CN110835347B - 一种9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种9,10‑恶嗪酮喜树碱衍生物及其应用，化学结构通式为

Description

一种9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及喜树碱衍生物及其应用。
背景技术
喜树碱(Camptothecin，CPT)是1966年从珙桐科植物喜树中提取的一种细胞毒性生物碱，其结构式如下：
Figure BDA0001766173490000011
经肿瘤实验证明喜树碱具有明显的抗肿瘤活性，尤其对消化道肿瘤、白血病、膀胱癌等活性更强，但它易引起骨髓抑制、呕吐和血尿等副作用，且其不溶于水又难溶于脂，不便于制成适宜的剂型，进一步限制了它的应用。直到1985年的研究证实，CPT是拓扑异构酶Ⅰ的特异性抑制剂，使其又成为抗肿瘤药物研究的热点。目前，针对拓扑异构酶I(Topo I)开发的小分子抑制剂有多个临床在研药物。已经上市和在临床(前)研究的拓扑异构酶I代表性抑制剂信息列举在表1中。伊立替康和拓扑替康均已通过美国FDA上市，相比喜树碱溶解性更强，但毒性仍然很强，不良反应主要包括腹泻、血尿、呕吐、恶心等，这就限制了它们的疗效及用量。目前许多对喜树碱的结构改造主要从增强水溶性和生物利用度和减低毒性出发，主要在7、9、10、11位上，或在A环上进行变化，又或者把E环打开、扩环以及增加亲水基团以获得更好的水溶性。其中Enzon公司在SN-38(伊立替康CPT-11的代谢物)的20号位引入了聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)，增大了化合物的溶解度。PEG-SN38的抗肿瘤活性是伊立替康的10倍，在小鼠模型上的毒性是伊立替康的3-4倍，人体毒性似乎达到了伊立替康的10倍以上。伊立替康可以注射350mg/m2/3周的剂量，而PEG-SN38在注射30mg/m2/3周时即存在安全性问题。
已有的研究表明，喜树碱衍生物结构的细微差异对其活性有着重大的影响。现有的喜树碱衍生物普遍存在活性不足，或者毒副作用过大的问题。一般认为喜树碱衍生物的抗肿瘤活性与其生物毒性正相关，如何在有效保留其抗肿瘤活性的同时减少其毒副作用，是极具挑战性的工作。虽然有大量的文献报导了多种对喜树碱的修饰策略并取得了一定的结果，但是其具体的构效关系依然是不清楚的，人们很难根据衍生物的结构预知其生物特性，特别是其生物毒性。此外，现有喜树碱衍生物的水溶解性、稳定性较差，难以成药，限制了其应用。
开发出一种低毒，易于成药的喜树碱衍生物具有非常重要的意义。发明人在CN102731517A公开了通式为
Figure BDA0001766173490000021
的喜树碱衍生物，通过酯化包括了用亲水基团酯化拓扑替康20位的羟基，以及磺酸化10位羟基，打破其分子内氢键，降低使得喜树碱/拓扑替康衍生物在血浆中开环可能性，保持其闭环形式，最终达到提高这类衍生物的生物活性和降低毒性。CN106188094A公开了通式为
Figure BDA0001766173490000022
的喜树碱衍生物，通过用亲水基团酯化拓扑替康20位的羟基，打破其分子内氢键，使得喜树碱/拓扑替康衍生物在血浆中开环可能性降低，有助于保持其闭环形式，使得本发明喜树碱衍生物对靶点－Topoisomerase I的结合能力得以保持，同时通过异噁唑环化9，10位，最终达到提高这类衍生物的生物活性和降低毒性。
炎症是免疫系统对病原威胁的正常反应，涉及各种化学信号的产生和免疫细胞的激活，中性粒细胞是最早反应的重要炎症效应细胞之一。炎症对控制细菌等病原体具有重要作用，但是炎症也会对身体自身细胞产生危害，严重炎症可以造成血容量不足，导致器官功能衰竭，危害健康甚至生命。如脓毒症这类严重的急性炎症，病死率居高不下，每10万人口中约50-300人会发生严重脓毒症，其短期死亡率达20％-25％，当发展为脓毒性休克时其死亡率达50％。有研究表明，喜树碱可以用于治疗系统性的严重炎症或自身免疫性的风湿性关节炎，但是实际使用中发现其毒性过大，并不能用于临床。糖皮质激素(如：地塞米松)具有抗炎作用，这就使得其被引入脓毒性休克的治疗，但与此同时发生的一些急性并发症如高钠血症、心律失常、高血糖、消化道出血等使得糖皮质激素在严重脓毒症及脓毒性休克中的应用一直饱受争议。因此诸多的临床研究对糖皮质激素疗效的评价褒贬不一，糖皮质激素是否有利于脓毒症的转归一直饱受争议。对于这种危害极大的炎症，目前严重缺乏有效药物。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种低毒性、易于成药的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物。
本发明的另一个目的于提供上述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的再一个目的在于提供上述化合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
喜树碱衍生物，其化学结构通式(1)如下：
Figure BDA0001766173490000031
式中，R1选自H或HOOC-(CH2)2-CO-NH-CH2-CO-；
或其可形成的药学上可接受的酯、醚、盐、酰胺类衍生物。
喜树碱衍生物药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、铁、锌盐，或乙酸、2,2-二氯乙酸、已二酸、藻酸、抗坏血酸(如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸盐；喜树碱衍生物药学上可接受的酯为其C1～C6的链酯；喜树碱衍生物药学上可接受的酰胺为其与药学上可接受的胺形成的酰胺。
喜树碱衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中喜树碱衍生物如上所述。
作为上述应用的进一步改进，肿瘤选自胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌。
喜树碱衍生物在制备治疗急性炎症药物中的应用，其中喜树碱衍生物如上所述。
作为上述应用的进一步改进，急性炎症选自脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
一种组合物，其活性成分包括上述的喜树碱衍生物。
作为上述组合物的进一步改进，组合物的剂型为口服制剂或注射剂。
作为上述组合物的进一步改进，组合物用于治疗肿瘤或急性炎症。
作为上述组合物的进一步改进，肿瘤胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌；急性炎症选自脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
本发明的有益效果是：
本发明的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物，具有较好的水溶性，溶解度可达3.40mg/mL，其水溶液的pH为7～8，接近人体生理pH。动物实验数据表明，4mg/kg和8mg/kg静脉给药组T/C％分别为17％和7％；1.3mg/kg口服给药组T/C％为7％。与之相对照的，拓扑替康组的T/C％为26％。本发明的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物，在4mg/kg静脉注射组动物体重较给药前升高6.33％，8mg/kg静脉注射组动物体重较给药前升高4.86％，1.3mg/kg口服给药组动物体重较给药前升高6.79％，与之相对照的，拓扑替康组中，动物的体重略微下降1.47％。本发明的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物单次静脉给药的最大耐受剂量MTD在15～18mg/kg附近，而拓扑替康的MTD在2mg/kg左右。可见，相对于拓扑替康，本发明的化合物具有更好的抑瘤活性和更低的药物毒性。更为重要的是可以制备成为口服制剂，大大方便了病人服用。
本发明的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物，可以显著降低脓毒症小鼠血液中IL-6和TNF-α浓度，对急性炎症具有很好地治疗效果。
附图说明
图1是化合物2(Rngn-YH-011)对荷瘤鼠肿瘤(HepG-2)体积(mm3)的影响；
图2是化合物2对老鼠体重的影响；
图3和图4分别是化合物1的核磁氢谱和碳谱；
图5和图6分别是化合物2的核磁氢谱和碳谱。
具体实施方式
喜树碱衍生物，其化学结构通式(1)如下：
Figure BDA0001766173490000051
式中，R1选自H或HOOC-(CH2)2-CO-NH-CH2-CO-；
或其可形成的药学上可接受的酯、醚、盐、酰胺类衍生物。
喜树碱衍生物药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、铁、锌盐，或乙酸、2,2-二氯乙酸、已二酸、藻酸、抗坏血酸(如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如D-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如L-谷氨酸)、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸盐；喜树碱衍生物药学上可接受的酯为其C1～C6的链酯；喜树碱衍生物药学上可接受的酰胺为其与药学上可接受的胺形成的酰胺。
喜树碱衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中喜树碱衍生物如上所述。
作为上述应用的进一步改进，肿瘤选自胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌。
喜树碱衍生物在制备治疗急性炎症药物中的应用，其中喜树碱衍生物如上所述。
作为上述应用的进一步改进，急性炎症选自脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
一种组合物，其活性成分包括上述的喜树碱衍生物。
作为上述组合物的进一步改进，组合物的剂型为口服制剂或注射剂。
作为上述组合物的进一步改进，组合物用于治疗肿瘤或急性炎症。
作为上述组合物的进一步改进，肿瘤胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌；急性炎症选自脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
相关定义：
1.药学中可接受的盐
本文所述的“药学上可接受的”指在化合物如盐或赋形剂中缺少不能接受的毒性。碱性化合物能够与各种酸形成不同形式的盐，这些酸被用以制备药学上可接受的盐，这些盐的无机阴离子，包括但并不限于，硫酸根、硫酸氢根，亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根、磷酸(一、二)氢根、异烟酸等；有机阴离子包括醋酸根、乳酸根、草酸根、马来酸根、枸橼酸根、水杨酸根、肉桂酸根、油酸根、富马酸根、酒石(氢)酸根、丙酮酸根、丹宁酸根、三氟醋酸盐、丙酸根、柠檬酸根、泛酸根、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸根、蔗糖盐、甲酸盐、苯酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸根、乙烷磺酸根、苯磺酸根、甲基苯磺酸根、双羟萘酸根等。
所发明的酸式化合物在自然界也可以与药理学上可接受的阳离子形成碱式盐，这些盐包括但并不限于碱土金属、碱性金属，尤其钙离子、镁离子、钠离子、锂离子、锌离子、钾离子、铁离子等等。
2.治疗方法和剂型：
本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括制定病人的治疗有效量，化合物或组合物，化合物及其组成，药学上可接受的载体、赋形剂，或稀释剂。该发明的化合物及其组合成分可以治疗或预防癌症包括但不仅限于，如淋巴管肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，腺癌，肾细胞癌，肝癌，子宫颈癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病(粒细胞，早幼粒细胞，粒细胞，单核细胞和白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞白血病(粒)和慢性淋巴细胞白血病)，淋巴癌(霍奇金疾病和非霍奇金疾病)，多发性骨髓瘤等。该发明的化合物及其组合成分可以治疗或预防急性炎症包括但不限于，如败血症、脓毒症、关节炎、肺炎、肠炎等。
本发明的化合物和组合物可以连续地或间断地任何与其他分子相容的方式给药，口服或不经肠道的方式吸收，包括肌肉注射、腹腔、静脉、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、阴道，透皮，直肠，通过吸入或外敷，特别是耳朵，鼻子，眼睛，或皮肤等。也可能是与另一种生物活性剂一起作用。其作用可以是全身或局部。不同的药物输送系统包括了，封装于脂质体、微粒子、微胶囊、胶囊等。
本发明也可以通过使用吸入器或喷雾器，和制成气雾剂，或通过灌注在氟碳化合物或合成的肺表面活性剂。本发明的化合物还可作为栓剂，以传统的粘合剂和载体如甘油三酯。
“药学上可接受”普遍公认的药典所列在动物身上，更尤其是在人类身上载体是指稀释剂，助剂，辅料。这种载体可以诸如水和油。动物，蔬菜或合成来源，如花生油，大豆油，矿物油，香油之类的。载体亦可以为生理盐水，阿拉伯胶，明胶，淀粉糊，滑石粉，角质，胶体二氧化硅等等。此外。辅助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂，着色剂均可以使用。当给病人用药时，发明的化合物成分和药学上可接受载体，赋形剂或稀释剂，最好是无菌的。静脉给药时，水是本发明的化合物是首选的载体。盐、葡萄糖和甘油的溶液也可作为液态载体，特别是注射的方案中。合适的制药载体还包括诸如辅料淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸，滑石粉，氯化钠，脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。目前化合物和组成，如果有需要的话，也可以包含适量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。
目前的化合物和组合物可以采取解决方案的形式包括，悬浮物。乳剂，片剂，丸剂，装有液体的颗粒，胶囊，粉末，长控释制剂，栓剂，乳剂。航空溶胶，喷雾剂，悬浮物，或任何其他形式适合使用。
发明的化合物和组成物口服给药可能是在片剂，含片，水的形式或油性悬浮物，颗粒，粉末，乳液，胶囊剂，糖浆的。化合物和组成物口服给药方式也可以制定食品和食品混合。另外在药片或药丸形式的化合物成分可延迟解体和在胃肠道吸收，从而提供持续一个较长时期的效果。时间延迟材料包括如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸。口服成分可以包括标准医药级别的载体如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。
2.1联合治疗
本发明的化合物可同时与一个或多个其他的治疗药物，用于哺乳动物，尤其人类。当结合使用其他治疗药物，该化合物和治疗剂的加法可以充当或更好的协同作用。发明的化合物与其他治疗药物可以是同样的组成，或是分开的组合，之前或之后的用药方式。对于许多慢性疾病治疗，其体现就在于一个综合疗法与交互组合的用药方式，例如，以尽量减少特定的药物毒性。在某些情况，当发明的组成与另一种治疗剂或试剂使用可能产生的副作用，包括，但不仅限于毒性，可以降低治疗剂剂量以低于阈值达到降低所引起的不良副作用。
下面结合实施例和实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：
化合物1
Figure BDA0001766173490000081
的制备
1)10-羟基喜树碱(100mg,0.27mmol)以及HMTA(80mg,0.55mmol)的TFA溶液在氩气保护条件下加热回流20小时，待反应完全后，浓缩反应液，向浓缩后的残留物中加入20mlH2O，然后常温搅拌1小时，再加入80ml水稀释，用饱和NaHCO3溶液将反应液pH调至8-9，乙酸乙酯洗水相，再将水相的pH调至1.5，再用乙酸乙酯萃取水相(20ml*5)，合并有机相，依次用1N盐酸、H2O和饱和食盐水洗有机相，无水硫酸钠干燥、过滤后浓缩，剩余物经快速柱层析分离获得化合物A(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)；
2)化合物A(44mg,0.11mmol),盐酸羟胺(20mg,0.29mmol)和甲酸钠(100mg,1.47mmol)溶于甲酸中(10ml)，反应混合物在加热回流条件下搅拌过夜，待反应完全后，移除反应溶剂，剩余物经快速柱层析分离获得化合物B(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)；
3)在化合物B(600mg,1.54mmol)的TFA(4.8ml)溶液中缓慢加入浓硫酸(1.2ml)，反应混合物在95摄氏度条件下反应16小时，待反应完全后，冷却至室温并浓缩，残留物经快速柱层析分离获得化合物C(甲醇/二氯甲烷1:10作为洗脱体系)；
4)将化合物C(407mg,1.0mmol)溶于toluene:DMSO＝20ml:10ml的混合溶剂中，加入对甲苯磺酸(17mg,0.1mmol)以及异丁醛(140mg,2.0mmol)，反应混合物在110摄氏度加热条件下反应16小时，待反应完全后，移除甲苯溶剂，剩余物用二氯甲烷稀释，并用H2O和饱和食盐水洗有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤和浓缩，剩余物经快速柱层析分离获得化合物1(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。
化合物1结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图3和图4，表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),8.96(s,1H),8.24(dd,J＝9.2,1.9Hz,1H),7.56(dd,J＝9.2,4.3Hz,1H),7.33–7.23(m,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),5.41(s,2H),5.24(m,3H),2.14(m,1H),1.94–1.78(m,2H),1.09(t,J＝6.1Hz,6H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.89,163.65,159.21,157.17,150.94,150.44,150.39,145.72,144.87,136.41,131.82,129.33,127.40,122.31,119.22,110.53,96.79,88.41,72.82,65.69,50.93,30.75,17.32,16.35,8.21.
13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.90,156.94,155.17,151.74,150.27,147.50,146.23,145.42,135.07,130.70,127.65,125.75,121.10,119.27,115.64,96.84,72.79,65.67,50.67,30.81,8.25。
实施例2：
化合物2：
Figure BDA0001766173490000091
的制备
化合物1(120mg,026mmol),Sc(OTf)3(78mg,0.16mmol)以及DMAP(94mg,0.78mmol)溶于干燥的二氯甲烷溶剂中，反应混合物常温条件下搅拌30分钟，再加入Boc-甘氨酸(136mg,0.78mmol)，反应混合物再搅拌30分钟，然后再加入DCC(272mg,1.3mmol)，反应混合物再在室温条件下搅拌过夜，然后硅藻土过滤，滤液浓缩后经快速柱层析分离获得化合物D(甲醇/二氯甲烷1:100作为洗脱体系)。
在化合物D(95mg,0.15mmol)的二氯甲烷溶液中加入TFA(1ml)，反应混合物再室温条件下搅拌30分钟后，移除反应溶剂，剩余物溶于DMF(2ml)，向反应溶液中加入丁二酸酐(97mg,0.97mmol)以及4-甲基吡啶(73mg,0.81mmol)，反应混合物在室温条件下搅拌过夜，移除反应溶剂，剩余物经快速柱层析分离获得目标产物化合物2(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。
化合物2结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图5和图6，表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.05(s,1H),9.81(d,J＝4.3Hz,1H),8.99(s,1H),8.42(t,J＝6.0Hz,1H),8.28(d,J＝9.2Hz,1H),7.59(d,J＝9.3Hz,1H),7.11(s,1H),5.48(s,2H),5.33(t,J＝8.9Hz,2H),5.21(s,1H),4.15(dd,J＝18.1,5.9Hz,1H),3.99(dd,J＝17.9,5.4Hz,1H),2.46–2.41(m,2H),2.36(dd,J＝12.1,5.7Hz,2H),2.14(d,J＝5.3Hz,3H),1.09(t,J＝6.0Hz,6H),0.93–0.86(m,3H).
13C NMR(101MHz；DMSO-d6)δ7.97,16.36,17.34,29.34,30.09,30.74,30.83,51.03,66.78,76.63,88.44,95.42,110.66,119.17,122.50,127.57,129.46,132.00,136.43,144.93,145.50,146.30,150.94,156.95,159.30,163.70,167.55,169.57,172.01,174.16。
本发明喜树碱衍生物/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性实验
实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。
实验步骤：
1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为1000-10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
2)将96孔板放在5％CO2，37℃培养箱中孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但常在前一天晚上铺板，次日上午加药。一般5～7个梯度，每孔5μL，设3-5个平行孔；5％CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察；每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；
3)终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值。
3种分子分别用于检测9种肿瘤细胞的抗癌细胞活性，分别为上述化合物1和化合物2以及拓扑替康。9种肿瘤细胞为：1)MGC80-3，人胃癌细胞；2)HepG-2，人肝癌细胞；3)MDA-MB-231，人乳腺癌细胞；4)SK-N-SH，人神经母细胞瘤；5)A549，人肺癌细胞；6)MCF-7，人乳腺癌细胞；7)KB，人口腔表皮样癌细胞；8)BEL-7402，人肝癌细胞；9)SMMC-7721，人肝癌细胞。实验结果见表1。
表1.喜树碱/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性
Figure BDA0001766173490000101
从表1体外抗肿瘤活性的评价数据可知，化合物1和2对多种肿瘤细胞表现出良好的体外抗肿瘤活性，尤其是人胃癌细胞MGC80-3、人肝癌细胞HepG-2和人神经母细胞瘤SK-N-SH。
本发明喜树碱衍生物/拓扑替康衍生物的体内抗肿瘤活性实验
体内抗肿瘤活性实验研究了拓扑替康和化合物2(Rngn-YH-011)对人肝癌裸鼠的治疗作用，采用人肝癌细胞株HepG2接种裸鼠建立荷人肝癌裸鼠模型。待荷瘤裸鼠瘤体积长至50mm3左右时，基于瘤体积随机化分组。按照以下不同方法给药治疗，检测动物体重、瘤径等指标，待给药结束后约1周将动物处以安乐死，称量瘤重并进行大体病理解剖检查。
实验结果如表2及图1和图2所示。
表2、拓扑替康和化合物2的体内抗肿瘤(HepG-2)活性
Figure BDA0001766173490000111
备注：T/C％表示相对肿瘤增殖率。计算公式为TRTV/CRTV×100％，其中T为治疗组，C为模型组。T/C％＜40％，且P＜0.05，为有效。
从表2及图1的实验结果可以看出，化合物2(YH-011)各剂量组均表现出良好的抑瘤效果，化合物2 4mg/kg和8mg/kg静脉给药组T/C％分别为17％和7％，化合物2 1.3mg/kg口服给药组T/C％为7％，其中TPT组T/C％为26％，各组别的相对肿瘤体积(RTV)与模型组比较均存在显著性差异(P＜0.01)。化合物2(静脉8mg/kg和口服1.3mg/kg)抗肿瘤作用显著优于TPT组(P＜0.01)。
此外，模型组动物在实验期间体重基本呈现上升趋势(图2)，化合物2在4mg/kg静脉注射组动物体重较给药前升高6.33％，8mg/kg静脉注射组动物体重较给药前升高4.86％，1.3mg/kg口服给药组动物体重较给药前升高6.79％。
本发明喜树碱衍生物的体内抗急性炎症实验
化合物2抗急性炎症的效果通过药物对小鼠注射内毒素(LPS)后存活率的影响来评价。
将C57小鼠随机分为10组，每组数量为10只。在开始实验前一天下午为小鼠禁食，不禁水。次日开始实验，为小鼠称重，根据体重各组小鼠分别给予相应的药物一次，给药后0.5h腹腔注射LPS，剂量为10mg/kg。注射LPS后1h、4h和8h后受试各组再分别给予一次受试药物。观察记录各组小鼠注射LPS后的死亡时间，连续观察72h。72h后对存活小鼠摘眼球取血约0.5ml/只，置离心机3000r/min离心10min，取血清，-80℃保存。监测动物体内炎症介质的表达，如前炎症细胞因子TNF-α、IL-6等。实验结果如表3～表5所示。
表3.注射LPS后各时间段小鼠存活率(％)(n＝10)
Figure BDA0001766173490000121
*P<0.05，**P<0.01vs溶剂对照组
表4.化合物2对血液中IL-6浓度的影响(pg/mL)
Figure BDA0001766173490000122
*异常数据剔除，另外该表格仅统计存活个体数据
表5.化合物2对血液中TNF-α浓度的影响(ng/L)
Figure BDA0001766173490000131
*血清样品不足，另外该表格仅统计存活个体数据
腹腔注射LPS 10mg/kg后，各组小鼠活动明显减少，四肢蜷缩无力，毛发竖起，呼吸加快并伴有轻度腹泻。在注射LPS 24h左右小鼠开始出现死亡，溶剂对照组24h存活率仅为40％，其它各给药组存活率较高，基本在90％以上(表3)。72h后，各组小鼠存活率分别为：溶剂对照组30％，阳性组100％，与溶剂对照组比较差异非常显著。化合物2组1(iv)、组2、(iv)组3(po)、组4(po)存活率分别为：80％、60％、100％、90％。可见化合物2与溶剂对照组比较抗LPS的效果非常明显，且灌胃给药的给药途径优于静脉注射的给药途径。从表4和表5中可以看出化合物2可以显著降低脓毒症小鼠血液中IL-6和TNF-α浓度。
本发明的9,10-恶嗪酮喜树碱衍生物，可以显著降低脓毒症小鼠血液中IL-6和TNF-α浓度，对急性炎症具有很好地治疗效果。
急性毒性评价
对化合物2进行了急性毒性评价。单次尾静脉给药实验结果显示，化合物2单次静脉给药18和20mg/kg出现毒性反应，确定化合物2单次静脉给药的MTD在15～18mg/kg附近。。化合物2一周重复给药的MTD在10mg/kg左右，而拓扑替康的MTD在2mg/kg左右
以上数据和分析证实了新制备的新型喜树碱/拓扑替康类衍生物相较于上市的拓扑替康，降低了毒性，提高了生物活性，因此，本发明的喜树碱衍生物在作为一类低毒、高效的候选新药应用具有广泛前景。
水溶性及剂型
用乙醇钠与候选化合物反应获得其钠盐，测量化合物2的水溶性。先用蒸馏水配成饱和溶液后用HPLC测浓度，再往这个水溶液中加样品，过滤后再测浓度。实验结果如表6所示。
表6、化合物2和拓扑替康的水溶性比较
Figure BDA0001766173490000141
从表中数据可知，候选化合物2的水溶性明显优于拓扑替康，而且候选药物水溶液的pH为7～8，接近人体生理pH，而拓扑替康(Topotecan)需在pH2～3时才有比较好的溶解度。
可见，相对于拓扑替康，本发明的化合物具有更好的抑瘤活性和更低的药物毒性。更为重要的是可以制备成为口服制剂，大大方便了病人服用。

Claims (11)

1.喜树碱衍生物，其化学结构通式(1)如下：
Figure FDA0002726179310000011
式中，R1选自H或HOOC-(CH2)2-CO-NH-CH2-CO-；
或其可形成的药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的喜树碱衍生物，其特征在于：喜树碱衍生物药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、铁、锌盐，或乙酸、2,2-二氯乙酸、已二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸，以及酰化氨基酸盐。
3.喜树碱衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：喜树碱衍生物如权利要求1或2所述。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：肿瘤为胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌。
5.喜树碱衍生物在制备治疗急性炎症药物中的应用，其特征在于：喜树碱衍生物如权利要求1或2所述。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：急性炎症为脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
7.一种组合物，其活性成分包括权利要求1或2所述的喜树碱衍生物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：其剂型为口服制剂或注射剂。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：组合物用于治疗肿瘤或急性炎症。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于：肿瘤为自胃癌，肝癌，乳腺癌，神经母瘤，肺癌，以及口腔表皮样癌。
11.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，急性炎症为脓毒症、败血症以及细菌或病毒引起的急性炎症。
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