CN110878299A - 一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法 - Google Patents
一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法。本发明的克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，包括步骤：1)选取细菌一；2)扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因引物采用第一简并引物，模板为细菌一的基因组；3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得其的完整异戊烯转移酶的基因序列；4)根据亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，扩增细菌一的完整异戊烯转移酶基因，模板为细菌一的基因组；5)按照该方法依次得到多个细菌的完整异戊烯转移酶基因，建构异戊烯转移酶基因家族成员群。本发明的方法能够获取大量的异戊烯转移酶基因家族成员。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法。
背景技术
异戊烯转移酶是他汀类药物生产的重要催化剂，获取异戊烯转移酶基因家族成员群能为异戊烯转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。目前，克隆异戊烯转移酶基因家族成员的方法是首先在基因库中寻找异戊烯转移酶基因序列，然后根据异戊烯转移酶基因序列设计引物克隆异戊烯转移酶基因；这种方法获取的异戊烯转移酶基因十分有限，仅局限于基因库中已公开的异戊烯转移酶基因，不能获取未公开在基因库中异戊烯转移酶基因，不能全面获取异戊烯转移酶基因家族成员。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，能够获取大量的异戊烯转移酶基因家族成员，为异戊烯转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。
为实现上述目的，本发明所设计的克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，包括步骤：
(1)选取细菌一；
(2)利用PCR技术扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；
(3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶的基因序列；
(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，利用PCR技术扩增细菌一的完整异戊烯转移酶基因，该步骤的PCR扩增技术中引物为第二简并引物，模板为细菌一的基因组DNA；
(5)再选取细菌二，按照上述步骤(2)至步骤(4)的方法获取细菌二的完整异戊烯转移酶基因，按照该方法依次得到多个细菌的完整异戊烯转移酶基因，建构异戊烯转移酶基因家族成员群。
作为优选方案，所述步骤2)和步骤4)中PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液5μl、25mmol/L Mgso4 2μl、10mmol dNTP 5μl、10nmol/L引物各1μl、模板80ng、KoD-Plus DNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
本发明的优点在于：本发明利用第一简并引物克隆出细菌一异戊烯转移酶基因的部分碱基序列，将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对获得亲缘关系最近的菌种并确定亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因的序列，根据该异戊烯转移酶基因的序列设计第二简并引物，利用第二简并引物和基因组DNA，扩增得到细菌一的完整异戊烯转移酶基因基因。采用这种方法能得到大量的完整异戊烯转移酶基因序列，相比于基因库中的异戊烯转移酶基因，本发明能得到基因库中未公开的异戊烯转移酶基因，显著增加了异戊烯转移酶基因的种类，为异戊烯转移酶研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。
附图说明
图1为Cryobacterium sp.GCJ06细菌的部分异戊烯转移酶基因的核酸电泳图；
图2为Cryobacterium sp.GCJ06细菌的完整异戊烯转移酶基因的和核酸电泳图；
图3为重组表达质粒pET21a-AKR构建示意图；
图4为4个菌种的异戊烯转移酶基因碱基序列比对图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
克隆异戊烯转移酶基因家族成员的方法，包括步骤：
(1)选取细菌一：细菌Cryobacterium sp.GCJ06；
(2)利用PCR技术扩增Cryobacterium sp.GCJ06细菌的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；
2.1)第一简并引物碱基序列的设计过程：
利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，以“Al/ketoreductase”为检索词，进行“Nucleotide”及“Protein”检索，获得多条多条异戊烯转移酶基因蛋白序列及编码基因序列，分别下载蛋白氨基酸序列，并进入Identical Proteins引导界面中CDSRegion inNucleotide下载相对应核酸序列，为了避免赘述，本发明仅罗列Cryobacteriumsp.MLB-32、Cryobacterium roopkundense、Agromyces sp.Leaf222、marineactinobacterium PHSC20C1 4个菌种的异戊烯转移酶基因碱基序列，需要说明的是，本发明实际进行了10个以上的菌种的异戊烯转移酶碱基序列对比，以确保得到的保存序列的准确性。
Cryobacterium sp.MLB-32的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQID NO.3所示，Cryobacterium roopkundense的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQ ID NO.4所示，Agromyces sp.Leaf222 contig_1的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQ ID NO.5所示，marine actinobacteriumPHSC20C1的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQ ID NO.6所示；将上述4条异戊烯转移酶基因碱基序列进行比对，如图4所示，图4中框线中为4条异戊烯转移酶基因碱基序列的高度保守序列。
根据高度保守序列设计得到第一简并引物，第一简并引物的上游引物：CG GGATCCAGC TGG RTS AAY ACV GC；下游引物：G GAATTC RTC YTG MAC VGC NCC GAA。引物碱基序列中“S”＝C/G、“R”＝A/G、“N”＝A/C/G/T、“Y”＝C/T和“V”＝A/C/G“M”＝A/C。
2.2)提取细菌的基因组DNA作为模板：
细菌的基因组DNA按照常规细菌基因组DNA操作进行，提取细菌的基因组DNA属于分子生物领域的常规技术手段，在此不再赘述。
2.3)PCR扩增
PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液5μl、25mmol/L Mgso4 2μl、10mmol dNTP 5μl、10nmol/L第一简并引物(上游引物和下游引物)各1μl、模板80ng、KoD-Plus DNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将如图1所示的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由ABI3100测序仪完成。测序后获得部分异戊烯转移酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。
(3)获得与Cryobacterium sp.GCJ06细菌亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列：
将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对获得亲缘关系最近的菌种并确定与Cryobacterium sp.GCJ06细菌亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因的序列。
具体为，将SEQ ID NO.7的序列进行BLAST比对，通过比对后获得亲缘关系细菌Cryobacterium arcticum strain PAMC 27867，Cryobacterium arcticum strain PAMC27867的完整异戊烯转移酶基因序列如SEQ ID NO.8所示。
(4)克隆Cryobacterium sp.GCJ06细菌的完整异戊烯转移酶基因序列。
(4.1)根据步骤(3)Cryobacterium arcticum strain PAMC 27867的完整异戊烯转移酶基因序列(SEQ ID NO.8)设计第二简并引物，利用PCR技术扩增未知细菌的完整异戊烯转移酶基因，该步骤的PCR扩增技术中引物为第二简并引物，模板为Cryobacteriumsp.GCJ06的基因组DNA。
第二简并引物的序列(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)：上游引物：CGGGATCCTAGAAGGGCAGCAGCGGGTCG，下游引物：GGAATTCGATACCGCCGAACAGACGCCCACC。
(4.2)PCR扩增
采用聚合酶链式方应(PCR)扩增得到Cryobacterium sp.GCJ06的完整异戊烯转移酶基因(如SEQ ID NO.11)，结合图2所示，完整异戊烯转移酶基因的琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，并将其克隆入商业化质粒pET21a(+)中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cgggatccag ctggrtsaay acvgc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggaattcrtc ytgmacvgcn ccgaa 25
<210> 3
<211> 894
<212> DNA
<213> Cryobacterium sp. MLB-32 c2
<400> 3
atgcgtgaat ccaccctgct ctggaaaatc cgccaggtgg cactctcctc gcgtcccctc 60
agctgggtca acacggcctt ccctttcgcg gcggcctact tcatcaccac cgggcgagtc 120
gacttcatgt ttctggtcgg gaccctattt ttcttgatcc cgtacaacct cgtgatgtac 180
ggcatcaacg atgtcttcga ttatgagtcc gaccttcgaa atccacgcaa gggcggtgtc 240
gagggcgccc tgctcgcacc gtcaatgcat cgacccgtga tcgccgccgg gatcgtcacg 300
gcggttccgc tgatcgcagt gatgctcgtt atgggcggca ccgcacaccc attgtcatgg 360
gcggccctgg ccgtgagcct ctttttcgtc gtcgcctatt ccgtgccggg gctgcggttc 420
aaggagcgac cggggctcga ttcgatcacc tcgagcattc attttgtgag tccggcggtg 480
tacgccctgc tcgtgaccgg ggccgcattc accaccggcc tctgggcgct gctcgctgcc 540
ttcttgctgt ggggcatggc cagtcacgcc ttcggagcgg tgcaagacgt cacccccgat 600
cgtgacgccg gtatttcctc cgtggctacc gtcctcggtg ctgcacacac ggtacgcctc 660
gccatcggtc tatggacgtt ggccggactg ctgatgttgc tgacacggtg gccgggcccg 720
atcgctgcga ttcttgtgct cccgtatatc atcgctgctc tcccctactg gtcggtcacc 780
gatgacaggg cggacctggc caaccgcggc tggaaacatt tcctctggct caatttcttc 840
acgggattcg tcgtcaccct gctcctgctc ggatggtccg ggctgagggc ataa 894
<210> 4
<211> 900
<212> DNA
<213> Cryobacterium roopkundense
<400> 4
gtgcagaaag ctaaatcgac cgtgggctgg cgggcccgcc aggtcgttct gtcgtcccgt 60
cccctcagct ggatcaacac ggcgtttccg ttcgctgccg cctatctgat gacaaccggg 120
cgcatagacg cactgttcgt cgtgggcacc ctcttcttcc tgattcccta caaccttttg 180
atgtacggca tcaacgacgt gttcgactac gagtcggacc tccgcaatcc gcgtaagggc 240
ggcgcccagg gcgcactgct ggcccccgaa cttcaccggc ttgtgatcac gtctggaatt 300
gtgaccgccg caccgttgat cgcggccatg ctcgttctgg ccggcccggc gcatgctctc 360
tcgtggctgg tcctggccct gagcctcttc ttcgtggtgg cctattcagt tccggggctg 420
agattcaaag agcgacccgg actcgattcg gtcacctcca gcattcactt cgtgagcccg 480
gccgtatacg gattgctcgt ggccggggct gcgttcgatg acagcctgta cgccctgctc 540
ctcgccttct ttttctgggg catggccagt cacgccttcg gggccgtgca ggacgtcaca 600
cccgatcgtg acgccgggat tgcgtcagtt gccactgccc tcggcgcggc gaccacggtg 660
cgtctcgccg tgctgctgtg gactctggcg ggagcgctga tactcctcac tcggtggccc 720
ggtccgatcg ccgcgatcct ggtgctcccg tacattatcg ccgcgctgcc tcattggtcg 780
gtcaccgacg atcgctcgga ccgggccaac cgcgggtgga agcattttct ctggctgaat 840
ttcttcagcg gattcgttgt caccatgctg ctcatcgggt gggtcggtct gaacgcgtag 900
<210> 5
<211> 879
<212> DNA
<213> Agromyces sp. Leaf222
<400> 5
atgggttcgc gcgtcgcgca ggtgctcgtc tcgtcgcgac cgatcagctg gatcaacacg 60
gcgttcccgt tcgcggccgc gtacctgctg accgcgggca ccgtcgacgt cacgttcgtc 120
gtcggcacgc tcttcttcct cgtgccgtac aacctgctga tgtacggcgt gaacgacgtg 180
ttcgactacg agtccgacct gcgcaatccc cgcaagggcg gcgccgaggg cgcgctgctc 240
gacccgtcgc tgcatcgcac ggtggtctgg gcgggcatcg ccacggccgc cccgtgcctc 300
gtcgtgatgc tgtggtcggc gggcgcgggg catccgtggt cctggttcgt gctcgccgtg 360
agtctcttcg cggtcttcgc gtactccgtg cccgggttgc gcttcaagga gcggccggtg 420
ctcgactcga tcacctcgag cttccacttc gtgagcccgg cgatctacgg actcgcggtc 480
gcgggagcgg tggcgacgcc ccagctcgcc gcgctgctca cggcgttctt ctgctggggc 540
atggcgagcc atgcgttcgg cgccgtgcag gacgtcgtgc ccgaccggga ggccggcatc 600
gcgtcgatcg cgaccgcgtt cggcgctcgg gcgaccgtgc gcgtcgcgct cgcgctctgg 660
gcgctcgccg gactgctcat gctcgcgacc gagtggcccg ggccgctcgg ggccgtgctc 720
gccgtgccct acctcgtggt cgtgtggccg ttccggtcga tcgacgacgc gcactccggc 780
gaggcgaacc gcggctggcg gcacttcatc gccctgaact acgcggtcgg attcctcgtg 840
acgatgctgc tcatctggtg ggcggccgtt cgcgcgtag 879
<210> 6
<211> 858
<212> DNA
<213> Marine actinobacterium PHSC20C1
<400> 6
gtgattaggg atctcctgct ttcctcgcgg ccgctgagct gggtgaatac ggcctttccc 60
ttcgccgcgg cctactactt gacgacgggc cagatcgatc tcacgttcgt gctcggcact 120
atcttcttcc tcgtgccata caacctcgcg atgtatggaa tcaacgatgt cttcgactac 180
gagtcagatc ttcgcaaccc gcgcaagggt ggcgtcgagg gcgctctact cgaccctcgg 240
atgcaccggc caaccctcat cgctggagcg gtgacaacgc tcccctttat tggctatctc 300
gttatcgtcg gcggcccgct gtcgtggctc gtgctgctca taagtatgtt tgccgttgtt 360
gcctattctg cgaaaggact gcggttcaaa gagcgcccat tcttggattc gctcacgtcg 420
agcactcact tcgtttcgcc agcggtctat gcgcttgttc tcaccggggc gatgtggacg 480
ccgcaactta ttgcggtact cgccgccttc ttcctgtggg gaatcgcatc gcatgcattc 540
ggggctgttc aggatgtctt agccgaccgt gcggcacaga tagcgtcgat cggtacggta 600
atcggcgctc gtgccacgac ccgtttcgcg gtactggcct accttgcagg cggagtgcta 660
ttgctattct ctgcgtggcc gggcccgttg gcatccattc ttgtcttgcc gtacgtggcc 720
atgtgcgcgc cattttgggg cattacggat gcgacggcag agtcggcgaa ccgcggttgg 780
cgaaaattct tggccctcaa tttcgtcacc gggttcttcg tgacgatgtt gctgatctgg 840
tgggcactca ttcgttag 858
<210> 7
<211> 370
<212> DNA
<213> Cryobacteirum sp GCJ06
<400> 7
caacgagtcg ctcatcgccc gcgcccttgc atcctggggc ggcgacacct cgcaggtggt 60
cgtggccacc aagggcgggc acctgcgccc cggcgacggc agctggtacg tcgacgggcg 120
gcccgagtac ctcaagcagg cggcgaaggc gtcgctggcg cggctcggcg gcgacgccat 180
cgacctgtac caccaccacc ggcccgaccc ggcggttccc tacgcggatt ccatcggcgc 240
catccgcgac ctgctcgacg acggtgtcat ccgcctcgcc ggcatctcca acgccaaccc 300
ggagcagatc cgcgaggcgt atgagatcct cggcggccgg ctggccagtg tacagaacca 360
gtactccccg 370
<210> 8
<211> 929
<212> DNA
<213> Cryobacterium arcticum
<400> 8
tagaagggca gcagcgggtc gacgccgacg gccacgaaca ccagcgtgag gtacgcgatc 60
gagccgtgga agacgcgcat cggcgacacg tgctcgtgcc ggatggtgag gttgtacagg 120
cggtgggtct cgtagatgaa ccaggcaccg gatgcgatgg ccacgacgct gtagaccagc 180
cccatgtcgg cgatcgggat gagcagcagc gagcaggcca cggtcgccca cgcgtagagg 240
atgacctgca gcccgacctg ggcgcggccg cgcaccacgg cgagcatcgg gacgccggcc 300
gcctgatagt cgtcgcggta cttcatcgac aacggccagt agtgcggcgg ggtccacagg 360
aagatgatca ggaacaggat gaacggcggc caggacaggt ccccggtcac ggcggcccag 420
ccgatcagca ccggcatgca gccggcaacg ccgccccaga cgatgttctg cgccgtgcgg 480
cgcttgagga tcatcgtgta gaacaccacg tacagcagga tggcgccgag ggacaggagc 540
gcggccaccc agttcgtgaa gatccacagc cacgcgatgg acacggcgcc cagaacccag 600
gcgaagacca gggcctgccg gtccgagagt tccccggtga ccagggggcg cccctgggtg 660
cggttcatca accggtcgat gtcgcggtcg aggtagcagt tgaacgcgcc ggccgatccg 720
gcgctgaagg cgccgccgat cagggtggcc agcaccagcc acaggctggg gatgccgcgc 780
tcggcgagga tcatcgtcgg ggccgtgaca acaagcagca attcgaccac gcgcggcttc 840
gtgagcgaca gataggcgcg gaaggtgttg cccgcccgct ggaatcggtc aggccggttg 900
agggtgggcg tctgttcggc ggtatccat 929
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
cgggatccta gaagggcagc agcgggtcg 29
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ggaattcgat accgccgaac agacgcccac c 31
<210> 11
<211> 861
<212> DNA
<213> Cryobacteirum sp GCJ06
<400> 11
atgaagaccc gtcaactcgg cgaccgcacc gtgagttcca tcggcctggg cggcatgccc 60
atgtcgatcg agggccggcc agacgaggcc cgctccatcg ccaccatcca cgccgccctc 120
gaggagggcg tgaccctgat cgacacggcg gatgcgtacc acctgcacgc cgacgaggtc 180
ggccacaacg agtcgctcat cgcccgcgcc cttgcatcct ggggcggcga cacctcgcag 240
gtggtcgtgg ccaccaaggg cgggcacctg cgccccggcg acggcagctg gtacgtcgac 300
gggcggcccg agtacctcaa gcaggcggcg aaggcgtcgc tggcgcggct cggcggcgac 360
gccatcgacc tgtaccacca ccaccggccc gacccggcgg ttccctacgc ggattccatc 420
ggcgccatcc gcgacctgct cgacgacggt gtcatccgcc tcgccggcat ctccaacgcc 480
aacccggagc agatccgcga ggcgtatgag atcctcggcg gccggctggc cagtgtacag 540
aaccagtact cgccggcgtt ccgcagcagc caggccgagc tggacctctg caccgaactc 600
ggtgtcgcgt tcctgtcctg gagcccgctg ggcggcatca agtccgccgc cgacctcggc 660
acccggttcg ccccgttcca gcaggtggcg gatgcccacg gcgtgagccc gcaggtcgtc 720
acgctggcct ggcacctggc cgcctccccc cgggtgatcc ccattcccgg ggcgagccgg 780
ccggagagca tccgggattc ggcccacgcg gccgacctca ccctctcggc cgaggaactg 840
gccgcgctca acgcggcctg a 861
Claims (3)
1.一种用于克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的简并引物，其特征在于，所述简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
2.一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)选取细菌一；
(2)利用PCR技术扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；
(3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶的基因序列；
(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，利用PCR技术扩增细菌一的完整异戊烯转移酶基因，该步骤的PCR扩增技术中引物为第二简并引物，模板为细菌一的基因组DNA；
(5)再选取细菌二，按照上述步骤(2)至步骤(4)的方法获取细菌二的完整异戊烯转移酶基因，按照该方法依次得到多个细菌的完整异戊烯转移酶基因，建构异戊烯转移酶基因家族成员群。
3.根据权利要求2所述的克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，所述步骤2)和步骤4)中PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液5μl、25mmol/L Mgso4 2μl、10mmoldNTP 5μl、10nmol/L引物各1μl、模板80ng、KoD-Plus DNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
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