JP2023520374A - 神経学的障害に対する活動依存性遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はベクター系であって、遺伝子は、対象の神経細胞内で遺伝子産物の発現を駆動するのに適した神経活動依存性プロモーターに作動可能に連結される、発現ベクター又はベクター系を提供する。発現ベクターの特徴は、対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置を有利に改善するために組み合わされる。本発明は、関連する処置の方法における使用のための発現ベクター又はベクター系並びに発現ベクター又はベクター系を使用するウイルス粒子、細胞、キット及び方法も提供する。【選択図】図１１

Description

本願は、２０２０年３月２７日に出願された独国特許出願公開第２００４４９８．８号からの優先権を主張し、その内容及び要素は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、概して、てんかんなどの神経学的障害を処置する場合に使用され得る、活動依存性に発現される遺伝子産物を伴う方法及び材料に関する。

背景技術
ニューロンの異常な発火を特徴とする神経回路障害は、社会にとって莫大な負担であり、薬剤での処置は、不十分である。例えば、人口の最大１％がてんかんを患う。これらの患者のうち、３０％が薬理学的処置に対して難治性（「薬剤抵抗性」）であり、てんかん発作が起こる脳領域（てんかん発作ゾーン）の外科的切除は、発作消失を達成するための最良の希望であり続けている。しかし、そのような手術は、記憶、言語、視力又は運動の制御などの機能に関与する皮質又は白質経路を代表する領域に対する損傷のリスクに起因して、多くにとって適さない（Kwan, P. et al (2011), N. Engl. J. Med. 365, 919-926；Picot, M.C. et al (2008), Epilepsia 49, 1230-1238）。

新しい抗てんかん薬は、難治性てんかんに対する影響をほとんど有さず、制御されないてんかん発作を有する人々は、併存症、社会的疎外及びてんかんにおける予期しない突然死（ＳＵＤＥＰ）の実質的リスクを絶えず経験している。難治性てんかんは、最も限局性である（即ちてんかん発作ゾーンから生じるてんかん発作を特徴とする）が、原発性全般性てんかんも薬物療法に対して抵抗性を示し得る。

てんかん発作ゾーンの外科的切除は、発作消失をもたらし得るが、難治性てんかんを有する人々の９０％に適さない。さらに、外科的切除の範囲は、不可逆的な神経学的障害のリスクによって制限され、それは、手術を受けている多くの患者がてんかん発作を有し続けることを意味する。レーザーを使用する最小浸潤性の切除手技は、脳内の隔絶された深部構造の標的化における役割を有するが、隣接する構造に対する損傷のリスクによって制限を受ける。深部脳刺激及び他の神経調節処置における有効性は、限られている。

遺伝子療法は、薬剤抵抗性の焦点性てんかんの外科的処置に対する合理的な治療法として有望視されている。例として、ニューロペプチドＹ及びＹ２受容体の過剰発現（Woldbye et al, 2010）、Ｋｖ１．１過剰発現（Wykes et al, 2012；Snowball et al. 2019；国際公開第２０１８／２２９２５４号）；デザイナー薬（DREADD）によって排他的に活性化されるデザイナー受容体、例えばｈＭ４Ｄｉを用いる化学遺伝学（Katzel, et al, 2014）及び増強されたグルタミン酸依存性塩化物チャネルｅＧｌｕＣｌの使用（Lieb et al, 2018）が挙げられる。

しかし、現在の実験的遺伝子療法は、神経興奮性（神経伝達物質、イオンチャネル又は受容体の過剰発現）の永久的修飾又はニューロン活動のオンデマンド調節を達成するための光若しくは化学物質の外因性送達（オプトジェネティクス及びケモジェネティクス）のいずれかに基づく。これらの手法は、オフターゲット効果に起因して制限を有する。それらは、てんかん発作に関与するニューロンと混ざり合う「バイスタンダー」ニューロン間を識別しない。類推により、深部脳刺激（ＤＢＳ）は、特定の脳部位に標的化される（例えば、パーキンソン病、ＯＣＤ及び抑うつに対する）治療法の例であるが、それは、細胞型に特異的でなく、副作用をもたらし得る。さらに、オプトジェネティクス及びケモジェネティクスがオンデマンドで使用され得るが、療法を光又は薬物送達によっていずれの時点で活性化させるかの決定は、ヒト介入又はてんかん発作を検出するコンピュータなどのさらなるステップを必要とする。これらの制限の一部を回避する遺伝子療法は、てんかんにおいて起こると、細胞外グルタミン酸塩の蓄積に応答して開くｅＧｌｕＣｌの使用であるが、てんかんの共通型におけるこの手法の有効性は未知であり、非哺乳動物の膜タンパク質の永久発現に依存するため、免疫原性のリスクを表すことがある。

従って、オフターゲット効果又は副作用が低減された、神経学的障害の中でも難治性てんかんに対する代替的な治療法を開発が急務となっている。

発明の開示
本発明者らは、ニューロン特性に影響する遺伝子の発現を駆動又は改変するための神経活動依存性プロモーターを使用することにより、てんかん発作を駆動するか、又は脳におけるてんかん発作の伝播に寄与するニューロンの選択的調節を達成できることを見出した。これにより、難治性てんかんなどの神経学的障害は、オフターゲット効果又は副作用を低減して処置することができる。

例えば、ある場合には、カリウムチャネル遺伝子ＫＣＮＡ１が活動依存性ｃ－Ｆｏｓプロモーターの制御下に置かれる場合、ＫＣＮＡ１発現の上方制御は、強力なニューロン活動（例えば、てんかん発作）に応答して誘導され、これは、神経興奮性及び神経伝達物質放出における減少を引き起こし、てんかん発作の開始又は伝播に対する感受性の低下をもたらす。回路活性が準正常レベルに戻る場合、プロモーター活性は、低下し、カリウムチャネルの発現は、ベースラインに戻る。従って、この遺伝子療法は、（バイスタンダーニューロンに対抗するものとして）過剰活動性であるニューロンと、活動亢進が持続する時間との両方に特異的である。

別の場合、（エンドヌクレアーゼ欠損ｃａｓ９としても知られる）ｄＣａｓ９及び転写活性化因子からなる融合タンパク質が活動依存性ｃ－Ｆｏｓプロモーターの制御下に置かれる場合、このタンパク質の上方制御は、強力なニューロン活動（例えば、てんかん発作）に応答して誘導され、適切な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の存在下において、これは、内因性遺伝子の改変された発現を引き起こし得る。次に、内因性遺伝子（例えば、ＫＣＮＡ１）の改変された発現は、神経興奮性及び神経伝達物質放出における減少を引き起こし、てんかん発作の開始又は伝播に対する感受性の低下をもたらす。回路活性が準正常レベルに戻る場合、プロモーター活性は、低下し、融合タンパク質（及び内因性遺伝子）の発現は、ベースラインに戻る。従って、この遺伝子療法は、改めて、（バイスタンダーニューロンに対抗するものとして）過剰活動性であるニューロンと、活動亢進が持続する時間との両方に特異的である。

ｃ－Ｆｏｓプロモーターの活性は、強力なニューロン活性化のいくつかの形態に応答して増加することが実証されており（例えば、Hunt et al., 1987 PMID: 3112583；Singewald et al., 2003 PMID: 12586446）、ｃ－Ｆｏｓ活性化についても、星状細胞（Morishita et al., PMID:21785243）、オリゴデンドロサイト（Muir & Compston, 1996 PMID: 8926624）及びミクログリア（Eun et al., 2004 PMID: 15522236）において報告されている。従って、てんかんの治療における活動依存性プロモーターの使用がオフターゲット効果の低下を引き起こすであろうことは、予測され得なかった。さらに、このように使用される活動依存性プロモーターが、機能的効果又は改善された機能的効果をインビボで有するための十分な発現をもたらすであろうことは、予測され得なかった。

従って、一態様において、本発明は、対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置の方法における使用のための発現ベクター又はベクター系であって、特許請求の範囲に定義される発現ベクター又はベクター系を提供する。関連する場合、「ベクター」という用語は、詳細な説明における「ベクター系」を指し得る。

別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義されるような発現ベクター又は発現ベクター系を提供する。

別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義される通りのウイルス粒子を作製するインビトロ方法を提供する。別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義される通りのウイルス粒子及び特許請求の範囲に定義される通りの方法における使用のためのそのようなウイルス粒子を提供する。

別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義される通りのキットを提供する。

別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義される通りの神経学的障害の処置の方法を提供する。別の態様では、本発明は、遺伝子産物の存在を確認する方法であって、特許請求の範囲に定義される通りの方法を提供する。

別の態様では、本発明は、特許請求の範囲に定義される通りの細胞を提供する。

ここで、本発明の一部の特定の態様がより詳細に考察される。

活動依存性プロモーター
「神経活動依存性プロモーター」（又は本明細書で互換可能に用いられる「活動依存性プロモーター」）という用語は、神経細胞内のニューロン活動における変化に応答して標的遺伝子の発現を改変又は駆動するプロモーターを指す。ニューロン活動におけるそのような変化は、例えば、てんかん発作中、興奮性亢進に至るニューロンに起因し得る。

神経細胞は、ニューロン又はグリア細胞であり得る。特に好ましい実施形態では、神経細胞は、ニューロンである。一部の実施形態では、神経細胞は、皮質ニューロンである。

一部の好ましい実施形態では、神経活動依存性プロモーターは、最初期遺伝子（ＩＥＧ）プロモーターである。本明細書で用いられるとき、「最初期遺伝子」（ＩＥＧ）という用語は、ｌＥＧを含む細胞に対する刺激の直後に発現が増加する遺伝子である。例えば、ニューロン刺激の直後に発現における迅速な増加を示すニューロンによって発現される遺伝子は、ニューロンＩＥＧである。そのようなニューロンＩＥＧは、転写因子、細胞骨格ポリペプチド、成長因子及び代謝酵素並びにシグナル伝達に関与するポリペプチドを含む多様なポリペプチドをコードすることが見出されている。ニューロンＩＥＧ及びそれらがコードするポリペプチドの同定は、例えば、学習、記憶、シナプス伝達、耐性及びニューロン可塑性におけるニューロンの機能についての重要な情報を提供する。

いくつかの好適なＩＥＧプロモーターは、本発明に従って使用することができる。一部の好ましい実施形態では、ＩＥＧプロモーターは、ｃ－Ｆｏｓ（又は「ｃＦｏｓ」）を含む。ｃ－Ｆｏｓは、細胞増殖（Holt et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Set USA831: 4794-4798；Riabowol et al. (1988) J. Cell. Biol. 8: 1670-1676）、分化（Distel et al. (1987) Cell 49: 835-844；Lord et al. (1993) Mol Cell. Biol. 13: 841-851）及び腫瘍発生（Cantor et al. (1993) Proc. Natl .Acad. Sci. USA90: 10932-10936；Miller et al. (1984) Cell 36: 51-60；Ruther et al. (1989) Oncogene 4: 861-865を含む、いくつかの重要な細胞事象に関与している核原癌遺伝子である。

ｃ－Ｆｏｓは、ｃ－Ｊｕｎとヘテロ二量体を形成し、ＡＰ－１因子でＤＮＡに結合し、転写を刺激するＡＰ－１転写因子を形成する６２ｋＤａタンパク質をコードする。また、Ｆｏｓ遺伝子産物は、遺伝子発現を抑制し得る。Sassone et al. (1988) Nature 334: 314-319は、ｃ－Ｆｏｓがそれ自体のプロモーターを阻害することを示し、Gius et al. (1990)及びHay et al. (1989)は、ｃ－Ｆｏｓが初期応答遺伝子Ｅｇｒ－１及びｃ－ｍｙｃを阻害することを示した。また、ＡＰ－１因子は、ＭＨＣクラスｌ及びＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を阻害することが示されている（Gurney et al. (1992)J Biol. Chem. 267: 18133-18139を参照されたい）。

複数の細胞型において、ｃ－Ｆｏｓ調節領域活性化が起こり得る。標的細胞がニューロンである場合、ｃ－Ｆｏｓ調節領域活性化にとって十分な刺激は、例えば、限定されないが、シナプス活性化、電気生理学的活性化などを含むニューロン活性化を含み得る。

一部の実施形態では、ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

いくつかの場合、ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、ＣＲＥＢ、ＳＲＥ、ＡＰ１及びＳＩＦモチーフを含む。いくつかの場合、ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、ＣＲＥＢ、ＳＲＥ、ＡＰ１及びＳＩＦモチーフからなる。

ＣＲＥＢ－ＴＦ（ＣＲＥＢ、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）は、細胞性転写因子である。それは、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）と称される特定のＤＮＡ配列に結合し、それにより遺伝子の転写を増加又は減少させる。ＳＲＦとしても知られる血清応答因子は、転写因子タンパク質である。このタンパク質は、標的遺伝子のプロモーター領域内の血清応答エレメント（ＳＲＥ）に結合する。このタンパク質は、多くの最初期遺伝子、例えばｃ－ｆｏｓの活性を制御し、それにより細胞周期調節、アポトーシス、細胞増殖及び細胞分化に関与する。アクチベータータンパク質１（ＡＰ１）は、サイトカイン、成長因子、ストレス並びに細菌及びウイルス感染を含む種々の刺激に応答して遺伝子発現を制御する転写因子である。Ｓｉｓ誘導因子（ＳＩＦ）結合因子は、ｃ－ｆｏｓプロモーターにｓｉｓ／ＰＤＧＦの誘導能を付与する。

他の実施形態では、活動依存性プロモーターは、Ｅｇｒ１（Ｚｉｆ２６８としても知られる）、Ａｒｃ、Ｈｏｍｅｒ１ａ、Ｂｄｎｆ、Ｃｒｅｂ、Ｓｒｆ、Ｍｅｆ２、Ｆｏｓｂ及びＮｐａｓ４若しくはＰＲＡＭ（Soerensen et al., eLife 2016）及びＥＳＡＲＥ（Kawashima et al., Nature Methods 2013 PMID: 23852453）などの合成活動依存性プロモーター若しくはそれらの一部分又は上記の組合せであり、ｃ－Ｆｏｓの代わりに使用され得る。

一部の実施形態では、Ｅｇｒ１プロモーターは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、Ｅｇｒ１プロモーターは、配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

一部の実施形態では、活動依存性プロモーターは、Ａｒｃ又はＡｒｃ最小配列（ｍＡｒｃ）である。Ａｒｃは、主に海馬及び新皮質におけるグルタミン酸作動性ニューロン内で発現され、グリア細胞内でほとんど又は全く発現されない、活動調節性の細胞骨格関連タンパク質である。一部の実施形態では、Ａｒｃ又はｍＡｒｃプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ｍＡｒｃプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。ｍＡｒｃプロモーターは、完全長Ａｒｃプロモーターの切断バージョンである。

他の実施形態では、活動依存性プロモーターは、ＰＲＡＭ（プロモーターロバスト活性マーカー又はこの合成プロモーターの一部分：ＮＲＡＭ（ＮＰＡＳ４ロバスト活性マーカー）又はＦＲＡＭ（Ｆｏｓロバスト活性マーカー）である。ＰＲＡＭは、転写活性化によって支持される二次構造を形成するため、中央正中線エレメント（ＣＭＥ）に挿入されたコアＮＲＥ／ＡＰ－１ ＤＮＡモチーフのリピートからなる。それらは、作動可能に連結された遺伝子のより安定で一過性の低下が見られる発現を潜在的に駆動可能であるより長い活性化窓を有する。ＮＲＡＭは、最小ヒトｃ－ｆｏｓプロモーターとともに、ＮＰＡＳ－４応答性エレメント（ＮＰＡＳ４におけるコンセンサス結合モチーフ）を含む。ＦＲＡＭは、ヒトｃ－ｆｏｓ最小プロモーターとともに、ＡＰ－１モジュール（ＦＯＳ／ＪＵＮファミリー転写因子におけるコンセンサス結合配列）からなる。（例えば、Sun et al; Cell Volume 181, Issue 2, 16 April 2020, Pages 410-423. e17を参照されたい）。一部の実施形態では、ＰＲＡＭ、ＦＲＡＭ及びＮＲＡＭプロモーターは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号１７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

他の実施形態では、活動依存性プロモーターは、Ｅ－ＳＡＲＥ（増強されたシナプス活動応答性エレメント）である。この合成プロモーターは、転写開始のためのＣＲＥＢ、ＭＥＦ２及びＳＲＦの結合におけるＳＡＲＥモチーフの５つのリピート及び最小Ａｒｃプロモーター（ｍＡｒｃ）を含む。ＳＡＲＥは、Ａｒｃプロモーターの一部である。ＳＡＲＥモチーフは、最初期遺伝子Ａｒｃの誘導を制御する。Ｍｅｆ２は、心臓発生及び心臓遺伝子発現における決定的な制御因子である。一部の実施形態では、Ｅ－ＳＡＲＥプロモーターは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、Ｅ－ＳＡＲＥプロモーターは、配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

ＮＲＡＭ及びＥ－ＳＡＲＥのいずれも天然プロモーター由来の配列からなる。ＮＲＡＭは、Ｎｐａｓ４プロモーターの一部を含む。Ｅ－ＳＡＲＥは、Ａｒｃプロモーター由来の配列のタンデムリピートに基づく。

一部の実施形態では、活動依存性プロモーターは、例えば、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは内因性ナトリウムチャネル又は他のタンパク質のメッセンジャーＲＮＡに結合するＲＮＡの別のタイプの転写を駆動することにより、遺伝子の発現のレベルを抑制する。

好ましい遺伝子及び遺伝子産物
一部の好ましい実施形態では、特許請求の範囲で定義される活動依存性プロモーターに作動可能に連結される遺伝子は、ＫＣＮＡ１である。ＫＣＮＡ１（遺伝子ＩＤ３７３６、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１、ＫＶ１．１、ＨＢＫ１及びＲＢＫ１としても知られる）は、（カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１としても知られる）ヒトＫｖ１．１カリウムチャネルサブユニットをコードするヒト遺伝子である。「野生型ＫＣＮＡ１遺伝子」は、ヒト細胞内で見出され、ヒトＫｖ１．１カリウムチャネルサブユニットをコードする核酸分子を意味する。ＫＣＮＡ１遺伝子は、コード配列の上流又は下流に制御配列を含み得る。ノンコーディング５’及び３’非翻訳領域（５’及び３’ＵＴＲ）を含む野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００２１７．２に提供される。野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００２１７．２の１１０６～２５９３位に対応する配列番号４のヌクレオチド配列を有する。

一部の好ましい実施形態では、特許請求の範囲で定義される遺伝子によってコードされる遺伝子産物は、Ｋｖ１．１カリウムチャネルサブユニットである。Ｋｖ１ファミリーチャネルは、４つのサブユニットから構成される。それ自体上の４つのＫｖ１．１サブユニットは、機能的チャネルを形成し得るが、哺乳動物神経系に存在するＫｖ１．１を含むカリウムチャネルは、典型的には、Ｋｖ１ファミリーからの他のサブユニットも含むことから、完全な四量体チャネルは、様々な化学量論において、Ｋｖ１．２又はＫｖ１．４と一緒にＫｖ１．１を含み得る。「Ｋｖ１．１チャネル」という用語は、Ｋｖ１．１チャネルサブユニット又は少なくとも１つのＫｖ１．１サブユニットを含むホモ四量体若しくはヘテロ四量体チャネルのいずれかを示すように互換可能に用いられる。

Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、ショウジョウバエ（Drosophila）シェーカーチャネルに系統学的に関連する電位依存性遅延整流性カリウムチャネルである。野生型Ｋｖ１．１カリウムチャネルサブユニットにおけるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００２０８．２に一致する配列番号５のアミノ酸配列を有する。電位依存性カリウムチャネルは、電位に応答してカリウム選択性ポアを開口又は閉鎖することによって興奮性を調節する。多くの場合、カリウムイオン流は、細胞内粒子がポアを閉鎖する場合の、高速不活性化として知られる過程で中断され得る。Ｋｖ１カリウムチャネルサブユニットは、６つの推定上の膜貫通セグメントを有し、完全なチャネルを形成する４つのＫｖ１サブユニットの各々の第５及び第６セグメント間のループは、ポアを形成する。

細胞内での正常な生成中、細胞内のＫＣＮＡ１ ＲＮＡの一部は、第６膜貫通ドメイン内に位置し、イオン伝導性ポアの内側前庭を覆う単一の位置Ｉ４００でイソロイシン／バリン（Ｉ／Ｖ）記録事象を引き起こす、ＲＮＡに対して作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって編集される（Hoopengardner et al., Science 301 (5634): 832-6, 2003）。負の膜電位において、編集されていないＩ４００を含むチャネルは、それらの編集された（Ｖ４００）対応物より約２０倍遅い速度で不活性化から回復する（Bhalla et al., 2004）。

一部の好ましい実施形態では、本発明は、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルである遺伝子産物の活性依存性発現を含む。「編集されたＫｖ１．１カリウムチャネル」は、機能的なＫｖ１．１カリウムチャネルであるが、上記のイソロイシン／バリン突然変異を含む。これらの編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、不活性化からの回復時、それらの編集されていない対応物よりもはるかに迅速であると考えられる。

一部の実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置（「編集位置」）にバリンアミノ酸残基も含むことを条件として、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一部の好ましい実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列を有する。

配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、当技術分野で公知の方法によって同定され得る。例えば、編集位置は、配列番号２のアミノ酸配列と、目的の編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルのアミノ酸配列との間の配列アラインメントによって同定され得る。次に、そのような配列アラインメントを用いて、少なくともアラインメントにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基４００での編集位置と近いか又は同じ位置である、目的の編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルにおける編集位置を同定することができる。

機能的なＫｖ１．１カリウムチャネルは、カリウムチャネルの正常な活性を保持するタンパク質であり、例えば、チャネルは、電位に応答して開口及び閉鎖することができる。そのＫｖ１．１カリウムチャネルを検定する方法は、機能的であり、当技術分野で公知であり、その一部は、本明細書に記載される。即ち、Ｋｖ１．１カリウムチャネルが機能的であることを確認するための好適な方法は、細胞に、Ｋｖ１．１カリウムチャネルをコードする発現ベクターをトランスフェクトすることと、パッチクランピングなどの電気生理学的技術を使用してカリウムチャネルの電流を記録することとを含む。

野生型Ｋｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号５で示される３７９位にチロシンアミノ酸を含む。一部の実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸残基３７９に対応する位置にチロシンアミノ酸残基を含む。

他の実施形態では、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸残基３７９に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む。このアミノ酸配列を有する編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルの例は、配列番号１２で示される。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、Ｙ３７９Ｖ突然変異は、Ｋｖ１．１チャネルのテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）に対する感受性を、カリウムチャネルの機能的特性を改変することなく低減すると考えられる。例えば、感受性におけるこの変化は、パッチクランプ電気生理学実験において、トランスジェニックなＫｖ１．１チャネルがその野生型対応物から薬理学的に分離されることを可能にする（Heeroma et al. 2009）。

一部の実施形態では、「改変されたＫＣＮＡ１遺伝子」が使用される。改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、本明細書に記載のような野生型ＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列と異なるが、依然として機能的なＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする。本明細書で用いられるとき、改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の好ましい実施形態では、改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する。

上記の通り、本発明の実施形態は、配列番号１２で示される通り、３７９位にバリンアミノ酸残基を含む編集されたカリウムチャネルをコードする改変されたＫＣＮＡ１遺伝子を含む。配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする改変されたＫＣＮＡ１遺伝子の例は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を含むか若しくはそれからなるヌクレオチド配列を有するか、又は配列番号１１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する。

他の実施形態では、遺伝子産物は、Ｋｖ１．２などの他のカリウムチャネル又はＧＡＢＡａ若しくはＧＡＢＡｂ受容体などの神経伝達物質受容体、アデノシンＡ１受容体及びＮＰＹ Ｙ２若しくはＹ５受容体又はガラニン、ＮＰＹ若しくはダイノルフィンなどの神経ペプチドを含む、神経興奮性又は神経伝達物質放出に影響する別のタンパク質である。

一部の好ましい実施形態では、活動依存性プロモーターに作動可能に連結される遺伝子は、ＫＣＮＪ２として特許請求の範囲で定義される。ＫＣＮＪ２は、通常、骨格筋で発現される、内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１をコードする。Ｋｉｒ２．１は、負の静止膜電位を維持し、それにより内因性興奮性を低減することに寄与する。

一部の好ましい実施形態では、特許請求の範囲で定義される遺伝子によってコードされる遺伝子産物は、上記の内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１である。ＫＣＮＪ２のヌクレオチド配列は、本明細書に提供される。

一部の実施形態では、ＫＣＮＪ２遺伝子は、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、Ｋｉｒ２．１遺伝子は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

別の実施形態では、本発明は、内因性遺伝子又は遺伝子産物であり得るさらなる遺伝子又は遺伝子産物の発現を改変する（増加又は減少させる）ことによる、神経興奮性に間接的に影響する中間遺伝子産物の活性依存性発現を含む。さらなる／内因性遺伝子又は遺伝子産物は、ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２など、本明細書に記載の任意の遺伝子又は遺伝子産物であり得る。他のさらなる／内因性遺伝子又は遺伝子産物は、ＧＡＢＡａ又はＧＡＢＡｂ受容体などの神経伝達物質受容体、アデノシンＡ１受容体及びＮＰＹ Ｙ２若しくはＹ５受容体又はガラニン、ＮＰＹ若しくはダイノルフィンなどの神経ペプチドを含む。

中間遺伝子産物の活性依存性発現により、さらなる遺伝子又は遺伝子産物の発現を改変することは、いくつかの場合、ｄＣａｓ９（エンドヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９としても知られる）及び転写活性化因子からなる融合タンパク質の活性依存性発現を通して達成され得る。融合タンパク質は、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９などの任意の好適なｄｃａｓタンパク質からもなり得る。適切な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の存在下において、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）としても知られるこの戦略は、神経興奮性を低下させるＫＣＮＡ１などのさらなる遺伝子の転写増加を引き起こし得る。いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、標的配列を１００％の効率で標的にする。ｓｇＲＮＡは、構成的に発現され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６）などの別のプロモーターに作動可能に連結され得る。別のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩなど、ｓｇＲＮＡを発現するのに適した任意のプロモーターでもあり得る。ｓｇＲＮＡ及び別のプロモーターは、本明細書で開示される発現ベクター及びベクター系によっても含まれ得るか、又はそれらと別々であり得る。いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、活動依存性プロモーター又はＴｅｔ－Ｏｎなどの中間誘導性プロモーターにも作動可能に連結され得る。

一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

神経興奮性に間接的に影響するための中間遺伝子産物の活性依存性発現は、中間誘導性発現系などの中間発現系を介して達成され得る。そのような中間発現系は、一般的な意味において、当技術分野で公知であり、中間遺伝子又はさらなる遺伝子の発現を最適化するために当業者によって適切に選択され得る。

例えば、中間発現系は、Ｔｅｔ－Ｏｎなどの誘導性発現系であり得る。例えば、Gaia Colasante et. Al (Brain, Volume 143, Issue 3, March 2020, Pages 891-905, https://doi.org/10.1093/brain/awaa045)（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のこの態様の例示的な実施形態は、図２５に示される。この実施形態では、中間遺伝子は、ｒｔＴＡ及び／又はｄＣａｓ９であり、さらなる転写活性化因子もコードし得る。

現在利用可能な誘導性遺伝子発現系の中でも、Ｔｅｔ－Ｏｎは、最も広範に特徴付けられている。一部の実施形態では、ヒト対象における脳透過性を改善し、副作用を低減するため、中間誘導性遺伝子発現系は、「GeneSwitch（商標）」システムであり得る。「GeneSwitch（商標）」は、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＰ６５活性化ドメインとともに、内因性ステロイドに応答しない、切断されたヒトプロゲステロン受容体からなるキメラタンパク質を使用する。その受容体は、コリプレッサーから複合体を取り除くミフェプリストンによって活性化され、それが上流活性化配列（ＵＡＳ）への結合によって核内の所望の遺伝子の転写を開始することを可能にする。

中間発現系は、最適化されたエクジソン応答性プロモーターを制御する修飾エクジソン受容体の発現も含み得る。中間発現系は、cumateリプレッサーのcumateオペレーターへのcumate誘導性結合、ＦＫＢＰ１２とＦＲＡＰとの間のラパマイシン誘導性相互作用、ＦＫＢＰとシクロフィリンとの間のＦＫＣｓＡ誘導性相互作用、ＰＹＬ１とＡＢＩ１との間のＡＢＡ誘導性相互作用及び「リボスイッチ」システムにも基づき得る（Kallunki et al PMC6721553）。

マウスＫｃｎａ１の発現を上方制御するための構成的ＣＲＩＳＰＲａは、抗てんかん効果を有することが報告されている（Colasante et al.,2020）。しかし、ＣＲＩＳＰＲａをｃ－Ｆｏｓなどの活動依存性プロモーターの制御下に置くと、本明細書で開示される有利な特性、例えばてんかん発作に関与するニューロンにおける時間的可逆性及び空間的特異性を伴う活動依存性抗てんかん活性を引き起こすことになると予測することはできない。ｄＣａｓ９及び転写活性化因子ＶＰ６４のヌクレオチド配列は、マウスＫｃｎａ１遺伝子のプロモーター配列を認識するｓｇＲＮＡの配列として本明細書に提供される。

アミノ酸又はヌクレオチド配列同一性の百分率に関するアラインメント及び計算は、当業者に公知の様々な方法において、例えばClustalW1.82、T-coffee又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。そのようなソフトウェアを使用するとき、例えば、好ましくはギャップペナルティ及び伸長ペナルティについてのデフォルトパラメータが使用される。ClustalW1.82のデフォルトパラメータは、タンパク質ギャップオープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップエクステンションペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Gonnet、タンパク質／ＤＮＡエンドギャップ＝－１、タンパク質／ＤＮＡギャップディスト＝４である。

次に、同一性百分率は、多重アラインメントから（Ｎ／Ｔ）^＊１００（式中、Ｎは、２つの配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、比較される位置の総数である）として計算することができる。代わりに、同一性百分率は、（Ｎ／Ｓ）^＊１００（式中、Ｓは、比較されるより短い配列の長さである）として計算することができる。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、新規に合成され得るか、又は天然アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列若しくはその誘導体であり得る。

遺伝暗号の縮重に起因して、任意の核酸配列が、それによりコードされるタンパク質の配列に実質的に影響することなく変異又は変化を受け、その機能的変異体を提供し得ることは、明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変される配列を有し、そのため、サイレント変化をもたらすものである。他の好適な変異体は、相同性ヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸と類似する生物物理学的特性のある側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変される配列の全て又は一部分を含み、保存的変化をもたらすものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンを含む。大きい非極性の疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンを含む。正荷電（塩基性）アミノ酸は、リジン、アルギニン及びヒスチジンを含む。負荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。

一部の実施形態では、遺伝子産物の発現のレベルは、ニューロンの興奮性が高くなると増加し、及びニューロンの興奮性が低くなると減少する。

障害
本発明の一態様は、特許請求の範囲に定義される通り、対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置の方法における使用のための発現ベクターを提供する。前記処置の方法は、予防的であり得る。

特定の態様では、本発明は、ヒト又は動物対象の前記神経学的障害の処置のための薬剤の製造における、本明細書に記載のような発現ベクター及びウイルス粒子の使用、ヒト又は動物対象の前記神経学的障害の処置における使用のための、本明細書に記載のような発現ベクター並びに前記神経学的障害の処置の方法であって、本明細書に記載のような発現ベクター及びウイルス粒子を、それを必要とする個体に投与することを含む方法も提供する。動物対象は、マウス又はラットであり得る。

一部の実施形態では、処置の方法は、てんかん発作の終了後、自己制限的である（「閉ループ」又は「閉鎖ループ」療法）。

本明細書に記載のような神経学的障害は、ニューロン興奮性亢進に関連する。本明細書で用いられるとき、「興奮性亢進」は、神経回路網が過剰なニューロン発火と過同期化される可能性が増加するてんかんの特徴である。基礎的機構は、不完全に理解されており、通常であれば他のニューロンの興奮性と平衡化するであろう、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンなどの阻害性ニューロンの欠損又はそれらが異常に発火する可能性を高める、興奮性ニューロンの内因性特性における変化を含み得る。考えられる機構の中でも、ＧＡＢＡのレベル及びＧＡＢＡＡ受容体の神経伝達物質に対する感受性は、低下することで阻害の低下をもたらすことがある。

ニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の非限定例としては、発作性障害（てんかんなど）、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、振戦及び他の運動障害、慢性疼痛、片頭痛、大うつ病、双極性障害、不安及び統合失調症が挙げられる。特に好ましい実施形態では、処置は、てんかん、例えば特発性、症候性及び原因不明性てんかんを対象とする。特に好ましい実施形態では、てんかんは、特に治療濃度で使用される薬剤に対して抵抗性がある場合（薬理学的抵抗性又は難治性てんかん）、新皮質てんかん、側頭葉てんかんである。

いくつかの場合、てんかん発作は、皮質における錐体神経の深い脱分極及び発火のバーストを、５０Ｈｚを超える頻度で伴い、それは、生理学的環境下で起こるにしても稀である。活動依存性プロモーターは、非常に強力な感覚又は他の刺激（末梢侵害受容刺激、恐怖誘導性の電気ショック、コカイン）によって動員されているニューロンを標識するために使用されているが、ニューロンからの記録は、てんかん発作がそのような刺激よりはるかに高いレベルの活動を誘導することを意味する。さらに、そのような感覚刺激が活動依存性プロモーター機能を誘導することが示されているＣＮＳ領域は、典型的には、てんかん発作に関与する場合と異なる。

一部の好ましい実施形態では、神経学的障害は、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、発作性運動障害、単極性又は双極性感情障害、不安及び恐怖症などの異常な細胞活動のエピソードを特徴とする障害である。一部のそのような障害（特に片頭痛）において、異常な活動は、皮質拡散脱分極又は皮質拡延性抑制として知られるニューロン脱分極及び電気的サイレンシングをもたらすことがあり、この現象は、てんかんにおける予期しない突然死（ＳＵＤＥＰ）に関与している。

本明細書に記載の処置を用いて、てんかん性活動をクエンチ又は遮断することができる。その処置を用いて、てんかん発作の頻度を低減することができる。その処置を用いて、異常なニューロン興奮性を一時的に（例えば、２、６、２４、４８若しくは７２時間にわたり）又は永久的に低減することができる。

一部の実施形態では、ベクターは、対象における自発運動又は記憶に影響せず、任意選択的に、自発運動又は記憶は、オープンフィールド試験、オブジェクト局在化試験又はＴ迷路試験を使用して測定される。

一部の実施形態では、発現ベクターは、対象の脳のてんかん発作焦点に限り、局所的に活性である。いくつかの場合、発現ベクターは、てんかん発作を駆動し、及び／持続的発火をもたらすことが可能なニューロンに限り、局所的に活性である。いくつかの場合、発現ベクターは、過剰な脱分極のニューロンに限り、局所的に活性である。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、５％超、又は１０％超、又は２０％超、又は３０％超、又は４０％超、又は５０％超、又は６０％超、又は７０％超、又は８０％超、又は９０％超、又は９１％超、又は９２％超、又は９３％超、又は９４％超、又は９５％超、又は９６％超、又は９７％超、又は９８％超、又は９９％超、又は１００％の、対象のニューロンのスパイク頻度の減少を引き起こし得る。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、７５％超の、対象のニューロンのスパイク頻度の減少を引き起こし得る。ニューロンのスパイク頻度の減少は、２１ＤＩＶ（インビトロ日数）以降、多電極アレイを使用して測定され得る。スパイク頻度の減少は、２１ＤＩＶ以降、カルシウムイメージング又は細胞外フィールド電位記録を使用して測定され得る。ニューロンのスパイク頻度の減少は、配列番号６を含むベクターに対して測定される。いくつかの場合、ニューロンは、一次皮質ニューロンである。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、ニューロンにおいて、１秒あたり１０未満の活動電位、又は１秒あたり５つ未満の活動電位、又は１秒あたり４つ未満の活動電位、又は１秒あたり３つ未満の活動電位、又は１秒あたり２つ未満の活動電位、又は１秒あたりのゼロの活動電位を引き起し得る。一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、１秒あたり、活動電位における５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超又は１００％の減少を引き起こし得る。活動電位の数は、エクスビボでの急性海馬切片の電気生理学実験を使用して測定され得る。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、－５０ｍＶ未満、又は－６０ｍＶ未満、又は－７０ｍＶ未満、又は－８０ｍＶ未満、又は－９０ｍＶ未満、又は－１００ｍＶ未満の、ニューロンにおける静止膜電位を引き起こし得る。一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、ニューロンにおける活動電位の閾値を５０ｐＡ超、又は７５ｐＡ超、又は１００ｐＡ超、又は１５０ｐＡ超、又は２００ｐＡ超、又は２５０ｐＡ超、又は３００ｐＡ超、又は３５０ｐＡ超、又は４００ｐＡ超、又は４５０ｐＡ超、又は５００ｐＡ超、又は５５０ｐＡ超、又は６００ｐＡ超、又は７００ｐＡ超、又は８００ｐＡ超、又は９００ｐＡ超、又は１０００ｐＡ超まで増加させることができ、閾値は、電流閾値及び保持電流の合計である。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、例に記載の通り、多電極アレイ（ＭＥＡ）上で増殖された初代ニューロン培養物中で５スパイク未満／秒を引き起こし得る。スパイクは、凝集ニューロン活動と定義される。一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、例に記載の通り、ＭＥＡ上で増殖された初代ニューロン培養物中で１０バースト未満又は５バースト未満／分を引き起こし得る。一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、例に記載の通り、ＭＥＡ上で増殖された初代ニューロン培養物中で２００ミリ秒未満のバースト持続期間を引き起こし得る。一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、例に記載の通り、ＭＥＡ上で増殖された初代ニューロン培養物中で２０未満又は１５未満のスパイク／バーストの平均数を引き起こし得る。

一部の実施形態では、活動電位の数、静止膜電位又は活動電位の閾値は、対象からの急性海馬切片において測定される。一部の実施形態では、活動電位の数、静止膜電位又は活動電位の閾値は、急性海馬切片の電気生理学実験及び／又はパッチクランプ電気生理学実験を使用して測定される。

一部の実施形態では、ベクター又はベクター系は、対象における２回目のてんかん発作を駆動するニューロンにおいて、対象における１回目のてんかん発作を駆動するニューロンにおける抗てんかん効果よりも大きい抗てんかん効果を引き起こし得る。一部の実施形態では、抗てんかん効果は、本明細書に記載の適切な方法のいずれかを使用して測定される。

いくつかの場合、ベクター又はベクター系は、対象における２回目のてんかん発作を予防し得、２回目のてんかん発作は、対象における１回目のてんかん発作に後続する。

投与及び用量
本明細書に記載のウイルス粒子及び発現ベクターは、ウイルス粒子の脳への直接的注射などの種々の方法で対象に送達され得る。例えば、処置は、ウイルス粒子の大脳皮質、特に新皮質又は海馬体への直接的注射を含み得る。別の注射部位は、限局性皮質形成異常又は結節性硬化症において起こるとき、てんかん発作をもたらすことが疑われる皮膚形成異常症又は過誤腫の領域である。処置は、ウイルス粒子の、障害に機能的に関連すると考えられる脳内の位置への直接的注射を含み得る。例えば、処置がミオクローヌスてんかんを対象にする場合、これは、ウイルス粒子の運動皮質への直接的注射を含み得；処置が慢性又はてんかん発作性疼痛を対象にする場合、これは、ウイルス粒子の後根神経節、三叉神経節又は翼口蓋神経節への直接的注射を含み得；処置がパーキンソン病を対象とする場合、これは、ウイルス粒子の黒質、視床下核、淡蒼球又は被殻への直接的注射を含み得る。投与の特定の方法及び部位は、医師の自己判断となり、医師は、当業者に公知のその共通の一般的知見及びそれらの技術を用いて投与技術を選択することになるであろう。

また、本発明を用いて、複数の同定された焦点への直接的注射により、複数のてんかん焦点を同時に処置することができる。

患者は、薬剤耐性の又は医学的に難治性のてんかんを有すると診断されている者であり得、それは、抗てんかん薬の十分な投与にもかかわらず、てんかん発作が持続することを意味する。

対象は、脳の新皮質の単一領域に影響する、十分に定義された焦点性てんかんを有すると診断されている者であり得る。焦点性てんかんは、例えば、発生異常又はそれに続く脳卒中、腫瘍、穿通性頭部外傷若しくは感染に起因し得る。

ウイルス粒子の投与後、レシピエント個体は、処置されている疾患又は障害の症状の減少を示し得る。例えば、てんかんなどの発作性障害を有する処置されている個体において、レシピエント個体は、発作の頻度又は重症度の減少を示し得る。これは、個体における病状に対する有益な効果を有し得る。

「処置」という用語は、病態の治療と関連して本明細書で用いられるとき、一般に、いくつかの所望の治療効果、例えば病態の進行の阻害が達成されるヒトの処置及び治療法に関し、進行の速度における減少、進行の速度における停止、病態の退縮、病態の寛解及び病態の治癒を含む。予防的処置（即ち発病予防、予防）としての処置も含まれる。

ウイルス粒子は、治療有効量で送達され得る。

「治療有効量」という用語は、本明細書で用いられるとき、所望の治療計画に従って投与される場合、合理的なリスク・ベネフィット比に見合ういくつかの所望の治療効果をもたらすのに有効であるウイルス粒子の量に関する。

同様に、「予防有効量」という用語は、本明細書で用いられるとき、所望の治療計画に従って投与される場合、合理的なリスク・ベネフィット比に見合ういくつかの所望の予防効果をもたらすのに有効であるウイルス粒子の量に関する。

本明細書と関連する「発病予防」は、完全な成功、即ち完全な保護又は完全な予防を説明すると理解されるべきではない。むしろ、これに関連して、発病予防は、その特定の病態を遅らせるか、軽減するか又は回避することを補助することによって健康を維持することを目的として、症候性状態の検出前に投与される処置を指す。

ウイルス粒子の単独での使用（例えば、投与）が可能である一方、例えば、薬学的に許容される担体又は希釈剤を有する組成物又は製剤としてそれを提示することが好ましいことが多い。

「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いられるとき、健全な医学的判断の範囲内において、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答又は他の課題若しくは合併症を伴うことなく、問題の対象（例えば、ヒト）の組織との接触における使用に適した化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。また、各々の担体、希釈剤、賦形剤などは、製剤の他の成分に適合するという意味で「許容される」必要がある。

一部の実施形態では、組成物は、唯一の活性成分としての、本明細書に記載のようなウイルス粒子及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含むか、又は本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる医薬組成物（例えば、製剤、調製物、薬剤）である。

国際公開第２００８０９６２６８号に記載の通り、ウイルス粒子の送達を用いる遺伝子療法の実施形態において、単位用量は、投与中のウイルス粒子の用量を単位として計算され得る。ウイルス用量は、ウイルス粒子の特定数又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウイルスを含む実施形態の場合、特定の単位用量は、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３又は１０^１４ｐｆｕを含む。粒子用量は、感染欠損粒子の存在に起因してややより高い（１０～１００倍）場合がある。

一部の実施形態では、本発明の方法又は処置は、症候性又は疾患修飾のいずれかの他の治療法と組み合わされ得る。

「処置」という用語は、例えば、順次に又は同時に２つ以上の処置又は治療法が組み合わされる、組み合わせ処置及び治療法を含む。

例えば、本明細書に記載のような化合物による処置を１つ又は複数の他の（例えば、１、２、３、４つの）薬剤又は治療法と組み合わせることは、有利であり得る。

共治療薬の適切な例は、本明細書中の開示に基づいて当業者に公知であろう。典型的には、共治療薬は、処置されている個体の診断に従う本明細書に記載の疾患の処置において治療効果をもたらし得ると考えられる、当技術分野で公知のいずれかのものであり得る。例えば、てんかんは、ときに基礎的病因を直接的に処置することによって寛解され得るが、異常な放電及びてんかん発作を抑制する抗痙攣薬、例えばフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリギン、レベチラセタム、カルバマゼピン、クロバザム、トピラマート及びその他が既存の処置の主流である（Rho & Sankar, 1999, Epilepsia 40: 1471-1483）。

特定の組合せは、医師の自己判断となり、医師は、当業者に公知のその共通の一般的知見及び投与計画を用いて用量を選択することになるであろう。

薬剤（即ちウイルス粒子に加えて１つ又は複数の他の薬剤）は、同時に又は順次に投与され得、また個別に変更される投与計画で異なる経路を介して投与され得る。例えば、順次に投与される場合、薬剤は、密な間隔（例えば、５～１０分間にわたり）又はより長い間隔（例えば、１、２、３、４時間若しくはそれを超える時間間隔又は必要に応じてさらにより長い期間の間隔）で投与することができ、正確な投与計画は、治療薬の特性に適合している。

発現ベクター
発現ベクターは、本明細書で用いられるとき、細胞において外来遺伝子材料を導入及び発現するために使用されるＤＮＡ分子である。そのようなベクターは、発現されるべきタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。「プロモーター」は、それが作動可能に連結されるＤＮＡ配列の転写を導くのに十分な最小ＤＮＡ配列を意味する。「プロモーター」は、細胞型に特異的な発現について制御可能なプロモーター依存性遺伝子発現にとって十分なプロモーターエレメントを包含することも意味し；そのようなエレメントは、天然遺伝子の５’又は３’領域内に位置し得る。代わりに、発現ベクターは、逆転写酵素の結果としてＤＮＡへの逆転写を受けるＲＮＡ分子であり得る。

発現ベクターは、終止コドン及び発現エンハンサーも含み得る。任意の好適なベクター、エンハンサー及び終止コドンを用いて、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルなどの遺伝子産物を本発明に従う発現ベクターから発現することができる。好適なベクターは、プラスミド、バイナリーベクター、ファージ、ファージミド、ウイルスベクター及び人工染色体（例えば、酵母人工染色体又は細菌人工染色体）を含む。以下により詳細に記載の通り、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを含む。

発現ベクターは、加えて、レポータータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含み得る。レポータータンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）である。レポーター遺伝子は、それ自体のプロモーターに作動可能に連結され得るか、又はより好ましくは本発明で定義されるような遺伝子産物と同じプロモーターに作動可能に連結され得る。例として、ＫＣＮＡ１遺伝子及びレポーター遺伝子は、Ｔ２Ａペプチドなどの２Ａペプチドをコードする配列のいずれかの側に位置し得る。２Ａペプチドは、リボソーム媒介翻訳中にペプチド結合の形成を損なわせることにより、単一のプロモーターからのマルチシストロン性遺伝子発現を可能にする短い（約２０アミノ酸）配列である（Szymczak and Vignali, 2005）。レポーター遺伝子を遺伝子産物と同じプロモーターに作動可能に連結させることは、遺伝子産物発現の信頼できる指標として作用すると考えられる。レポーター遺伝子を含む発現ベクターは、前臨床適用、例えばそれが遺伝子発現の局在化の評価に寄与するために使用され得る場合の動物モデルにおける使用のために特に有用であり得る。ＧＦＰをコードする遺伝子は、ＧＦＰ、ｄｓＧＦＰ又はｄｓｃＧＦＰであり得る。

他の実施形態では、発現ベクターは、レポータータンパク質をコードする配列を欠いている。これは、例えば、調節性の理由で好ましいことがある。本発明の実施形態では、本開示の遺伝子産物の報告又は検出は、異なる方法において、例えばその改変された配列に基づいて達成され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ＧＦＰをコードする配列及び／又はＴ２Ａペプチドなどの２Ａペプチドをコードする配列を欠いている。

概して、当業者は、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現のためのプロトコルを設計することが十分に可能である。好適なベクターは、必要に応じて、上記の本発明のエレメントに加えて、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含むように選択又は構築され得る。細胞内でのポリペプチドの発現に適した分子生物学技術は、当技術分野で周知である。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, (1995, and periodic supplements)を参照されたい。

本明細書で用いられる「作動可能に連結される」という用語は、選択される遺伝子及びプロモーターが、遺伝子（即ちポリペプチドをコードする）の発現をプロモーターの影響下又は制御下に置くような方法で共有結合的に連結される状況を含む。従って、プロモーターは、プロモーターが細胞内で遺伝子のＲＮＡへの転写をもたらす能力がある場合、遺伝子に作動可能に連結される。必要に応じて、次に、得られるＲＮＡ転写物は、所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。プロモーターは、哺乳動物細胞内で作動可能に連結された遺伝子の発現をもたらすのに適する。好ましくは、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。

改変されたＫＣＮＡ１遺伝子などの本開示の遺伝子及び編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルなどの遺伝子産物は、発現ベクターに関連して、本明細書に記載のような必要な特徴及び配列同一性を有し得る。

一部の好ましい実施形態では、発現ベクターは、以下の配列：ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号１９）；ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号２１）；ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号２３）；ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号２５）；ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号２７）；ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号２９）；Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号３１）；Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号３３）
の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態では、発現ベクターは、図１～３５のいずれか１つで示される通りである。

ウイルスベクター
本発明での使用のための好ましい発現ベクターは、レンチウイルス又はＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである。特に好ましい発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）である。

いくつかの場合、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、安定及び部位特異的な様式において、それらが感染する細胞のゲノムに組み込み得る比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞増殖、形態又は分化に対して有意な効果を誘導することなく、広域スペクトルの細胞に感染することができる。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、特徴付けられている。それは、約４７００塩基を包含し、各末端に、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基のインバーテッド末端リピート（ＩＴＲ）領域を含む。ゲノムの残り部分は、キャプシド形成機能を保有する２つの必須領域：ウイルス遺伝子のウイルス複製及び発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左手部分；並びにウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右手部分に分割される。

ＡＡＶベクターは、当技術分野における標準的方法を用いて調製され得る。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが好適である（例えば、Blacklow, pp. 165-174 of “Parvoviruses and Human Disease”J. R. Pattison, ed. (1988)；Rose, Comprehensive Virology 3:1,1974；P. Tattersall“The Evolution of Parvovirus Taxonomy”in Parvoviruses (J R Kerr, S F Cotmore. M E Bloom, R M Linden, C R Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, London, UK (2006)；及びD E Bowles, J E Rabinowitz, R J Samulski“The Genus Dependovirus”(J R Kerr, S F Cotmore. M E Bloom, R M Linden, C R Parrish, Eds.) p15-23, Hudder Arnold, London, UK (2006)を参照されたく、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターについて精製する方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、米国特許第６，９８９，２６４号、米国特許第６９９５００６号及び国際特許出願公開の“Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”という名称の国際公開第１９９９／０１１７６４号（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

ハイブリッドベクターの調製については、例えば、ＰＣＴ出願のＰＣＴ／米国特許出願公開第２００５／０２７０９１号（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インビトロ及びインビボで遺伝子を導入するためのＡＡＶ由来のベクターの使用について記載がなされている（例えば、国際特許出願公開の国際公開第１／１８０８８号及び国際公開第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第６，５９６，５３５号及び米国特許第５，１３９，９４１号；並びに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたく、それらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失され、目的の遺伝子で置換される場合の様々なＡＡＶ由来の構築物並びにインビトロで目的の遺伝子を（培養細胞内に）又はインビボで（直接的に生物内に）導入するためのこれらの構築物の使用について記載している。本発明に従う複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶインバーテッド末端リピート（ＩＴＲ）領域によって隣接された目的の核酸配列を含むプラスミド及びＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染させた細胞株に運搬するプラスミドを同時トランスフェクトすることによって調製され得る。次に、作製されたＡＡＶ組換え体は、標準技術により精製される。

いくつかの場合、本明細書に記載のような発現構築物にとって有用なＡＡＶベクターは、ウイルス粒子（例えば、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６及びＡＡＶｒｈ１０を含むＡＡＶウイルス粒子）中にカプシド形成されるものを含む。従って、本開示は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（それは、組換えポリヌクレオチドを含むために組換えである）を含む。

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする配列を含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする配列を欠いている。

一部の実施形態では、ベクターは、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列である。

一部の好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、以下の配列：ＡＡＶ－ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号２０）；ＡＡＶ－ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号２２）；ＡＡＶ－ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号２４）；ＡＡＶ－ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号２６）；ＡＡＶ－ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号２８）；ＡＡＶ－ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号３０）；ＡＡＶ－Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（配列番号３２）；Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（配列番号３４）
の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、加えて、ウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む。

一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非組み込みレンチウイルスベクター（ＮＩＬＶ）である。これらのベクターから生成されるベクター粒子は、それらのウイルスゲノムを細胞のゲノムに組み込まず、そのため、一過性発現が必要とされる場合の適用において又は例えば静止細胞内での持続的なエピソーム発現にとって有用である。ＮＩＬＶは、インテグラーゼ酵素における突然変異により、又は５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲを改変し、インテグラーゼがこれらの配列に結合することを阻止することにより発現され得る。これらの修飾は、核への組み込み前複合体の逆転写及び輸送に影響することなく、インテグラーゼ活性を除去する。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、ＮＩＬＶが細胞に侵入する場合、レンチウイルスＤＮＡは、エピソームのような核内の残り部分として残存し、ニューロンなどの非分裂細胞（分裂終了細胞）内での持続的発現を引き起こすことが予想される。

一部の実施形態では、ベクターは、ＡｍｐＲ遺伝子、及び／又はｈＧｈポリ（Ａ）シグナル遺伝子、及び／又は１つ若しくは複数の複製起点遺伝子をさらに含む。

ウイルス粒子
本発明は、レンチウイルス粒子又はアデノ随伴ウイルス粒子などのウイルス粒子を作製するインビトロ方法も含む。一実施形態では、この方法は、哺乳動物細胞に本明細書に記載のようなウイルスベクターを形質導入することと、細胞内での粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質を発現させることと、形質導入細胞を培地で培養することとを含み、それにより、細胞は、培地中に放出されるウイルス粒子を生成する。好適な哺乳動物細胞の例としては、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞が挙げられる。

ウイルス粒子形成及び機能にとって必要とされる全てのウイルス成分をコードする単一の発現ベクターを使用することが可能である。しかし、最も多くは、宿主細胞に安定に組み込まれた複数のプラスミド発現ベクター又は個別の発現カセットを用いて、ウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝的成分を分離する。

一部の実施形態では、１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする発現カセットは、哺乳動物細胞に安定に組み込まれている。これらの実施形態では、これらの細胞に、本明細書に記載のウイルスベクターを形質導入することは、さらなる発現ベクターを付加することなく、ウイルス粒子の生成をもたらすのに十分である。

他の実施形態では、インビトロ方法は、複数の発現ベクターを使用することを含む。一部の実施形態では、方法は、哺乳動物細胞に、粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードするウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又は複数の発現ベクターを形質導入することを含む。

好適なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質並びにこれらのタンパク質をコードする発現ベクターの例は、市販されており、当技術分野で周知である。一般に、ウイルスパッケージング発現ベクター又は発現カセットは、ベクター粒子形成及びベクタープロセシングにとって必要とされるタンパク質をコードするＨＩＶ－１のｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ及びｔａｔ遺伝子領域を発現する。一般に、ウイルスエンベロープ発現ベクター又は発現カセットは、ＶＳＶ－Ｇなどのエンベロープタンパク質を発現する。いくつかの場合、パッケージングタンパク質は、Ｒｅｖをコードするものと、Ｇａｇ及びＰｏｌをコードするものとの２つの別々のベクター上に提供される。レンチウイルスベクターであって、それらに関連したパッケージング及びエンベロープベクターを伴うレンチウイルスベクターの例として、Dull, T. et al.,“A Third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system”J. Virol 72 (11): 8463-71 (1998)（参照により本明細書に組み込まれる）のものが挙げられる。

ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、ｃＤＮＡ鎖の合成の基本として、２つの１４５塩基のインバーテッド末端リピート（ＩＴＲ）によって隣接される２つのオープンリーディングフレームＲｅｐ及びＣａｐを含む。Ｒｅｐ及びＣａｐは、複数のタンパク質（ＡＡＶの生活環にとって必要とされるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０；及びカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を生成する。トランスジーンは、トランスにＩＴＲとＲｅｐ及びＣａｐとの間において挿入されることになる。ＡＡＶ２骨格は、一般に使用され、Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｏｒｉ）、パッケージング（ｐｋｇ）及び宿主細胞染色体組み込み（ｉｎｔ）を導くシス作用性配列は、ＩＴＲ中に含まれる。ＡＡＶは、アデノウイルスからの遺伝子を含むヘルパープラスミドも必要とする。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ及びＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介する。ｐＡＡＶプラスミドの例は、Addgene（Cambridge, MA, USA）からプラスミド番号１１２８６５又は６０９５８として入手可能である。

ウイルス粒子の放出後、ウイルス粒子を含む培地は、収集され得、また任意選択的に、ウイルス粒子は、培地から分離され得る。任意選択的に、ウイルス粒子は、濃縮され得る。

生成及び任意選択的な濃縮後、ウイルス粒子は、例えば、細胞に投与することによる使用及び／又は治療における使用が可能な状態で－８０℃において凍結させることによって貯蔵され得る。

本発明は、ウイルス粒子、例えば本明細書に記載の方法によって生成されるものも提供する。本明細書で用いられるとき、ウイルス粒子は、細胞、例えば哺乳動物細胞に感染する能力があるウイルスエンベロープ内部にパッケージングされるＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを含む。ウイルス粒子は、インテグラーゼ欠損であり得、例えば、それは、突然変異体インテグラーゼ酵素を含み得るか、又は本明細書に記載のような５’及び／又は３’ＬＴＲにおける改変を含み得る。

細胞
本発明は、上記の核酸又はベクターを含む細胞も提供する。一部の実施形態では、この細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ）２９３である。一部の実施形態では、細胞は、神経芽細胞腫細胞株に由来する。

キット
本発明は、本明細書に記載のような発現ベクターと、やはり本明細書に記載の１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープ発現ベクターとを含むキットも提供する。一部の実施形態では、ウイルスパッケージング発現ベクターは、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである。

遺伝子産物の存在を確認する方法
本発明は、細胞内において、改変されたＫＣＮＡ１など、本明細書に記載のような遺伝子産物の存在を確認する方法も提供する。

特定の遺伝子配列を用いる臨床解釈の制限は、脳内に存在するバックグラウンドの内因性チャネルに対するそれらの発現を検出することが困難なことである。

本明細書に記載のような遺伝子産物の配列は、細胞内で見出される内因性野生型遺伝子産物と異なり得るが、そこでは、この遺伝子がＲＮＡに転写されるとき、それは、固有のＲＮＡ配列（「ＲＮＡフィンガープリント」）を組み込む。このＲＮＡフィンガープリントは、通常、トランスジェニック及び内因性遺伝子産物間を識別できないと思われるＲＮＡ標的化技術によるトランスジーン発現の特定の追跡を可能にする。これは、遺伝子発現の局在化を、潜在的に免疫原性をもたらすことができる蛍光タグ又はエピトープをコードする配列を含む必要がない場合に判定することが重要である場合に特に有用である。

例えば、遺伝子産物で処置されている患者から採取される組織は、遺伝子産物が存在した場所及び細胞型（想定通りの興奮性ニューロン若しくは阻害性ニューロン又はグリア細胞）を決定するために試験することができる。そのような組織は、例えば、てんかん遺伝子療法の不成功時のてんかん手術から又は死後に得ることができる。このデータは、前臨床用量の計算、体内分布試験、規制当局の承認及び遺伝子療法に関するさらなる臨床開発にとって有用であることが期待される。

従って、一実施形態では、方法は、目的の遺伝子産物の発現を可能にする条件下において、細胞に、本明細書に記載のような発現ベクターを形質導入するか、又は本明細書に記載のようなウイルス粒子を細胞に投与することと、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、細胞内で遺伝子産物ＲＮＡの存在を検出することとを含む。方法は、インビトロ又はエクスビボ、例えばヒト又は動物身体から外植された細胞培養物中又は細胞内で実施され得る。代わりに、方法は、インビボで実施することができ、そこでは、例えばハイブリダイゼーションアッセイを使用して、細胞内の遺伝子産物ＲＮＡの存在を検出するため、ウイルス粒子がヒト又は動物対象における細胞に投与された後にヒト又は動物対象から細胞又は組織を抽出する。

一部の実施形態では、発現された遺伝子産物の局在化を試験するため、本発明のウイルス粒子で処置されている対象から細胞又は組織が抽出される。そのような組織は、例えば、てんかん遺伝子療法が失敗した場合のてんかん手術から又は死後に得ることができる。

本発明は、本明細書に記載のウイルス粒子が投与された対象から得られている、細胞内の遺伝子産物の存在を確認するインビトロ又はエクスビボ方法であって、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、細胞内の改変された遺伝子産物ＲＮＡの存在を検出することを含む方法も提供する。

ハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で公知であり、一般に相補的な核酸プローブを使用すること（標識プローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術など）を含む。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、蛍光標識プローブなどの標識プローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションアッセイである。

本明細書で用いられるとき、「プローブ」という用語は、相補的核酸を検出するために使用される核酸を指す。典型的には、プローブは、ＲＮＡプローブである。

１７～３０塩基のオリゴヌクレオチドに適した選択的ハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション及び４２℃～６５℃の一連の増加温度での６×ＳＳＣでの洗浄を含む。特定の配列相同性がある核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための１つの共通式は、（Sambrook et al., 1989）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Log［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－６００／二本鎖の＃ｂｐである。

本明細書中の任意のサブタイトルは、あくまで便利性を意図して含められ、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきでない。本発明は、ここで、以下の非限定的な図面及び実施例を参照してさらに説明される。本発明の他の実施形態は、当業者がこれらを参照して理解するであろう。本明細書中で引用される全ての参考文献の開示は、それが本発明を実施するために当業者によって使用され得る限り、相互参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。

図
本発明の特定の態様の概略図である。図１Ａ（上部）は、正常な活動レベルを有するニューロンを表す。図１Ａ（下部）は、てんかん発作を駆動する高い活性を有する過興奮性ニューロン（より暗いシェーディング）を表す。図１Ｂは、現在の遺伝子療法アプローチを表し、ここでは、ニューロン興奮性を調節し、てんかん発作を処置するため、全てのニューロンが持続的に修飾される。図１Ｃは、本発明の特定の態様を表し、ここでは、ニューロン興奮性を調節し、てんかん発作を処置するため、過興奮性ニューロンのみが修飾される。図１Ｄは、ｃ－Ｆｏｓ－ＫＣＮＡ１作用の仮定された分子機構及び本開示の例示的なベクターを示す。活動亢進（神経興奮性の強力な増加）／てんかん活動又は発作は、ｃ－ｆｏｓ又は他の活動依存性プロモーターの活性化を誘導し、次いで神経興奮性を低下させることができるＫＣＮＡ１又は他のトランスジーンを活性化することになる（Ｋｖ１．１チャネルＨＬ＝１２ｄ）。活動依存性プロモーターの活性化は、ＫＣＮＡ１の過剰発現を引き起こし得る。プロモーターの活性化は、一過性であるが、発現されるタンパク質は、よる長い期間（例えば、数日）、ニューロン内で発現されることになり、即ち持続性の抗てんかん効果である。病理学的状態が修正されると、ツールは、スイッチオフされる（及び必要に応じて再活性化される）。図１Ｅは、本発明における使用に適した活動依存性遺伝子の概要を示す。図１Ｆは、齧歯類及びヒトにおける活動亢進によって誘導されるｃ－ｆｏｓ活性化の例を示す。図１Ｇは、本発明における使用に適した、活動依存性プロモーター及びトランスジーンの異なる組合せを示す。表示のような他のトランスジーンも、本発明での使用に適することがある。トランスジーンは、異なる特性及び神経興奮性に対する機能的効果を有する。プロモーターは、活性化、細胞特異性及び非活性化のタイミングの観点から異なる特性を有する。図１は、実施例１でさらに説明される。 ｃ－Ｆｏｓ免疫染色実験の結果を示す（図２Ａ及び図２Ｂ）。てんかん発作様活動（４－アミノピリジン＋ピクロトキシンによって誘導される）は、内因性ｃ－Ｆｏｓ発現における、迅速であるが、一過性の増加を引き起こす。図２は、実施例２でさらに説明される。 レンチウイルスｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ（図３Ａ）蛍光イメージング実験の結果を示す（図３Ｂ及び図３Ｃ）。図３Ｄは、ＡＡＶ９ ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（中央）及びｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２（右）蛍光イメージング実験の結果を示す。これらは、プロモーターがニューロン活動に従うことを示す。図３は、実施例３でさらに説明される。 ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、スパイク／秒、バースト／分及びスパイク／バーストの平均数（下部パネルを参照されたい）による測定として、皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。ＥＥＧ実験からの記録例が上部パネルに示される（垂直スケールバーは、２０μＶに対応し；水平スケールバーは、１秒に対応する）。図４は、実施例４でさらに説明される。 ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、スパイク／秒（図４Ａ）、バースト／分（図４Ｂ）、バースト持続時間（ミリ秒）（図４Ｃ）及びスパイク／バーストの平均数（図４Ｄ）による測定として、インビトロで神経回路網の興奮性を４８時間にわたりＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。ＰＴＸは、けいれん誘発薬（ピクロトキシン）である。図５Ｅは、スパイク／秒の発火速度による測定として、ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１、ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２、ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１、ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２及びＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。図５は、実施例４及び５でさらに説明される。 細胞依存性遺伝子発現（図６Ａ）と比較して、活動依存性遺伝子発現（図６Ｂ）がてんかん発作焦点に特異的であることを実証する、インビボ蛍光実験の結果を示す。図６Ａにおけるスケールバーは、５００μｍであり；図６Ｂにおけるスケールバーは、５０μｍである。実験手順の概略図は、図６Ｃに示される。図６は、実施例６でさらに説明される。 ラットてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。図７は、実施例７でさらに説明される。水平スケールは、５００μｍに対応し得る。「ＣＡ１」は、海馬のアンモン角１サブ領域を指し、「ＤＧ」は、歯状回を指す。 実施例４～１１で使用されたベクターｐＸ５５２－ｃ－ＦｏｓＰ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。 ベクターｐＸ５５２－ｃ－ＦｏｓＰ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。図９は、実施例７でさらに説明される。図９は、実施例１１でもさらに説明される。 てんかん発作後の活動依存性プロモーターの活性化及びそれらがＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２のいずれかを駆動するときの神経興奮性に対する効果を実証するためのエクスビボ海馬切片電気生理学実験の実験計画を示す。ＰＴＺは、急性化学けいれん薬（ペンチレンテトラゾール）である。図１０は、実施例８でさらに説明される。 てんかん発作によって活性化される活動依存性ＫＣＮＡ１発現が神経興奮性を低下させるのに十分であることを実証する、急性海馬のニューロンにおけるエクスビボ電気生理学実験の結果を示す。図１１は、ニューロン発火における代表的なトレースを示す。図１１は、実施例８でさらに説明される。 てんかん発作によって活性化される活動依存性ＫＣＮＡ１発現が神経興奮性を低下させるのに十分であることを実証する、急性海馬のニューロンにおけるエクスビボ電気生理学実験の結果を示す。図１２は、神経興奮性を選択的に低下させる場合の活動依存性遺伝子療法の有効性を実証する、異なる電流注射で誘発される活動電位の数を示すグラフである。図１２は、実施例８でさらに説明される。 てんかん発作によって活性化される活動依存性ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２発現のいずれかが神経興奮性を低下させるのに十分であることを実証する、エクスビボ電気生理学実験の結果を示す。左側：ＫＣＮＪ２がニューロンを過分極化する（ＲＭＰ：静止膜電位）。右側：活動依存性プロモーター駆動性のＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２発現は、活動電位を誘発するに必要とされる電流を増加させる。図１４は、実施例８でさらに説明される。 てんかん発作によって活性化される活動依存性プロモーターが一部のニューロンのみを選択的に活性化したことを実証する、エクスビボ電気生理学実験後の切片の蛍光を示す。図１４は、実施例８でさらに説明される。 てんかん発作によって活性化される活動依存性プロモーターが一部のニューロンのみを選択的に活性化したことを実証する、エクスビボ電気生理学実験後の切片の蛍光を示す。図１５は、実施例８でさらに説明される。 反復性てんかん発作に対する保護効果を示すインビボ実験の結果を示す。活動依存性遺伝子療法は、１回目のてんかん発作によって活性化され、２回目のてんかん発作が誘導されると、抗てんかん効果を示した。この実験は、例として、ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２を使用して実施されている。図１６は、実施例９でさらに説明される。 反復性てんかん発作に対する保護効果を示すインビボ実験の結果を示す。活動依存性遺伝子療法は、１回目のてんかん発作によって活性化され、２回目のてんかん発作が誘導されると、抗てんかん効果を示した。この実験は、例として、ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２を使用して実施されている。図１７は、実施例９でさらに説明される。 マウスてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が慢性難治性てんかんの重篤モデルにおけるてんかん表現型を救出することを示す。図１８は、実施例１０でさらに説明される。 マウスてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が慢性難治性てんかんの重篤モデルにおけるてんかん表現型を救出することを示す。図１９は、実施例１０でさらに説明される。 マウスてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が慢性難治性てんかんの重篤モデルにおけるてんかん表現型を救出することを示す。図２０は、実施例１０でさらに説明される。 マウスてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が、対照ウイルスが注射されたてんかん動物の死を引き起こすさらに重篤な発作に対しててんかん動物を保護することを示す。図２１は、実施例１０でさらに説明される。 マウスてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験の結果を示す。これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が自己制御的（閉ループ）であることを示す。活動依存性遺伝子療法で処置された動物は、てんかん発作を示さず、検出可能な蛍光を示さず、これは、動物が治癒されたことから、活動依存性手法（及び発現）がスイッチオフされることを意味する。図２２は、実施例１０でさらに説明される。 行動に対する活動依存性遺伝子療法の効果を試験するために使用される試験を要約する。データは、活動依存性遺伝子療法が自発運動、不安及び記憶に対する効果を有しないことを示す。オープンフィールド、オブジェクト局在化試験及びＴ迷路は、健常動物における活動依存性遺伝子療法の効果についてスクリーニングするために使用された。図２３は、実施例１１でさらに説明される。 ラットてんかんモデルにおいて実施された活動依存性遺伝子療法の前臨床試験のさらなる結果を示す。Ｂにおける水平スケールバーは、５００μｍに対応する。図２１は、実施例７でさらに説明される。 ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｅＧＦＰ－Ｋｃｎａ１（２ＡＡＶ）が、４８時間にわたるスパイク／秒による測定として、ＰＴＸ（けいれん誘発薬）に曝露された皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｅＧＦＰ（２ＡＶＶ）と比較して低下させたことを示す。ドキシサイクリンは、ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４を駆動する誘導性プロモーターを活性化するために使用されている。全てのツールは、誘導性プロモーターのトランス活性化因子を駆動するｃ－Ｆｏｓプロモーターによって制御される。図２５は、実施例５でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ｃ－ＦｏｓＰ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＪ２のマップを示す。図２６は、実施例４、８及び９でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ｍｉｎｉＡＲＣ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。図２７は、実施例４及び８でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ｍｉｎｉＡＲＣ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＪ２のマップを示す。図２８は、実施例４及び８でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ＥＳＡＲＥ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。図２９は、実施例４及び８でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ＥＳＡＲＥ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＪ２のマップを示す。図３０は、実施例８でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ＮＲＡＭ－ｈｃｆｏｓ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。図３１は、実施例８でさらに説明される。 ベクターｐＸ５５２－ＮＲＡＭ－ｈｃｆｏｓ－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＪ２のマップを示す。 ベクターｐＸ５５２－Ｅｇｒ１－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＡ１ｃｏ．Ｉ４００Ｖのマップを示す。 ベクターｐＸ５５２－Ｅｇｒ１－ｄｓｃＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ＫＣＮＪ２のマップを示す。 ＣＲＩＳＰＲａベクターｐＡＡＶ－ＴｅｔＯ－ｄＣＡＳ９ＶＰ６４及びｐＡＡＶ－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ＿Ｋｃｎａ１－ｃＦｏｓ－ｒｔＴＡ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰのマップを示す。図３５は、実施例５でさらに説明される。

実施例
実施例１ － 活動依存性療法及びｃ－Ｆｏｓ－ＫＣＮＡ１作用の仮定された分子機構の例示
本発明の一態様は、活動依存性プロモーターを使用しててんかんを処置し、てんかん発作を駆動するか、又はてんかん発作の伝播に寄与し（図１Ａ中のより暗いシェーディング）、次いで神経特性に影響する遺伝子の発現を、てんかん発作を駆動することのないニューロン（図１Ａ中のより明るいシェーディング）と比較して改変するニューロンを選択的に標的にする方法である。

一部の現行の実験的遺伝子療法は、例えば、細胞特異的プロモーターの制御下でＫｖ１．１イオンチャネルを使用し、てんかん発作に関与するニューロンと健常ニューロンとの間を識別することができない、神経興奮性の永久的修飾に依存する（図１Ｂ）。

ニューロンの興奮は、ｃ－Ｆｏｓ及びＡｒｃなどの最初期遺伝子（ＩＥＧ）と称される遺伝子セットの迅速な誘導を誘発する。ｃ－Ｆｏｓは、ｃ－Ｆｏｓが一過性発現を有する場合、マウスモデル及びヒトてんかん脳において、てんかん発作が認められた後、特定のニューロンにおけるｃ－Ｆｏｓの発現増加に応じて、てんかん発作に関与するか又は関与しないニューロン間を識別し得る。

アデノ随伴ウイルスベクター内でのｃ－Ｆｏｓプロモーターの使用は、カリウムチャネルＫｖ１．１をコードするエフェクター遺伝子（ＫＣＮ１Ａ）の発現の上方制御を可能にし、次いでニューロン発火を低減する。ＫＣＮＡ１の発現増加は、てんかん焦点における正常なニューロン挙動を回復させると予測される。回路活動が準正常レベルまで戻った後、プロモーター活性は、低下し、カリウムチャネルの発現は、ベースラインまで戻る（図１Ｄ）。

ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、てんかん発作によって活性化され、次いで直後にスイッチオンの状態で６～１２時間留まることになる。この時間の遅れにおいて、治療遺伝子が発現され、タンパク質が転写されることになる。タンパク質は、より長い時間、安定性を維持する（ＫＣＮＡ１は、９６時間超にわたり膜内で安定であると思われる）。

この場合、患者は、てんかん発作から数日間「保護され」、多くの患者が集団でてんかん発作を経験するにつれて、治療は、集団内で経験されるてんかん発作の数を減少させる必要がある。さらに、集団化されたてんかん発作の救済は、さらなるてんかん発作を全く起こし得ないような生理学的状態の回復を引き起こし得る。

他のてんかん発作が後続する場合、系は、再びスイッチオンされる。

図１Ｅは、本発明における使用に適した活動依存性遺伝子の概要を示す。図１Ｆは、齧歯類及びヒトにおける活動亢進によって誘導されるｃ－ｆｏｓ活性化の例を示す。図１Ｇは、本発明における使用に適した活動依存性プロモーター及びトランスジーンの異なる組合せを示す。他のカリウムチャネルなどの他のトランスジーン（右）も本発明での使用に適し得る。トランスジーンは、異なる特性及び神経興奮性に対する機能的効果を有する。プロモーターは、活性化、細胞特異性及び非活性化のタイミングの観点から異なる特性を有する。

実施例２ － てんかん発作様活動は、ＩＥＧ発現を増加させる
材料及び方法
一次成熟皮質ニューロンをけいれん誘発剤で刺激し、固定後、ｃ－ｆｏｓ発現を異なる時点（２、６、２４及び４８）で免疫蛍光によって評価した。

結果及び考察
図２は、てんかん発作様活動（４－アミノピリジン（「４ＡＰ」）＋ピクロトキシン（「ＰＴＸ」）によって誘導される）が、内因性ｃ－Ｆｏｓ発現における、迅速であるが、一過性の増加を引き起こすことを示す。

実施例３ － ｃ－Ｆｏｓプロモーターは、ＧＦＰ発現を駆動し得、Ａｒｃプロモーターは、ＧＦＰ発現を駆動し得る
材料及び方法
トランスジーンの発現を増強するため、ｃ－Ｆｏｓの最小プロモーターとともに５’ＵＴＲの一部及びキメライントロンを使用した。次に、プロモーターを、コドン最適化したｄｓＧＦＰ及びＫＣＮＡ１を有するＡＡＶ骨格に挿入した。

また、Ａｒｃの最小プロモーターを用いて、トランスジーンの発現を増強した。プロモーターを、ＫＣＮＪ２を有するＡＡＶ骨格に挿入した。

結果及び考察
図３は、てんかん発作様活動が４ＡＰ及びＰＴＸによって神経細胞内で誘導されるとき、ｃ－ＦｏｓプロモーターがＧＦＰ発現を駆動し得ることを示す。

また、図３Ｄは、てんかん発作様活動が４ＡＰ及びＰＴＸによって神経細胞内で誘導されるとき、ＡｒｃがＧＦＰ発現を駆動し得ることを示す。

実施例４ － 興奮性の活動依存性減衰
材料及び方法
一次皮質ニューロンを２１ＤＩＶにわたって多電極アレイ（ＭＥＡ）上で成長させ、７ＤＩＶでＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１のいずれかをそれに形質導入した。回路網活動を２１ＤＩＶで評価した。反復は、ｎ＝６（Ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ）及びｎ＝７（Ｃ－Ｆｏｓ－ＫＣＮＡ１）であった。

また、一次皮質ニューロンを２１ＤＩＶ（インビトロ日数）にわたって多電極アレイ（ＭＥＡ）上で成長させ、７ＤＩＶでＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１又はｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２又はｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１又はｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２又はＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１のいずれかをそれに形質導入した。回路網活動を２１ＤＩＶで評価した。反復は、ｎ＝６（Ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ）、ｎ＝７（Ｃ－Ｆｏｓ－ＫＣＮＡ１）、ｎ＝１６（ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２）、ｎ＝６（ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１）、ｎ＝５（ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２）及びｎ＝５（ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１）であった。

結果及び考察
図４は、ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、スパイク／秒（図４Ａ）、バースト／分（図４Ｂ）、バースト持続時間（ミリ秒）（図４Ｃ）及びスパイク／バーストの平均数（図４Ｃ）による測定として、皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。ＭＥＡ実験からの記録例を上部パネルに示す。

また、図５Ｅは、ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１、ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２、ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１、ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２又はＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、スパイク／秒による測定として、皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。

実施例５で考察される通り、図５は、ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、スパイク／秒、バースト／分、バースト持続時間（ミリ秒）及びスパイク／バーストの平均数による測定として、皮質ニューロンにおける神経回路網の興奮性をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して低下させたことを示す。

実施例５ － 興奮性の活動依存性減衰における時間経過
材料及び方法
一次皮質ニューロンを２１ＤＩＶにわたって多電極アレイ（ＭＥＡ）上で成長させ、７ＤＩＶでＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１のいずれかをそれに形質導入した。回路網活動を２１ＤＩＶ及び３０μＭのピクロトキシンの添加（ベースライン／０時間）後の異なる時点（２、６、２４、４８時間）で評価した。反復は、ｎ＝６（ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ）及びｎ＝７（ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＫＣＮＡ１）であった。

また、一次皮質ニューロンを２１ＤＩＶにわたって多電極アレイ（ＭＥＡ）上で成長させ、７ＤＩＶでｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰ又はｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（２ＡＡＶ）のいずれかをそれに形質導入した。回路網活動を２１ＤＩＶ及び３０μＭのピクロトキシンの添加（ベースライン／０時間）後の異なる時点（２、６、２４、４８時間）で評価した。反復は、ｎ＝１６（ｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰ）及びｎ＝１０（ｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰ－ＫＣＮＡ１）であった。

結果及び考察
図５は、ＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、バースト持続時間（ミリ秒）によって明示される通り、ＰＴＸによって誘導される神経回路網の興奮性増加をＡＡＶ ｃ－Ｆｏｓ－ＧＦＰと比べて遅くすることを示す。

また、図２５は、ｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が、バースト持続時間（ミリ秒）又はスパイク／秒によって明示される通り、ＰＴＸによって誘導される神経回路網の興奮性増加をｃ－Ｆｏｓ－ｄＣＡＳ９－ＶＰ６４－ＧＦＰと比べて遅くすることを示す。２つのＡＡＶで送達される遺伝子療法は、ドキシサイクリンがＴｅＴ－Ｏｎシステムを用いてそれをスイッチオンすることを可能にする。

実施例６ － 活動依存性遺伝子療法は、従来の過剰発現よりも少ないニューロンに影響する
材料及び方法
ＡＡＶ Ｃａｍｋ２ａ－ＧＦＰ又はＡＡＶ ｃｆｏｓ－ＧＦＰのいずれかのウイルス注射後、視覚皮質における急性のピロカルピン注射を実施した。急性のピロカルピン注射は、焦点性てんかん発作を引き起こす。ウイルスの伝播及びＧＦＰ陽性のニューロンの数を評価した。

結果及び考察
図６は、インビボでの活動依存性遺伝子発現が、構成的遺伝子発現と比較して、てんかん発作焦点に特異的であることを示す。従来の遺伝子療法（図６Ａ）と対照的に、てんかん発作後、活動依存性遺伝子発現を用いて、少数のニューロンのみが標的にされ、ＧＦＰレポーターのみが点灯する（図６Ｂ）。

使用されるウイルス血清型が同じである（ＡＡＶ９）ことから、形質導入の広がりは、同等であり、これは、処置が、てんかん発作に関与しないバイスタンダーニューロンに影響しないことの直接的証拠を提供する。従って、治療効果は、過剰活性化されるニューロンに特異的に標的化される。

実験手順の概略図を図６Ｃに示す。

実施例７ － 前臨床てんかんモデル
材料及び方法
側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の慢性ラットモデルを、カイニン酸（ＫＡ）の腹腔内（ＩＰ）注射を用いて作出した。１２週後、ＥＥＧトランスミッター及びカニューレを移植し、ラットを５週間、継続的に記録した（ベースライン）。次に、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（図８に示す通り）を、カニューレを介して注射し、動物をさらに８週間記録した。

結果及び考察
図７は、図８の構築物を使用する、ラットてんかんモデルにおけるインビボでの活動依存性遺伝子療法を示す。ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が注射されたラットにおいて、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して、てんかん発作の数の減少が認められた（図７Ａ）。いくつかの場合、図８の構築物は、図９及び配列番号１０に示す通り、レポータータンパク質をコードする配列を欠くことになる。これは、例えば、調節上の理由で好ましいことがある。

図２４は、図８の構築物を使用する、ラットてんかんモデルにおけるインビボでの活動依存性遺伝子療法も示すためのさらなるデータを提供する。ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１が注射されたラットにおいて、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して、てんかん発作の数の減少が認められた（図２４Ｃ、Ｄ）。いくつかの場合、図８の構築物は、図９及び配列番号１０に示す通り、レポータータンパク質をコードする配列を欠くことになる。これは、例えば、調節上の理由で好ましいことがある。

実施例８ － 活動依存性遺伝子療法は、単一のてんかん発作によって活性化され、活動亢進ニューロンにおける神経興奮性を選択的に減衰させる
材料及び方法
ＡＡＶ ｃｆｏｓ－ＧＦＰ、若しくはｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２、若しくはｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１、ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２若しくはＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１又はＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１若しくはＮＲＡＭ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１のいずれかのウイルス注射後、急性の腹腔内ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）注射を実施した。急性のＰＴＺ注射は、単一の強直間代性の全般性てんかん発作を引き起こす。＞２時間後の（てんかん発作によって活性化される）蛍光細胞に対する効果を単細胞パッチクランプにより評価した。実験装置を図１０に示す。

結果及び考察
図１１～１５は、インビボでの活動依存性遺伝子発現がてんかん発作に特異的であり、異なるプロモーター及びトランスジーンによって神経興奮性を減衰可能であることを示す。プロモーターの強度は、異なった（図１２、１４及び１５）。発現が海馬ＣＡ３歯状回（顆粒細胞及び苔状細胞）、海馬台及び深部の海馬ＣＡ１ニューロンにおいて認められた。ＥＳＡＲＥは、特にＣＡ１において最強であると思われる。ニューロンに対するＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２いずれかの効果も異なったが（図１３）、プロモーター及びトランスジーンの全ての並べ替えが神経興奮性における著しい減少を引き起こす。ＫＣＮＡ１は、発火頻度を減少させる一方、ＫＣＮＪ２は、膜静止電位を過分極化し、ニューロンの興奮性を低下させる（図１１～１３）。

蛍光がニューロンの小さいサブセットに対して選択的であることから、これは、処置が、てんかん発作に関与しないバイスタンダーニューロンに影響しないことの直接的証拠を提供する。従って、治療効果は、過剰活性化されるニューロンに特異的に標的化される。ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２いずれかの一過性発現は、神経興奮性を低下させるのに十分である。これは、処置が、てんかん発作に関与する過興奮性ニューロンの活動を選択的に低下させることの直接的証拠を提供する。

実施例９ － 活動依存性遺伝子療法は、単一のてんかん発作によって活性化され、抗てんかん性である
材料及び方法
ＡＡＶ ｃｆｏｓ－ＧＦＰ又はｃ－Ｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２いずれかのウイルス注射後、２回の連続する急性の腹腔内ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）注射を実施した。各ＰＴＺ注射は、通常、単一の強直間代性の全般性てんかん発作を引き起こし、活動依存性療法の保護効果が２回目の注射で評価されることを可能にする。実験装置を図１６に示す。

結果及び考察
図１７は、化学けいれん薬注射に対する保護効果を示す。活動依存性遺伝子療法は、最初のてんかん発作によって活性化され、２回目の化学けいれん薬注射がてんかん発作を誘発することを予防する。この結果は、処置が反復性てんかん発作から保護することの直接的証拠を提供する。

実施例１０ － 活動依存性遺伝子療法は、前臨床てんかんモデルにおいててんかん発作を抑制する
材料及び方法
側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の慢性マウスモデルを、カイニン酸（ＫＡ）の扁桃体内注射を用いて作出した。２週後、ＥＥＧトランスミッター及びカニューレを移植し、マウスを２週間、継続的に記録した（ベースライン）。次に、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１（図１８～２０に示す通り）を、カニューレを介して注射し、ウイルス発現のために２週待機後、動物をさらに２週間記録した。記録後、一部の動物を用いて、蛍光発現を分析するか（図２２）又は急性のＰＴＺ注射を受けた（図２１）。

結果及び考察
図１８～２０は、マウスてんかんモデルにおけるインビボでの活動依存性遺伝子療法を示す。ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１を注射したマウスにおいて、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰと比較して、てんかん発作の数の著しい減少が認められた（図１９及び２０）。ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１を注射し、さらなるＰＴＺ注射を受けた動物は、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰを注射した動物と比較してより高い生存を示した（図２１）。さらに、てんかん発作が抑制された、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１で処置した動物は、蛍光を示さず、処置の成功後、その治療法がスイッチオフされることを示した（図２２）。Ｎ＝６（ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ）及びｎ＝５（ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１）。

これらのデータは、活動依存性遺伝子療法の自己調節された抗てんかん効果を確認する。

いくつかの場合、図８の構築物は、図９及び配列番号１０に示す通り、レポータータンパク質をコードする配列を欠くことになる。これは、例えば、調節上の理由で好ましいことがある。

実施例１１ － 活動依存性遺伝子療法は、生理学的行動（自発運動、不安及び記憶）に対する効果を有しない
材料及び方法
マウスを、異なる行動について、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ又はＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１いずれかの注射前及び後、オープンフィールドのオブジェクト位置試験及びＴ迷路自発的交替を用いて試験した。

結果及び考察
図２３は、ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１による処置が、自発運動を含む生理学的行動に対して有害な効果を有しなかったことを実証するために用いた試験並びに不安及び記憶の試験を要約する。Ｎ＝５（ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ）及びｎ＝３（ＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１）。

これらのデータは、活動依存性遺伝子療法が十分な耐性を示すことを確認する。

本発明のさらなる実施形態
以下の実施形態Ｅ１～Ｅ３３も本発明の一部を形成する：
Ｅ１．対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置の方法における使用のための発現ベクターであって、
（ｉ）対象の神経細胞内で発現されるとき、前記障害を寛解するポリペプチド（「遺伝子産物」）をコードするポリヌクレオチド配列（「遺伝子」）であって、
（ｉｉ）対象の神経細胞内での遺伝子産物の発現を駆動するのに適した神経活動依存性プロモーター
に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列（「遺伝子」）
を含む発現ベクター。
Ｅ２．遺伝子産物の発現のレベルは、ニューロンの興奮性が高くなると増加し、及びニューロンの興奮性が低くなると減少する、Ｅ１の使用のための発現ベクター。
Ｅ３．プロモーターは、錐体神経活動依存性プロモーターである、実施形態Ｅ１～Ｅ２のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ４．プロモーターは、最初期遺伝子（ＩＥＧ）プロモーターである、実施形態Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ５．プロモーターは、ｃ－Ｆｏｓ、Ａｒｃ又はＥｇｒ１である、実施形態Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ６．プロモーターは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ７．遺伝子は、イオンチャネル遺伝子であり、及び遺伝子産物は、イオンチャネルである、実施形態Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ８．遺伝子は、カリウムイオンチャネル遺伝子であり、及び遺伝子産物は、カリウムイオンチャネルである、実施形態Ｅ１～Ｅ７のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ９．遺伝子は、ＫＣＮＡ１遺伝子であり、及び遺伝子産物は、Ｋｖ１．１カリウムチャネルである、実施形態Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１０．遺伝子は、改変されたＫＣＮＡ１遺伝子であり、及び遺伝子産物は、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルである、実施形態Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１１．改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、
編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置でバリンアミノ酸残基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１２．処置の方法は、閉ループ療法である、実施形態Ｅ１～Ｅ１１のいずれかの使用のための発現ベクター。
Ｅ１３．神経学的障害は、発作性障害である、実施形態Ｅ１～Ｅ１２のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１４．発作性障害は、てんかん、任意選択的に新皮質てんかん、側頭葉てんかん又は難治性てんかんである、Ｅ１３に記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１５．神経学的障害は、パーキンソン病、慢性疼痛、てんかんにおける予期しない突然死（ＳＵＤＥＰ）、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、発作性運動障害、単極性若しくは双極性感情障害、不安又は恐怖症である、Ｅ１～１２のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１６．ウイルスベクターである、実施形態Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１７．ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターであり、任意選択的に、レンチウイルスベクターは、非組み込みレンチウイルスベクターである、Ｅ１６に記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１８．配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｅ１６に記載の使用のための発現ベクター。
Ｅ１９．発現ベクターであって、
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する改変されたＫＣＮＡ１遺伝子；及び
（ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する活動依存性プロモーター
を含み、遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結される、発現ベクター。
Ｅ２０ ウイルス粒子を作製するインビトロ方法であって、
哺乳動物細胞に、Ｅ１～１９のいずれか１つに記載のベクターを形質導入し、及び細胞内での粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質を発現させることと；
形質導入細胞を培地で培養することであって、それにより、細胞は、培地中に放出されるウイルス粒子を生成する、培養することと
を含むインビトロ方法。
Ｅ２１．哺乳動物細胞に、粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープ発現ベクターを形質導入することを含む、Ｅ２０のインビトロ方法。
Ｅ２２．１つ又は複数のパッケージングタンパク質は、非機能的なインテグラーゼ酵素を含み、それにより、ベクターは、そのウイルスゲノムを細胞のゲノムに組み込むことができない、Ｅ２０又はＥ２１のインビトロ方法。
Ｅ２３．ウイルス粒子を培地から分離することと、任意選択的に、ウイルス粒子を濃縮することとをさらに含む、Ｅ２０～２２のいずれか１つのインビトロ方法。
Ｅ２４．Ｅ２０～２３のいずれか１つの方法によって生成されるウイルス粒子であって、任意選択的に、Ｅ１～１９のいずれかの発現ベクターから転写されるＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むウイルス粒子。
Ｅ２５．Ｅ１～１９のいずれか１つに記載のような遺伝子をコードする一本鎖ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むウイルス粒子であって、
遺伝子は、Ｅ１～１９のいずれか１つで定義されるような遺伝子産物をコードし、
プロモーターは、任意選択的に、Ｅ１～１９のいずれか１つで定義されるものであり、
ウイルス粒子は、任意選択的に、ＡＡＶである、ウイルス粒子。
Ｅ２６．Ｅ１～１９のいずれか１つの発現ベクターと、細胞内で発現されるとき、粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープ発現ベクターとを含むキット。
Ｅ２７．ウイルスパッケージング発現ベクターは、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである、Ｅ２６のキット。
Ｅ２８．、処置の方法における使用のためのものであり、処置の方法は、Ｅ１２～１５のいずれか１つで定義される、Ｅ２４又はＥ２５のウイルス粒子。
Ｅ２９．Ｅ１及び１２～１５のいずれか１つで定義されるような神経学的障害の処置の方法であって、神経学的障害を有する個体に、Ｅ１～１９のいずれか１つで定義されるような発現ベクター又はＥ２４若しくはＥ２５のウイルス粒子を投与することを含む方法。
Ｅ３０．Ｅ１～１９のいずれか１つで定義されるような遺伝子産物の存在を確認する方法であって、
遺伝子産物の発現を可能にする条件下において、細胞に、Ｅ１～１９のいずれか１つの発現ベクターを形質導入するか、又はＥ２４若しくはＥ２５のウイルス粒子を細胞に投与することと；
細胞内の遺伝子産物の存在を、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出することと
を含む方法。
Ｅ３１．Ｅ２４又はＥ２５のウイルス粒子を投与された対象から得られている、Ｅ１～１９のいずれか１つで定義されるような遺伝子産物の存在を確認するインビトロ又はエクスビボ方法であって、
細胞内の遺伝子産物の存在を、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出すること
を含むインビトロ又はエクスビボ方法。
Ｅ３２．ハイブリダイゼーションアッセイは、標識ＲＮＡプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションアッセイであり、任意選択的に、標識ＲＮＡプローブは、蛍光標識される、Ｅ２９又はＥ３０の方法。
Ｅ３３．Ｅ１～１９のいずれか１つの発現ベクターを含む細胞。

添付配列
例示的な改変されたヒトＫＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）

（式中、ｎは、Ｔ又はＣである）
４００位（下線）にバリンを含む編集されたヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号２）

ｃｆｏｓプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号３）

ヌクレオチド位置１９９８（下線）にアデニンを含む、野生型ＫＣＮＡ１コード配列のヌクレオチド配列（配列番号４）

４００位（下線）にイソロイシンを含む、野生型ヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号５）

ｃｆｏｓ－ＧＦＰ構築物のヌクレオチド配列（配列番号６）

ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号７）

最適化されたＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号８）

ｃｆｏｓ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号９）

最適化されたＡＡＶ－ｃｆｏｓ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号１０）

Ｙ３７９Ｖ置換を有する編集されたＫｖ１．１をコードする改変されたヒトＫＣＮＡ１遺伝子（配列番号１１）

４００位（下線）にバリン及び置換位置３７９（太字）にバリンを含む編集されたヒトＫｖ１．１のアミノ酸配列（配列番号１２）

例示的なＫＣＮＪ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）

Ｋｉｒ２．１のアミノ酸配列（配列番号１４）

ｍＡｒｃプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１５）

ＥＳＡＲＥプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１６）

ＮＲＡＭ－ヒトｃＦｏｓプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１７）

Ｅｇｒ１プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１８）

ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号１９）

最適化されたＡＡＶ－ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２０）

ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２構築物のヌクレオチド配列（配列番号２１）

最適化されたＡＡＶ－ｍＡｒｃ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２２）

ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号２３）

最適化されたＡＡＶ－ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２４）

ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２構築物のヌクレオチド配列（配列番号２５）

最適化されたＡＡＶ－ＥＳＡＲＥ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２６）

ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号２７）

最適化されたＡＡＶ－ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２８）

ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２構築物のヌクレオチド配列（配列番号２９）

最適化されたＡＡＶ－ＮＲＡＭ－ｈＣｆｏｓ－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３０）

Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１構築物のヌクレオチド配列（配列番号３１）

最適化されたＡＡＶ－Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＡ１ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２）

Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２構築物のヌクレオチド配列（配列番号３３）

最適化されたＡＡＶ－Ｅｇｒ１－ｄｓＧＦＰ－ＫＣＮＪ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４）

Ｔｅｔ－Ｏｎ－ｄＣＡＳ９ＶＰ６４構築物のヌクレオチド配列（配列番号３５）

最適化されたＡＡＶ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ｄＣＡＳ９ＶＰ６４ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３６）

ｓｇＲＮＡ＿ＫＣＮＡ１のヌクレオチド配列（配列番号３７）
ＡＧＴＣＡＡＴＧＡＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣ
ｓｇＲＮＡ＿ＬａｃＺ（対照）のヌクレオチド配列（配列番号３８）
ＴＧＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＣＡＣＧＣＧＡＴ
最適化されたＡＡＶ－ｓｇＲＮＡ＿ＫＣＮＡ１－ｃＦｏｓ－ｒＴＴＡ－ＥＧＦＰベクターのヌクレオチド配列（配列番号３９）

最適化されたＡＡＶ－ｓｇＲＮＡ＿ＬａｃＺ－ｃＦｏｓ－ｒＴＴＡ－ＥＧＦＰベクターのヌクレオチド配列（配列番号４０）

Claims (68)

1. 対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置の方法における使用のための発現ベクターであって、
   （ａ）（ｉ）前記対象の神経細胞内で発現されるとき、前記障害を寛解するポリペプチド（「遺伝子産物」）をコードするポリヌクレオチド配列（「遺伝子」）であって、
   （ｉｉ）前記対象の神経細胞内での前記遺伝子産物の発現を駆動するのに適した神経活動依存性プロモーター
   に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列（「遺伝子」）；又は
   （ｂ）（ｉ）前記対象の神経細胞内で発現されるとき、前記障害を寛解するさらなるポリペプチド（「さらなる遺伝子産物」）をコードするさらなるポリヌクレオチド配列（「さらなる遺伝子」）の発現を改変する中間ポリペプチド（「中間遺伝子産物」）をコードする中間ポリヌクレオチド配列（「中間遺伝子」）であって、
   （ｉｉ）前記対象の神経細胞内での前記中間遺伝子産物の発現を駆動するのに適した神経活動依存性プロモーター
   に作動可能に連結される中間ポリヌクレオチド配列（「中間遺伝子」）
   を含む発現ベクター。
2. 前記遺伝子産物、又は中間遺伝子産物、又はさらなる遺伝子産物の発現のレベルは、ニューロンの興奮性が高くなると増加し、及びニューロンの興奮性が低くなると減少する、請求項１に記載の使用のための発現ベクター。
3. 前記プロモーターは、錐体神経活動依存性プロモーターである、請求項１又は２に記載の使用のための発現ベクター。
4. 前記プロモーターは、最初期遺伝子（ＩＥＧ）プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
5. 前記プロモーターは、ｃ－Ｆｏｓである、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
6. 前記プロモーターは、配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
7. 前記プロモーターは、Ａｒｃであるか、又は前記プロモーターは、前記Ａｒｃヌクレオチド配列の一部を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
8. 前記プロモーターは、ｍＡｒｃ（「最小Ａｒｃ」）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
9. 前記プロモーターは、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列又は配列番号１５で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、請求項７又は８に記載の使用のための発現ベクター。
10. 前記プロモーターは、ＥＳＡＲＥ（「増強されたシナプス活動応答性エレメント」）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
11. 前記プロモーターは、配列番号１６で示されるヌクレオチド配列又は配列番号１６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、請求項９に記載の使用のための発現ベクター。
12. 前記プロモーターは、ＮＲＡＭ（「Ｎｐａｓ４に特異的なロバスト活性マーカー」）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
13. 前記プロモーターは、配列番号１７で示されるヌクレオチド配列又は配列番号１７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の使用のための発現ベクター。
14. 前記プロモーターは、Ｅｇｒ１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
15. 前記プロモーターは、配列番号１８で示されるヌクレオチド配列又は配列番号１８で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する、請求項１３に記載の使用のための発現ベクター。
16. 前記遺伝子又はさらなる遺伝子は、イオンチャネル遺伝子であり、及び前記遺伝子産物又はさらなる遺伝子産物は、イオンチャネルである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
17. 前記遺伝子又はさらなる遺伝子は、カリウムイオンチャネル遺伝子であり、及び前記遺伝子産物又はさらなる遺伝子産物は、カリウムイオンチャネルである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
18. 前記遺伝子又はさらなる遺伝子は、ＫＣＮＡ１遺伝子であり、及び前記遺伝子産物又はさらなる遺伝子産物は、Ｋｖ１．１カリウムチャネルである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
19. 前記遺伝子又はさらなる遺伝子は、改変されたＫＣＮＡ１遺伝子であり、及び前記遺伝子産物又はさらなる遺伝子産物は、編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
20. 前記改変されたＫＣＮＡ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、
    前記編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む、請求項１９に記載の使用のための発現ベクター。
21. 前記遺伝子又はさらなる遺伝子は、ＫＮＣＪ２遺伝子であり、及び前記遺伝子産物又はさらなる遺伝子産物は、Ｋｉｒ２．１カリウムチャネルである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
22. 前記ＫＮＣＪ２遺伝子は、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、
    前記Ｋｉｒ２．１カリウムチャネルは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の使用のための発現ベクター。
23. 前記さらなる遺伝子は、内因性遺伝子であり、及び前記さらなる遺伝子産物は、内因性遺伝子産物である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
24. 前記内因性遺伝子は、ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２である、請求項２３に記載の使用のための発現ベクター。
25. 前記中間遺伝子は、ｄｃａｓ９、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９などのエンドヌクレアーゼ欠損ｃａｓ（「ｄｃａｓ」）である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
26. （ａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩであって、任意選択的にＵ６であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ；及び
    （ｂ）前記さらなる遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）
    をさらに含む、請求項２５に記載の使用のための発現ベクター。
27. 前記中間遺伝子産物は、前記さらなる遺伝子の発現を、中間発現系、任意選択的に中間誘導性発現系を介して増加させる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター。
28. 前記中間誘導性発現系は、Ｔｅｔ－Ｏｎ発現システムである、請求項２７に記載の使用のための発現ベクター。
29. 対象におけるニューロン興奮性亢進に関連する神経学的障害の処置の方法における使用のための発現ベクター系であって、
    （ａ）前記対象の神経細胞内でのリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（「ｒｔＴＡ」）の発現を駆動するのに適した神経活動依存性プロモーターを含む第１のヌクレオチド配列；及び
    （ｂ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の中間遺伝子又はさらなる遺伝子の発現を駆動するのに適したＴｅｔ－Ｏｎプロモーターを含む第２のヌクレオチド配列
    を含み、前記第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド又は発現系のいずれかは、任意選択的に、
    （ｃ）ＲＮＡポリメラーゼであって、任意選択的にＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩであり、さらに任意選択的に、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、Ｕ６である、ＲＮＡポリメラーゼ；及び
    （ｄ）前記さらなる遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）、及び／又は
    （ｅ）テトラサイクリン、好ましくはドキシサイクリン
    をさらに含む、発現ベクター系。
30. （ａ）配列番号３７若しくは３９で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３７若しくは３９で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のヌクレオチド配列；及び
    （ｂ）配列番号３５若しくは３６で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３５若しくは３６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のヌクレオチド配列
    を含む、請求項２９に記載の使用のための発現ベクター系。
31. ５％超、又は１０％超、又は２０％超、又は３０％超、又は４０％超、又は５０％超、又は６０％超、又は７０％超、又は８０％超、又は９０％超、又は９１％超、又は９２％超、又は９３％超、又は９４％超、又は９５％超、又は９６％超、又は９７％超、又は９８％超、又は９９％超、又は１００％の、前記対象のニューロンのスパイク頻度の減少を引き起こし得る、請求項１～３０のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
32. ７５％超の、前記対象のニューロンのスパイク頻度の減少を引き起こし得る、請求項３１に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
33. 前記ニューロンのスパイク頻度の前記減少は、２１ＤＩＶ（インビトロ日数）以降、多電極アレイを使用して測定される、請求項３２又は３１に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
34. 前記ニューロンのスパイク頻度の前記減少は、配列番号６を含むベクターに対して測定される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
35. 前記ニューロンは、一次皮質ニューロンである、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
36. ニューロンにおいて、１秒あたり１０未満の活動電位、又は１秒あたり５つ未満の活動電位、又は１秒あたり４つ未満の活動電位、又は１秒あたり３つ未満の活動電位、又は１秒あたり２つ未満の活動電位、又は１秒あたりのゼロの活動電位を引き起こし得る、請求項１～３５のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
37. －５０ｍＶ未満、又は－６０ｍＶ未満、又は－７０ｍＶ未満、又は－８０ｍＶ未満、又は－９０ｍＶ未満、又は－１００ｍＶ未満の、ニューロンにおける静止膜電位を引き起こし得る、請求項１～３６のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
38. ニューロンにおける活動電位の閾値を５０ｐＡ超、又は７５ｐＡ超、又は１００ｐＡ超、又は１５０ｐＡ超、又は２００ｐＡ超、又は２５０ｐＡ超、又は３００ｐＡ超、又は３５０ｐＡ超、又は４００ｐＡ超、又は４５０ｐＡ超、又は５００ｐＡ超、又は５５０ｐＡ超、又は６００ｐＡ超、又は７００ｐＡ超、又は８００ｐＡ超、又は９００ｐＡ超、又は１０００ｐＡ超まで増加させることができ、前記閾値は、電流閾値及び保持電流の合計である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
39. 活動電位の数、静止膜電位又は活動電位の閾値は、対象からの急性海馬切片において測定される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
40. 活動電位の数、静止膜電位又は活動電位の閾値は、急性海馬切片の電気生理学実験及び／又はパッチクランプ電気生理学実験を使用して測定される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
41. 前記ニューロンが持続的発火をもたらす場合及び／又は前記ニューロンが過剰な脱分極になる場合、前記ニューロンは、てんかん発作を駆動することが可能である、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
42. 対象における２回目のてんかん発作を駆動するニューロンにおいて、前記対象における前記１回目のてんかん発作を駆動する前記ニューロンにおける抗てんかん効果よりも大きい前記抗てんかん効果を引き起こし得、前記２回目のてんかん発作は、前記１回目のてんかん発作に後続する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
43. 抗てんかん効果は、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の方法のいずれかを使用して測定される、請求項４２に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
44. 対象における２回目のてんかん発作を予防し得、前記２回目のてんかん発作は、前記対象における１回目のてんかん発作に後続する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
45. 前記処置の方法は、閉ループ療法である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
46. 前記神経学的障害は、発作性障害である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
47. 前記発作性障害は、てんかん、任意選択的に新皮質てんかん、側頭葉てんかん又は難治性てんかんである、請求項４６に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
48. 前記神経学的障害は、パーキンソン病、慢性疼痛、てんかんにおける予期しない突然死（ＳＵＤＥＰ）、片頭痛、群発頭痛、三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、発作性運動障害、単極性若しくは双極性感情障害、不安又は恐怖症である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
49. ウイルスベクター又はベクター系である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
50. 前記ウイルスベクター又はベクター系は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター若しくはベクター系又はレンチウイルスベクター若しくはベクター系であり、任意選択的に、前記レンチウイルスベクター又はベクター系は、非組み込みレンチウイルスベクター又はベクター系である、請求項４９に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
51. 配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
52. 配列番号２０～３４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の使用のための発現ベクター又はベクター系。
53. 発現ベクターであって、
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する改変されたＫＣＮＡ１遺伝子；及び
    （ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は配列番号３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する活動依存性プロモーター
    を含み、前記遺伝子は、前記プロモーターに作動可能に連結される、発現ベクター。
54. 発現ベクター系であって、
    （ａ）（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、及び配列番号２で示されるアミノ酸残基４００に対応する位置にバリンアミノ酸残基を含む編集されたＫｖ１．１カリウムチャネルをコードする、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する改変されたＫＣＮＡ１遺伝子；又は
    （ｉｉ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＫｉｒ２．１カリウムチャネルをコードする、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するＫＣＮＪ２遺伝子；及び
    （ｂ）配列番号３及び１３～１８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列又は配列番号３及び１３～１８のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるヌクレオチド配列を有する活動依存性プロモーター
    を含み、
    （ｃ）前記ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２遺伝子は、前記プロモーターに作動可能に連結されるか；又は
    （ｄ）前記ＫＣＮＡ１又はＫＣＮＪ２遺伝子の発現は、請求項１～５２のいずれか一項に記載の中間遺伝子によって改変され得、前記中間遺伝子は、前記活動依存性プロモーターに作動可能に連結される、発現ベクター系。
55. ウイルス粒子を作製するインビトロ方法であって、
    哺乳動物細胞に、請求項１～５４のいずれか一項に記載のベクター又はベクター系を形質導入し、及び前記細胞内での粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質を発現させることと；
    前記形質導入細胞を培地で培養することであって、それにより、前記細胞は、前記培地中に放出されるウイルス粒子を生成する、培養することと
    を含むインビトロ方法。
56. 前記哺乳動物細胞に、粒子形成に必要な前記ウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープ発現ベクターを形質導入することを含む、請求項５５に記載のインビトロ方法。
57. 前記１つ又は複数のパッケージングタンパク質は、非機能的なインテグラーゼ酵素を含み、それにより、前記ベクター又はベクター系は、そのウイルスゲノムを前記細胞のゲノムに組み込むことができない、請求項５５又は５６に記載のインビトロ方法。
58. 前記ウイルス粒子を前記培地から分離することと、任意選択的に、前記ウイルス粒子を濃縮することとをさらに含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載のインビトロ方法。
59. 請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法によって生成されるウイルス粒子であって、任意選択的に、請求項１～５８のいずれか一項に記載の発現ベクター又はベクター系から転写されるＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むウイルス粒子。
60. 請求項１～５９のいずれか一項に記載の遺伝子、及び／又は中間遺伝子、及び／又はさらなる遺伝子をコードする一本鎖ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むウイルス粒子であって、
    前記遺伝子、及び／又は中間遺伝子、及び／又はさらなる遺伝子は、請求項１～５９のいずれか一項に記載の遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物をコードし、
    前記プロモーターは、任意選択的に、請求項１～５９のいずれか一項に記載のものであり、
    前記ウイルス粒子は、任意選択的に、ＡＡＶである、ウイルス粒子。
61. 請求項１～６０のいずれか一項に記載の発現ベクター又はベクター系と、細胞内で発現されるとき、粒子形成に必要なウイルスパッケージング及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又は複数のウイルスパッケージング及びエンベロープ発現ベクターとを含むキット。
62. 前記ウイルスパッケージング発現ベクターは、インテグラーゼ欠損ウイルスパッケージング発現ベクターである、請求項６１に記載のキット。
63. 処置の方法における使用のためのものであり、前記処置の方法は、請求項４５～４８のいずれか一項に記載される、請求項５９又は６０に記載のウイルス粒子。
64. 請求項１又は４５～４８のいずれか一項に記載の神経学的障害の処置の方法であって、前記神経学的障害を有する個体に、請求項１～６３のいずれか一項に記載の発現ベクター若しくはベクター系又は請求項５９若しくは６０に記載のウイルス粒子を投与することを含む方法。
65. 請求項１～６４のいずれか一項に記載の遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物の存在を確認する方法であって、
    前記遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物の発現を可能にする条件下において、細胞に、請求項１～６４のいずれか一項に記載の発現ベクターを形質導入するか、又は請求項５９若しくは６０に記載のウイルス粒子を細胞に投与することと；
    前記細胞内の前記遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物の存在を、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出することと
    を含む方法。
66. 請求項５９又は６０に記載のウイルス粒子を投与された対象から得られている、請求項１～６５のいずれか一項に記載の遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物の存在を確認するインビトロ又はエクスビボ方法であって、
    前記細胞内の前記遺伝子産物、及び／又は中間遺伝子産物、及び／又はさらなる遺伝子産物の存在を、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出すること
    を含むインビトロ又はエクスビボ方法。
67. 前記ハイブリダイゼーションアッセイは、標識ＲＮＡプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションアッセイであり、任意選択的に、前記標識ＲＮＡプローブは、蛍光標識される、請求項６５又は６６に記載の方法。
68. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の発現ベクター又はベクター系を含む細胞。

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