CN110845485A

CN110845485A - 蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用

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Publication number: CN110845485A
Application number: CN201911213790.0A
Authority: CN
Inventors: 龙菁; 陈翔; 彭聪; 周哲; 唱祺; 胡高云; 李乾斌; 胡维稳; 邓广通; 李雅芸; 王媛
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110845485B

Abstract

本发明涉及一种蛋白降解靶向嵌合体及制备方法和应用，该蛋白降解靶向嵌合体结构如下所示：

为含有杂环的连接基团，杂环含有至少一个N原子。该蛋白降解靶向嵌合体将能与靶标CD147蛋白质特异性结合土荆皮乙酸部分和能与E3泛素连接酶结合的沙利度胺部分连接，通过同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，将活化的泛素转移至靶标蛋白上，实现了对其选择性泛素化，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解，在用于制备治疗或预防癌症的药物中，尤其在用于制备以CD147为靶点的抗肿瘤药物中有很高的应用价值。

Description

蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，特别涉及一种蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的化合物，主要包括三部分：配体1部分、配体2部分与中间连接部分linker。

linker将作用于靶标蛋白的配体1和作用于E3泛素连接酶的配体2有机连接起来，蛋白降解靶向嵌合体作用于靶标蛋白时，能形成靶蛋白-PROTACs-E3泛素化酶三元复合物，从而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，实现对其选择性泛素化，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解，进而达到靶向降解靶蛋白，以治疗一些疾病。不同的靶蛋白和E3泛素化酶的生物特性千差万别，找到合适的配体并进一步开发合适的linker使配体有机结合形成能特异性降解靶标蛋白的蛋白降解靶向嵌合体一直是本领域技术人员面对的难题。

CD147蛋白是一个相对分子量50-60kDa的单次跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员之一；其高表达于各种肿瘤细胞上，参与肿瘤细胞的增殖，侵袭，转移，代谢，分化，抵抗凋亡等重要生物学功能，是有效的药物靶标。

目前，还没有以CD147蛋白为靶标蛋白的连接部分含杂环状结构的蛋白降解靶向嵌合体问世。

发明内容

基于此，本发明提供了一种蛋白降解靶向嵌合体及其制备方法和应用，该蛋白降解靶向嵌合体能特异性靶向降解CD147蛋白。

本发明的技术方案如下。

本发明提供了一种蛋白降解靶向嵌合体，该蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)。

式(I)，

为连接基团。

上述连接基团含有杂环，杂环含有至少一个N原子。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述连接基团至少含有两个N原子，且以所述两个N原子分别作为两个连接位点。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述杂环含有至少两个N原子，上述连接基团以所述杂环中的两个N原子分别作为两个连接位点。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述连接基团除上述杂环的其他部分含有至少一个N原子，上述连接基团以上述杂环中的一个N原子和其他部分的一个N原子分别作为两个连接位点。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述杂环为脂杂环。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述杂环为五元环或六元环。

上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述蛋白降解靶向嵌合体为(a)～(c)中任意一种：

上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，包括以下步骤。

提供化合物1；其中，化合物1含有杂环和至少两个伯胺基团或仲胺基团，所述杂环含有至少一个N原子；

将上述化合物1的至少一个伯胺基团或仲胺基团进行保护反应，得到化合物2；

将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与上述化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3；

将上述化合物3脱去保护基团后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。

上述制备方法中，化合物1选自(1-a)～(1-b)中任意一种：

上述蛋白降解靶向嵌合体或上述制备方法制得的蛋白降解靶向嵌合体能用于制备抗肿瘤药物。

有益效果

本发明制得的蛋白降解靶向嵌合体中，含杂环结构的连接基团将沙利度胺类似物与土荆皮乙酸(PAB)有机连接起来，使得蛋白降解靶向嵌合体能同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，其中，土荆皮乙酸部分能与CD147蛋白质特异性结合，沙利度胺部分能与E3泛素连接酶结合，用于降解靶标CD147蛋白时，能形成靶蛋白-蛋白降解靶向嵌合体-E3泛素化酶三元复合物，进而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。

上述制备蛋白降解靶向嵌合体应用在制备抗肿瘤药物中时，能特异性降解参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、代谢、分化和抵抗凋亡等过程的CD147蛋白，从而有效地抑制肿瘤细胞生长。

附图说明

图1为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体a对CD147蛋白的降解活性的电泳图；

图2为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体b对CD147蛋白的降解活性的电泳图；

图3为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体c对CD147蛋白的降解活性的电泳图；

图4为不同浓度土荆皮乙酸对CD147的降解活性的电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一个实施方式提供的蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)，

式(I)，

为连接基团；

连接基团含有杂环，杂环含有至少一个N原子。

在其中一个实施例中，上述连接基团至少含有两个N原子，且以所述两个N原子分别作为两个连接位点。

在其中一个实施例中，上述杂环含有至少两个N原子，上述连接基团以所述杂环中的两个N原子分别作为两个连接位点。

在其中一个实施例中，上述连接基团除上述杂环的其他部分含有至少一个N原子，上述连接基团以上述杂环中的一个N原子和其他部分的一个N原子分别作为两个连接位点。

在其中一个实施例中，上述连接基团含有一个杂环。

在其中一个实施例中，上述连接基团至少含有两个杂环。

在其中一个实施例中，上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述杂环为脂杂环。

在其中一个实施例中，上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述杂环为五元环或六元环。进一步地，在其中一个实施例中，上述杂环为六元环，该六元环含有至少两个N原子，且其中两个N原子分别作为两个连接位点。

进一步地，在其中一个实施例中，上述杂环为六元环，上述连接基团除六元环的其他部分含有至少一个N原子，上述连接基团以六元环中的一个N原子和其他部分的一个N原子分别作为两个连接位点。

在其中一个实施例中，上述蛋白降解靶向嵌合体中，上述蛋白降解靶向嵌合体为(a)～(c)中任意一种：

上述蛋白降解靶向嵌合体中，含杂环结构的连接基团将沙利度胺类似物与土荆皮乙酸(PAB)有机连接起来，使得蛋白降解靶向嵌合体能同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，其中，土荆皮乙酸部分能与CD147蛋白质特异性结合，沙利度胺部分能与E3泛素连接酶结合，用于降解靶标CD147蛋白时，能形成靶蛋白-蛋白降解靶向嵌合体-E3泛素化酶三元复合物，进而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。

本发明的一实施方式进一步提供了上述蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，制备方法包括以下步骤S11-S14。

S11、提供化合物1；其中，化合物1含有杂环和至少两个伯胺基团或仲胺基团，所述杂环含有至少一个N原子；

在其中一个实施例中，上述化合物1含有两个仲胺基团。

在其中一个实施例中，上述化合物1含有一个伯胺基团和一个仲胺基团。

在其中一个实施例中，上述杂环为脂杂环。

在其中一个实施例中，上述杂环为五元环或六元环

在其中一个实施例中，上述化合物1含有一个杂环，杂环为五元环或六元环。进一步地，在其中一个实施例中，上述杂环为六元环，该六元环含有两个仲胺基团。

在其中一个实施例中，上述杂环为六元环，该六元环含有一个伯胺基团和一个仲胺基团。

S12、将上述化合物1的至少一个伯胺基团或仲胺基团进行保护反应，得到化合物2。

在其中一个实施例中，上述保护反应在二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)的作用下进行。进一步地，上述化合物1与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为(1～6)：1。

在其中一个实施例中，上述化合物1中的一个伯胺基团进行保护反应。

在其中一个实施例中，上述化合物1中的一个仲胺基团进行保护反应。

S13、将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与步骤S12得到的化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3。

具体地，上述化合物2中没进行保护反应的伯胺基团或仲胺基团与2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮中的氟取代基发生上述亲核反应。

在其中一个实施例中，步骤S13中，亲核取代反应在催化剂作用下、在极性溶剂中进行，其中，催化剂为非亲核性碱。

一般来说，亲核性和碱性是同时存在，而上述非亲核性碱由于负离子体积太大，无法进行亲核进攻，因此，能作为强碱促进亲核反应而又不作为亲核试剂参与反应产生副产物。

在其中一个实施例中，上述催化剂选自N,N-二异丙基乙胺、二异丙基氨基锂、4-二甲氨基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯中的至少一种。

在其中一个实施例中，上述极性溶剂选自N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中的一种或几种的组合。

S14、将步骤S13得到的化合物3脱去保护基团后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体。

在其中一个实施例中，将步骤S13得到的化合物3脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行。

在其中一个实施例中，上述脱水缩合反应是在碳鎓盐类缩合剂与催化剂的作用下进行。

在其中一个实施例中，上述碳鎓盐类缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)中的一种或几种的组合；催化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

碳鎓盐类缩合剂与催化剂配合作用进行缩合反应时，催化剂能进一步加快反应速率，避免反应停留在中间过程产生副产物，从而提高脱水缩合的效率。

具体地，上述脱水缩合反应中，先加入中间产物4脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基的产物，然后依次加入土荆皮乙酸、碳鎓盐类缩合剂、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，避免产生副产物，提高产率。

在其中一个实施例中，上述化合物1选自(1-a)～(1-b)中任意一种。

在其中一个实施例中，上述化合物1选自(1-a)，上述制备方法包括以下步骤S21-S24。

S21、提供化合物(1-a)。

S22、将上述化合物(1-a)的一个仲胺基团进行保护反应，得到化合物(2-a)，化合物(2-a)的结构如下。

上述保护反应在二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)的作用下进行。进一步地，化合物(1-a)与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为6：1。

可理解，上述化合物(2-a)可通过上述步骤制得，也可直接购买。

二碳酸二叔丁酯的摩尔量远小于化合物1中(1-a)中仲胺基团的摩尔数，以此保证化合物1中有一个仲胺基团不进行保护反应。

S23、将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与步骤S22得到的化合物(2-a)进行亲核取代反应，得到化合物(3-a)，化合物(3-a)的结构如下。

在其中一个实施例中，步骤S23中，亲核取代反应在催化剂作用下、在极性溶剂中进行，其中，催化剂为非亲核性碱。

可理解，上述步骤23中的亲核取代反应与上述步骤13中的亲核取代反应为同类型反应，相应地，其中催化剂、极性溶剂和反应条件的选择范围与上述步骤13相同。

在其中一个实施例中，上述催化剂选自N,N-二异丙基乙胺。

在其中一个实施例中，上述极性溶剂选自N-甲基吡咯烷酮(NMP)。

S24、将步骤S23得到的化合物(3-a)脱去保护基叔丁基氧羰基后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到上述蛋白降解靶向嵌合体(a)。

在其中一个实施例中，将步骤S23得到的化合物(3-a)4脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行。

具体地，上述脱水缩合反应中，先加入化合物(3-a)4脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基的产物，然后依次加入土荆皮乙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，避免产生副产物，提高产率。在其中一个实施例中，上述化合物1选自(1-b)，制备方法包括以下步骤S31-S34。

S31、提供化合物(1-b)。

S32、将上述化合物(1-b)的一个仲胺基团或一个伯胺基团进行保护反应。

在其中一个实施例中，将化合物(1-b)的一个仲胺基团进行保护反应。具体地，化合物(1-b)中的伯胺先在甲基异丁基酮上的作用下发生脱水反应生成亚胺基团，然后化合物(1-b)中的仲胺在Boc酸酐的作用下进行保护反应，最后在水和异丙醇中加热，将亚胺基团水解，得到化合物(2-b)，化合物(2-b)的结构如下。

具体反应可参考专利CN102617548(A)。

在其中一个实施例中，将化合物(1-b)的一个伯胺基团进行保护反应。具体地，化合物(1-b)中的伯胺基团在-10℃下，在二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)的作用下，进行保护反应，得到化合物(2-c)。进一步地，化合物(1-b)与二碳酸二叔丁酯的摩尔比(3～6)：1。化合物(2-c)的结构如下。

可理解，上述化合物(2-b)与(2-c)可通过上述步骤制得，也可直接购买。

S33、将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与步骤S32得到的化合物(2-b)进行亲核取代反应得到化合物(3-b)，或将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与化合物(2-c)进行亲核取代反应得到化合物(3-c)，化合物(3-b)与(3-c)的结构如下所示。

在其中一个实施例中，步骤33中，亲核取代反应在催化剂作用下、在极性溶剂中进行，其中，催化剂为非亲核性碱。

可理解，上述步骤33中的亲核取代反应与上述步骤13和步骤23中的亲核取代反应为同类型反应，相应地，其中催化剂、极性溶剂和反应条件的选择范围与上述步骤13和步骤23相同。

S34、将步骤S33得到的化合物(3-b)和化合物(3-c)脱去保护基叔丁基氧羰基后分别与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，分别得到上述蛋白降解靶向嵌合体(b)与(c)。

在其中一个实施例中，将步骤S33得到的化合物(3-b)或化合物(3-c)脱去胺基的保护基叔丁基氧羰基是在三氟乙酸的作用下进行。

可理解，上述步骤34中的脱水缩合反应与上述步骤14或步骤24中的脱水缩合反应为同类型反应，相应地，其中碳鎓盐类缩合剂、催化剂和反应条件的选择范围与上述步骤14或24相同。

本发明的一实施方式还涉及到上述蛋白降解靶向嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用；尤其是在制备能够靶向降解CD147蛋白的抗肿瘤药物中的应用。

上述制备方法制得的蛋白降解靶向嵌合体中，含杂环结构的连接基团将沙利度胺类似物与土荆皮乙酸(PAB)有机连接起来，使得蛋白降解靶向嵌合体能同时作用于靶标蛋白和E3泛素连接酶，其中，土荆皮乙酸部分能与CD147蛋白质特异性结合，沙利度胺部分能与E3泛素连接酶结合，用于降解靶标CD147蛋白时，能形成靶蛋白-蛋白降解靶向嵌合体-E3泛素化酶三元复合物，进而将活化的泛素转移至靶标蛋白上，最终泛素化的靶标蛋白被蛋白酶体识别并降解。

因此，上述得到的蛋白降解靶向嵌合体应用在制备抗肿瘤药物中时，能特异性降解参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、代谢、分化和抵抗凋亡等过程的CD147蛋白，从而有效地抑制肿瘤细胞生长。

为此，本发明进一步对上述蛋白降解靶向嵌合体对CD147蛋白的降解活性以及上述蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性水平进行了测定，详细过程参考具体实施例。

结果表明，上述蛋白降解靶向嵌合体对CD147蛋白有很好的降解效果，进而能有效抑制了癌症细胞的生长。

下面将结合具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。

具体实施例

这里按照本发明的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法举例，但本发明并不局限于下述实施例。

实施例1

蛋白降解靶向嵌合体(c)的结构式如下所示：

合成步骤如下：

(1)分别称取2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮(55mg、0.2mmol)和4-Boc-氨基哌啶(44mg、0.22mmol)，加入装有2mL NMP的反应器中，搅拌溶解，然后往反应器中加入66uL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，氮气保护下加热至100℃反应4小时，冷却后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经柱层析得到中间体78mg，产率为86％。中间体结构如下所示。

中间体的表征结果如下：

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ：11.10(s,1H),7.71-7.65(m,1H),7.33(d,J＝7.9Hz,2H),6.92(d,J＝7.7Hz,1H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),3.68-3.60(m,2H),3.51-3.40(m,1H),2.98-2.83(m,3H),2.63-2.52(m,2H),2.07-1.99(m,1H),1.88-1.79(m,2H),1.65-1.54(m,2H),1.40(s,9H).

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₃H₂₉N₄O₆(M+H)⁺:457.2082,found 457.2085.

(2)将步骤(1)所得中间体(40mg，0.088mmol)溶于0.4mL二氯甲烷中，加入133uL三氟乙酸，室温下搅拌1小时后旋干溶剂，然后加入甲苯将残留的三氟乙酸除去，将得到的脱去胺基保护基的粗产品悬浮于3mL二氯甲烷中，依次加入土荆皮乙酸(35mg，0.08mmol)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg，0.112mmol)，N,N-二异丙基乙胺(40uL)，70℃下反应2小时，冷却后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经柱层析得到51mg蛋白降解靶向嵌合体(c)，蛋白降解靶向嵌合体(c)的表征结果如下。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:8.79-8.67(m,1H),7.63-7.54(m,1H),7.37(d,J＝7.1Hz,1H),7.18(t,J＝8.7Hz,2H),6.95(d,J＝11.3Hz,1H),6.48(dd,J＝15.0,11.4Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.82(d,J＝15.0Hz,1H),4.98(dd,J＝12.1,5.3Hz,1H),4.13-4.02(m,1H),3.73-3.66(m,4H),3.28(d,J＝5.6Hz,1H),3.10-2.97(m,3H),2.90-2.84(m,1H),2.81-2.70(m,5H),2.65-2.56(m,1H),2.18-2.05(m,7H),1.94(s,3H),1.86-1.68(m,7H),1.57(s,3H).

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₄₁H₄₇N₄O₁₁(M+H)⁺:771.3236,found 771.3252.

实施例2

蛋白降解靶向嵌合体(b)的结构式如下所示：

合成步骤同实施例1基本相同，不同之处在于将实施例1步骤(1)中的4-Boc-氨基哌啶换成1-Boc-4-氨基哌啶，得到的中间体的结构如下所示。

中间体的表征结果如下。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ：11.11(s,1H),7.60(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.22(d,J＝8.7Hz,1H),7.06(d,J＝7.0Hz,1H),6.27(d,J＝8.4Hz,1H),5.06(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),3.97-3.85(m,2H),3.79-3.72(m,1H),3.02-2.81(m,3H),2.62-2.46(m,4H),2.06-1.99(m,1H),1.95-1.88(m,2H),1.41(s,9H).

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₃H₂₈N₄NaO₆(M+Na)⁺479.1901,found 479.1904.

蛋白降解靶向嵌合体(b)的表征结果如下。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ：8.31(s,1H),7.57-7.49(m,1H),7.24-7.20(m,1H),7.14(d,J＝7.1Hz,1H),6.93(d,J＝8.6Hz,1H),6.45(dd,J＝15.1,11.0Hz,1H),6.27(d,J＝7.9Hz,1H),6.12(d,J＝11.0Hz,1H),5.64(d,J＝15.1Hz,1H),4.93(dd,J＝12.2,5.4Hz,1H),3.76-3.70(m,4H),3.28(d,J＝6.0Hz,1H),3.21-3.04(m,3H),2.93-2.71(m,6H),2.65-2.59(m,1H),2.19-2.08(m,7H),2.00(s,3H),1.88-1.62(m,8H),1.59(s,3H).

HRMS(ESI)m/z calcd for C₄₁H₄₇N₄O₁₁(M+H)⁺771.3236,found 771.3243.

实施例3

蛋白降解靶向嵌合体(a)的结构式如下所示：

合成步骤同实施例1基本相同，不同之处在于将实施例1步骤(1)中的4-Boc-氨基哌啶换成N-Boc-哌嗪，得到的中间体的结构如下所示。

中间体的表征结果如下。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ:11.11(s,1H),7.75-7.70(m,1H),7.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.35(d,J＝8.4Hz,1H),5.11(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.56-3.47(m,4H),3.28-3.21(m,4H),2.94-2.82(m,1H),2.64-2.52(m,2H),2.07-2.00(m,1H),1.43(s,9H).

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₂₂H₂₇N₄O₆(M+H)⁺443.1925,found 443.1923.

蛋白降解靶向嵌合体(a)的表征结果如下。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:8.49-8.43(m,1H),7.69-7.60(m,1H),7.46(d,J＝7.1Hz,1H),7.24-7.16(m,2H),6.45(dd,J＝15.1,11.1Hz,1H),6.13(d,J＝11.0Hz,1H),5.64(d,J＝15.1Hz,1H),4.97(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),3.85-3.74(m,3H),3.72(s,3H),3.35-3.25(m,5H),3.08(dd,J＝14.0,6.2Hz,1H),2.89(dd,J＝15.4,4.5Hz,2H),2.83-2.71(m,3H),2.66-2.58(m,1H),2.17-2.10(m,5H),2.00(s,3H),1.87-1.71(m,6H),1.59(s,3H).

HRMS(ESI)m/z:calcd for C₄₀H₄₅N₄O₁₁(M+H)⁺757.3079,found 757.3084.

由上述核磁与质谱测试结果表明：通过上述步骤成功制备得了目标蛋白降解靶向嵌合体。

实施例4

蛋白降解靶向嵌合体对CD147蛋白的降解活性测试。

测试方法：采用的是Western Blot方法测定蛋白降解靶向嵌合体对CD147的降解活性。将处于对数增长期的SK-MEL-28细胞(人皮肤恶性黑色素瘤细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于6孔板(1×105个/孔)，每孔2mL放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药，每组设置3个复孔，阴性对照组加入2mL/孔10％血清培养基，实验组加入2mL/孔以10％血清培养基稀释得到的不同浓度的蛋白降解靶向嵌合体或土荆皮乙酸，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中继续培养24h后，吸弃上清液，用1mL/孔PBS(KH₂PO₄ 2mM，Na₂HPO₄ 8mM,，NaCl 136mM，KCl 2.6mM)冲洗细胞两次后，再次加入1mLPBS，使用细胞刮将细胞刮下，置EP管中，转速为1000rmp，3min沉淀细胞，吸弃上清液，根据细胞数量加入预冷的裂解/冼涤缓冲液以及蛋白酶抑制剂，重悬细胞，将细胞裂解液冰上放置30min，超速低温离心机转速为13000rmp，4℃离心10min，轻轻吸取上清液至EP管中，进行BCA蛋白定量。向进行蛋白定量后的上清液中加入2×Laemmli缓冲液(4％SDS，10％2-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125Mtris-HCl，测定pH值并将pH调整为6.8)配置成上样样品。

按常规凝胶配制SDS聚丙烯酰胺凝胶。样品电泳：将上述制备好的上样样品加入孔道进行电泳，电泳条件：恒压100伏，90min。转膜：按常规将胶块与PVDF膜置于转膜槽内，冰上环境进行转膜，转膜条件：恒流300mA，90min。封闭、抗体孵育以及发光等步骤同常规免疫印迹反应。

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参蛋白质蛋，电泳图如附图1与2所示，图1～图3分别为不同浓度蛋白降解靶向嵌合体a，b，c对CD147的降解活性的电泳图；图4为不同浓度土荆皮乙酸对CD147的降解活性的电泳图。

结果显示靶向嵌合体b，c对CD147蛋白有很好的降解效果，而土荆皮乙酸(PAB)对CD147蛋白几乎没有降解效果。

注：1μM＝10^-6mol/L，DMSO为二甲基亚砜。

SK-MEL-28细胞是人体皮肤恶性黑色素瘤细胞，CD147蛋白高表达于SK-MEL-28细胞上。

实施例5

蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性水平的测定。

方法：蛋白降解靶向嵌合体细胞水平的活性检测采用CCK-8检测法。将处于对数增长期的SK-MEL-28细胞(人皮肤恶性黑色素瘤细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于96孔板(2×103个/孔)，每孔100μL。放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养，24h后待细胞贴壁后加药。每组设置3个复孔，阴性对照组加入100μL/孔10％血清培养基，实验组加入100μL/孔不同浓度的蛋白降解靶向嵌合体(以10％血清培养基稀释药物)，放入37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养。药物作用48h后，吸弃上清液，向每孔加入10μL CCK和100μL10％血清培养基，37℃孵育1-3h后，用酶联免疫检测仪于450nm波长下测定各孔吸光度(OD)值，数据用GraphPad处理，计算蛋白降解靶向嵌合体的IC₅₀(μM)值，表1为蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性测试结果。

表1蛋白降解靶向嵌合体抗肿瘤活性水平的测试结果

蛋白降解靶向嵌合体	c	b	a
				IC<sub>50</sub>(μM)	2.4	9.9	18.4

注：IC₅₀(μM)指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，可以用来衡量蛋白降解靶向嵌合体抑制肿瘤细胞增殖的能力，抑制能力越强，数值越低。

从表1的测试结果可以看出按照本发明的蛋白降解靶向嵌合体对癌症细胞具有较好的抑制活性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述蛋白降解靶向嵌合体的结构式如式(I)，

式(I)，

为连接基团；

所述连接基团含有杂环，所述杂环含有至少一个N原子。

2.如权利要求1所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述连接基团含有至少两个N原子，且以所述两个N原子分别作为两个连接位点。

3.如权利要求2所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述杂环含有至少两个N原子，所述连接基团以所述杂环中的两个N原子分别作为两个连接位点。

4.如权利要求2所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述连接基团除所述杂环的其他部分含有至少一个N原子，所述连接基团以所述杂环中的一个N原子和所述其他部分的一个N原子分别作为两个连接位点。

5.如权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述杂环为脂杂环。

6.如权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述杂环为五元环或六元环。

7.如权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体，其特征在于，所述蛋白降解靶向嵌合体为(a)～(c)中任意一种：

8.如权利要求1-7任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供化合物1；

将所述化合物1的至少一个伯胺基团或仲胺基团进行保护反应，得到化合物2；

将2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-4-氟基-异吲哚-1,3-二酮与所述化合物2进行亲核取代反应，得到化合物3；

将所述化合物3脱去保护基团后与土荆皮乙酸进行脱水缩合反应，得到所述蛋白降解靶向嵌合体；

其中，所述化合物1含有杂环和至少两个伯胺基团或仲胺基团，所述杂环含有至少一个N原子。

9.如权利要求8所述的蛋白降解靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，化合物1选自(1-a)～(1-b)中任意一种：

10.如权利要求1-7任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或如权利要求8或9所述的制备方法制得的蛋白降解靶向嵌合体在制备抗肿瘤药物中的应用。