JP7161518B2 - 植物材料からの蛋白質の単離のための方法 - Google Patents
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Description
i) したがって、最初の抽出ステップのために用いる第1の水性溶媒の主成分は水であり、
ii) 第2の溶媒の主成分は、1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールの群に属し、
iii) 第3の溶媒の主成分は、室温で第2の溶媒に混和性であるが、第1の溶媒には部分的にのみ混和性である有機エステルの群に属する無極性溶媒である。
a) 植物材料を破砕又は微粉砕して、固体ケークを生成するステップ、
b) ステップa)において得た固体ケークを、第1の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の水を含む第1の溶媒を用いて抽出して、第1の固体画分と第1の液体画分との混合物を得るステップ、
c) 第1の固体画分から第1の液体画分を分離するステップ、
d) ステップc)において得た第1の液体画分から蛋白質濃縮物を製造するステップであって、蛋白質濃縮物は、蛋白質濃縮物の総重量を基準として50~90重量%の水を含み、蛋白質は第1の溶媒中に溶解しており、且つ/又は蛋白質は第2の固体画分中に存在し、濃縮物中の蛋白質含量が濃縮物の総乾燥重量を基準として少なくとも40重量%である、ステップ、
e) ステップd)において得た蛋白質濃縮物に第2の溶媒を加えるステップであって、第2の溶媒は、第2の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールを含む、ステップ、
f) ステップe)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第2の液体画分と第3の固体画分とに分離するステップであって、第3の固体画分の蛋白質含量が第3の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも60重量%である、ステップ、
g) ステップf)において得た第3の固体画分に、第3の溶媒を加えるステップであって、該第3の溶媒は、第3の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルを含み、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルは、室温において、第1の溶媒と少なくとも部分的に混和性であり、且つ第2の溶媒と完全に混和性であり、第3の溶媒の量は、全体としての液相が別個の液相に分離しないように選択される、ステップ、
h) ステップg)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第3の液体画分と第4の固体画分とに分離するステップであって、第4の固体画分の蛋白質含量が第4の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
i) 蛋白質単離物を得るために、ステップh)において得た第4の固体画分を、真空乾燥、噴霧乾燥、過熱水蒸気乾燥、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法に供するステップであって、蛋白質含量が蛋白質単離物の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
を含む。
本発明の一態様を以下に示す。
[発明1]
植物材料から蛋白質単離物を製造するための方法であって、前記植物材料が乾燥重量基準で10~50重量%の蛋白質を含み、
a) 植物材料を破砕又は微粉砕して、固体ケークを生成するステップ、
b) ステップa)において得た固体ケークを、第1の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の水を含む第1の溶媒を用いて抽出して、第1の固体画分と第1の液体画分との混合物を得るステップ、
c) 第1の固体画分から第1の液体画分を分離するステップ、
d) ステップc)において得た第1の液体画分から蛋白質濃縮物を製造するステップであって、蛋白質濃縮物が、蛋白質濃縮物の総重量を基準として50~90重量%の水を含み、蛋白質が第1の溶媒中に溶解しており、且つ/又は蛋白質が第2の固体画分中に存在し、濃縮物中の蛋白質含量が、濃縮物の総乾燥重量を基準として少なくとも40重量%である、ステップ、
e) ステップd)において得た蛋白質濃縮物に第2の溶媒を加えるステップであって、第2の溶媒が、第2の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールを含む、ステップ、
f) ステップe)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第2の液体画分と第3の固体画分とに分離するステップであって、第3の固体画分の蛋白質含量が、第3の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも60重量%である、ステップ、
g) ステップf)において得た第3の固体画分に、第3の溶媒を加えるステップであって、前記第3の溶媒が、第3の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルを含み、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルが、室温において、第1の溶媒と少なくとも部分的に混和性であり、且つ第2の溶媒と完全に混和性であり、第3の溶媒の量が、全体としての液相が別個の液相に分離しないように選択される、ステップ、
h) ステップg)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第3の液体画分と第4の固体画分とに分離するステップであって、第4の固体画分の蛋白質含量が、第4の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
i) 蛋白質単離物を得るために、ステップh)において得た第4の固体画分を、真空乾燥、噴霧乾燥、過熱水蒸気乾燥、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法に供するステップであって、蛋白質含量が、蛋白質単離物の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
を含む上記方法。
[発明2]
ステップa)の前に植物材料を、機械的手段を用いて、好ましくはコールドプレスを用いて、少なくとも部分的に脱脂する、発明1に記載の方法。
[発明3]
機械的手段を用いる脱脂ステップにおいて、有機溶媒もミネラル溶媒も用いない、発明2に記載の方法。
[発明4]
植物材料が乾燥重量基準で、少なくとも5重量%、好ましくは少なくとも10重量%の脂肪、油及び脂質を含む、発明1~3のいずれかに記載の方法。
[発明5]
ステップb)における抽出を低剪断条件下で実行する、発明1~4のいずれかに記載の方法。
[発明6]
ステップb)とc)との間に、ステップb)において得た第1の固体画分と第1の液体画分との混合物中に存在する脂肪、油及び脂質の少なくとも一部を、好ましくは遠心分離、濾過、又はこれらの組み合わせを用いて除去する、発明1~5のいずれかに記載の方法。
[発明7]
ステップc)における第1の固体画分から第1の液体画分の分離を、遠心分離、濾過、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて実行する、発明1~6のいずれかに記載の方法。
[発明8]
ステップd)において、非蛋白質成分の少なくとも一部を除去するために第1の液体画分を1つ若しくは複数の透析濾過ステップに供し、且つ/又は第1の液体画分を蒸発ステップに供する、発明1~7のいずれかに記載の方法。
[発明9]
ステップb)における第1の溶媒が、水である、又は塩を含み任意選択により更なる添加剤を含む水溶液である、発明1~8のいずれかに記載の方法。
[発明10]
1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、発明1~9のいずれかに記載の方法。
[発明11]
1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールがエタノールである、発明10に記載の方法。
[発明12]
ステップb)において用いる第1の溶媒対ステップe)において用いる第2の溶媒の重量比が1:10~1:1、好ましくは1:3~2:3である、発明1~11のいずれかに記載の方法。
[発明13]
ステップg)において用いる第3の溶媒中の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルが酢酸エチルである、発明1~12のいずれかに記載の方法。
[発明14]
ヘキサンなどの、6個以上の炭素原子を有する有機又はミネラル溶媒を用いずに実行する、発明1~13のいずれかに記載の方法。
[発明15]
0~50℃、好ましくは10~20℃の温度で実行する、発明1~14のいずれかに記載の方法。
[発明16]
5~8のpHで実行する、発明1~15のいずれかに記載の方法。
[発明17]
ステップf)の後且つステップg)の前の第3の固体画分を、第2の溶媒と第1の溶媒との混合物を用いる追加の洗浄ステップに、続いて固液分離ステップに供する、発明1~16のいずれかに記載の方法。
[発明18]
ステップh)の後且つステップi)の前の第4の固体画分を、第3の溶媒を用いた追加の洗浄ステップに、続いて固液分離ステップに供する、発明1~17のいずれかに記載の方法。
[発明19]
植物材料が、野菜、果実、種子、豆果、穀粒、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、発明1~18のいずれかに記載の方法。
[発明20]
植物材料が、ナタネ、アブラナ、ヒマワリ、ベニバナ及び綿実を含む脂肪種子、ダイズを含む豆類、並びに、ヒヨコマメ、赤、緑、黄及び茶レンズマメを含む他の豆、豆果及びエンドウ、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、発明1~19のいずれかに記載の方法。
[発明21]
植物材料が、ナタネ、アブラナ、ヒマワリ種子、亜麻仁、ベニバナ種子、綿実を含む脂肪種子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、植物材料が好ましくはナタネである、発明19に記載の方法。
[発明22]
蛋白質単離物が、乾物を基準として少なくとも95重量%の植物系蛋白質を含む、発明1~21のいずれかに記載の方法。
[発明23]
蛋白質単離物が、乾物を基準として少なくとも70重量%の天然の植物系蛋白質を含む、発明1~22のいずれかに記載の方法。
[発明24]
植物材料が未加工植物材料である、発明1~23のいずれかに記載の方法。
[発明25]
乾物を基準として、少なくとも70重量%の天然の植物系蛋白質、1重量%未満の炭水化物、0.2重量%未満のフェノール性化合物を含み、6個以上の炭素原子を有する有機溶媒又はミネラル溶媒を含まない、蛋白質単離物。
[発明26]
発明1~24のいずれかに記載の方法によって得られうる、蛋白質単離物。
[発明27]
乾物を基準として2重量%未満の脂肪、油及び脂質を含む、発明25又は26に記載の蛋白質単離物。
[発明28]
発明25~27のいずれかに記載の蛋白質単離物の、食品における使用。
本明細書において用いる「ミール」という用語は、小麦粉など、粉末形態における植物材料を指し、該植物材料は、ヘキサンなどの有機又はミネラル溶媒によって油又は脂質を抽出し、その後水蒸気で温めることによって該溶媒を除去することにより、これらの油又は脂質を実質的に欠いている。本明細書において用いる「ミネラル溶媒」という用語は、クラッキング、精製及び/又は精留のプロセスによって、石油又は瀝青炭のような化石堆積物から誘導された溶媒を指す。本明細書において用いる「植物材料」という用語は従来の意味を有し、野菜、果実、種子、豆果及び穀粒を包含する植物に由来する材料を指す。本明細書において用いる「未加工植物材料」という用語は従来の意味を有し、本発明による方法によって、粗製植物材料中に元々存在する蛋白質を含有する蛋白質単離物などの、新しく有用な生成物に変換することができる粗製植物材料を指す。本明細書において用いる「室温」という用語は、18~25℃の温度である。
a) 植物材料を破砕又は微粉砕して、固体ケークを生成するステップ、
b) ステップa)において得た固体ケークを、第1の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の水を含む第1の溶媒を用いて抽出して、第1の固体画分と第1の液体画分との混合物を得るステップ、
c) 第1の固体画分から第1の液体画分を分離するステップ、
d) ステップc)において得た第1の液体画分から蛋白質濃縮物を製造するステップであって、蛋白質濃縮物は、蛋白質濃縮物の総重量を基準として50~90重量%の水を含み、蛋白質は第1の溶媒中に溶解しており、且つ/又は蛋白質は第2の固体画分中に存在し、濃縮物中の蛋白質含量が濃縮物の総乾燥重量を基準として、少なくとも40重量%、好ましくは少なくとも50重量%である、ステップ、
e) ステップd)において得た蛋白質濃縮物に第2の溶媒を加えるステップであって、第2の溶媒は、第2の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールを含む、ステップ、
f) ステップe)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第2の液体画分と第3の固体画分とに分離するステップであって、第3の固体画分の蛋白質含量が第3の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも60重量%である、ステップ、
g) ステップf)において得た第3の固体画分に、第3の溶媒を加えるステップであって、該第3の溶媒は、第3の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルを含み、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルは、室温において、第1の溶媒と少なくとも部分的に混和性であり、且つ第2の溶媒と完全に混和性であり、第3の溶媒の量は、全体としての液相が別個の液相に分離しないように選択される、ステップ、
h) ステップg)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第3の液体画分と第4の固体画分とに分離するステップであって、第4の固体画分の蛋白質含量が第4の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
i) 蛋白質単離物を得るために、ステップh)において得た第4の固体画分を、真空乾燥、噴霧乾燥、過熱水蒸気乾燥、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法に供するステップであって、蛋白質含量が蛋白質単離物の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
を含む。
a) STR中で混合すること、
b) 充填床として固定化された、破砕又は微粉砕された植物材料を、充填床に浸透した第1の溶媒と接触させること、
c) 破砕又は微粉砕された植物材料を、上方に流動している第1の溶媒に懸濁させることによって接触させること、
d) 破砕又は微粉砕された植物材料を、重力及び/又は遠心力の作用によって第1の溶媒中に沈殿させることによって、第1の溶媒と接触させること、
などの、懸濁又は分散した固相と第1の溶媒の連続液相との間の物質移動を促進するのに好適な、任意の技法によって達成されうる。
ナタネミールから蛋白質単離物を製造する3つの実施(1a、1b及び1c)を実行した。
1. すべての実験の前に、粉砕機においてナタネのミール又はケークを微粉砕してふるい分けし、必要な粒子サイズ(1000μm未満)を有するナタネ固体ケークを作製した。ナタネ固体ケークの特徴については表3を参照されたい。
2. このように前処理した微粉砕ナタネ固体ケークを、塩水溶液(2重量%のNaCl及び0.1重量%のNa2SO3)である第1の溶媒に加え、パドルを用いて穏やかに均一化させ、懸濁液を得た。第1の溶媒対前処理した微粉砕ナタネの重量比は4であった(正確な量については表1を参照されたい)。
3. 体積の最大5%の第1の溶媒を予備投入したALSEOSカラムに、懸濁液を装填した。カラムの作用空間全体(カラム体積、CV)が満たされたとき、カラムをめぐる第1の溶媒の流動を開始した。ALSEOS 7Lシステムの模式図を図1に与える。ALSEOSの動作原理は、WO2016/093698A2において説明されており、参照によって本明細書に組み込まれる。
4. 第1の溶媒のALSEOS装置への流動、及びALSEOS装置からの濾液(=粗抽出物、=第1の液体画分)の流出を、蠕動ポンプによって制御した。粗抽出物(第1の液体画分)を別の容器に捕集した。合計で約23Lの粗抽出物を捕集した。正確な量及びプロセスパラメータについては表1を参照されたい。抽出中のpHは調整しなかった。
5. 続くステップにおいて、粗抽出物をサンプル採取し、乾物含量、総合蛋白質含量、及び脂肪含量について分析した。粗抽出物の特徴については表3を参照されたい。
6. 一定分量のステップ4)において得た粗抽出物のアリコートを遠心分離(4000g、30分、10℃)し、存在する場合、上部軽相として脂質の残留物、及び重ペレット相として存在する固体デブリの残留物を、清澄化抽出物から分離した。遠心分離後、水相として清澄化抽出物が存在した。遠心分離した清澄化抽出物(第1の液体画分)の特徴については表3を参照されたい。
7. ステップ6)において得た遠心分離後の清澄化抽出物を、UF(限外濾過)法(ポリスルホン膜、フィルタ表面積:0.042m2、カットオフ:0.1μm、交差TMP:1.5bar)を実施するために、TFF(タンジェンシャルフロー濾過)システムに装填し、主としてクルシフェリン蛋白質を含有する蛋白質濃縮物、及び膜を通過することができる蛋白質画分を含有するUF透過液を得た。UF蛋白質濃縮物(保持液)及びUF透過液の特徴については、表3を参照されたい。
8. ステップ7)において得た蛋白質濃縮物を、STR(体積5L、2~8℃の温度において撹拌下、追加時間10~15分、続いて磁気撹拌機による撹拌下、10分のインキュベーション時間)において、96体積%エタノール(Honeywell Specialty Chemicals Seelze GmbHによる供給)である第2の溶媒による精製ステップに供した。第2の溶媒を、蛋白質濃縮物の重量の1.85倍に等しい量で適用した。続いて、混合物を遠心分離(4000g、30分、10℃)によって分離し、第3の固体画分(粗製)及び第3の液体画分(粗製)を得た。
9. 続いて、ステップ8)において得た第3の固体画分(粗製)を、5:1の液体対固体の重量比において、第2の溶媒(混合物の70体積%)と水(混合物の30体積%)との混合物を用いて、STR(体積5L、2~8℃の温度において撹拌下、追加時間10~15分、続いて磁気撹拌機による撹拌下、10分のインキュベーション時間)中の第3の固体画分に、第2の溶媒と水との混合物を加えることによって、追加の洗浄ステップに供した。続いて、混合物を遠心分離(4000g、30分、10℃)によって分離し、洗浄された第3の固体画分及び第3の液体画分を得た。
10. 続いて、ステップ9)において得た洗浄された第3の固体画分を、STR(体積5L、2~8℃の温度において撹拌下、追加時間10~15分、続いて磁気撹拌機による撹拌下、10分のインキュベーション時間)中の洗浄された第3の固体画分に、酢酸エチル(CAS:141-78-6、供給業者:Stanlab J.、純度グレード:分析試薬グレード)である第3の溶媒を加えることによって、1:5の液体対固体の重量比において実施される第3の溶媒による精製ステップに供した。続いて、混合物を遠心分離(4000g、30分、10℃)によって分離し、第4の固体画分(粗製)及び第4の液体画分(粗製)を得た。
11. 続いて、ステップ10)において得た第4の固体画分(粗製)を、第3の溶媒を用いて、ステップ10)に記載した方法による追加の洗浄ステップに供した。続いて、混合物を遠心分離(4000g、30分、10℃)によって分離し、洗浄された第4の固体画分及び第4の液体画分を得た。
12. 続いて、ステップ11)において得た洗浄された第4の固体画分を、40℃におけるオーブン中、トレイ上で終夜乾燥させ、乳鉢中、乳棒によって粉砕し、ふるい分けし、粉末形態における蛋白質単離物を得た。
13. ステップ12)において得た蛋白質単離物を、乾物、蛋白質、脂肪、炭水化物(単糖)、ポリフェノール性化合物、及びフィタート含量について分析した(表4参照)。ステップ12)において得た蛋白質単離物を、窒素溶解度及び乳化活性などの機能的特性の観点からも試験した(表4参照)。更に、蛋白質単離物中のアミノ酸組成を評価した(表5参照)。それに加えて、サイズ排除クロマトグラフィーを実行し、存在する蛋白質成分の分子サイズを評価した。図3a、3b及び3cはそれぞれ、実施1a、1b及び1cにおいて得た蛋白質単離物のSECクロマトグラムを示す。SECを用いて、高分子量ポリペプチド(ピーク1、約100分)を低分子量ポリペプチド(ピーク2、約140分)から分離した。高分子量ポリペプチド含有蛋白質であるクルシフェリン140~150kDa(7S)はピーク1として、残りのナピン(画分:26~28kDa)はピーク2として溶出した。蛋白質単離物の構造、アミノ酸組成及び分子サイズのより詳細な調査によれば、得られた蛋白質単離物の主な蛋白質成分は、Svedbergスケールの分類7Sに対応する148+/-10kDの分子サイズを有することを示し、これは得られた蛋白質単離物の主な蛋白質成分が、植物のアブラナ科に存在する貯蔵タンパク質であり、グロブリンのクラスに属する天然クルシフェリンのサブユニットであることを示す。プロセスの模式図を図2に与える。
実施1a、1b及び1cにおいて用いたナタネ供給源材料は、NS%が異なっていた。最も低いNS%(25%)は市販のナタネミール(実施1c)について得られ、最も高いNS(59.9%)はコールドプレスしたナタネケーク(実施1b)について得られた。
蛋白質単離物を4つの異なる供給源から製造した4つの実施(2a、2b、2c及び2d)を、下に記載するプロトコルを適用して、本発明の方法により実行した。
a) 抽出媒体:水、2%NaCl、0.1%Na2SO3
b) 温度:15℃
c) 抽出のpH:自然
d) 抽出物の目標体積 14kg(2CV)
e) 媒体の目標流速:3.5kg/h、到達できない場合は調整可能
f) 抽出時間:4時間
2. 遠心分離
a) 時間 30分
b) 温度 4℃
c) 相対遠心力 4000G
3. UF/DF
a) カットオフ膜:10kDa
b) 材料繊維:PS
c) 膜面積:0.12m2
d) 繊維i.d.1mm、カートリッジ長 33cm、 Cat.No.GE UFP-10-E-5A
4. EtOHステップ1
a) 96%EtOH- 1.85×UF/DF濃縮物の量(w/w)
b) 投与時間- 10分
c) インキュベーション時間- 10分
5. EtOHステップ2
a) 70%EtOH- 5×湿潤蛋白質沈殿
b) 投与時間- 10分
c) インキュベーション時間- 10分
6. EAステップ
a) EA-酢酸エチル- 5×EtOHステップ2の後の湿潤蛋白質沈殿
b) 投与時間- 素早く1回で投与
c) インキュベーション時間- 30分
7. 乾燥
a) 時間:24~48時間
b) 温度:50℃
c) 真空乾燥機内の圧力:10mbar
例3の狙いは、先行技術(WO2013/013949A1)において記載されているナタネ蛋白質単離物を得るための方法と、同じ中間生成物(UF/DFステップ後の蛋白質濃縮物)を加工する本発明による方法とを比較することであった。
未加工植物材料及び蛋白質単離物を特性評価するために用いた方法
蛋白質含量
未加工植物材料及び蛋白質単離物の蛋白質含量を、AOCS991.20公式法に従い、ケルダール法によって決定した。6.25の換算係数を用いて、蛋白質の量(重量%)を決定した。
未加工植物材料のサンプル(未加工植物材料については2.0±0.5g、蛋白質単離物については1.0±0.5g)を105℃の温度において、水分分析装置に載置した。乾燥前後のサンプル重量における差から、水分含有量を決定した。
Weibull-Stoldt法によって脂肪含量を決定した。10%(v/v)HCl溶液によってサンプル(未加工植物材料及び蛋白質単離物)を加水分解し、赤外線加熱システムを用いて300℃に加熱した。抽出システムにおいて、加水分解サンプルを石油エーテルによって抽出した。
によって計算し、
式中、
aは乾燥後のサンプル脂肪を含むガラスサンプルチューブの質量(g)であり;
bは乾燥後のガラスサンプルチューブの質量(g)であり;及び
cはサンプルの質量(g)である。
フェノール性化合物の含量を、Sigerら、脂肪種子作物(Oilseed Crops)、2004、XXV、263~274頁に記載されているように、フォリン-チオカルト法によって決定した。λ725nmにおける吸光度を測定した。
フィチン酸(フィタート)/総リンアッセイ手順K-PHYTY 08/14に従い、Megazymeのフィチン酸(総リン)アッセイキットによって、フィタート含量分析を行った。
炭水化物(単糖)濃度を、G.L.Miller、分析化学(Analytical Chemistry)、1959、31、426~428頁に記載されているように、アルカリ性且つ高温の媒体における還元糖と3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)との呈色生成物への化学反応によって決定した。λ540nmにおいて、分光光度的に赤褐色の強度を測定した。実際の炭水化物含量は、標準としてグルコースを用いた検量線から導出した。
未加工植物材料をサンプル(植物材料については2重量%の、蛋白質単離物については1重量%の濃度)において150mM NaCl中に溶解させることによって蛋白質溶液を製造し、0.1M HClによって、又は0.1M NaOHによってpHを7.0に調節した。得られた溶液を激しく振とうしながら、22℃において1時間インキュベーションした。続いて、サンプルを4000gにおいて30分遠心分離し、得られた上澄みを捕集した。上澄みの溶解性蛋白質含有量及び植物材料中の溶解性蛋白質を、ケルダール法(×6.25)によって分析した。窒素溶解度(NS%)は
として規定した。
蛋白質単離物(0.25重量%の濃度)をサンプルチューブ中の150mM NaClに溶解させることによって、蛋白質溶液を製造した。得られた溶液のpHを、0.1M HCl又は0.1M NaOHによって7.0に調節した。5gの蛋白質溶液を、450rpmにおいて1時間振とうした。続いて、溶液を5gのナタネ油と、6000gにおいて5分均一化させ、乳化させた。50μlのエマルションをサンプルチューブから直ちに取り、7.5mLの0.1%SDS中に希釈した後、ボルテックスした。次いで、希釈液のλ500nmにおける吸光度を、分光光度計を用いて決定した。10分後、吸光度測定を繰り返した。
として規定し、
式中、
A0は均一化直後の希釈エマルションの吸光度であり;
ΔAは0分と10分の間の吸光度の差(A0-A10)であり;
tは時間の間隔(10分)であり;
cは体積当たりの蛋白質の重量[g/ml]であり;
はエマルションの油の体積部分であり;及び
Nは希釈倍数である。
3つの異なる加水分解法によって、蛋白質単離物のアミノ酸分析を実行した。
1. 酸化していないアミノ酸組成を決定するために、M. G. Davis及びA. J. Thomas、J. Agric. Food Agric.、1973、24、1525頁に記載されている方法によって、蛋白質の酸性加水分解を実施した。
2. 含硫アミノ酸を分離するために、E. Schram、S. Moore、E. J. Bigwood、Biochem. J.、1954、57(1)、33~37頁に記載されている方法によって、蛋白質の加水分解を実施した。
3. トリプトファン含有量を決定するために、P. Slawinski、K. Tyczkowska、Roczn. Technol. i Chemii Zywn.、1974に記載されている方法によって、アルカリ性加水分解を実施した。
参照として標準蛋白質(43000~669000Da)を備えるサイズ排除クロマトグラフィーによって、蛋白質単離物を特性評価した。蛋白質単離物サンプルを、溶出液50mM Tris-HCl、pH=7.5、1M NaClに溶解させた。AKTA avant SEC、Superdex 200Å、175mL、16mm/100cmカラムで、25℃において、定組成溶出及び1.0ml/分の流速を用いて、分離を実行した。蛋白質ピークの検出は、220及び280nmにおけるUV吸収を用いて実行した。
ヘキサンによる抽出によってサンプルを製造した後、水素炎イオン化型検出器(GC-FID)によってガスクロマトグラフィー分析を行った。キャピラリカラム(Stabilwax-DA、30m×0.25mm×0.25μm)を用い、注入器S/SLを用いてクロマトグラフィー分離を実行した。検出器及び注入器の温度はそれぞれ250及び200℃であり、注入体積1μL、1mL/分のヘリウムフローであった。オーブンの温度を30℃において5分維持し、次いで2分保持される115℃の最終温度にプログラムした。キャリアガスとして40mL/分の流速における水素を用い、総合空気流速は280mL/分であり、スプリット比は1:25であった。
脱イオン水による抽出によってサンプルを製造した後、水素炎イオン化型検出器(GC-FID)によってガスクロマトグラフィー分析を行った。キャピラリカラム(Stabilwax-DA、30m×0.25mm×0.25μm)を用い、注入器PTVを用いてクロマトグラフィー分離を実行した。検出器及び注入器の温度はそれぞれ250及び200℃であり、注入体積0.5μL、1mL/分のヘリウムフローであった。オーブンの温度を70℃において4分維持し、次いで15分保持される230℃の最終温度にプログラムした。キャリアガスとして40mL/分の流速における水素を用い、総合空気流速は280mL/分であり、スプリット比は1:20であった。
蛋白質含量
第1の液体画分の蛋白質含量を、AOAC公式法991.20(2005)に従い、ケルダール法によって決定した。6.25の換算係数を用いて、蛋白質の量(重量%)を決定した。
第1の液体画分のサンプル(2.0±0.5g)を、105℃の温度において、水分分析装置に載置した。乾燥前後のサンプル重量における差から、水分含有量を決定した。
第1の液体画分の脂肪含量を、PN-ISO 2446:2010に従い、ゲルベル法によって決定した。
Claims (17)
- 植物材料から蛋白質単離物を製造するための方法であって、前記植物材料が乾燥重量基準で10~50重量%の蛋白質を含み、
a) 植物材料を破砕又は微粉砕して、固体ケークを生成するステップ、
b) ステップa)において得た固体ケークを、第1の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の水を含む第1の溶媒を用いて抽出して、第1の固体画分と第1の液体画分との混合物を得るステップ、
c) 第1の固体画分から第1の液体画分を分離するステップ、
d) ステップc)において得た第1の液体画分から蛋白質濃縮物を製造するステップであって、蛋白質濃縮物が、蛋白質濃縮物の総重量を基準として50~90重量%の水を含み、蛋白質が第1の溶媒中に溶解しており、且つ/又は蛋白質が第2の固体画分中に存在し、濃縮物中の蛋白質含量が、濃縮物の総乾燥重量を基準として少なくとも40重量%である、ステップ、
e) ステップd)において得た蛋白質濃縮物に第2の溶媒を加えるステップであって、第2の溶媒が、第2の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールを含む、ステップ、
f) ステップe)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第2の液体画分と第3の固体画分とに分離するステップであって、第3の固体画分の蛋白質含量が、第3の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも60重量%である、ステップ、
g) ステップf)において得た第3の固体画分に、第3の溶媒を加えるステップであって、前記第3の溶媒が、第3の溶媒の総重量を基準として少なくとも90重量%の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルを含み、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルが、室温において、第1の溶媒と少なくとも部分的に混和性であり、且つ第2の溶媒と完全に混和性であり、第3の溶媒の量が、全体としての液相が別個の液相に分離しないように選択される、ステップ、
h) ステップg)において得た混合物を、濾過、沈降、遠心分離、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を用いて、第3の液体画分と第4の固体画分とに分離するステップであって、第4の固体画分の蛋白質含量が、第4の固体画分の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
i) 蛋白質単離物を得るために、ステップh)において得た第4の固体画分を、真空乾燥、噴霧乾燥、過熱水蒸気乾燥、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法に供するステップであって、蛋白質含量が、蛋白質単離物の総乾燥重量を基準として少なくとも90重量%である、ステップ、
を含む上記方法。 - 植物材料が未加工植物材料である、請求項1に記載の方法。
- ステップa)の前に植物材料を、機械的手段を用いて、少なくとも部分的に脱脂する、請求項1又は2に記載の方法。
- 機械的手段がコールドプレスである、請求項3に記載の方法。
- 機械的手段を用いる脱脂ステップにおいて、有機溶媒もミネラル溶媒も用いない、請求項3又は4に記載の方法。
- 植物材料が乾燥重量基準で、少なくとも5重量%の脂肪、油及び脂質を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 植物材料が乾燥重量基準で、少なくとも10重量%の脂肪、油及び脂質を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)における抽出を低剪断条件下で実行する、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)における第1の溶媒が、水である、又は塩を含み任意選択により更なる添加剤を含む水溶液である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 1~5個の炭素原子を有し室温で水に混和性であるアルコールがエタノールである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップg)において用いる第3の溶媒中の、最大5個の炭素原子を有する無極性且つ親油性の有機エステルが酢酸エチルである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- ヘキサンなどの、6個以上の炭素原子を有する有機又はミネラル溶媒を用いずに実行する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 植物材料が、野菜、果実、脂肪種子を含む種子、ダイズ及び他の豆を含む豆類、豆果、ヒヨコマメ、赤、緑、黄及び茶レンズマメを含むエンドウ、穀粒、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 植物材料が、ナタネ、アブラナ、ヒマワリ種子、亜麻仁、ベニバナ種子、綿実を含む脂肪種子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 蛋白質単離物が、乾物を基準として少なくとも95重量%の植物系蛋白質を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 蛋白質単離物が、乾物を基準として少なくとも70重量%の天然の植物系蛋白質を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
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