CN110799649A - 用于减少有需要的受试者中nkcc1表达的载体和药物组合物，以及相关的治疗处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于使用人工microRNA(amiR)减少NKCC1表达的RNA干扰(RNAi)策略。特别地，本发明涉及通过使用人突触蛋白启动子驱动转基因表达来实现针对NKCC1的特异性amiR的神经元特异性表达的载体。
Description
技术领域
本发明涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体、药物组合物和方法。
背景技术
由SLC12A2(NKCC1)编码的Na+、K+、2Cl-协同转运蛋白(NKCC)属于阳离子氯化物协同转运蛋白(CCCs)的亚家族，其提供钠、钾和氯化物跨质膜的电中性转运。几项证据表明，NKCC1通过调节细胞内氯化物的浓度参与多种疾病的发病机制。例如，最近的研究表明，氯化物协同转运蛋白NKCC1在DS小鼠模型和唐氏综合症患者的脑中过表达(Deidda et al.,2015；WO2015091857A1)。唐氏综合症(DS)是儿童和成人智力障碍的最常见原因。唐氏综合症是一种遗传疾患，由全部或部分的人类21号染色体的第三条拷贝的存在引起，因此也被称为21三体综合症。唐氏综合症几乎都以认知障碍、记忆力减退和学习困难为特点。因此，用NKCC1抑制剂(也是利尿的FDA批准的药物)布美他尼(Bumetanide)进行药物治疗可在DS的Ts65Dn小鼠模型中恢复突触可塑性和认知障碍(Deidda et al.,2015；WO2015091857A1)。但是，一些数据表明需要使用布美他尼进行终生治疗，从而潜在地引起不期望的过度利尿(这会损害治疗依从性)以及许多电解质长期失衡的相关副作用。此外，布美他尼的全身性治疗也会在除大脑以外的其他器官中阻断NKCC1的活性，这可能会引起耳毒性(Ben-Ari et al.,2016)。因此，有必要克服基于NKCC1活性降低的DS疗法的这些限制。
发明内容
本发明涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体、药物组合物和方法。本发明的范围由所附权利要求书限定。
具体实施方式
发明人已经基于使用人工microRNA(amiR)减少NKCC1表达开发了RNA干扰(RNAi)策略。通过用针对hNKCC1的反义靶向序列替换天然存在的初级microRNA(pri-miRNA)支架(scaffold)(例如小鼠microRNA155；基因库登录号：NR_029565.1)的21-22个核苷酸的反义靶向序列(所谓的引导链)来构建人工microRNA。特别地，发明人已设计了一种系统，该系统通过使用人突触素启动子驱动转基因表达来实现针对NKCC1的特定amiR的神经元特异性表达。
因此，在第一方面，本发明涉及用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的治疗方法的载体，该载体包含编码能够降低NKCC1表达的amiR的多核苷酸，其中amiR包含选自由SEQID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的至少一个核酸序列。
本发明的第二方面涉及用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的治疗方法的药物组合物，该组合物包含根据本发明的载体。
本发明的第三方面涉及减少有需要的受试者中NKCC1表达的方法，包括向该受试者递送治疗有效量的根据本发明的载体。
通过下面的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
如本文所用，用于“Na-K-Cl协同转运蛋白”的NKCC表示有助于钠、钾和氯化物主动转运进出细胞的蛋白质。该膜转运蛋白有几种变体或同种型，特别是NKCC1和NKCC2。NKCC1由SLC12A2基因(基因ID 6558)编码，并广泛分布于整个身体，但也分布在大脑中，且尤其是在发育中的动物和人脑中。它起到增加神经元中细胞内氯化物的作用，并从而使GABA更具兴奋性。大量研究表明，阻断NKCC1减少了细胞内的氯化物，从而增强GABA的抑制作用。示例性的人核酸和氨基酸序列分别由NCBI参考序列NM_001046.2和NP_001037.1表示。
如本文所用，术语“受试者”是指人类和动物受试者两者。动物包括但不限于哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物、猴子(例如猕猴、恒河猕猴或猪尾猕猴)、犬、猫、牛、猪、禽类(例如鸡)、小鼠、兔和大鼠。在一些实施方式中，受试者典型地意指人类。
在一些实施方式中，受试者患有选自由以下组成的组的疾病：唐氏综合症、脆性X综合征、雷特综合征(Rett syndrome)、结节性硬化症、外伤性脑损伤、癫痫病、自闭症、精神分裂症、帕金森氏病、高血压。因此，本发明的载体特别适合于治疗上述疾病。
如本文所用，术语“雷特综合征”具有其在本领域中的一般含义，并且是指X染色体连锁的神经发育障碍，其导致发育逆转，特别是在表达语言和手使用方面。临床特征包括手脚小和头部生长速度减慢，某些情况下包括小头畸形。雷特综合征与树突棘的神经病理学有关，特别是在患有雷特综合征的患者中发现了海马锥体神经元中树突棘密度的降低((Chapleau CA et al,Neurobiol Dis 2009,35(2):219-33)。
如本文所用，术语“结节性硬化症”或“伯恩维尔氏病”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由两个基因TSC1和TSC2中的任一个的突变引起的神经皮肤综合症，所述两个基因分别编码蛋白质错构瘤蛋白(hamartin)和结节蛋白(tuberin)，两者均起抑癌作用。结节性硬化症导致大脑和其他重要器官(诸如肾脏、心脏、眼、肺和皮肤)的非恶性肿瘤生长。在结节性硬化症患者中已经描述了不同类型的树突异常(Machado-Salas JP,ClinNeuropathol 1984,3(2):52-8)。
如本文所用，术语“外伤性脑损伤”或“TBI”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由于头部的任何类型的外伤(诸如对头部的撞击或摇晃)引起的任何微观或宏观损伤、伤口或伤害。外伤性脑损伤可能是由于外在的物理力量对大脑造成的后天伤害。外伤性脑损伤的常见原因包括但不限于跌倒(例如，从床上跌落、在浴缸中滑倒、跌落台阶、从梯子上跌落以及相关的跌倒)、与车辆相关的碰撞(例如，涉及汽车、摩托车或自行车，以及涉及此类事故的行人的碰撞)、暴力(例如，枪伤、家庭暴力或虐待儿童(例如，摇晃婴儿综合症)、运动伤害(例如，发生在足球、拳击、橄榄球、棒球、长曲棍球、滑板、曲棍球和其他高冲击或极限运动中)、炸药爆炸和其他战斗伤害(例如，来自穿透性伤口、弹片或碎屑对头部的重击以及爆炸后的跌倒或与物体的身体碰撞)等等。诊断TBI的方法在本领域中是众所周知的。外伤性脑损伤还可包括由缺血性事件(例如中风)、手术、放射或其他医疗程序引起的脑外伤。
如本文所用，术语“癫痫病”具有其在本领域中的一般含义，并且是指以反复无故发作为特点的慢性神经疾患。这些癫痫发作是大脑中异常、过度或同步神经元活动的短暂征兆和/或症状。有40多种不同类型的癫痫病，包括但不限于儿童期失神癫痫、青少年失神癫痫、良性罗兰氏(Rolandic)癫痫、阵挛性癫痫、复杂的部分性癫痫、额叶癫痫、高热性癫痫、婴儿痉挛、青少年肌阵挛性癫痫、兰诺克斯(Lennox-Gastaut)综合征、蓝道-克里夫纳(Landau-Kleffner)综合征、肌阵挛性癫痫、与癫痫发作相关的线粒体疾患、拉福拉病、进行性肌阵挛性癫痫、反射性癫痫和拉斯穆森氏综合征。癫痫发作的类型也很多，包括简单的部分性癫痫发作、复杂的部分性癫痫发作、全身性癫痫发作、继发性全身性癫痫发作、颞叶性癫痫发作、强直-阵挛性癫痫发作、强直性癫痫发作、精神运动性癫痫发作、边缘性癫痫发作、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态或超级难治性癫痫持续状态、腹部癫痫发作、运动不能性癫痫发作、自主神经性癫痫发作、严重双侧肌阵挛、跌落性癫痫发作、局灶性癫痫发作、痴笑性癫痫发作、杰克逊癫痫(Jacksonian March)、运动性癫痫发作、多灶性癫痫发作、新生儿性癫痫发作、夜间性癫痫发作、光敏性癫痫发作、感官性癫痫发作、sylvan癫痫发作、戒断性癫痫发作和视觉反射性癫痫发作。
如本文所用，术语“精神分裂症”具有其在本领域中的一般含义，并且表示一类神经精神疾患，其特点在于思维过程的功能障碍，诸如妄想、幻觉以及患者对其他人的兴趣大幅度戒断。全世界约有百分之一的人患有精神分裂症，且这种疾患伴随着高发病率和高死亡率。
如本文所用，术语“帕金森氏病”或“PD”具有其在本领域中的一般含义，并且是指神经退行性疾病，特别是影响黑质(致密部)及其黑纹状体的突出的多巴胺能神经元的神经退行性疾病。如本文所用，术语“帕金森氏病”、“帕金森氏”和“帕金森症”应理解为包括病症的各种形式，包括特发性帕金森氏病、脑炎后帕金森氏病、药物诱导的帕金森氏病(诸如精神抑制药诱导的帕金森症)以及缺血后的帕金森症。
如本文所用，术语“高血压”描述了其中存在异常高的动脉血压的病症；在年轻人中，通常当舒张压大于90 mm Hg并且收缩压大于约135至140 mm Hg时出现高血压状态。
如本文所用，术语“脆性X综合征”具有其在本领域中的一般含义，并且是指智力低下的最常见的遗传形式，影响每4000个男孩中的约1个和每8000个女孩中的约1个。脆性X综合征(FXS)是一种遗传疾患，由位于X染色体上的脆性X智力低下1(FMR1)基因的5'非翻译区(5'-UTR)中CGG三核苷酸重复序列的扩增引起。突变导致脆性X智力低下蛋白(FRMP)的表达减少或缺失。与FXS相关的主要症状是智力低下和学习障碍，尤其是学习如何坐下、行走和说话的延迟。因此，FXS患者通常表现出紧张或混乱的言语。此外，FXS患者可能缺乏中央执行、工作、语音和/或视觉空间记忆；或面部识别困难。也可能遇到行为和情感问题，诸如例如过度活跃、刻板行为、焦虑、癫痫发作、社交行为受损、认知迟缓、易怒、攻击性或自残行为。此外，FXS还可能在儿童早期引起包括斜视的眼科问题和复发性中耳炎以及鼻窦炎。
如本文所用，术语“自闭症”表示一类神经发育疾患，其特点在于社交互动和沟通受损、受限和重复的行为并伴有其他缺陷。这些迹象都在儿童三岁之前开始。自闭症通过改变神经细胞及其突触的连接和组织方式来影响大脑中的信息处理；还不是很清楚自闭症是如何发生的。另外两个自闭症谱系障碍(ASD)是在认知发展和语言上没有延迟的阿斯伯格(asperger)综合症、是非典型自闭症，其在不满足其他两种疾患的完全标准时被诊断，以及PDD-NOS，其在没有指定广泛性发育障碍时被诊断。
如本文所用，术语“唐氏综合症”或“21三体综合症”是指由全部或部分的21号染色体的第三条拷贝的存在引起的染色体病症。它通常与认知能力和身体生长的延迟以及面部特点的特定集合相关。唐氏综合症患者的认知功能障碍与树突分支和复杂性减少以及皮质神经元中异常形状的棘较少有关(Martinez de Lagran,M.et al,Cereb Cortex 2012,22(12):2867-77)。
如本文所用，术语“处理(treatment)”或“治疗”是指预防性或防备性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括具有患病风险或怀疑已患病的患者以及处于疾病状态或被诊断为患有疾病或医学病症的患者的治疗，并且包括抑制临床复发。可以向患有医学疾患或最终可能患有该疾患的受试者实施该治疗，以预防、治愈疾患或复发性疾患、延迟疾患或复发性疾患的发作，减轻疾患或复发性疾患的严重程度，或减轻疾患或复发性疾患的一种或多种症状，或与不施用该治疗情况下所预期的存活相比更加延长受试者的存活。“治疗方案”是指疾病的治疗方式，例如在治疗期间使用的给药方式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段为患者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“负荷方案”，该方案可以包括比维持方案期间医生使用的剂量给药更大剂量的药物，比维持方案期间医生的给药更频繁地给药，或两者兼而有之。短语“维持方案”或“维持期”是指在疾病治疗期间用于维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长期处于缓解状态(几个月或几年)。维持方案可以采用连续疗法(例如，以规律的间隔给药，例如每周、每月、每年等)或间歇疗法(例如，间断治疗、间歇治疗、复发治疗或为了达到特定预定标准的治疗[例如疾病表现等])。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”具有其在本领域中的一般含义，并且是指DNA或RNA分子。然而，该术语涵盖了包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物的序列，该碱基类似物诸如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如所使用的，术语“miR”、“microRNA”或“miRNA”具有其在本领域中的一般含义，并且是指涉及基于RNA的基因调控的真核生物中发现的长度为15-30个核苷酸的短的非编码RNA序列。
如本文所用，术语“人工miRNA”或“amiR”是指编码pri-miRNA支架的核酸序列；编码引导链的核酸序列；以及编码随从链的核酸序列，其中所述pri-miRNA支架衍生自天然存在的pri-miRNA，并包含至少一个侧翼序列和包含至少4个核苷酸的环形成序列。通过替换天然存在的pri-microRNA支架的21-22个核苷酸的引导链(反义靶向序列)来构建不同的amiR序列。
在一些实施方式中，amiR的引导链和amiR的随从链与NKCC1核酸序列具有至少50％的互补性，但彼此之间不是100％的互补性。在一些实施方式中，将编码引导链的核酸序列和编码随从链的核酸序列插入侧翼序列和环形成序列之间的pri-miRNA支架中，从而形成茎。
在一些实施方式中，编码amiR的引导链的核酸序列和编码amiR的随从链的核酸序列具有至少一个碱基对错配。在一些实施方式中，编码引导链的核酸序列和编码随从链的核酸序列具有两个碱基对错配、三个碱基对错配、四个碱基对错配、五个碱基对错配、六个碱基对错配、七个碱基对错配、八个碱基对错配、九个碱基对错配、十个碱基对错配、十一个碱基对错配、十二个碱基对错配、十三个碱基对错配、十四个碱基对错配或十五个碱基对错配。在一些实施方式中，编码引导链的核酸序列和编码随从链的核酸序列具有不超过十个连续碱基对的错配。在一些实施方式中，至少一个碱基对错配位于锚位置。在一些实施方式中，至少一个碱基对错配位于茎的中心部分。
在一些实施方式中，本发明的amiR支架由源自天然miRNA(例如，来自小鼠miRNA-155，序列：tggaggcttgctgaaggctgtatgct)的5'侧翼区域，TGCT核苷酸突出端，5'G+选自由SEQ ID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的源自hNKCC1的短21个核苷酸的反义序列(引导链)，环形成序列(例如：GTTTTGGCCACTGACTGAC)，源自hNKCC1的2个核苷酸被去除(Δ2)以形成内部环的短19个核苷酸的有义序列(随从链)，CAGG突出端和源自天然miRNA(例如来自小鼠miRNA-155，序列：caggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggccc)的3'侧翼区域组成。在美国专利公开No.2004/0053876中描述了这种构建体，并且在图1中对其进行了描述。在一些实施方式中，amiR支架源自选自由以下组成的组的pri-miRNA：pri-MIR-21、pri-MIR-22、pri-MIR-26a、pri-MIR-30a、pri-MIR-33、pri-MIR-122、pri-MIR-375、pri-MIR-199、pri-MIR-99、pri-MIR-194、pri-MIR-155和pri-MIR-451。
如本文所用，术语“载体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指可以通过插入或掺入多核苷酸来操纵的质粒、病毒或其他媒介物。本发明的载体用于进行遗传操纵，以将多核苷酸引入/转移到细胞中以及在细胞中转录或翻译所插入的多核苷酸。载体通常至少包含用于在细胞中增殖的复制起点和表达控制元件(例如启动子)。包含在载体内存在的控制元件(包括本文所述的表达控制元件)以促进适当的转录，并且进而适当的翻译(例如内含子的剪接信号，维持基因的正确阅读框架以允许mRNA的框架内翻译，以及终止密码子等)。
通常，载体是非病毒载体或病毒载体。大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且是可商购的。非病毒载体通常依赖于基于质粒的基因递送系统，其中仅递送裸DNA，可能地与促进转染的物理化学方法相结合。在一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒、逆转录病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒、多瘤病毒或感染性病毒。逆转录病毒由于其将其基因整合到宿主基因组、转移大量外来遗传物质、感染广泛的物种和细胞类型以及被包装在特殊细胞系中的能力而被选作基因递送载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了包含gag、pol和/或env基因但没有LTR和/或包装成分的包装细胞系。当将含有cDNA的重组质粒以及逆转录病毒的LTR和包装序列引入到该细胞系中时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列使重组质粒的RNA转录物可以包装成病毒颗粒，然后病毒颗粒被分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还包含其他具有调节性或结构性功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，像在潜伏感染过程中那样。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV 1，HIV 2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体已通过多重减毒HIV毒力基因而产生，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，从而使该载体具有生物学上的安全性。慢病毒载体是本领域已知的，参见例如美国专利No.6,013,516和5,994,136，其均通过引用并入本文。通常，载体被配置为携带用于掺入外源核酸、用于选择以及用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。感兴趣载体的gag、pol和env基因在本领域中也是已知的。因此，将相关基因克隆到选择的载体中，并然后用于转化感兴趣靶细胞。在美国专利No.5,994,136中描述了能够感染不分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或更多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env以及rev和tat，该美国专利通过引用并入本文。在一些实施方式中，载体是AAV载体。如本文所用，术语“AAV”是指超过30种天然存在且可用的腺相关病毒，以及人工AAV。通常，本文所述的AAV衣壳、ITR和其他选择的AAV成分可以很容易地从任何AAV中选择，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh74、AAV-DJ、AAV2g9、任何已知或提及的AAV的变体或尚未发现的AAV或变体或它们的混合物。AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和包括VP1蛋白的衣壳亚基的序列是本领域已知的。这样的序列可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见例如GenBank登录号NC_002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC_001729(AAV-3)、NC_001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC_006152(AAV-5)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)和NC_006261(AAV-8)；上述的公开内容通过引用并入本文以教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见，例如，Srivistava et al.(1983)J.Virology 45:555；Chiorini et al.(1998)J.Virology71:6823；Chiorini et al.(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al.(1999)J.Virology 73:939；Xiao et al.(1999)J.Virology73:3994；Muramatsu et al.(1996)Virology 221:208；Shade et al.,(1986)J.Virol.58:921；Gao et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:11854；Moris et al.(2004)Virology33:375-383；国际专利公开WO 00/28061,WO 99/61601,WO 98/11244；和美国专利No.6,156,303。本发明的重组AAV载体通常包含5'和3'腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)，可操作地连接至启动子的感兴趣多核苷酸(即异源多核苷酸)。使用本领域已知的方法产生本发明的载体。简而言之，该方法通常包括(a)将AAV载体引入宿主细胞，(b)将AAV辅助构建体引入宿主细胞，其中所述辅助构建体包含AAV载体中缺失的病毒功能，以及(c)将辅助病毒引入宿主细胞。需要提供AAV病毒体复制和包装的所有功能，以实现将AAV载体复制并包装成AAV病毒体。可以同时或顺序地使用标准病毒学技术实施向宿主细胞的引入。最后，培养宿主细胞以产生AAV病毒体，并使用标准技术诸如CsCl梯度法或柱色谱法纯化。残留的辅助病毒活性可以使用已知的方法灭活，诸如例如热灭活。然后纯化的AAV病毒体即可用于这些方法。
通常，本发明的载体包括“控制序列”，其统称为启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等等，它们共同为受体细胞中的编码序列提供复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译，并非总是需要存在所有这些控制序列。另一个核酸序列是“启动子”序列，其在本文中以其通常的含义使用，是指包含DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列源自能够结合RNA聚合酶并能够启动下游(3'方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中可操作地连接至该启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)，“阻遏型启动子”(其中可操作地连接至该启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)，以及“组成型启动子”。组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选地带有CMV增强子)[参见例如Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子[Invitrogen]。在一些实施方式中，使用神经元特异性启动子。示例性的神经元特异性启动子包括但不限于以下：突触蛋白-1(Syn)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))以及神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli et al.,Neuron,15:373-84(1995))等等，这些对本领域技术人员而言是显而易见的。
在一些实施方式中，本发明的载体在受试者的海马中递送。在一些实施方式中，本发明的载体通过静脉内注射递送至受试者。在一些实施方式中，本发明的载体通过鞘内给药递送。如本文所用，术语“鞘内给药”是指将载体给药到椎管中。例如，鞘内给药可包括在椎管的颈部区、在椎管的胸部区或在椎管的腰部区中注射。通常，鞘内给药是通过将载体注射到椎管的蛛网膜下腔(蛛网膜下腔空间)中进行的，该蛛网膜下腔是椎管的蛛网膜和软脑膜之间的区域。蛛网膜下腔空间由海绵状组织占据，海绵状组织由小梁(微细的结缔组织丝，从蛛网膜延伸并掺入到软脑膜)和相互连通的通道组成，其中包含脑脊液。在一些实施方式中，本发明的载体通过脑室内给药来递送。如本文所用，术语“脑室内给药”是指将载体给药至受试者的前脑的脑室区域。
在一些实施方式中，有效量是治疗有效量。“治疗有效量”是指以合理的获益/风险比治疗疾病的足够量的载体。应该理解，载体的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间，给药途径和所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定多肽组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。例如，本领域技术人员中公知的是，以低于获得期望的治疗效果所需的水平开始所述化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。因此，可以根据疾病状况、受试者(例如，根据他的体重、新陈代谢等)、治疗方案等来调整载体的剂量。在本发明的上下文中优选的有效剂量是允许最佳转导的剂量。通常，在小鼠中每剂量给药108至1012个病毒基因组(vg)。通常，要在人类中给药的AAV载体的剂量可以在1010至1014vg的范围内。
本发明的载体被配制成药物组合物。除了载体以外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分(即，本发明的载体)的功效。载体或其他材料的精确性质可以由技术人员根据给药途径来确定。药物组合物通常为液体形式。液体药物组合物通常包括液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖或其他糖溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二醇。对于注射，活性成分将为水溶液形式，其不含热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物(诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液)来制备合适的溶液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。为了延迟释放，可以将载体包含在药物组合物中，该药物组合物根据本领域已知的方法被配制为用于缓慢释放，诸如在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或在脂质体载体系统中。通常，本发明的药物组合物在预填充注射器中提供。“即用型注射器”或“预填充注射器”是以填充状态提供的注射器，即，待给药的药物组合物已经存在于注射器中并准备好给药。与分别提供的注射器和小瓶相比，预填充注射器具有许多优势，诸如改善的便利性、可负担性、准确性、无菌性和安全性。预填充注射器的使用可提高剂量精度，减少从小瓶中吸取药物时可能发生的针刺伤害的可能性，以预先确定的剂量减少因需要重构药物和/或将药物吸入至注射器而导致的配量错误，以及减少注射器的过量填充以通过最小化药物浪费来降低成本。在一些实施方式中，本发明的液体药物组合物的pH在5.0至7.0、5.1至6.9、5.2至6.8、5.3至6.7或5.4至6.6的范围内。
通过以下附图和实施例将进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1表示由以下组成的amiR构建体：源自天然miRNA的5'侧翼区域、TGCT核苷酸突出端、5'G+源自hNKCC1的短21个核苷酸反义序列、环形成序列、源自hNKCC1的2个核苷酸被去除(Δ2)以产生内部环的短19个核苷酸有义序列、CAGG突出端和源自天然miRNA的3'侧翼区域。
图2表示针对小鼠NKCC1的3种不同amiR分子的病毒表达对培养物中WT和Ts65Dn神经元中相应的NKCC1蛋白水平的影响。与WT相比，小鼠NKCC1在Ts65Dn神经元中的表达更高，其由对照amiR(虚线)的WT细胞的百分比来表示。3种不同amiR分子的病毒表达降低了WT和Ts65Dn神经元二者中的小鼠NKCC1蛋白。直方图表示平均值±SEM。**p<0.01，***p<0.001，双因素ANOVA之后事后Tukey检验。
图3表示来自Ts65Dn小鼠的培养物中对GABA表现出兴奋性反应的海马神经元。通过施加GABA浴，在对照amiR的WT神经元中的尖峰频率(spike frequency)降低，而在Ts65Dn神经元中的尖峰频率增加。通过病毒传递施用两种不同的amiR分子(即图2的amiR#1和amiR#3)可通过降低尖峰频率来恢复Ts65Dn神经元中GABA的兴奋作用。直方图表示平均值±SEM。**p<0.01，***p<0.001，双因素重复测量ANOVA之后事后Tukey检验。
图4表示针对小鼠NKCC1的amiR的海马病毒递送对Ts65Dn小鼠中行为任务中的认知功能的影响。(A)顶部，新对象识别任务的示意图。底部，与WT相比，Ts65Dn小鼠显示出较差的新颖辨别力。两种不同的amiR分子(即图2的amiR#1和amiR#3)的病毒递送恢复了Ts65Dn小鼠中的对象新颖判别力。(B)顶部，对象位置测试的示意图。底部，与WT相比，Ts65Dn小鼠表现出强烈的空间记忆障碍。两种不同的amiR分子的病毒传递恢复了Ts65Dn小鼠中的空间记忆。(C)顶部，T-迷宫自发交替测试的示意图。底部，与WT相比，Ts65Dn小鼠表现出减少的交替。两种不同的amiR分子的病毒传递恢复了Ts65Dn小鼠中的交替行为。(D)顶部，条件化情境恐惧测试的示意图。底部，与WT相比，Ts65Dn小鼠表现出联想记忆力受损。两种不同的amiR分子的病毒传递恢复了Ts65Dn小鼠中的情境学习。对于所有小图，直方图表示平均值±SEM，而圆圈表示来自单个动物的数据。对于所有小图：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，双因素ANOVA之后事后Tukey检验。
图5表示用于筛选针对人NKCC1(hNKCC1)DNA序列(NM_001046.2)的不同amiR分子的双荧光素酶传感器质粒。该传感器质粒从两个不同的启动子表达萤火虫荧光素酶(FLuc)和海肾荧光素酶(RLuc)。hNKCC1 DNA序列被克隆到RLuc的下游且在聚腺苷酸化(pA)信号之前。当将质粒与针对hNKCC1的不同amiR分子一起共转染到人类H293肾细胞中时，Rluc/Fluc比值的降低将反映amiR对应序列的沉默活性。
图6表示针对人NKCC1(hNKCC1)的不同amiR分子对图6的双荧光素酶hNKCC1传感器质粒的Rluc/Fluc比率的影响。对照样品用hNKCC1传感器质粒和对照amiR序列转染。直方图表示平均值±SEM。
实施例1
在Ts65Dn神经元中，细胞内氯化物浓度升高，导致GABA的去极化和的可能的兴奋作用。我们用amiR设计了一种RNAi策略，以减少神经元中NKCC1的表达。使用唐氏综合症的著名小鼠模型Ts65Dn小鼠的原代神经元培养物，我们发现我们的使用病毒载体的amiR策略能够减少NKCC1蛋白的表达。通过amiR降低NKCC1蛋白表达恢复了Ts65Dn神经元中GABA的抑制作用，与野生型(WT)神经元相似。此外，我们发现在Ts65Dn小鼠海马中amiR分子的体内病毒递送在四种不同的学习和记忆的行为测试中挽救了认知缺陷。因此，该方法在体外和体内均能有效恢复DS中的生理活性和行为参数。
实施例2
通过使用在线工具BLOCK-iTTMRNAi Designer(算法1，表A)，均基于人NKCC1(hNKCC1)DNA序列(NM_001046.2)预测了表B中报告的amiR序列。通过使用8种其他算法(表A中列出的算法2-9)，我们预测了一些其他RNAi序列，这些序列在一些情况下与使用算法1获得的表B中报道的序列相对应。根据这些序列±4个核苷酸被算法2-9预测的次数，对由算法1预测的每个序列(表B)进行评分。因此，表B中列出的序列具有结合和沉默NKCC1的最高概率。
实施例3
用双荧光素酶hNKCC1传感器评价了表B中报告的89个amiR序列中的78个对hNKCC1的沉默效力(图6和7)。人H293T肾细胞在96孔板中生长，并用Lipofectamnine2000(Thermo)转染每个amiR序列以及hNKCC1双荧光素酶质粒传感器。48小时之后，在Victor3多板读板仪(PerkinElmer)上用双荧光素酶测定法(Promega)测量海肾荧光素酶(RLuc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)之间的比率。对于每个转染的amiR序列，相对于用对照amiR质粒转染的样品，RLuc/FLuc比率的降低表明了hNKCC1敲落的程度。表C中报告了不同amiR序列对hNKCC1的沉默活性，表示为平均RLuc/Fluc比率(从4次独立转染中获得)，以及通过相对于用对照amiR质粒转染的样品的学生t检验获得的相应P值。
实施例4
还评价了表B中报道的针对hNKCC1的不同amiR序列的可能的脱靶基因的数量，其由可自由获取的microRNA预测工具TargetScan预测(Agarwal et al.,Elife.12:4(2015))。针对所有注释的人类基因(ENSEMBL版本GRCh38)的全长转录物序列(编码序列加上3'非翻译区)评价了脱靶预测。表D示出了每个amiR序列可能的脱靶基因的数目。该列表从可能的脱靶基因的最低数量到最高数量进行排序，并且还从表C报告了相应的沉默活性。因此，表D顶部列出的序列具有最高的活性，以最低的脱靶机率使NKCC1沉默。
表A：用于预测hNKCC1中的RNAi序列的算法说明。
表B：由BLOCK-iTTMRNAi Designer预测的amiR序列得分。a，根据某个amiR序列±4个核苷酸被算法2-9(表A)预测的次数对每个序列进行评分。b，每个amiR序列的第一个核苷酸在hNKCC1序列中的位置(NCBI参考序列NM_001046；该专利的SEQUENCE XX)。C，blast预测amiR序列与食蟹猕猴(Macaca Fascicularis，Mac)和小鼠(Mus Musculus，Mus)NKCC1序列(NCBI参考序列分别为XM_005557674和NM_009194)的同源性。
表C：用hNKCC1双荧光素酶质粒传感器筛选amiR序列沉默活性。
将每个amiR序列与hNKCC1双荧光素酶质粒传感器一起转染到人H293T肾细胞中。48小时后，测量海肾荧光素酶(RLuc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)之间的比率。对于每个转染的amiR序列，相对于用对照amiR质粒转染的样品，RLuc/FLuc比率的降低表明了hNKCC1敲落的程度。
根据表C中报告的数据，在hNKCC1敲除中更有效的amiR序列为SEQ ID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88。
表D：amiR可能的脱靶基因的预测。使用TargetScan软件评价了每个amiR序列在所有注释的人类转录物上脱靶基因的可能数目。该表还示出了表C中的沉默活性。该表从检测到的可能的脱靶基因的最低数量到最高数量进行排序。
基于表D中报告的数据，SEQ ID No：25、39、45、53、64、66和82由于它们显示出最低数目的可能的脱靶基因而被鉴定为用于本发明的最优选的序列。
序列表
<110> 国家医疗保健研究所（INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LARECHERCHE MÉDICALE)）
埃夫里大学（UNIVERSITÉ D'EVRY-VAL-D'ESSONNE）
吉尼松公司（GENETHON）
泰莱托恩基金会（FONDAZIONE ISTITUTO ITALIANO DI TECNOLOGIA）
<120> 用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的载体和药物组合物，以及相关的治疗处理方法
<130> PN19038246P
<150> EP17305434.7
<151> 2017-04-11
<160> 92
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 1
ttccacactt actaccacat c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 2
tacatatcca catccctcat a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 3
tatacatatc cacatccctc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 4
tccacactta ctaccacatc c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 6
ttaacctgat ctgccggtat g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 7
taagcaactc caccacggtt t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 8
atatccacat ccctcatatc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 9
atacatatcc acatccctca t 21
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<223> amiR序列
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<223> amiR序列
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<210> 18
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<223> amiR序列
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<210> 19
<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 19
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<220>
<223> amiR序列
<400> 21
ctcattatct gttattcgcc a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 22
aatagaaggt aaggacactc t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 23
tactaataca cccttgatcc a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 24
tattgctgaa gtagacaatc c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 25
aatccaacca catacatagc a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 26
ttccttaagc aactccacca c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 27
aattgaatgc tgcagtgcat t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 28
atccacatcc ctcatatctg c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 29
tatccacatc cctcatatct g 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 30
cacacttact accacatcct t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 31
ttcaacagtg gttgagttgc a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 32
agcaaagtag ccatcgctct c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 33
aagcaaagta gccatcgctc t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 34
taagcaaagt agccatcgct c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 35
acttgctaag caaagtagcc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 36
aacttgctaa gcaaagtagc c 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 37
aacctgatct gccggtatgt c 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 38
ttctgcagta tacgtgacca c 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 39
acaacgtact aatacaccct t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 40
catacaacgt actaatacac c 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 41
tgttccttaa gcaactccac c 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 42
aggagtgttc ctttgggtat g 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 43
taggagtgtt cctttgggta t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 44
ctaggagtgt tcctttgggt a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 45
agaacctaca gatactgcaa t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 46
tcattaacgt ttccagtggc a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 47
tgtcattaac gtttccagtg g 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 48
aatcctgaca ccatactcat t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 49
aaatcctgac accatactca t 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 50
tcactaggga tgctaatgct g 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 51
tacagcccaa ggactatcac a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 52
tatacagccc aaggactatc a 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 53
aagacgaatt gaatgctgca g 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 54
aagacgaatt gaatgctgca g 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 55
tttcatggct tgtcttcgag g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 56
atctgcttgc aaccaatctt t 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 57
atatctgctt gcaaccaatc t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 58
catatctgct tgcaaccaat c 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 59
aacagtggtt gagttgcagt c 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 60
ttgctaagca aagtagccat c 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 61
attatctgtt attcgccatg g 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 62
agctcattat ctgttattcg c 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 63
tgggtatcat aatagtagtg c 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 64
gtgggtatca taatagtagt g 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 65
acctattcca gcttgaccca c 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 66
caaaggcgaa gattagacca a 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 67
aaagaatcac gactgtaatg g 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 68
aacacaagaa cctacagata c 21
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 69
agtacagttt gttagctctg t 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 70
ttaatttgca ggctgcagaa g 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 71
ttgggagcac tcactaggga t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 72
tttgggagca ctcactaggg a 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 73
aatgcatatg atgcaaggaa g 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 74
ctgcagtgca ttcaggtaag t 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 75
tgctgcagtg cattcaggta a 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 76
ttgaatgctg cagtgcattc a 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 77
tctctttcat ggcttgtctt c 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 78
ttggcttgat cgatggacat c 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 79
ttgagttgca gtcttgccat c 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 80
tttcaacagt ggttgagttg c 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 81
gaacttgcta agcaaagtag c 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 82
aagtctatcc ggaacttgct a 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 83
aactcattta acctgatctg c 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 84
taaccatgcc atgtagagag c 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 85
ttctaaccat gccatgtaga g 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 86
ctttgggtat ggctgactga g 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 87
ttcctttggg tatggctgac t 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 88
atacatagca actgcaacag c 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> amiR序列
<400> 89
agatgttgtc cttacataga g 21
<210> 90
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'侧翼区
<400> 90
tggaggcttg ctgaaggctg tatgct 26
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 环形成序列
<400> 91
gttttggcca ctgactgac 19
<210> 92
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'侧翼区
<400> 92
caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggccc 46
Claims (15)
1.一种包含编码能够减少受试者中NKCC1表达的人工microRNA(amiR)的多核苷酸的载体，用于在有需要的受试者中降低NKCC1表达的治疗处理方法的用途，其特征在于，所述amiR包含选自由SEQ ID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的至少一种核酸序列。
2.根据权利要求1所述的用途的载体，其中，所述受试者患有选自由以下组成的组的疾病：唐氏综合症、脆性X综合征、雷特综合征、结节性硬化症、外伤性脑损伤、癫痫病、自闭症、精神分裂症、帕金森氏病和高血压。
3.根据权利要求1或2所述的用途的载体，其中，所述amiR由以下组成：源自天然miRNA的5'侧翼区域，TGCT核苷酸突出端，5'G+源自hNKCC1的选自由SEQ ID NO：4、8、15、16、18、23、25、39、40、44、45、53、57、64、66、67、68、69、82和88组成的组的短21个核苷酸反义序列，环形成序列，源自hNKCC1的2个核苷酸被除去(Δ2)以产生内部环的短19个核苷酸有义序列，CAGG突出端以及源自天然miRNA的3'侧翼区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的载体，其中，所述源自天然miRNA的5'侧翼区域是SEQ ID NO：90。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途的载体，其中，所述环形成序列是SEQ IDNO：91。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的载体，其中，所述源自天然miRNA的3'侧翼区域为SEQ ID NO：92。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途的载体，其中，所述载体是非病毒载体或病毒载体。
8.根据权利要求7所述的用途的载体，其中，所述病毒载体是AAV载体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途的载体，其中，所述载体包含神经元特异性启动子。
10.根据权利要求9所述的用途的载体，其中，所述神经元特异性启动子选自由突触蛋白-1(Syn)启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、神经丝轻链基因启动子以及神经元特异性vgf基因启动子组成的组。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的载体，其中，所述治疗处理方法包括将所述载体递送至所述受试者的海马。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的载体，其中，所述治疗处理方法包括通过静脉内注射将所述载体递送至所述受试者。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的载体，其中，所述治疗处理方法包括通过鞘内给药将所述载体递送至所述受试者。
14.一种药物组合物，用于减少有需要的受试者中NKCC1表达的治疗处理方法的用途，所述组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的载体。
15.一种减少有需要的受试者中NKCC1表达的方法，包括向所述受试者递送治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的载体。
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