.实施例2中使用的植物原材料的物理化学特性
表8.在使用第二溶剂之前，直到超滤浓缩物工艺步骤的实验设定点和工艺参数总结
表9在实验2、试验2a-2d中获得的蛋白质分离物的物理化学特性和功能特性
表10实施例2中使用的主要设备
实施例3
实施例3的目的是将现有技术(WO2013/013949A1)中所述的用于获得油菜籽蛋白质分离物的方法与根据本发明加工相同中间体(UF/DF步骤之后的蛋白质浓缩物)的方法进行比较。
起始材料是获自WILMAR GROUP Marek Wilczyński S.K.A.的脱皮油菜籽饼(DRC)(批号A-00#27)，其特性列于表11中。表12中列出了与STR装置中的萃取步骤有关的实验条件。
图4中示出了实施例3中应用的方法的示意图。
表13中示出了实施例3中获得的油菜籽蛋白质分离物的物理化学特性。表14中示出了实施例3中使用的主要设备。
实施例3中获得的样品中脂肪含量的比较清楚地表明，与现有技术(WO2013/013949A1)中描述的方法相比，使用第三溶剂(乙酸乙酯)的本发明方法具有优势。
证明了在根据本发明的方法获得的样品油菜籽蛋白质分离物2(0.22％DW)中的脂肪被有效去除，而在现有技术所述的方法获得的油菜籽蛋白质分离物1中脂肪含量高(5.73％DW)。
表11.实施例3中使用的获自GRUPA WILMAR Marek Wilczyński S.K.A的脱壳菜籽饼(DRC)的物理化学特性和功能特性。
表12.萃取步骤的工艺条件和参数设置总结
试验编号 1
工艺参数和设置
植物材料 脱皮油菜籽饼
原始材料粒径[μm] <1000
萃取温度(℃) 30
转速(RPM) 60
萃取时间(min) 60
装载的原始材料(g) 2000
第一溶剂-水的量(g) 10000
表13.根据现有技术(WO2013/013949A1)获得的油菜籽蛋白质分离物1和油菜籽蛋白质分离物2(EA＝＝乙酸乙酯用作第三溶剂)的物理化学特性和功能特性
*未分析，该方法中未使用EA
表14.实施例3中使用的主要设备
实施例中使用的分析方法的描述
用于表征植物原材料和蛋白质分离物的方法
蛋白质含量
根据AOCS官方方法991.20，用凯氏定氮法测定植物原材料和蛋白质分离物中的蛋白质含量。使用6.25的转化因子来确定蛋白质的量(wt％)。
干物质含量
将植物原材料样品(对于植物原材料为2.0±0.5g，对于蛋白质分离物为1.0±0.5g)置于温度为105℃的水分分析仪中。由干燥前后样品重量的差确定水分含量。
脂肪含量
根据Weibull-Stoldt方法测定脂肪含量。将样品(植物原材料和蛋白质分离物)用10％(v/v)HCl溶液水解并使用红外加热系统加热至300℃。在萃取系统中用石油醚萃取水解的样品。
脂肪含量(X)根据下式计算为wt％：
其中：
a是干燥后具有样品脂肪的玻璃样品管的质量(g)；
b是干燥后玻璃样品管的质量(g)；以及
c是样品的质量(g)。
酚类含量
酚类化合物的含量通过Siger et al.Oilseed Crops,2004,XXV,pp 263-274描述的Folin-Ciocalteu方法测定。在λ725nm处测量吸光度。
植酸含量
根据植酸(phytate)/总磷测定方法K-PHYTY 08/14，通过植酸(总磷)测定试剂盒Megazyme进行植酸含量分析。
碳水化合物含量
碳水化合物(仅糖)浓度是通过在碱性和高温介质中将糖和3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原成有色产物的化学反应来测定，如由G.L.Miller,Analytical Chemistry,1959,31,pp 426-428中所描述的。红棕色的强度用分光光度法在λ540nm处测量。实际碳水化合物含量来自以葡萄糖为标准的校准曲线。
氮溶解度(NS％)
通过将植物原材料样品(对于植物原材料而言，浓度为2wt％，对于蛋白质分离物而言，浓度为1wt％)溶于150mM NaCl中制备蛋白质溶液，并用0.1M HCl或0.1M NaOH将pH调节至7.0。将所得溶液在22℃下温育1h，同时剧烈振荡。随后，将样品在4000g下离心30min并收集所得上清液。通过凯氏定氮法(x6.25)分析上清液中的可溶性蛋白质含量和植物材料中的可溶性蛋白质。氮溶解度(NS％)定义为：
乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)
通过将蛋白质分离物(浓度为0.25wt％)溶解在样品管中的150mM NaCl中来制备蛋白质溶液。用0.1M HCl或0.1M NaOH将所得溶液的pH调节至7.0。将5g蛋白质溶液以450rpm振荡1h。随后，将溶液与5g油菜籽油在6000g下均质化5min，得到乳液。立即从样品管中取出50μl乳液并在7.5mL的0.1％SDS中稀释，随后涡旋。然后，使用分光光度计测定稀释物在λ500nm处的吸光度。10min后，重复吸光度测量。
EAI(m2/g)和ESI(min)定义为：
/>
其中
A0是均质化后立即稀释的乳液的吸光度；
ΔA是0和10分钟的吸光度差(A0–A10)；
t是时间间隔(10min)；
c是每体积蛋白质的重量[g/ml]；
是乳液的油体积分数；以及
N是稀释因子。
氨基酸分析
蛋白质分离物的氨基酸分析通过三种不同的水解方法进行：
1.根据M.G.Davis和A.J.Thomas,J.Agric.Food Agric.,1973,24,page1525中描述的方法进行蛋白质的酸性水解以确定氨基酸组成而无需氧化。
2.根据E.Schram,S.Moore,E.J.Bigwood,Biochem.J.,1954,57(1),pp 33-37中所述的方法进行蛋白质水解以分离含硫氨基酸。
3.根据P.K.Tyczkowska,Roczn.Technol.i Chemii />1974中描述的方法进行碱水解以确定色氨酸含量。
通过离子交换色谱法分离氨基酸。将柱依次加热至60℃和74℃。该仪器通过在波长440nm(对于脯氨酸)和570nm(对于所有其他氨基酸)的光度检测鉴定茚三酮衍生的氨基酸。
氨基酸分离后，用0.2M NaOH使柱再生。
尺寸排阻色谱法
以标准蛋白质(43000至669000Da)作为参考，蛋白质分离物通过尺寸排阻色谱法进行表征。将蛋白质分离物样品溶于洗脱剂50mM Tris-HCl，pH＝7.5，1M NaCl中。在AKTAavant SEC，Superdex175mL，16mm/100cm柱上，在25℃下使用等度洗脱和1.0ml/min的流速进行分离。使用220nm和280nm处的UV吸收进行蛋白质峰的检测。
乙酸乙酯含量
通过用己烷萃取，然后用火焰离子化检测器(GC-FID)分析的气相色谱法制备样品。使用毛细管柱Stabilwax-DA，30m x 0.25mm x 0.25μm)进行色谱分离，并使用进样器S/SL。检测器和进样器温度分别为250℃和200℃，注入体积为1μL，氦流量为1mL/min。烘箱温度在30℃保持5min，然后编程为115℃的最终温度，保持2分钟。氢气用作载气，流速为40mL/min，且合成空气流速为280mL/min，分流比为1:25。
乙醇含量
通过用去离子水萃取，然后用火焰离子化检测器(GC-FID)分析的气相色谱法制备样品。使用毛细管柱Stabilwax-DA，30m x 0.25mm x 0.25μm进行色谱分离，并且使用进样器PTV。检测器和进样器温度分别为250℃和200℃，注入体积为0.5μL，氦流量为1mL/min。烘箱温度在70℃下保持4min，然后编程为230℃的最终温度，保持15分钟。氢气用作载气，流速为40mL/min，合成空气流速为280mL/min，分流比为1:20。
用于表征粗萃取物(步骤b)中获得的第一液体级分)的方法
蛋白质含量
根据AOAC官方方法991.20(2005)，通过凯氏定氮法测定第一液体级分的蛋白质含量。使用6.25的转化因子来确定蛋白质的量(wt％)。
干物质含量
将第一液体级分的样品(2.0±0.5g)置于温度为105℃的水分分析仪中。由干燥前后样品重量的差确定水分含量。
脂肪含量
根据PN-ISO 2446:2010通过盖勃氏法(Gerber method)测定第一液体级分的脂肪含量。

Claims (17)

1.一种用于从植物材料制备蛋白质分离物的方法，其中所述植物材料包含基于干重10-50wt％的蛋白质，所述方法包括以下步骤：
a)压碎或粉碎所述植物材料以产生固体饼；
b)使用第一溶剂萃取步骤a)中获得的所述固体饼，以获得第一固体级分和第一液体级分的混合物，基于所述第一溶剂的总重量，所述第一溶剂包含至少90wt％的水；
c)将所述第一液体级分与所述第一固体级分分离；
d)由步骤c)中获得的所述第一液体级分制备蛋白质浓缩物，其中基于所述蛋白质浓缩物的总重量，所述蛋白质浓缩物包含50-90wt％的水，其中蛋白质溶解在所述第一溶剂中和/或其中蛋白质存在于第二固体级分中，其中基于所述浓缩物的总干重，所述浓缩物中的蛋白质含量为至少40wt％；
e)向步骤d)中获得的所述蛋白质浓缩物中添加第二溶剂，其中基于所述第二溶剂的总重量，所述第二溶剂包含至少90wt％的乙醇；
f)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤e)中获得的混合物分离成第二液体级分和第三固体级分，其中基于所述第三固体级分的总干重，所述第三固体级分的蛋白质含量为至少60wt％；
g)向步骤f)中获得的所述第三固体级分中添加第三溶剂，基于所述第三溶剂的总重量，所述第三溶剂包含至少90wt％的乙酸乙酯，其中选择所述第三溶剂的量使得整个液相不会分离成不同的液相；
h)使用选自由过滤、沉降、离心分离及其组合组成的组的技术将步骤g)中获得的混合物分离成第三液体级分和第四固体级分，其中基于所述第四固体级分的总干重，所述第四固体级分的蛋白质含量为至少90wt％；
i)使步骤h)中获得的所述第四固体级分进行选自由真空干燥、喷雾干燥、过热蒸汽干燥及其组合组成的组的技术以获得蛋白质分离物，其中基于所述蛋白质分离物的总干重，所述蛋白质含量为至少90wt％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前使用机械手段将所述植物材料至少部分脱脂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在使用机械手段的脱脂步骤中既不使用有机溶剂也不使用矿物溶剂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料包含基于干重至少5wt％的脂肪、油和脂质。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的所述萃取在低剪切条件下进行。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的所述第一溶剂是水或包含盐和任选地包含其他添加剂的水溶液。
7.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法在不使用具有6个或更多个碳原子的有机溶剂或矿物溶剂如己烷的情况下进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料选自由以下组成的组：蔬菜、水果、谷物及其组合。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质分离物包含基于干物质至少95wt％的植物性蛋白质。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质分离物包含基于干物质至少70wt％的天然植物性蛋白质。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料是植物原材料。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)之前使用冷压榨将所述植物材料至少部分脱脂。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料包含基于干重至少10wt％的脂肪、油和脂质。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料选自由以下组成的组：种子、豆科植物及其组合。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料选自由以下组成的组：含油种子，包括油菜籽、芥花籽、向日葵、红花和棉籽；豆类，包括大豆和其他豆类；豆科植物和豌豆，包括鹰嘴豆、红扁豆、绿扁豆、黄扁豆和棕扁豆，及其组合。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料选自由以下组成的组：含油种子，包括油菜籽、芥花籽、向日葵种子、亚麻籽、红花种子、棉籽及其组合。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物材料为油菜籽。
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