CN110810638A - 玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用，具体涉及桑枝叶青贮发酵技术领域。本发明将玉米粉加入到桑枝叶的青贮原料中，经青贮发酵后取样分析，结果表明：(1)玉米粉能够有效提高桑枝叶青贮产品中的WSC(可溶性碳水化合物)、LA(乳酸)；(2)玉米粉能够降低桑枝叶青贮产品的pH值到4.5～5.0；(3)玉米粉与桑枝叶混合青贮可以产生乳酸型发酵，且没有BA(丁酸)生成，能有效改善桑枝叶的青贮环境，得到的青贮产品在气味、质地、色泽上具有更好的效果。
Description
技术领域
本发明属于桑枝叶青贮技术领域，具体涉及一种玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。
背景技术
饲养蛋白源不足是制约我国养殖业发展的瓶颈之一。桑叶是一种新型的蛋白质饲料，具有不与粮食作物争地，生态环保等优势，目前已在牛、羊、猪、鸡和鱼等饲料中应用，是我国正在大力扶持发展的重要方向，对保证我国粮食安全具有重要意义。桑叶的制成粉状添加剂和直接鲜食都有一些不足之处，制粉的成本较高，不利于桑叶的大规模利用，鲜桑叶直接利用的方式又不适应现代化规模化的养殖业对饲料的要求。
桑枝叶青贮是其饲料化利用的有效方法之一，也是应对桑树产叶季节性变化的有效措施。大量实验已发现桑叶单独青贮时，存在品质不佳的问题。有研究表示：桑叶的特性与苜蓿、饲料槐相似，在青贮时会因WSC较低，不利于 LAB(乳酸菌)的长期繁殖，不能大量产生乳酸，造成pH下降速度缓慢导致杂菌增殖，品质变坏。
针对上述问题，唐庆凤等提供了一种桑枝叶与玉米秸秆等比例混贮的方法，但其桑枝叶青贮产品的品质仍不理想。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明公开了玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。
优选的，所述提高桑枝叶青贮品质包括提高桑枝叶青贮产品中的WSC、提高桑叶青贮产品中的LA、降低桑枝叶青贮产品的pH值到4.5～5.0和消除桑枝叶青贮产品中的BA中的一种或多种。
优选的，所述应用包括如下步骤：
(1)将玉米粉与桑枝叶混合，得到青贮发酵原料；
(2)将所述青贮发酵原料置于青贮环境下发酵。
优选的，步骤(1)所述玉米粉与桑枝叶混合的质量比为0.8～1.2：4.5～5.5，
优选的，步骤(2)所述青贮环境为避光和密封。
优选的，步骤(2)所述发酵的温度为20℃～35℃。
优选的，步骤(2)所述青贮发酵原料的含水率约为50％～65％。
优选的，所述桑枝叶包括桑叶和/或桑枝。
优选的，所述桑枝叶为桑枝叶粉碎物；所述桑枝叶粉碎物的最大粒径≤ 2cm。
有益效果：
本发明提供了一种玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。本发明将饲料中常用的价格较低廉的原料玉米粉加入到桑枝叶的青贮原料中，经青贮发酵后取样分析，结果表明：(1)玉米粉能够有效提高桑枝叶青贮产品中的WSC、LA； (2)玉米粉能够降低桑枝叶青贮产品的pH值到4.5～5.0；(3)玉米粉与桑枝叶混合青贮可以产生乳酸型发酵，且没有BA生成，能有效改善桑枝叶的青贮环境，得到的青贮产品在气味、质地、色泽上极大地提高了产品的品质。
附图说明
图1为本发明实施例1中Y组主要微生物菌群数量变化；
图2为本发明实施例1中M组主要微生物菌群数量变化；
图3为本发明实施例1中Z组主要微生物菌群数量变化；
图4为本发明实施例1中J组主要微生物菌群数量变化；
图5为本发明实施例1中门、属水平下Y组微生物相对丰度图；
图6为本发明实施例1中门、属水平下M组微生物相对丰度图；
图7为本发明实施例1中门、属水平下Z组微生物相对丰度图；
图8为本发明实施例1中门、属水平下J组微生物相对丰度图；
图9为本发明实施例1中各处理间属水平下的主坐标分析(PCoA)。
具体实施方式
本发明提供了一种玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。在本发明中，所述玉米粉为常规市售玉米粉，本发明对所述玉米粉的具体来源不做特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明中，所用玉米粉优选由生玉米粉径恒温干燥灭菌处理。所述恒温干燥灭菌的温度优选为90～100℃，更优选为95℃。所述恒温干燥灭菌的时间优选为3～5h，更优选为4h。在本发明中，所述桑枝叶优选包括桑叶和/或桑枝，更优选为桑叶和桑枝。当所述桑枝叶为桑叶和桑枝时，本发明对所述桑叶和桑枝的混合比例不作特别限定，常规采摘后获得的桑叶和桑枝的比例即可。在本发明中，所述桑枝叶优选为桑枝叶粉碎物；所述桑枝叶粉碎物的最大粒径优选≤2cm。在本发明更具体的实施方式中，所述桑枝叶优选来源于重庆市畜科院饲料桑基地，品种为桂桑优62。在本发明中，所述提高桑枝叶青贮品质优选包括提高桑枝叶青贮产品中的(可溶性碳水化合物)WSC、提高桑叶青贮产品中的(乳酸)LA、降低桑枝叶青贮产品的pH值到4.5～5.0和消除桑枝叶青贮产品中的BA中的一种或多种。
在本发明中，所述应用优选包括如下步骤：
(1)将玉米粉与桑枝叶混合，得到青贮发酵原料；
(2)将所述青贮发酵原料置于青贮环境下发酵。
本发明先将玉米粉与桑枝叶混合，得到青贮发酵原料。在本发明中，所述玉米粉与桑枝叶混合的质量比优选为0.8～1.2：4.5～5.5，更优选为1：5。本发明对所述混合的方法不作特别限定，本领域常规方法均可。混合后，得到青贮发酵原料。
本发明将所述青贮发酵原料置于青贮环境下发酵。在本发明中，所述青贮环境优选为避光和密封。所述发酵的环境温度优选为20～35℃，更优选为 22～28℃。所述其青贮发酵原料的含水率优选为50％～65％，更优选为55％～60％。发酵后，得到桑枝叶青贮产品。
本发明研究表明：添加玉米粉能快速提高青贮有益微生物的丰度，抑制真菌等有害杂菌。在添加玉米粉的桑枝叶青贮过程中的微生物变化主要表现为：变形菌门的肠杆菌属(Enterobacter)和大肠埃希菌志贺菌属 (Escherichia-shigella)比例下降，厚壁菌门有肠球菌属(Enterococcus)，乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)比例上升。
桑枝叶在青贮过程中，CP(粗蛋白)、DM(干物质)，NDF(中性洗涤纤维) 和ADF(中性洗涤纤维)含量在第10d后皆趋于稳定。本发明通过在桑枝叶青贮过程中添加玉米粉或添加乳酸菌，发现玉米粉或乳酸菌能快速降低青贮料的 pH值，显著降低NH3-N的含量。但添加乳酸菌在青贮后期pH值上升，发生了二次发酵产生了较高的BA，说明WSC不足限制了LAB在青贮中的发酵作用和 LA的合成。而添加玉米粉的桑枝叶发酵能够通过提升其WSC的含量，同时桑枝叶青贮过程中的LAB的丰度，进而产生足够的LA来保持青贮品质的稳定，来达到显著改善青贮品质的技术效果，解决了桑枝叶单独青贮品质不高的问题。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1 材料与方法
1.1 试验材料
桑枝叶：种植于重庆市畜科院饲料桑基地，品种为桂桑优62。
玉米粉：生玉米粉，购于荣昌区宝荣路23号大润发超市，95℃恒温干燥箱灭菌4h，青贮添加量为90g/重复。
植物乳杆菌：购于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，保藏编号：ACCC11016，配制4.30×109CFU/ml菌液，青贮添加量为0.5ml/重复。
布氏乳杆菌：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号： 20293，配制6.32×108CFU/ml菌液，青贮添加量为0.5ml/重复。
1.2 试验设计
采取桑树中嫩枝刈割的方式，于2018年6月15日14:00-18:30在重庆市畜科院饲料桑基地通过选取离地0.3m，叶片完整，叶面无水，无虫蛀，无白点的平均株高0.7m桂桑优62桑枝，剪取足量带叶桑枝，带回试验室摊平萎蔫，于 16日8:30处理桑枝，保留足量桑枝叶并用灭菌菜刀切短至2cm，其余桑枝枝叶分离，将桑叶切短至2cm，桑枝保留原长度；各选择1.35kg桑叶、桑枝叶分装后存于冷藏室，用作附生与内生菌数量、多样性与化学成分测定。
青贮制作将桑叶组(Y)，桑枝叶组(Z)，添加乳酸菌桑枝叶组(J)与添加玉米粉桑叶组(M)共4个处理，每个处理设置3个重复，按照比例混匀后分装至带单向排气阀专用青贮袋中，每袋约装0.45kg，用真空包装机真空包装并封口，于17日2:00制作结束后，青贮袋20℃-30℃避光保存发酵。在青贮完成后的第1、3、5、7、10、14、20、28、38、56d分袋取样，每重复(每袋) 用作单处理单重复单时间点的样本仅取样一次，进行微生物、化学成分和发酵品质的分析，青贮56d对青贮品质进行鉴定。
1.3 样品采集
根据设置的青贮时间分时在无菌环境下每个处理分别称取8g、8g与9g共计25g用于微生物分离培养，每个重复分别称取100g样本冷冻于-30℃用于发酵品质测定与微生物多样性分析，剩余样本置于103℃恒温干燥箱快速烘杀 15min，65℃烘干粉碎用于测定化学成分。
1.4 主要仪器与试剂
1.4.1 主要仪器
超净工作台、恒温培养箱、分析天平、厌氧培养袋、全自动菌落计数器和立式高压灭菌锅。
1.4.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(PotatoDextroseAgar，PDA)培养基，营养琼脂(NutrientAgar，NA)培养基和MRS(de Man,Rogosa and Sharpe，MRS)培养基：青岛海博生物技术有限公司
强化梭菌鉴别琼脂(Differential Reinforced Clostridial Agar，DRCA)培养基：北京索莱宝科技有限公司
1.5 样品处理方法
1.5.1 主要微生物分离计数
样品中的LAB、霉菌和酵母菌和梭菌计数参考《全株玉米青贮制作与质量评价》进行，LAB、霉菌和酵母菌和好氧菌计数分别参照GB 4789.35-2016、 GB4789.15-2016和GB4789.2-2016并作出适当改动，方法如下：
取待测样品，剪碎，混匀，准确称取25g(处理重复3袋随机各取8g，8g， 9g)，放入装有225mL无菌水的500mL烧杯中，灭菌保鲜膜封口，置于摇床上震荡30min，使微生物细胞分散，静置30～60s，即成10-1稀释液；再用移液枪吸取10-1稀释液2mL，移入装有18mL无菌水的试管中，吹吸6次，使菌液充分混匀，即成10-2稀释液；再换1支移液枪吸头吸取10-2稀释液2mL，移入装有18mL无菌水的试管中，也吹打6次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4-10-9一系列稀释菌液。每种培养基取2个稀释度，2个重复，使用移液枪滴加80μL相应处理的稀释液，使用涂布棒涂抹培养基表面涂抹均匀，每涂布1皿换用1个枪头，同时涂布棒置于酒精灯上灼烧灭菌，待冷却后处理下一个；空白组滴加80μL生理盐水。待菌液渗入培养基，翻转培养皿，将MRS培养皿放于内置足量吸氧剂与指示剂的MGCAnaeroPac C-43厌氧袋，与NA、DRCA培养皿分置放入培养箱中，37℃恒温培养2d；PDA培养皿置于紫外灭菌培养箱，30℃恒温培养2d，采用Interscience
500菌落计数器计数。
2.1 青贮过程中主要微生物的数量变化
为了探究不同时间处理的差异显著性，对不同分组和不同取样时间点进行双因素方差分析，表1显示各处理和时间之间均有极显著差异，说明在青贮过程中发生了极显著的微生物数目变化，所取的青贮时间点具有统计学意义。
Y组主要微生物的数量变化如图1，LAB在青贮期间经历了两次波动，在第0d到第3d急剧增加，于第3d达到最大值9.15lgCFU/g，在第5d有所下降，第7d回升至8.59lgCFU/g，之后趋于平缓，LAB数量维持在107.5-108.5之间。梭菌在第3d和第10d分别达11.75lgCFU/g和10.23lgCFU/g，数量显著高于其他微生物；霉菌酵母菌和好氧菌呈现相似的变化动态，分别在第3d和第7d达到峰值；各种微生物均在第14d趋于平缓，到第56dLAB已经明显高于其他微生物，在7.64lgCFU/g，霉菌酵母菌数量最低，在5.99lg CFU/g。
表1 处理间基于微生物数量的双因素方差分析
| 微生物 | 青贮天数 | 处理组 | 青贮天数×处理组 | R方 |
| 乳酸菌 | ** | ** | ** | 0.885 |
| 好氧菌 | ** | ** | ** | 0.921 |
| 霉菌酵母菌 | ** | ** | ** | 0.955 |
| 梭菌 | ** | ** | ** | 0.959 |
注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，NS表示无显著差异
通过在桑叶中添加20％玉米粉，M组主要微生物的数量变化如图2，从青贮开始微生物的数量急速上升，LAB、梭菌和霉菌酵母菌在第3d达到最大值，分别为9.17lgCFU/g、9.89lg CFU/g、10.34lg CFU/g，好氧菌在第5d达到最大值，为9.27lg CFU/g，霉菌酵母菌和梭菌在第7d到达第2个峰值，LAB则在第10d 到达，各种微生物均在第10d后开始下降，其中好氧菌和霉菌酵母菌的下降趋势相同且最大，在56d时下降至5.54lg CFU/g和5.48lg CFU/g，LAB在第20d是数量超过了其他微生物，所有分离的微生物均在第20d后呈平稳下降趋势。
Z组要微生物的数量变化如图3，各种微生物均在第3d达到最大值，但LAB 的含量最少，仅为9.65lg CFU/g，好氧菌则达到了11.64lg CFU/g，除霉菌酵母菌外，其他微生物在第7d到达第2个峰值，之后各微生物的变化趋于一致，在第20d到达第3个峰，之后各种微生物的数量逐渐下降，LAB的数量超过了其他微生物，第56d到达最低值微生物数量均在106.5CFU/g左右。
通过在桑枝叶中添加0.2％植物乳杆菌+布氏乳杆菌，J组主要微生物的数量变化如图4，微生物在第3d到达第1个峰值，其中梭菌和好氧菌达到最大值，分别为9.67lg CFU/g和9.86lg CFU/g，霉菌酵母菌在第7d到达最大值，之后迅速下降，各种微生物均在第10d后稳定下降，在20d时LAB的数量超过其他微生物。
2.2 青贮过程中的微生物多样性变化
2.2.1 基本数据分析
如表2和表3所示，在科分类下Y,Z,J,M各组经过青贮香农指数均有下降，其中，Y组的香农指数下降40.379％，Z组下降43.145％，J组下降19.884％， M组下降47.809％，J组下降幅度最低，其香农指数在整个青贮期都显著低于其他组；选择相对丰度>0.1％的序列，发现分类数大大降低，Y、Z、J、M组分别下降 65.070％、57.836％、78.552％和68.895％；在同组内随着青贮时间的增加下降幅度也相应增加，在Y组中，分类数的下降幅度从54.919％增加到76.472％，Z组从12.873％增加到68.316％，J组从66.175％增加到83.571％，M组从44.791％增加到82.142％，虽然相对丰度>0.1％的序列数和香农指数也有所下降但下降幅度并不大，保留了90.580％-98.848％的序列和微生物多样性；在选择相对丰度>1％的条件下，微生物分类数下降至测得总分类数的4.592％-32.673％，仍然保留了 64.734％-91.593％的序列和多样性。
在属分类下，共在Y、Z组原料中检测到约98个分类群，经过青贮处理，仍有103个分类群，J、M组中分类群也没有较大的变化，经过对大于相对丰度0.1％和1％菌群进行筛选，不同处理的分类数和香农指数显著降低，J、M组降低程度要显著高于Y、Z组。
2.2.2 门、属水平下各处理间的菌群组成
如图5所示，在Y组中，不同时期的优势体现在变形菌门Proteobacteria)丰度降低与厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加，放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)仅在青贮前和第3d有较高的存在，放线菌大部分是腐生菌，具有与霉菌相似的气味，大多数放线菌都是好气菌，拟杆菌门(Bacteroidetes) 主要有三大类微生物，分别为拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲，拟杆菌纲是粪便中的主要微生物，而黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲常生活在水中。
在Y组原料中的主导菌分别为肠杆菌属(Enterobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、Aureimonas、甲基杆菌属(Methylobacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)；肠杆菌属 (Enterobacter)在青贮全期都存在且经历了先变多后边少的动态，在14d达到最大50.950％；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、Aureimonas、甲基杆菌 (Methylobacterium)在桑叶中有较高的含量，在青贮过后相对丰度则大量降低，其中Aureimonas在原料中高达29.122％；薄层菌属(Hymenobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、未分类属(Microbateriaceae)和未分类属 (Comamonadacese)在原料中相对丰度都>1％，但含量很少，分别仅占 4.988％、4.582％、1.352％和1.991％，而大肠埃希菌志贺菌属 (Escherichia-shigella)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus) 和魏斯氏属(Weissella)在青贮后才出现，及相对丰度超过1％，在第7d达到最大值，分别为33.312％、16.121％、7.345％和11.337％。除大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)之外，其余微生物在第7d后丰度下降，不再呈现优势；乳杆菌属(Lactobacillus)也在青贮后出现，它的相对丰度随着青贮时间的延长而增多，在青贮56d达到49.256％。
如图6所示，M组中门水平的微生物变化与Y组呈现相似的丰度变化，都是从变形菌门(Proteobacteria)丰度降低，厚壁菌门(Firmicutes) 丰度增加的趋势，在整个青贮过程中厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度的比值都高于Y组，拟杆菌在M组不再有菌群优势，未在丰度图中体现。厚壁菌门(Firmicutes)目前可分为3个纲：厌氧的梭菌纲，兼性或者赚性好氧的芽胞杆菌纲和没有细胞壁的柔膜菌纲，其中目前在发酵产业相关的乳杆菌大多来自于芽胞杆菌纲的微生物，变形菌门(Proteobacteria)中的微生物常被发现在植物和动物体中，以内生菌或肠道微生物的形式存在。
与Y组相比，M组抑制了甲基杆菌属(Methylobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、和Aureimonas在原料中的比例，相对丰度各降至4.872％、5.256％、6.174％和5.874％，经过青贮丰度也呈现下降趋势；在青贮中下降的微生物还有肠杆菌属(Enterobacter)、魏斯氏属(Weissella)和乳球菌属(Lactococcus)，各自经历了47％-18％、8％-1％和22％-2％的丰度变化；乳杆菌属(Lactobacillus)在青贮全期的相对丰度皆有所提升，在第56d时平均相对丰度达到68.926％，泛菌属(Pantoea)、戊糖片球菌(Pediococcus)和假柠檬酸盐杆菌属(Pseudocitrobacter)仅在第14d超过1％。
如图7所示，在Z组中主导菌的变化与Y组相似，值得注意的是，尽管在青贮第7d时放线菌门(Actinobacteria)已不再占据优势(相对丰度<1％)，但在青贮56d有较高的存在(3％)，暂不清楚是原料的影响还是空气的进入造成好氧菌的比例增大。
在Z组中的变化大致可分为3种，第一种在青贮全期可见(相对丰度皆大于1％)，有乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Aureimonas、甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、大肠埃希菌·志贺菌属(Escherichia-shigella)和肠球菌属(Enterococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)在青贮过程中丰度增加，分别从2％扩大到45％和3％，而Aureimonas、甲基杆菌属(Methylobacterium)和鞘脂单胞菌属 (Sphingomonas)则减少，原料中它们的比例分别占22.496％、12.128％和23.357％；大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)和肠球菌属(Enterococcus) 未呈现明显的丰度变化。第二种在原料中不占据优势，青贮之后丰度才>1％, 此类微生物有魏斯氏属(Weissella)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、戊糖片球菌(Pediococcus)、未分类属(Enterobacteriaceae)、未分类属(Lactobacillales)、假柠檬酸盐杆菌属(Pseudocitrobacter)和狭义梭菌属类群12(Clostridium_sensu_stricto_12)，其中魏斯氏属(Weissella)在第14d达到最大相对丰度值，为5.998％；肠球菌属(Enterococcus)在第7d达到最大相对丰度值，为58.168％；乳球菌属 (Lactococcus)随着青贮时间的延长相对丰度逐渐降低，从26％降至3％，戊糖片球菌(Pediococcus)随青贮时间延长而增加，但最大相对丰度仅占 2.351；未分类属(Enterobacteriaceae)、未分类属(Lactobacillales)和假柠檬酸盐杆菌属(Pseudocitrobacter)在青贮期间都有少量存在，狭义梭菌属类群12(Clostridium_sensu_stricto_12)仅在第56d有出现。第3种微生物集中出现在青贮前期,微杆菌属(Microbacterium)和变形杆菌属(Proteus)仅在青贮第7d前相对丰度>1％，未分类属(Microbateriaceae)在前3d中相对丰度>1％，仅在原料中相对丰度>1％的有芽孢杆菌属(Bacillus)、薄层菌属 (Hymenobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和螺状菌属(Spirosoma)，前两者占12.990％和3.443％。
如图8所示，在J组中微生物种类和丰度度发生了较大地变化，厚壁菌门(Firmicutes)在青贮起始(第3d)就已占据主导优势，变形菌门(Proteobacteria) 的相对丰度被降到了10％以下。
J组自青贮第3d起，乳杆菌属(Lactobacillus)便保持了90％的绝对主导地位，Aureimonas随着青贮时间延长受到抑制，其很快便从5％下降至1％，肠杆菌属(Enterobacter)随青贮时间增长，但在青贮结束时也没有超过5％，剩余2种为鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和大肠埃希菌志贺菌属 (Escherichia-shigella)则一直保持在1％-2％。
如表4所示，在所有处理组的微生物动态变化中，大致可以分为3类，第 1种在Y、Z组中相对丰度都>1％，其中肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)和乳球菌属(Lactococcus)在全部时间相对丰度都>1％，J组、M组的处理对肠杆菌属(Enterobacter)没有明显的抑制作用，J组的处理使得肠球菌属 (Enterococcus)、大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)和乳球菌属(Lactococcus)在青贮中不再出现(<1％),而M组的处理仅影响了肠球菌属(Enterococcus)在第14d后的菌群优势，对以上其他微生物均无较大影响，乳杆菌属(Lactobacillus)作为桑叶青贮的“主力军”，在桑叶常规青贮中前 3d并未占据优势。
第2种仅在部分时间占据优势，其中Aureimonas、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和甲基杆菌(Methylobacterium)在青贮0-7天存在， J、M组中Aureimonas和鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)的变化与Y、Z组一致，而甲基杆菌属(Methylobacterium)在J组中不再出现，未分类属 (Enterobacteriaceae)和魏斯氏属(Weissella)分别在3-14d，14-56d出现，在J组处理得到有效抑制。第3种微生物仅在常规料中出现，如未分类属 (Comamonadaceae)在Y组中出现，螺状菌属(Spirosoma)、金黄杆菌属 (Chryseobacterium)和变形杆菌属(Proteus)仅在Z组中出现，薄层菌属 (Hymenobacter)、未分类属(Microbacteriaceae)和微杆菌属 (Microbacterium)在Y、Z组原料中及青贮第0d皆存在，双歧杆菌属(Bifidobacterium)在Z组的原料和青贮料及青贮第56d有发现；戊糖片球菌(Pediococcus)则在第56d存在，在J、M组中抑制了它的出现。
表4 属水平下不同时间微生物的种类变化(＞1％)
注：表格中的“√”指在该处理青贮时间点上，该微生物的样本平均相对丰度>1％,没有“√”代表该微生物<1％，标题行不同字母表示不同处理，数字表示不同时间。
2.2.3 属水平下各处理间的微生物差异性分析
通过主坐标分析，可以利用降维的方式来研究样本中群落组成的相似性，利用一系列特征值和特征向量进行排序选择主要特征值表现在坐标系中，样本间的距离显示了其群落间的相似程度。
在对不同样品结果的主坐标分析中，J组紧密的聚类在一起，除0Z1,3Z3 样本外，其他组则形成了0d，3-7d，7-14d,14-56d以青贮时间做区分的聚集，其中M组的部分样本聚集有所提前(7M样本与3Y、3Z样本聚集)，所有时期J组均与56d的其他处理相近，PCoA图解释了添加剂对桑叶和桑枝叶的影响，及M组样本与Z组相比，微生物变化提前；J组所有时期的样本都近似于Y、Z、M组第56d的样本，各各处理间属水平下的主坐标分析(PCoA) 如图9。
3 结论
(1)在Y、Z组青贮原料中以Aureimonas、鞘脂杆菌属(Sphingomonas) 和甲基杆菌属(Methylobacterium)丰度最高，占79.3％。在大于1％的物种中，能产LA的微杆菌科(Microbateriaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus) 仅占5％，不具优势。青贮第3d是微生物最大值的时间，Y组中的梭菌最多，为11.75lg CFU/g，Z组中梭菌和好氧菌最多，皆为11lgCFU/g；在J、 M组中，梭菌和好氧菌数量均降至10lgCFU/g以下，M和J的处理均抑制了Y、Z中梭菌和好氧菌的数量。
(2)各科属微生物的分类数经过青贮没有较大的变化，M组的处理增加了LAB的相对丰度，J组的处理极大降低了有害菌的相对丰度，使乳杆菌属在全期均占据优势。在Y、Z组和M组中，大量变形菌门丰度降低，厚壁菌门增多，主要表现在肠杆菌属(Enterobacter)和大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)丰度变低，肠球菌属(Enterococcus)，乳球菌属 (Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)丰度变高；而J组抑制了除乳杆菌属外所有微生物(包括其他属的LAB)的优势。
(3)用PCoA检测不同时间、处理样品中微生物进化上的相似性，发现Y、Z组中，原料与青贮料有着很大的群落差异，M组处理使桑枝叶中微生物提前进入青贮乳酸发酵期和稳定期。J组处理使乳杆菌属在青贮第3d后的相对丰度增加并一直维持在90％以上。
实施例2
1 材料与方法
1.1 试验材料
见实施例1的1.1和1.3
1.2 主要仪器与试剂
1.2.1 主要仪器
世纪方舟pHS-3C+、恒温鼓风干燥箱、真空泵、岛津高效液相色谱 LC-20A液相色谱仪、超声波振荡器、恒温震荡器、紫外分光光度计、FOSS 脂肪提取仪(索氏提取器)、FOSS纤维测定仪、VELP全自动凯氏定氮仪和恒温水浴锅。
1.2.2 主要试剂
0.45μm合成纤维素酯膜：天津市津腾实验设备有限公司；乳酸标品：北京索莱宝科技有限公司,纯度>98％；乙酸标品： EhrenstorferQualityDr.Ehrenstorfer,纯度>99％；丙酸标品： EhrenstorferQualityDr.Ehrenstorfer,纯度>98％；丁酸标品： EhrenstorferQualityDr.Ehrenstorfer,纯度>99％；色谱柱：AgilentHC-C18柱(250 mm×4.6mm),5-Micron。
1.3 样品处理与分析方法
1.3.1 发酵品质分析
将冻存于-30℃的青贮样本各自准确称取20g于100mL蓝盖瓶中，入 100mL纯水于4℃振荡30min，用4层纱布过滤，再转移至100mL蓝盖瓶中，用方舟pHS-3C+检测滤液的pH值，滤液用于测定NH3-N[93]；另取10g样本装入加有100mL超纯水的蓝盖瓶中，旋紧瓶盖置于4℃浸提24h,每12h振荡 1次，取出后用4层纱布、中速定量滤纸先后抽滤到10mL离心管中，冻存于-30℃，使用前解冻并使用0.45μm合成纤维素酯膜过滤，根据白杰的方法用高效液相色谱仪测定LA、AA、PA和BA。标曲及条件有改动，改动如下：色谱柱的洗脱：开始：90％甲醇超纯水溶液洗脱30min，12％甲醇超纯水溶液洗脱20min。结束：10％甲醇超纯水溶液洗脱30min，50％甲醇超纯水溶液洗脱30min，100％甲醇洗脱45min，总流速0.8mL/min。
平衡柱子与跑样：1：9的甲醇：pH＝2.70.02mol/LKH2PO4，总流速1mL/min，单次30min，柱温30℃。
表5 测定有机酸混合标样浓度
1.3.2 化学成分测定
干物质(Drymatter，DM)：样本中DM的测定参考GB/T6435-2014；
粗蛋白(Crude protein，CP)：样本中CP的测定参考GB/T 6432-94；
粗脂肪(Ether extract，EE)：样本中EE的测定参考GB/T6433-2006；
可溶性糖(Water-soluble carbohydrate，WSC)：样本中WSC根据邹琦[98]的《植物生理学实验指导》进行测定，略有改动，改动部分如下：取风干样本 0.3g放入具塞试管中，加入10mL纯水，盖紧，于95℃水浴锅恒温提取60min，过滤于25mL容量瓶，定容并用于测定；
中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)：样本中NDF的测定参考
GB/T 20806-2006；
酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)：样本中ADF的测定参考 NY/T1459-2007。
1.3.3 缓冲能值测定
缓冲能的测定参考Playne等与包娜等的酸碱滴定法测定，计算公式有改动，改动如下：
1.3.4 数据分析
基础数据使用Excel2016整理汇总，用IBMSPSSStatistics20进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 桑枝叶原料特性
由表6可以得出，Y组和Z组的原料差异主要来自于ADF与NDF，Z 组中的ADF与NDF显著高于Y组，作为禾本科的植物，桑枝叶中的BC低于豆科植物，但桑枝叶中的WSC含量较少，可能会影响LAB的发酵，是一种较难青贮的植物原料。
表6 桑枝叶青贮原料特性
2.2 青贮发酵品质变化
2.2.1 pH值动态变化
从表7可以看到，除J组外，其他组在前10天pH的下降趋势相似，在第10d后Z、Y组的趋于平缓，M组的pH显著低于Y组，Y组显著低于Z 组；在第38d后Y、Z组的pH值有上升趋势；J组pH值在第7d降到最低，在第14d后有所上升，但都低于Z组。
表7 pH值动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 6.748±0.007 | - | 6.708±0.026 | - |
| 1 | 6.720±0.031<sup>b</sup> | 6.608±0.029<sup>c</sup> | 6.845±0.062<sup>a</sup> | 6.618±0.018<sup>c</sup> |
| 3 | 6.553±0.086<sup>a</sup> | 6.387±0.041<sup>a</sup> | 6.513±0.052<sup>a</sup> | 5.470±0.387<sup>b</sup> |
| 5 | 6.110±0.043<sup>a</sup> | 6.152±0.064<sup>a</sup> | 6.285±0.105<sup>a</sup> | 4.640±0.246<sup>b</sup> |
| 7 | 6.025±0.041<sup>a</sup> | 6.115±0.069<sup>a</sup> | 5.998±0.261<sup>a</sup> | 4.553±0.073<sup>b</sup> |
| 10 | 5.728±0.136<sup>a</sup> | 5.677±0.095<sup>a</sup> | 5.682±0.036<sup>a</sup> | 4.610±0.161<sup>b</sup> |
| 14 | 5.323±0.038<sup>b</sup> | 5.127±0.137<sup>c</sup> | 5.672±0.220<sup>a</sup> | 4.567±0.175<sup>d</sup> |
| 20 | 5.158±0.065<sup>a</sup> | 4.700±0.118<sup>b</sup> | 5.290±0.052<sup>a</sup> | 4.782±0.233<sup>b</sup> |
| 28 | 4.880±0.065<sup>b</sup> | 4.362±0.057<sup>c</sup> | 5.050±0.037<sup>a</sup> | 4.847±0.106<sup>b</sup> |
| 38 | 4.677±0.036<sup>b</sup> | 4.250±0.027<sup>c</sup> | 5.185±0.114<sup>a</sup> | 5.093±0.378<sup>a</sup> |
| 56 | 4.800±0.089<sup>b</sup> | 4.288±0.048<sup>c</sup> | 5.468±0.343<sup>a</sup> | 4.887±0.033<sup>b</sup> |
注：数据形式为平均数±标准差，“-”表示无数据，单行右方的不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2.2 有机酸动态变化
从表8可以看到，LA含量的变化分为2个时段，第0-14d时，J组的 LA含量显著高于其他组，20-56d M组显著高于其他组，青贮全期Y、Z组中的LA含量没有显著差异。
表8 乳酸含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | - | - | 0.140±0.212 | - |
| 1 | 0.150±0.369<sup>a</sup> | 0.200±0.280<sup>a</sup> | - | 0.300±0.471<sup>a</sup> |
| 3 | 0.020±0.029<sup>b</sup> | 0.210±0.292<sup>b</sup> | - | 2.840±0.597<sup>a</sup> |
| 5 | 0.290±0.455<sup>b</sup> | 0.130±0.114<sup>b</sup> | 0.090±0.112<sup>b</sup> | 4.660±1.690<sup>a</sup> |
| 7 | 1.920±0.754<sup>b</sup> | 0.790±0.209<sup>c</sup> | 2.190±0.323<sup>b</sup> | 3.850±0.781<sup>a</sup> |
| 10 | 1.700±0.686<sup>b</sup> | 0.800±0.363<sup>c</sup> | 1.180±0.063<sup>b</sup> | 3.680±0.708<sup>a</sup> |
| 14 | 2.670±0.415<sup>b</sup> | 2.830±0.417<sup>b</sup> | 2.090±0.473<sup>b</sup> | 3.670±1.017<sup>a</sup> |
| 20 | 2.170±0.141<sup>ab</sup> | 2.430±0.247<sup>a</sup> | 1.480±0.521<sup>b</sup> | 2.190±0.700<sup>ab</sup> |
| 28 | 2.550±0.303<sup>b</sup> | 3.760±0.675<sup>a</sup> | 1.750±0.636<sup>b</sup> | 1.710±0.226<sup>b</sup> |
| 38 | 2.590±0.271<sup>b</sup> | 3.680±0.202<sup>a</sup> | 0.900±0.384<sup>c</sup> | 0.990±0.321<sup>c</sup> |
| 56 | 1.570±0.493<sup>b</sup> | 10.580±0.585<sup>a</sup> | 1.070±0.408<sup>b</sup> | 4.550±3.475<sup>b</sup> |
从表9可以看到，J组的AA含量在全期皆少于其他组，各组AA含量呈现波动上升的趋势，其中，Y、Z组之间呈现一致的变化趋势，M组在第 5d和第56d具有较高的AA含量。
表9 乙酸含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | - | - | 0.320±0.313 | - |
| 1 | 0.040±0.089<sup>ab</sup> | 0.600±0.922<sup>ab</sup> | - | 1.170±1.547<sup>a</sup> |
| 3 | 0.660±0.491<sup>b</sup> | 2.370±1.847<sup>a</sup> | 0.770±0.738<sup>b</sup> | 0.050±0.043<sup>b</sup> |
| 5 | 1.730±0.967<sup>b</sup> | 4.630±1.125<sup>a</sup> | 2.140±0.871<sup>b</sup> | 0.050±0.071<sup>c</sup> |
| 7 | 4.930±0.346<sup>b</sup> | 1.790±0.453<sup>c</sup> | 6.160±1.231<sup>a</sup> | 0.840±0.340<sup>d</sup> |
| 10 | 3.360±0.101<sup>a</sup> | 2.900±0.590<sup>b</sup> | 2.760±0.269<sup>b</sup> | 1.320±0.177<sup>c</sup> |
| 14 | 3.320±0.365<sup>b</sup> | 3.060±0.269<sup>b</sup> | 4.020±0.420<sup>a</sup> | 1.450±0.540<sup>c</sup> |
| 20 | 3.120±0.337<sup>a</sup> | 1.890±0.116<sup>b</sup> | 3.070±0.592<sup>a</sup> | 0.790±0.182<sup>c</sup> |
| 28 | 2.900±0.638<sup>a</sup> | 2.640±0.638<sup>a</sup> | 3.500±0.215<sup>a</sup> | 0.900±0.303<sup>b</sup> |
| 38 | 2.770±0.474<sup>ab</sup> | 2.460±0.362<sup>ab</sup> | 3.240±0.261<sup>a</sup> | 1.890±0.775<sup>b</sup> |
| 56 | 3.620±0.366<sup>b</sup> | 6.550±1.081<sup>a</sup> | 3.500±1.584<sup>b</sup> | 3.990±1.775<sup>b</sup> |
从表10可以看到，各组PA多在青贮前期(第0-5d)有稳定出现在饲料中；除J组外，第7d后各组多数时间均未检出PA，但J组在青贮后期(14-56d) 含有0.15％-0.6％的PA。
表10 丙酸含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 0.090±0.216<sup>a</sup> | - | 0.140±0.349<sup>a</sup> | - |
| 1 | 0.720±0.962<sup>a</sup> | 0.820±0.618<sup>a</sup> | 0.420±0.568<sup>a</sup> | - |
| 3 | 1.400±0.158<sup>a</sup> | 0.370±0.544<sup>b</sup> | 0.690±0.792<sup>ab</sup> | 0.480±0.753<sup>b</sup> |
| 5 | 0.530±0.414<sup>a</sup> | 0.250±0.454<sup>ab</sup> | 0.230±0.361<sup>ab</sup> | 0.020±0.061<sup>b</sup> |
| 7 | 0.080±0.067<sup>a</sup> | - | - | - |
| 10 | - | - | - | - |
| 14 | - | 1.000±0.482<sup>a</sup> | - | 0.620±0.176<sup>b</sup> |
| 20 | - | - | 0.030±0.054<sup>a</sup> | 0.520±0.589<sup>a</sup> |
| 28 | - | - | - | - |
| 38 | - | - | 0.090±0.139<sup>a</sup> | 0.150±0.080<sup>a</sup> |
| 56 | - | - | - | 0.300±0.187 |
从表11可以看到，各组多在青贮中后期(第10-56d)有稳定的BA出现在饲料中，其中，除第38dY组的BA含量达到1％，其他各组不同时间的 BA含量均在0.7％以下，J、M组呈现与Y、Z组一样的BA水平。
表11 丁酸含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | - | - | - | - |
| 1 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 10 | 0.060±0.090<sup>b</sup> | 0.440±0.274<sup>a</sup> | - | 0.020±0.048<sup>b</sup> |
| 14 | 0.060±0.099<sup>a</sup> | 0.010±0.016<sup>a</sup> | - | 0.650±0.720<sup>b</sup> |
| 20 | 0.110±0.106<sup>a</sup> | - | 0.090±0.091<sup>a</sup> | 0.180±0.310<sup>a</sup> |
| 28 | - | 0.580±1.007<sup>a</sup> | 0.470±0.755<sup>a</sup> | 0.280±0.490<sup>a</sup> |
| 38 | 1.190±1.033<sup>a</sup> | 0.680±1.174<sup>a</sup> | 0.360±0.338<sup>a</sup> | 0.380±0.655<sup>a</sup> |
| 56 | 0.320±0.548<sup>a</sup> | - | 0.350±0.509<sup>a</sup> | 0.470±0.813<sup>a</sup> |
2.2.3 氨态氮动态变化
从表12可以看到，各组的NH3-N含量随着时间的延长整体呈现升高的趋势，在第38d后趋于稳定，Y组与Z组除第14d外在青贮全期NH3-N的含量没有显著差异，在第5d后J、M组的NH3-N含量显著低于Y、Z组，青贮结束时，NH3-N含量以J组最低，仅为0.080％，其次是M组0.064％，Y、Z组依然没有显著性差异。
表12 氨态氮含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | J(％) | Z(％) | M(％) |
| 0 | 0.002±0.002 | - | 0.000±0.001 | - |
| 1 | 0.003±0.003<sup>a</sup> | 0.003±0.007<sup>a</sup> | 0.003±0.001<sup>a</sup> | 0.004±0.003<sup>a</sup> |
| 3 | 0.017±0.004<sup>a</sup> | 0.015±0.001<sup>a</sup> | 0.014±0.003<sup>a</sup> | 0.013±0.003<sup>a</sup> |
| 5 | 0.020±0.003<sup>a</sup> | 0.015±0.002<sup>c</sup> | 0.016±0.003<sup>ab</sup> | 0.012±0.003<sup>bc</sup> |
| 7 | 0.036±0.003<sup>a</sup> | 0.030±0.005<sup>c</sup> | 0.039±0.005<sup>a</sup> | 0.019±0.003<sup>b</sup> |
| 10 | 0.052±0.005<sup>a</sup> | 0.038±0.007<sup>b</sup> | 0.050±0.007<sup>a</sup> | 0.032±0.004<sup>b</sup> |
| 14 | 0.070±0.004<sup>a</sup> | 0.041±0.008<sup>c</sup> | 0.057±0.004<sup>b</sup> | 0.044±0.002<sup>c</sup> |
| 20 | 0.072±0.002<sup>a</sup> | 0.039±0.004<sup>b</sup> | 0.072±0.004<sup>a</sup> | 0.048±0.003<sup>c</sup> |
| 28 | 0.094±0.002<sup>a</sup> | 0.069±0.002<sup>b</sup> | 0.091±0.004<sup>a</sup> | 0.069±0.006<sup>b</sup> |
| 38 | 0.103±0.021<sup>ab</sup> | 0.084±0.024<sup>c</sup> | 0.107±0.011<sup>a</sup> | 0.066±0.007<sup>bc</sup> |
| 56 | 0.101±0.008<sup>a</sup> | 0.080±0.004<sup>c</sup> | 0.107±0.005<sup>a</sup> | 0.064±0.005<sup>b</sup> |
从表13可以看到，NH3-N/总氮(Totalnitrogen，TN)的变化与NH3-N 的变化相同，随着青贮时间的延长比值逐渐增加，其中，在青贮全期M组的比值皆小于其他组，各组间的比值在第20d后趋于稳定，比值从大到小分别为Z、J、Y、M组，添加玉米粉和LAB处理有效降低了桑枝叶青贮中NH3-N 的含量。
表13 氨态氮/总氮动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 0.188 | - | 0.067 | - |
| 1 | 0.284 | 0.420 | 0.378 | 0.490 |
| 3 | 1.677 | 1.218 | 1.850 | 2.144 |
| 5 | 1.858 | 1.012 | 2.066 | 1.647 |
| 7 | 3.479 | 1.651 | 5.259 | 4.449 |
| 10 | 5.128 | 2.965 | 6.644 | 6.881 |
| 14 | 6.792 | 3.972 | 7.391 | 6.084 |
| 20 | 7.126 | 4.221 | 9.491 | 5.751 |
| 28 | 8.965 | 6.415 | 11.887 | 10.780 |
| 38 | 9.576 | 6.092 | 12.917 | 12.005 |
| 56 | 9.784 | 5.798 | 14.472 | 11.878 |
2.3 青贮化学成分变化
2.3.1 可溶性糖含量动态变化
从表14可以看到，M组在青贮全期的WSC显著高于其他组，J、Z组除第1d外其它时期WSC均无显著差异，在0-14dY组显著高于J、Z组，显示 WSC在桑树中更多集中在桑叶上，二者(Y与J、Z)在青贮中前期含量差异并不大，仅有1％，在第20d时Y、J、Z组的含量趋于稳定，而M组的含量则一直降低，糖分一直在被消耗。
表14 可溶性糖含量动态变化(DM)
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 4.334±1.782 | - | 4.717±0.899 | - |
| 1 | 5.414±1.984<sup>c</sup> | 9.224±1.131<sup>a</sup> | 5.536±0.622<sup>c</sup> | 6.836±0.500<sup>b</sup> |
| 3 | 5.230±0.558<sup>b</sup> | 11.777±1.616<sup>a</sup> | 3.781±0.759<sup>c</sup> | 3.564±0.446<sup>c</sup> |
| 5 | 4.298±0.634<sup>b</sup> | 11.204±1.533<sup>a</sup> | 3.245±0.095<sup>bc</sup> | 2.438±0.278<sup>c</sup> |
| 7 | 3.031±0.230<sup>b</sup> | 10.518±1.568<sup>a</sup> | 2.050±0.227<sup>bc</sup> | 1.457±0.321<sup>c</sup> |
| 10 | 2.176±0.126<sup>b</sup> | 7.981±1.007<sup>a</sup> | 1.399±0.100<sup>c</sup> | 1.022±0.144<sup>c</sup> |
| 14 | 2.111±0.189<sup>b</sup> | 6.597±0.877<sup>a</sup> | 1.556±0.160<sup>bc</sup> | 1.243±0.478<sup>c</sup> |
| 20 | 1.505±0.062<sup>b</sup> | 5.706±0.501<sup>a</sup> | 1.259±0.273<sup>b</sup> | 1.368±0.226<sup>b</sup> |
| 28 | 1.027±0.071<sup>b</sup> | 3.783±0.908<sup>a</sup> | 0.834±0.086<sup>b</sup> | 0.878±0.160<sup>b</sup> |
| 38 | 0.966±0.172<sup>b</sup> | 4.764±1.036<sup>a</sup> | 0.656±0.113<sup>b</sup> | 0.657±0.125<sup>b</sup> |
| 56 | 0.797±0.118<sup>b</sup> | 2.251±1.165<sup>a</sup> | 1.153±0.783<sup>b</sup> | 0.927±0.276<sup>b</sup> |
2.3.2 粗蛋白含量动态变化
从表15可以看到，Y组在全期显著高于其他组，除J组外，各组CP含量在青贮全期均无明显变化，CP含量由多到少依次为Y>Z>J>M。
表15 粗蛋白含量动态变化(D)
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 26.845±1.768 | - | 23.176±0.940 | - |
| 1 | 28.038±1.338<sup>a</sup> | 17.540±0.312<sup>d</sup> | 22.497±0.272<sup>b</sup> | 20.071±0.751<sup>c</sup> |
| 3 | 28.546±0.878<sup>a</sup> | 18.287±0.259<sup>d</sup> | 24.946±0.488<sup>b</sup> | 20.985±1.552<sup>c</sup> |
| 5 | 29.475±0.355<sup>a</sup> | 17.818±0.743<sup>c</sup> | 25.544±0.561<sup>b</sup> | 25.891±0.825<sup>b</sup> |
| 7 | 29.674±0.433<sup>a</sup> | 18.033±0.653<sup>c</sup> | 24.232±1.191<sup>b</sup> | 23.196±1.658<sup>b</sup> |
| 10 | 29.404±0.565<sup>a</sup> | 17.281±0.252<sup>d</sup> | 24.150±1.192<sup>b</sup> | 18.482±1.787<sup>c</sup> |
| 14 | 29.792±0.555<sup>a</sup> | 18.206±0.541<sup>d</sup> | 24.663±0.805<sup>b</sup> | 20.173±1.667<sup>c</sup> |
| 20 | 28.907±0.181<sup>a</sup> | 18.610±1.419<sup>d</sup> | 24.204±0.695<sup>b</sup> | 21.088±1.328<sup>c</sup> |
| 28 | 29.946±0.442<sup>a</sup> | 18.456±0.715<sup>d</sup> | 24.624±0.931<sup>b</sup> | 20.791±1.382<sup>c</sup> |
| 38 | 29.800±0.439<sup>a</sup> | 17.574±0.266<sup>d</sup> | 27.779±1.498<sup>b</sup> | 22.383±1.535<sup>c</sup> |
| 56 | 29.215±0.508<sup>a</sup> | 17.702±0.486<sup>d</sup> | 25.490±0.823<sup>b</sup> | 21.865±0.724<sup>c</sup> |
2.3.3 粗脂肪含量动态变化
从表16可以看到，各组的EE含量呈现上升趋势，整体变化不大，曲线相对平缓，其中Y组在青贮全期的含量皆大于其他组，含量变化与CP相似，由多到少依次为Y>Z>J>M。
表16 粗脂肪含量动态变化(DM)
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 2.752±1.479 | 0 | 3.392±0.783 | 0 |
| 1 | 2.653±1.041<sup>a</sup> | 1.594±0.307<sup>b</sup> | 2.775±0.218<sup>a</sup> | 2.656±0.164<sup>a</sup> |
| 3 | 2.886±0.266<sup>a</sup> | 1.867±0.208<sup>c</sup> | 2.784±0.186<sup>ab</sup> | 2.512±0.200<sup>b</sup> |
| 5 | 3.476±0.353<sup>a</sup> | 1.723±0.351<sup>c</sup> | 2.352±0.119<sup>b</sup> | 2.674±0.102<sup>b</sup> |
| 7 | 3.532±0.227<sup>a</sup> | 2.060±0.247<sup>c</sup> | 2.343±0.171<sup>c</sup> | 2.775±0.294<sup>b</sup> |
| 10 | 4.587±0.409<sup>a</sup> | 3.033±0.295<sup>c</sup> | 3.645±0.275<sup>b</sup> | 3.449±0.251<sup>b</sup> |
| 14 | 4.275±0.411<sup>a</sup> | 2.983±1.665<sup>b</sup> | 3.599±0.138<sup>ab</sup> | 3.293±0.545<sup>ab</sup> |
| 20 | 5.179±0.543<sup>a</sup> | 3.370±0.259<sup>c</sup> | 4.409±0.430<sup>b</sup> | 4.526±0.755<sup>b</sup> |
| 28 | 5.488±1.250<sup>a</sup> | 4.452±2.249<sup>a</sup> | 5.345±1.166<sup>a</sup> | 4.287±0.646<sup>a</sup> |
| 38 | 5.275±1.157<sup>a</sup> | 3.424±0.679<sup>b</sup> | 5.216±1.088<sup>ab</sup> | 4.811±0.948<sup>ab</sup> |
| 56 | 6.466±0.653<sup>a</sup> | 3.285±0.371<sup>c</sup> | 5.369±0.891<sup>ab</sup> | 4.734±2.176<sup>bc</sup> |
2.3.4 干物质含量动态变化
从表17可以看到，青贮全期各处理组的DM含量保持一致，由多到少依次为M>Y>J>Z，Z、J组间无显著差异。
表17 干物质含量动态变化
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 22.060±0.396 | - | 20.587±1.001 | - |
| 1 | 22.466±0.325<sup>b</sup> | 37.625±0.807<sup>a</sup> | 20.136±1.225<sup>d</sup> | 21.400±0.802<sup>c</sup> |
| 3 | 22.106±0.292<sup>b</sup> | 37.302±0.806<sup>a</sup> | 19.643±1.173<sup>c</sup> | 20.497±0.773<sup>c</sup> |
| 5 | 22.324±9.129<sup>b</sup> | 37.551±1.873<sup>a</sup> | 19.096±0.363<sup>b</sup> | 21.401±0.399<sup>b</sup> |
| 7 | 22.020±0.273<sup>b</sup> | 39.111±0.725<sup>a</sup> | 19.016±0.927<sup>c</sup> | 17.940±1.990<sup>c</sup> |
| 10 | 21.521±0.364<sup>b</sup> | 38.546±0.951<sup>a</sup> | 19.367±0.358<sup>c</sup> | 18.846±0.410<sup>c</sup> |
| 14 | 21.495±0.082<sup>b</sup> | 38.312±0.610<sup>a</sup> | 19.558±0.705<sup>c</sup> | 19.756±1.441<sup>c</sup> |
| 20 | 21.775±0.364<sup>b</sup> | 38.021±0.979<sup>a</sup> | 19.545±1.080<sup>c</sup> | 19.936±0.321<sup>c</sup> |
| 28 | 21.865±0.374<sup>b</sup> | 36.697±1.229<sup>a</sup> | 19.527±0.281<sup>c</sup> | 19.036±0.619<sup>c</sup> |
| 38 | 22.586±0.303<sup>b</sup> | 38.719±0.772<sup>a</sup> | 19.231±1.077<sup>c</sup> | 19.587±1.250<sup>c</sup> |
| 56 | 22.176±0.154<sup>b</sup> | 38.690±1.340<sup>a</sup> | 18.241±0.936<sup>c</sup> | 19.213±1.145<sup>c</sup> |
2.3.5 中性洗涤纤维含量动态变化
从表18可以看到，各处理在青贮前期(0-7d)DNF含量有所波动下降，其他时间都保持相对稳定，根据处理的不同，各组中的DNF从第10d开始，皆为J>Z>Y>M。
表18 中性洗涤纤维含量动态变化(DM)
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 30.522±8.751 | - | 37.614±3.281 | - |
| 1 | 38.873±5.612<sup>b</sup> | 22.389±3.650<sup>c</sup> | 44.319±1.684<sup>a</sup> | 44.481±1.546<sup>a</sup> |
| 3 | 34.578±4.248<sup>d</sup> | 20.746±2.714<sup>c</sup> | 42.072±2.494<sup>b</sup> | 46.285±2.928<sup>a</sup> |
| 5 | 29.215±3.912<sup>c</sup> | 19.731±4.382<sup>d</sup> | 39.714±2.790<sup>a</sup> | 35.129±3.873<sup>b</sup> |
| 7 | 26.718±6.624<sup>b</sup> | 18.752±2.239<sup>c</sup> | 42.822±7.236<sup>a</sup> | 38.952±4.845<sup>a</sup> |
| 10 | 24.707±1.272<sup>c</sup> | 16.747±3.041<sup>d</sup> | 36.275±2.099<sup>b</sup> | 43.452±3.053<sup>a</sup> |
| 14 | 24.922±4.253<sup>b</sup> | 15.718±2.573<sup>c</sup> | 32.541±4.163<sup>ab</sup> | 36.670±10.278<sup>a</sup> |
| 20 | 22.830±2.971<sup>b</sup> | 15.019±1.558<sup>c</sup> | 32.933±3.109<sup>a</sup> | 35.510±3.359<sup>a</sup> |
| 28 | 18.346±5.698<sup>b</sup> | 11.834±1.632<sup>c</sup> | 35.933±3.982<sup>a</sup> | 38.901±3.518<sup>a</sup> |
| 38 | 22.732±1.731<sup>c</sup> | 16.579±6.492<sup>c</sup> | 34.885±2.422<sup>b</sup> | 41.642±5.127<sup>a</sup> |
| 56 | 19.641±0.820<sup>c</sup> | 10.845±1.545<sup>d</sup> | 33.455±2.463<sup>b</sup> | 36.482±2.366<sup>a</sup> |
2.3.6 酸性洗涤纤维含量动态变化
从表19可以看到，各处理在青贮期ANF含量与NDF变化动态相似，各处理中的ANF从第10d开始，皆为J>Z>Y>M。
表19 酸性洗涤纤维含量动态变化(DM)
| 青贮时间(d) | Y(％) | M(％) | Z(％) | J(％) |
| 0 | 27.329±4.313 | - | 32.801±1.223 | - |
| 1 | 28.253±5.416<sup>b</sup> | 11.603±1.646<sup>c</sup> | 35.598±4.581<sup>a</sup> | 36.515±1.928<sup>a</sup> |
| 3 | 24.625±1.222<sup>c</sup> | 11.943±1.678<sup>d</sup> | 30.288±2.385<sup>b</sup> | 36.190±2.955<sup>a</sup> |
| 5 | 20.620±0.842<sup>b</sup> | 11.248±0.417<sup>c</sup> | 29.657±1.961<sup>a</sup> | 28.691±2.066<sup>a</sup> |
| 7 | 19.680±1.425<sup>b</sup> | 10.642±0.352<sup>c</sup> | 28.373±0.700<sup>a</sup> | 29.877±3.948<sup>a</sup> |
| 10 | 22.784±3.533<sup>b</sup> | 11.450±0.354c | 34.651±4.733<sup>a</sup> | 36.603±1.300<sup>a</sup> |
| 14 | 21.481±0.475<sup>b</sup> | 12.060±0.383c | 30.856±1.055<sup>ab</sup> | 32.857±8.571<sup>a</sup> |
| 20 | 23.063±1.778<sup>b</sup> | 13.439±2.372c | 36.436±1.089<sup>a</sup> | 34.662±1.127<sup>a</sup> |
| 28 | 28.094±4.496<sup>a</sup> | 14.135±1.148b | 33.332±6.559<sup>a</sup> | 35.558±3.602<sup>a</sup> |
| 38 | 23.005±1.686<sup>b</sup> | 13.604±2.371c | 35.686±2.796<sup>a</sup> | 40.184±6.110<sup>a</sup> |
| 56 | 20.673±0.498<sup>c</sup> | 12.072±1.042d | 35.091±2.393<sup>b</sup> | 40.368±5.376<sup>a</sup> |
3 结论
(1)J、M组与Z、Y组比较pH值更低，J组仅在第7d就降低到最低值4.6，随后pH值有所升高，M组的pH降到了4.2，并能保持更长的时间；各处理组中NH3-N、LA、AA在各组均随时间延长而增多，M组和J组与Y、Z组比较，青贮后期(20d后)NH3-N更低，LA更高；CP、DM，NDF和ADF均在第10d后皆趋于稳定；WSC随青贮时间的延长大幅度降低，其中M组处理显著提高了WSC的含量，下降幅度和青贮终点的含量；说明J、M组处理均改善了桑枝叶的青贮效果，J组主要表现在加快了青贮LA的生成速度， M组主要表现在增加了LA的生成量
(2)根据发酵组分和化学成分的变化，Y组在第14-20d之间各组分的含量趋于稳定，M组则在第28d左右；Z组在第28d各组分的含量趋于稳定， J组则在第5-7d左右。
(3)Q型聚类分析将Y组分为0-6d,6-24d,24-56d三个时期，与主要微生物的两次数量峰值出现的时间段相似，Y组在第20d左右开始进入稳定保存期；相应地，M组提前至第10d左右。将Z组分为第0-5d，7d，10-56d 三个时期，与Z组中两次主要微生物的数量峰值出现的时间段相似，Z在第 14d左右开始进入稳定保存期；相应地，J组的变化提前至第10d左右。
本发明采用微生物分离培养、化学成分测定等方法，分析了桑枝叶在青贮过程中微生物种类与丰度及其化学成分变化的关系，并用聚类分析、主成分分析等方法综合评定了桑枝叶和添加菌剂、添加玉米粉等不同处理的青贮品质，为桑枝叶的科学青贮提供依据。主要结论如下：
(1)桑枝叶青贮过程中的微生物变化主要表现为变形菌门的肠杆菌属(Enterobacter)和大肠埃希菌志贺菌属(Escherichia-shigella)比例下降，厚壁菌门有肠球菌属(Enterococcus)，乳球菌属(Lactococcus) 和乳杆菌属(Lactobacillus)比例上升；添加玉米粉组和添加乳酸菌组均能快速提高青贮有益微生物的丰度，抑制真菌等有害杂菌。
(2)青贮过程中桑枝叶组中的CP、DM，NDF和ADF含量在第10d后皆趋于稳定。添加玉米粉组或添加乳酸菌组能快速降低青贮料的pH值，显著降低NH3-N的含量。乳酸菌处理组在青贮后期pH值上升，发生了二次发酵产生了较高的BA，说明WSC不足限制了LAB在青贮中的发酵作用和LA 的合成。
(3)对桑枝叶第56d青贮样本的青贮品质进行分析，结果表明玉米粉处理组是唯一组产生了乳酸型发酵的处理，且没有BA生成；聚类分析中显示了青贮过程中不同处理组的化学成分变化与微生物变化呈现出很强的相关性。主成分分析，模糊综合评价与传统青贮品质评定都显示出桑枝叶单独青贮品质不高，而添加玉米粉能显著改善其青贮品质，WSC是决定桑枝叶青贮品质的关键指标，而添加乳酸菌组虽然快速提高了桑枝叶青贮过程中的LAB的丰度，但其在青贮过程中无法产生足够的LA来保持青贮品质的稳定。
综上所述，桑枝叶BC不高，单独青贮品质不佳；添加乳酸菌组改善了乳杆菌属在桑枝叶中的丰度优势以快速抑制青贮杂菌，生成LA的含量不足；添加玉米粉增加了青贮过程中LA的含量，降低青贮饲料的pH值至4.5～5.0。 WSC是影响桑枝叶青贮品质的关键因素，添加玉米粉显著地改善了桑枝叶的青贮品质。
注：在上述各实施例中，所涉及的主要符号和缩略词释意见表20
表20 主要符号和缩略词注释表
Claims (9)
1.玉米粉在提高桑枝叶青贮品质中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高桑枝叶青贮品质包括提高桑枝叶青贮产品中的可溶性碳水化合物、提高桑叶青贮产品中的乳酸、降低桑枝叶青贮产品的pH值到4.5～5.0和消除桑枝叶青贮产品中的丁酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将玉米粉与桑枝叶混合，得到青贮发酵原料；
(2)将所述青贮发酵原料置于青贮环境下发酵。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述玉米粉与桑枝叶混合的质量比为0.8～1.2：4.5～5.5。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述青贮环境为避光和密封。
6.根据权利要求3所属的应用，其特征在于，步骤(2)所述发酵的温度为20℃～35℃。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述青贮发酵原料的含水率为50％～65％。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述桑枝叶包括桑叶和/或桑枝。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述桑枝叶为桑枝叶粉碎物；所述桑枝叶粉碎物的最大粒径≤2cm。
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