CN110769925A - 使用组合的核酸酶、连结酶、聚合酶以及测序反应测定核酸序列、表达、拷贝数或甲基化变化的装置、方法以及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从血液，即从无细胞循环DNA、外泌体、微RNA、lncRNA、循环肿瘤细胞或总血细胞对人基因组和转录组区域进行高度特异性靶向分子分析的方法、装置、仪器、工艺以及系统。所述技术使得能够使用空间多重和组合的核酸酶、连结、聚合酶以及测序反应对突变、表达、拷贝数、易位、可变剪接以及甲基化变化进行高灵敏度鉴定和计数。此技术可用于非侵入性早期癌症检测、非侵入性癌症预后以及监测癌症的治疗功效与疾病复发两者。
Description
本申请要求2017年3月29日提交的美国临时专利申请序列号62/478,412的优先权益，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及使用组合的核酸酶、连结、聚合酶以及测序反应测定核酸序列、表达、拷贝数或甲基化变化的装置、方法以及系统。
发明背景
DNA测序的进展使得有望标准化和发展非侵入性分子诊断以改善产前护理、移植功效、癌症和其他疾病检测以及个体化治疗。当前，具有易感染的疾病或早期疾病的患者未被鉴定出来并且未给予患有疾病的患者最佳治疗，这些都是因为诊断水平上的失败。
在癌症领域中，对发展用于早期检测、指导疗法以及监测复发(所有都是从血液样品进行)的技术存在需要。这包括需要发展：(i)已知基因中的单碱基突变、小插入以及小缺失突变(当以无细胞DNA的1％至0.01％存在时)的高灵敏度检测；(ii)启动子高甲基化和低甲基化(当以无细胞DNA的1％至0.01％存在时)的高灵敏度检测；(iii)从肿瘤源性外泌体或RISC复合物分离的肿瘤特异性mRNA、lncRNA以及miRNA或血液中的循环肿瘤细胞的准确定量；(iv)从循环肿瘤细胞分离的DNA中的肿瘤特异性拷贝变化的准确定量；(v)从循环肿瘤细胞分离的DNA中的突变、启动子高甲基化和低甲基化的准确定量。所有这些(除了从循环肿瘤细胞分离的DNA中的肿瘤特异性拷贝变化的定量)均需要使测序集中于所靶向的基因组基因或区域。另外，确定原始片段的两条链的序列信息或甲基化状态提供非常需要的对罕见事件的确认。
正常血浆含有由经历正常生理学过程的正常细胞所释放的核酸(即外泌体，细胞凋亡)。在应激、炎症、感染或损伤的条件下可能存在核酸的额外释放。一般来说，从凋亡细胞释放的DNA的长度平均为160bp，而来自胎儿细胞的DNA平均为约140bp。来自癌症患者的血浆含有由经历异常生理学过程的癌细胞释放的核酸以及在循环肿瘤细胞(CTC)内的核酸。同样地，来自孕妇的血浆含有从胎儿细胞释放的核酸。
开展可靠的诊断和筛选测试存在若干挑战。第一项挑战为将由肿瘤或胎儿产生的指示疾病(即早期癌症)的那些标记物与由正常组织产生的相同标记物的存在区分开。还需要平衡所检验标记物的数目和测试成本与分析的特异性和灵敏度。这是一项需要解决诸如癌症等疾病中的生物变异的挑战。在许多情况下，分析应充当筛选工具，从而需要可获得二级诊断随访(即结肠镜检查、羊膜穿刺)。结合生物问题为需要可靠地检测核酸序列突变或启动子甲基化差异，或者可靠地定量来自极小数目的起始细胞(即来自CTC)或当癌症或胎儿特异性信号中存在量大得多的由正常细胞产生的核酸时的DNA或RNA拷贝数。最后，在区分由检测所需疾病特异性核酸差异所产生的真实信号与由存在于样品中的正常核酸所产生的伪信号以及在不存在疾病特异性核酸差异的情况下所产生的伪信号方面存在技术挑战。
举例来说，考虑检测血浆中存在p53基因中具有突变或具有甲基化启动子区域的循环肿瘤DNA的挑战。此类样品将含有量大得多的由正常细胞产生的无细胞DNA，其中肿瘤DNA可能仅包含总无细胞DNA的0.01％。因此，为了通过总体测序发现此类突变体DNA的存在，人们将需要对100,000个基因组进行测序以鉴定10个具有突变的基因组。这将需要对300,000GB的DNA进行测序，此任务超出当前测序技术能力范围，更不必说庞大的数据管理问题。为避开此问题，许多小组尝试捕获特异性靶区域或对所讨论的区域进行PCR扩增。序列捕获受脱扣(dropout)困扰，使得可能捕获了90-95％的所需序列，但所需片段丢失。或者，PCR扩增提供引入不能与真实突变区分开的罕见错误的风险。另外，PCR丢失甲基化信息。虽然亚硫酸氢盐处理已在传统上用于确定启动子甲基化的存在，但它也破坏DNA样品并且缺乏鉴定无细胞DNA中的多个甲基化变化的能力。
存在若干不同方法来降低错误率和提高测序操作的准确性。可通过对相同DNA区域进行30至100次测序在存在高错误率的情况下实现一致性准确性。然而，高错误率使得鉴定低丰度的序列变体极其困难，例如当在存在正常DNA的情况下设法鉴定癌症突变时。因此，需要低错误率以检测相对低丰度的突变。第一种方法称为标记扩增子深度测序(TAm-Seq)法(Forshew等,“Noninvasive Identification and Monitoring of CancerMutations by Targeted Deep Sequencing of Plasma DNA,”Sci Transl Med.4(136):136(2012))，所述方法是基于将引物设计成扩增覆盖所选癌症相关基因区域(包括TP53、EGFR、BRAF以及KRAS)的5995个碱基。此方法能够以2％至65％的频率鉴定p53基因中的突变。在此方法中，将引物设计成在多重反应中使用许多PCR引物预扩增DNA(持续15个循环)。这形成所需的和不需要的产物两者，所以随后进行单重PCR，以进一步扩增所需产物中的每一者。在标准下一代测序之前对片段进行最终条形码PCR步骤。此方法的优点为它使用经时间检验的多重PCR-PCR，这对于低数目起始核酸的扩增来说为无可比拟的。缺点在于此方法在早期多轮扩增中不能区分真实突变与PCR错误。因此，虽然2％的灵敏度(即检测50wt等位基因中的一个突变体等位基因)足够用于在作出治疗决定之前评估晚期癌症，但是它对于早期检测不够灵敏。
第一种方法的变化形式称为安全测序系统“Safe-SeqS”(Kinde等,“Detectionand Quantification of Rare Mutations with Massively Parallel Sequencing,”ProcNatl Acad Sci USA 108(23):9530-5(2011))，其中随机剪切的基因组DNA附加至连结至基因组DNA的接头的末端。所述方法证实，由基因组测序描述的大多数突变实际上为错误，并且使假定测序错误降低至少70倍。同样地，称为超灵敏深度测序(Narayan等,“Ultrasensitive Measurement of Hotspot Mutations in Tumor DNA in Blood UsingError-suppressed Multiplexed Deep Sequencing,”Cancer Res.72(14):3492-8(2012))的方法将条形码附加至引物上用于巢式PCR扩增。推测起来，可开发出用于检测罕见突变和拷贝数变异的附加条形码的相似系统，这依赖于生物信息学工具(Talasaz,A.；Systemsand Methods to Detect Rare Mutations and Copy Number Variation,美国专利申请公布号US 2014/0066317A1)。使用配对末端读段覆盖含有假定突变的区域。使用此方法来跟踪患有晚期癌症的患者的血浆中的已知突变。这些方法需要许多读段以建立共有序列。这些方法需要跨过靶DNA进行延伸，并且因此，将不可能区分真实突变与聚合酶产生的错误，尤其在跨过受损碱基(诸如脱氨基胞嘧啶)进行拷贝时。最后，这些方法不提供关于片段内CpG位点的甲基化状态的信息。
第二种方法称为双重测序(Schmitt等,“Detection of Ultra-Rare Mutationsby Next-Generation Sequencing,”Proc Natl Acad Sci USA 109(36):14508-13(2012))，所述方法是基于使用含有12个碱基随机化标签的双重接头。通过扩增输入靶DNA的上链与下链两者，给定片段获得独特标识符(每个末端包含12个碱基)，使得它可经由测序跟踪。将共同拥有一组独特标签的序列读段分组至成员在上链或下链取向上具有链标识符的配对家族中。每个家族对反应一个双链DNA片段的扩增。存在于仅一个或几个家族成员中的突变表示发生在扩增后期的测序差错或PCR引入的错误。发生在一个成对家族的许多或所有成员中的突变由第一轮扩增期间的PCR错误产生，诸如可能在跨过诱变DNA损伤位点进行拷贝时出现。另一方面，存在于DNA片段的两条链上的真实突变出现在家族对的所有成员中。尽管在具有真实突变的家族对中可能共同存在人为突变，但除第一轮PCR扩增期间产生的那些突变外全部可独立地鉴定，并且当产生进行了错误校正的单链共有序列时被忽略。然后可将从个别DNA双链体的两条链中的每一者获得的序列相比较以获得双链体共有序列，此举消除了第一轮PCR期间发生的剩余错误。此方法的优点在于它清楚地区分真实突变与PCR错误或诱变DNA损伤，并且实现3.8x 10-10的非常低的错误率。此方法的缺点在于需要对许多片段进行测序以获得家族对中每条链的至少五个成员(即每个原始片段最少10个序列读段，但由于波动常常需要多得多)。另外，所述方法尚未对cfDNA进行测试，cfDNA倾向于小于由完整基因组DNA产生的片段，并且因此将需要对更多片段进行测序以涵盖所有潜在突变。最后，所述方法不提供关于片段内CpG位点的甲基化状态的信息。
第三种方法称为单分子分子倒置探针的smMIP(Hiatt等,“Single MoleculeMolecular Inversion Probes for Targeted,High-Accuracy Detection of Low-Frequency Variation,”Genome Res.23(5):843-54(2013)，所述方法将单分子标记与多重捕获组合以实现高度灵敏地检测低频率亚克隆变异。所述方法声称在临床试样中错误率为2.6x 10-5。此方法的缺点在于需要对许多片段进行测序以获得家族对中每条链的至少五个成员(即每个原始片段最少10个序列读段，但由于波动常常需要多得多)。另外，所述方法需要跨过靶DNA进行延伸，并且因此，将不可能区分真实突变与聚合酶产生的错误，尤其跨过受损碱基(诸如脱氨基胞嘧啶)进行拷贝时。另外，所述方法尚未对cfDNA进行测试，cfDNA倾向于小于由完整基因组DNA产生的片段，并且因此将需要对更多片段进行测序以涵盖所有潜在突变。最后，所述方法不提供关于片段内CpG位点的甲基化状态的信息。
第四种方法称为环形测序(Lou等,“High-throughput DNA Sequencing Errorsare Reduced by Orders of Magnitude Using Circle Sequencing,”Proc Natl AcadSci USA 110(49):19872-7(2013)；Acevedo等,“Mutational and Fitness Landscapes ofan RNA Virus Revealed Through Population Sequencing,”Nature 2014505(7485):686-90(2014)；以及Acevedo等,“Library Preparation for Highly AccuratePopulation Sequencing of RNA Viruses,”Nat Protoc.9(7):1760-9(2014))，所述方法是基于将DNA或RNA剪切至约150个碱基，使其变性以形成单链，使所述单链环化，使用随机六聚物引物和phi29 DNA聚合酶进行滚环扩增(在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶的情况下)，将产物再剪切至约500个碱基，然后继续进行标准下一代测序。此方法的优点在于滚环扩增形成原始靶DNA的多个串联拷贝，使得聚合酶错误可仅出现在一个拷贝中，但真实突变出现在所有拷贝中。读段家族的尺寸为平均3个拷贝，因为所述拷贝彼此物理连接。所述方法还使用尿嘧啶-DNA糖基化酶和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶移除含有受损碱基的靶标，以消除此类错误。此技术的优点在于它使当前水平的约0.1至1x 10-2的测序错误率变为低至7.6x 10-6的比率。后一错误率现足以在存在100至10,000倍过量的野生型DNA的情况下区分血浆中的癌症突变。另一优点为相同序列的2-3个拷贝为物理连接的，从而允许从由单一片段产生的序列数据验证真实突变，对比之下使用双重测序法为至少10个片段。然而，所述方法不提供测定拷贝数变化的能力，也不提供关于片段内CpG位点的甲基化状态的信息。
由Complete Genomics开发的第五种方法(Drmanac等,“Human GenomeSequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays,”Science 327(5961):78-81(2010))是基于使用纳米球阵列上的连结读段。将基因组DNA的约400个核苷酸用接头环化，裂解，用额外接头再环化，并且最终再环化为含有约四个接头。DNA经历使用phi 29 DNA聚合酶的滚环扩增以产生纳米球。然后将这些纳米球放至阵列上，并且使用基于连结的方法测序。此方法与本文相关的突出之处为可产生相同序列的多个串联拷贝并且随后对单一滚环扩增产物进行测序。由于通过连结酶或聚合酶将同一序列考查多次(通过将滚环与其他边合成边测序方法组合)，所以每个碱基的错误率可显著降低。因而，对滚环产物直接测序提供许多与上文所描述的环状测序法相同的优点。
第六种方法称为SMRT-单分子实时测序(Flusberg等,“Direct Detection of DNAMethylation During Single-Molecule,Real-Time Sequencing,”Nat Methods7(6):461-5(2010))，所述方法是基于将发夹环添加至DNA片段的末端，并且允许具有链置换活性的DNA聚合酶在共价闭合环周围延伸，从而提供关于两个互补链的序列信息。特定而言，单一聚合酶分子催化荧光标记的核苷酸合并至互补核酸链中。当在甲基化碱基对面合并核苷酸时，聚合酶减慢或“卡顿”，并且所得荧光脉冲允许直接检测DNA模板中的经修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶以及5-羟甲基胞嘧啶。所述方法的准确性得以提高，尤其在聚合酶可在闭合环周围穿过若干次时，从而允许测定共有序列。虽然所述技术被设计成提供关于“哑铃”形底物(主要含有线性DNA片段的两个互补序列)的序列信息，但它也可适用于单链环状底物。
若干科研小组和公司已开发出用于扩增特定靶序列同时将独特分子标识符(UMI)或条形码附加至每个片段的试剂盒。
称为SiMSen-Seq的巧妙方法(使用测序对DNA进行基于简单多重PCR的条形码技术以进行灵敏突变检测)使用用将发夹保护的条形码附加至每个片段的高保真度聚合酶以及外部通用引物进行的两轮PCR(等,“Simple,Multiplexed,PCR-based Barcodingof DNA Enables Sensitive Mutation Detection in Liquid Biopsies UsingSequencing,”Nucleic Acids Res.44(11):e105)(2016))。在此方法中，一个引物含有衔接子茎以使来自靶DNA的条形码“隐藏”，使得引物与靶标的杂交不会由条形码序列中的随机碱基错误引导。另一引物为末端具有Illumina衔接子序列的普通引物。在用高保真度聚合酶进行两轮扩增之后，衔接子和条形码被附加至靶片段。在蛋白酶处理和稀释之后，使用含有患者标识条形码的Illumina衔接子进行第二次PCR。所述方法鉴定原始测序错误的热点位置，并且当前被设计成仅对一条链进行条形码处理。
在ThruPLEX Tag-seq试剂盒(Rubicon Genomics)中，将茎环衔接子连结至双链DNA的末端。就标准Y衔接子而言，对基因组DNA进行修复，得到平末端。在下一步骤中，将5'末端阻断的含有独特分子标签(UMI)的茎环衔接子连结至DNA的5'末端，在靶片段的3'末端留下缺口。茎环衔接子不具有防止彼此连结的单链突出物，这两者均促成在许多其他NGS制备情况下所发现的非特异性背景。替代地，茎环衔接子含有可裂解复制停止碱基。在最后的步骤中，延伸DNA的3'末端以完成文库合成并且通过高保真度扩增添加Illumina相容性索引。将任何剩余游离衔接子降解。连结反应可为效率低的，这造成在突变样品输入受限制时产率较低的可能性。另外，此方法不选择特定靶标。
在NEBNext Direct靶向富集法(New England Biolabs)中，将DNA片段化为长度为约150-200bp。将片段化的DNA快速杂交至生物素化寡核苷酸“诱饵”，所述诱饵确定每个所关注靶标的3'末端。针对每个靶标的上链与下链两者来设计此类寡核苷酸诱饵。使诱饵-靶标杂合物结合于链霉亲和素珠粒，并且对任何3'脱靶序列进行酶促修整，以产生平末端。此短杂交时间与酶促移除3'脱靶序列的组合使得相对于常规基于杂交的富集方法测序效率更大。然后将修整的靶标转化成包括独特分子标识符(UMI)和样品条形码的Illumina相容性文库。如下实现此转化。使用末端转移酶使平末端具有dA尾，从而允许发夹环序列连结至单链dA突出物。接着，使用DNA聚合酶延伸探针以产生原始片段的拷贝并且产生具有随机5'末端的双链DNA。使这些末端为平端(使用T4聚合酶或DNA聚合酶1)，并且5'末端含有来自原始片段化的磷酸酯或者使用T4激酶添加磷酸酯。此新末端现在适合于在衔接子上连结至包含UMI序列的原始靶标链。然后裂解衔接子发夹环，因此形成上链，所述上链包含5'衔接子序列、UMI序列、一段5'靶序列、直至3'末端的与诱饵互补的所需靶区域、聚dA序列，然后为3'衔接子序列。此上链可然后从链霉亲和素珠粒熔解掉，纯化，然后适合于使用含有患者标识条形码的Illumina或Ion Torrent衔接子进行扩增。在一天内产生序列就绪文库。程序与大多数自动化液体处置仪器相容。虽然所述技术被设计成在仅仅捕获所需片段中为高效的，但它也是一种冗长、多步骤程序，具有当突变样品输入受限制时产率较低的可能性。
在QIAseq靶向RNA测序法(Qiagen Inc.)中，将独特标识符附加至RNA序列，从而允许其精确计数。在纯化RNA样品之后，使用逆转录酶来合成cDNA。使用包含第一5'通用序列、内部12碱基分子标签(即UMI)以及基因特异性3'部分的复合引物来制备cDNA的延伸产物。在延伸之后，将反应物净化以移除未反应的引物。这之后使用通用引物和包含第二5'通用序列的第二基因特异性引物进行第一阶段PCR。根据制造商的说法，第一基因特异性引物和第二基因特异性引物“从不彼此相见，由此使引物二聚体最小化”。在第一次PCR之后，存在另一反应物净化步骤。这随后为第二阶段PCR，使用通用衔接子序列来附加含有患者标识条形码的Illumina或Ion Torrent衔接子。在6小时内产生序列就绪文库。由于推测起来每个初始cDNA分子已由包含UMI的引物延伸，所以可通过使转录物与独特UMI相匹配来计算每个RNA分子存在多少原始转录物，并且因此区分1种转录物的5个复制品与相同基因的5个独特转录物。所述技术被设计成如在RNA-seq中一般计数RNA片段，但不计数非常特定的所需片段。虽然它也可适合于鉴定低丰度突变，但多次洗涤程序造成当突变样品输入受限制时产率较低的可能性。
在用于液体活组织切片检查临床研究的Oncomine无细胞DNA分析(ThermoFisherScientific)中，使用两步PCR反应直接从cfDNA扩增靶序列。正向与反向复合引物两者均包含第一/第二5'通用序列、内部独特分子标签(即UMI)以及基因特异性3'部分。在刚好两个循环的PCR之后，形成两种复合双链产物。第一产物包含上链引物延伸产物、上链靶序列以及包括第二通用序列的下链引物的补体；与包括下链靶序列的下链引物的初始延伸物杂交。第二产物包含下链引物延伸产物、下链靶序列以及包括第一通用序列的上链引物的补体；与包括上链靶序列的上链引物的初始延伸物杂交。因此，上链与下链均含有通用衔接子序列和由每个初始靶标链产生的独特UMI序列。然后将靶扩增子捕获于基因特异性引物纯化的固体支撑物上。使产物从固体支持物释放，然后为适合的第二阶段PCR，使用通用衔接子序列来附加含有患者标识条形码的Ion Torrent衔接子。在几小时内产生序列就绪文库，然后可组合以便使用乳液PCR在珠粒上进行进一步模板制备。此方法为非常快速并且稳健的；然而，它需要物理移除初始基因特异性引物以及在第二PCR步骤之后净化/尺寸选择(推测用于消除引物二聚体)的额外步骤，并且不清楚此程序是否造成当突变样品输入受限制时产率较低的可能性。
本发明用于克服本领域中的这些和其他缺陷。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。此系统包括入口孔和筒柱。筒柱限定含有多个初级反应室的空间，所述多个初级反应室流体连接至入口孔以从入口孔接收材料并且由材料产生初级反应室产物。所述空间还含有产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，初级反应产物在其中进一步反应形成阵列产物。在微孔隙或微孔中检测阵列产物，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过多个初级反应室中的一者的材料。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。所述系统包括：入口孔；出口孔；以及筒柱，所述筒柱包括微孔隙或微孔的阵列，并且筒柱流体连接入口孔和出口孔。筒柱限定含有多个初级反应室的空间，所述多个初级反应室流体连接至入口孔以从入口孔接收材料并且由材料产生初级反应室产物。所述空间还含有多个二级反应室，所述多个二级反应室中的一者或多者流体连接至多个初级反应室中的一者以从多个初级反应室中的一者接收材料，并且产生二级反应室产物。多个初级和二级反应室中的至少一些被配置成维持多个初级和二级反应室中的液体槽，以促进样品、试剂和/或产物反应物的混合以便产生后续反应室或阵列产物。所述空间还含有多个混合室，所述多个混合室各自流体连接至多个二级反应室中的一者以从多个二级反应室中的一者接收材料并且将材料排放至产物捕获外壳，使得单独产物捕获亚单元的每一列流体连接至一个或多个混合室中的一者以从一个或多个混合室中的一者接收材料。所述空间还含有产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，二级反应产物在其中进一步反应形成阵列产物。在微孔隙或微孔中检测阵列产物，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过多个初级反应室中的一者的材料。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。所述系统包括：入口孔；出口孔；以及筒柱，所述筒柱流体连接入口孔和出口孔。筒柱限定含有产物捕获外壳的空间，所述产物捕获外壳用产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物。每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙的阵列，所述多个个别亲水微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径。产物捕获外壳包括多个流体通道以容许材料从入口孔穿过一列产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的微孔隙的阵列接触，并且到达出口孔，其中多个流体通道定位于固体支撑物的上方和下方。
本发明的另一方面涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法。所述方法包括提供本发明的系统以及将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至产物捕获外壳内固体支撑物上的产物捕获亚单元的微孔隙或微孔中。因此，通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留于微孔隙或微孔内。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。在填充一个或多个初级反应室和/或一个或多个二级反应室(若存在)之后，所述方法包括在系统中进行初级和/或二级反应以及基于执行初级和/或二级反应检测在微孔或微孔隙中的样品中靶核酸分子的存在。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。在执行初级和/或二级反应之后，在以下条件下在微孔或微孔隙中对此类反应的产物进行扩增，在所述条件下聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶或核糖核酸酶以靶标特异性方式裂解包含淬灭剂和荧光基团的一个或多个探针，使得如果样品中存在靶核酸分子，则释放荧光基团从而产生信号。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。所述方法包括提供含有多个靶核酸分子的样品，然后使样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成聚合酶链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与靶核酸分子的一部分互补的第一部分以及第二部分。在初级反应室中对此混合物进行聚合酶链反应，以产生一组扩增产物。将扩增产物传送至产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙含有与第二部分互补的固定化捕获探针。捕获靶核酸分子并且拷贝至固定化捕获探针上。通过在微孔隙中执行测序反应获得固定化靶核酸分子的核苷酸序列。
本发明还涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的微量滴定板的方法。这涉及为微量滴定板提供多个单独行和列的产物捕获亚单元，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔的阵列。用含有寡核苷酸引物和/或探针的水性液体填充微量滴定板的微孔。将微量滴定板离心以使水性液体散布至微量滴定板中每个单独产物捕获亚单元中的未填充微孔。然后终止离心以促使水性液体不与疏水表面接触。将水性液体蒸发，并且将微孔干燥，使得寡核苷酸引物留在微孔中。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。此系统包括入口孔；出口孔；以及筒柱，所述筒柱流体连接至入口孔和出口孔。筒柱限定含有产物捕获外壳的空间，所述产物捕获外壳用产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物。每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙的阵列，所述多个个别亲水微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径。产物捕获外壳包括多个流体通道以容许材料从入口孔穿过一列产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的微孔隙的阵列接触，并且到达出口孔，其中多个流体通道定位于固体支撑物的上方和下方。
本发明提供一组用于直接从血液样品确定疾病原因的装置、腔室以及分析。从临床样品纯化核酸，对靶区域进行一系列扩增反应，并且使用实时PCR或测序作为读出鉴定或计数靶标。
本发明旨在帮助解决美国和全世界所面临的主要诊断性临床挑战。最大的未满足需要为在最早阶段检测癌症。可获得并且准确的早期检测测试具有在美国每年挽救超过300,000个生命并且在全球挽救超过4,000,000个生命的潜力；它单独在美国即可使每年健康护理成本节省$3000亿。此挑战的一种可能的解决方案为如本申请中所描述提供一种以单分子水平的灵敏度同时分析多种DNA突变和甲基化变化的方法和系统。相同的分析还可用于监测血液中的“癌症标记物负荷”，以监测手术后给定治疗如何有效地杀死残余癌细胞。相关挑战为在替代治疗可能仍有效时监测患者的癌症早期复发。本发明提供使用TaqmanTM分析、测序或两者跟踪癌症标记物的灵活性。
感染性疾病测试正从单病原体检测转移到基于症状的或血液中的病原体检测。本发明具有同时提供数百个靶标的准确病毒或细菌负荷值，以指导医师作出临床上可执行的判定的潜能。举例来说，罹患呼吸道疾病的患者可同时针对以下进行测试：流感和副流感病毒、腺病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、A族链球菌、肺炎霉浆菌、流感嗜血杆菌等的所有菌株。对于血源性病原体，本发明可用于区分：葡萄球菌属、MRSA、链球菌属、肠球菌属(VRE)、李斯特菌属(Listeria)、不动杆菌属、肠杆菌属、大肠杆菌(包括毒素产生者)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)(包括KPC's)、假单胞菌属、变形杆菌属、念珠菌属、隐球酵母属、奈瑟氏菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属等。可对具有发热症状的国际旅客进行测试以区分寨卡病毒(Zika virus)与病毒性出血热(登革热(Dengue)、黄热病、西尼罗河(West Nile)、沙粒病毒、丝状病毒、本雅病毒(bunyavirus)以及其他黄病毒)或其他病毒(流感、RSV、SARS、切昆贡亚热(Chikungunya)、风疹、麻疹、细小病毒、肠道病毒、腺病毒以及α病毒感染)或寄生虫性起因(疟疾)或细菌性起因(A族链球菌、立克次氏体(rickettsia)、包柔氏螺旋体(borrelia)、钩端螺旋体病)。
非侵入性产前测试目前用于使用经由直接测序进行染色体片段计数或基于连结的检测加上基于阵列的定量来区分染色体拷贝异常。本发明在单分子水平准确鉴定和计数靶标的能力将提供以更低成本提供高度准确的结果的机会。作为实例，实现对以下各项的更完整的基于血液的测试：威胁生命的常染色体和X连锁隐性孟德尔病症(Mendeliandisorder)：21三体、18三体、13三体、特纳综合征(Turner Syndrome)、克兰费尔特综合征(Kleinfelder Syndrome)(染色体拷贝异常)；杜兴和贝克尔肌营养不良(Duchenne andBeckers Muscular dystrophies)、囊性纤维化以及其他遗传性疾病。
附图说明
图1A至图1D说明适合于流体连接至筒柱的固体支撑物的示意图，所述固体支撑物包含子部分，每个子部分包含用于后续qPCR、UniTaq、FRET、qLDR或测序反应以及靶标鉴定的微孔隙或微孔。在图1A中，每个子部分为400微米宽x 600微米长(画为矩形部分)，包含24个具有50微米直径的微孔隙或微孔。子部分之间使用额外的100微米宽的脊以提供子部分的分离和额外结构支撑。这些脊表示为矩形子部分的行与列之间的“白色”区域。在图1B中，每个子部分为600微米宽x 400微米长(画为矩形部分)，包含2,760个具有5微米直径的微孔隙或微孔。子部分之间使用额外的100微米宽的脊以提供子部分的分离和额外结构支撑。在图1C中，每个子部分为800微米宽x 1,200微米长(画为矩形部分)，包含96个具有50微米直径的微孔隙或微孔。子部分之间使用额外的200微米宽的脊以提供子部分的分离和额外结构支撑。在图1D中，每个子部分为400微米宽x 600微米长(画为矩形部分)，包含2,760个具有5微米直径的微孔隙或微孔。子部分之间使用额外的100微米宽的脊以提供子部分的分离和额外结构支撑。
图2说明微通道流体连接至具有50微米直径的微孔或微孔隙的阵列的示意性正视图。图2说明允许液体流体移动至包含数千个微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室设计的示意性正视图。在此说明中，输入样品流体连接至六边形室(底部)，所述六边形室流体连接至第一组的12个菱形室(每组4个，分别含有大槽、中槽以及小槽)，所述12个菱形室流体连接至第二组的24个菱形室(每组2个，分别含有大槽和小槽)，所述24个菱形室流体连接至24个长较窄混合室，所述24个长较窄混合室流体连接至包含微孔或微孔隙的腔室(图的顶部，放大的正视图中仅说明2行)。
图3说明微通道流体连接至具有5微米直径的微孔隙的阵列的示意性正视图。图3说明允许液体流体移动至包含数百万个适合于TaqmanTM或测序反应的微孔隙的腔室的另一示例性前腔室设计的示意性正视图。在此说明中，输入样品流体连接至六边形室(底部)，所述六边形室流体连接至第一组的8个六方形室(每组4个，分别含有大槽和小槽)，所述8个六方形室流体连接至第二组的16个六方形室(每组2个，分别含有大槽和小槽)，所述16个六方形室流体连接至包含微孔或微孔隙的腔室(图的顶部，在放大的正视图中仅说明2行)。
图4A至图4C说明固体支撑物中的50微米微孔的视图的示意性正视图(图4A)、沿图4A的线B-B取得的剖视图(图4B)以及沿图4A的线C-C取得的剖视图(图4C)，示出腔室之间的脊如何与板连接以帮助引导流体流动和提供结构稳定性。所述说明还与5或2.5微米微孔隙有关，除了每个腔室内将说明更多微孔隙。在一个实施方案中，竖直脊与顶板和底板齐平，同时水平脊具有凹陷或通道，使液体能够沿所述列向上流动，但不从一列流至下一列。
图5A至图5C说明固体支撑物中的50微米微孔的视图的示意性正视图(图5A)、沿图5A的线B-B取得的剖视图(图5B)以及沿图5A的线C-C取得的剖视图(图5C)，示出腔室之间的脊如何连接至两个板以帮助引导流体流动和提供结构稳定性。所述说明还与5或2.5微米微孔隙有关，除了每个腔室内将说明更多微孔隙。在此说明中，腔室的正面为较浅色板与具有较宽直径的微孔隙之间的区域，而腔室的背面为较深色板与具有较窄直径的微孔隙之间的区域。可将背面板压在加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。在一个实施方案中，竖直脊与顶板和底板齐平，同时水平脊具有凹陷或通道，使液体能够沿所述列向上流动，但不从一列流至下一列。
图6A至图6C说明固体支撑物中的50、5或2.5微米微孔隙的视图的示意性正视图(图6A)、沿图6A的线B-B取得的剖视图(图6B)以及沿图6A的线C-C取得的剖视图(图6C)，这类似于图13，但现说明50、5或2.5微米微孔隙的底部如何具有在200至400纳米厚的氮化硅上的另一层0.5微米孔洞，使得能够用液体从正面填充5或2.5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过背面的0.5微米孔隙逃脱。在此说明中，腔室的正面为较浅色板与具有较宽直径的微孔隙之间的区域，而腔室的背面为较深色板与具有较窄直径的微孔隙之间的区域。可将背面板压在加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。
图7A至图7I说明各种前腔室设计的示意性正视图，所述前腔室设计可经历各种任务，所述任务涉及混合不同试剂、经历各种扩增反应或省略所述扩增反应的一部分供随后在下一反应中使用，或用于使液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室。图7A示出了具有槽以便在排放之后保留小部分反应物的腔室。图7B示出了具有槽以便在排放之后保留中等部分反应物的腔室。图7C示出了具有槽以便在排放之后保留大部分反应物的腔室。图7D展示具有两个槽以便在排放之后保留一份或两份小部分反应物的腔室。图7E示出了具有两个槽，以便在排放之后保留一份中等部分和/或一份小部分反应物的腔室。图7F展示具有槽以便在排放之后保留大部分反应物的腔室，并且额外的隔板确保第二反应流体被向下引导以与先前从第一反应剩余的产物充分混合。图7G类似于图7A，除了试剂从腔室的侧面而不是底部引入。图7H类似于图7G；然而，更大量的产物保留于腔室底部。图7I类似于图7H，具有一些添加物以允许水性液体层和油层独立地移动。在图7I中，腔室类似于图7H，具有一些添加物。
图8A至图8C说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的各种前腔室设计的示意性正视图。图8A为使8个腔室内的引物和/或探针(灰色圆形)流体连接，然后注入更长更窄腔室中和各行微孔或微孔隙中，以便最终在微孔或微孔隙内干燥或共价连接至微孔或微孔隙的内部表面的实例。图8B为使试剂流体连接至4+4个腔室，然后注入更长更窄腔室的实例。左侧为涂布过的，或由非常疏水的塑料制成，而右侧几乎不具疏水性，或略具亲水性。图8C类似于图8A，但仅具有4个腔室，并且具有额外的塑料脊或分隔物。
图9A至图9B说明如由图5A和图6B所说明填充微孔隙的实施方案的示意性侧视图。图9A示出了顶部与底部均开放的微孔隙。从顶部将引物(和探针)流体引入微孔隙中，同时从底部引入油。随后，用油从顶部区域驱出水溶液，使得引物/探针流体分离。可将引物固定或干燥。图9B示出了以下微孔隙，所述微孔隙为顶部开放的并且具有在200至400纳米度的氮化硅上的另一层0.5微米孔洞，使得能够用液体从正面填充50、5或2.5微米微孔隙，允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。
图10说明填充反应室然后填充微孔或微孔隙的实施方案的示意性正视图。所述设置包括各自具有槽的两组反应室，并且将第二组用适当的连结探针寡核苷酸(灰色圆形)预点样。在底部引入轻油盖，随后引入包含靶标、PCR引物以及PCR试剂的水性液体，然后使用重油使水性液体流体移动至第一组反应室中。在PCR步骤之后，将油和大多数水性反应物排放，在两个初始室的槽中留下一部分产物。再次用轻油填充腔室，随后添加LDR试剂和酶，并且然后使用重油使此水性反应混合物流体移动至第二组反应室中(在第二组反应室中它与预点样的LDR引物混合)。
图11A至图11B说明如图5A和图6B所说明)填充微孔隙用于进行实时PCR反应(诸如TaqmanTM或UniTaq反应)的实施方案的示意性正视图。所述说明从已用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充并且干燥的微孔隙开始。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在图11A中，将带尾靶标或连结的探针从底部正面流体引入微孔隙中，同时从底部背面引入油。随后，使油从正面流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出进微孔隙，同时在正面用油覆盖每个单独微孔隙。在图11B中，所有表面为疏水的，除了微孔隙的内表面，以及具有0.5微米孔洞的氮化硅。在从底部正面泵送水性流体时，它从正面进入微孔隙，从背面排出空气并且不推进穿过0.5微米氮化硅孔隙。当水性液体从正面填充微孔隙时，使油从正面流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出进微孔隙，同时在正面用油覆盖每个单独微孔隙。腔室的背面可用油填充。每个微孔隙流体分离并且适合于后续的独立扩增和热循环反应。
图12说明如图6所说明填充微孔隙用于进行测序反应的实施方案的示意性侧视图。在此实例中，所有表面为疏水的，除了微孔隙的内表面，以及具有0.5微米孔洞的氮化硅。在从底部正面泵送水性流体时，它从正面进入微孔隙，从背面排出空气并且不推进穿过0.5微米氮化硅孔隙。当水性液体从正面填充微孔隙时，使油从正面流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出进微孔隙，同时在正面用油覆盖每个单独微孔隙。背面也用油填充。每个微孔隙流体分离并且适合于后续的独立热循环反应以扩增模板链并且将其固定至固体支撑物上的孔隙的内部表面上。从正面腔室驱出油，同时使相对链产物变性并且将其他产物和引物洗掉。使用重油塞来堵塞正面腔室的底部，同时冲洗背面以为阵列提供在适合用于测序的微孔隙内克隆扩增的固定化靶标链。
图13A至图13B说明使用如图1和图6中所描述的微孔或微孔隙的腔室模式的示意性正视图。图13A为一种微孔模式，其中子部分为800微米宽x1200微米长(画为矩形部分)，包含96个具有50微米直径的微孔。子部分之间使用额外的200微米宽的脊以提供子部分的分离和额外结构支撑。这些脊表示为矩形子部分的行与列之间的“白色”区域。图13B为用于在微量滴定板模式中在微孔隙阵列上进行测序的微流体室的总览。在放大图中，仅示出了2个双列和1个双行的子部分，所述子部分各自包含2,072个微孔隙。在一个实施方案中，使用一系列个别开口馈入含有微孔隙的腔室，所述个别开口可为流体封闭的或开放的以使用声学微滴喷射使试剂、酶、靶标或预扩增靶标向上进入给定列的所有腔室。当使用声学微滴喷射时可通过将微滴馈入随后馈入所述列的微孔隙的一系列亲水性输入室中来促进流体进入个别开口。在此示意图中，每个个别开口连接至馈入两列微孔隙的亲水性输入室。此外，腔室也为流体连接的以允许试剂从一个入口孔进入所有腔室并且在另一侧离开进入单个废料孔或出口孔。在亲水性输入室适当地用试剂、酶、靶标或预扩增靶标填充后，所述开口关闭，然后通过所述一个入口孔添加油或其他试剂以使输入溶液流体移动至微孔隙中用于进一步的反应。
图14说明使用如图13A中所描述并且适合于用适当引物和探针预填充的腔室中的微孔的微量滴定板模式的示意性侧视图。步骤A示出了包含50微米亲水孔并且在每一侧具有脊的疏水板内的一个腔室的侧视图。在步骤B中，将板上下翻转并且使用声学微滴喷射用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与突变或甲基化特异性TaqmanTM探针)填充。在步骤C中，将板离心，使水性液体散布至空的微孔，而步骤D说明在离心之后，微孔上将形成微滴，因为水溶液避开疏水表面。在步骤E中，水溶液蒸发，孔中留下干燥的引物/探针组(说明于步骤F中)。
图15说明使用如图13A中所描述并且用适当的TaqmanTM或UniTaq引物和探针预填充的腔室中的微孔的微量滴定板模式的示意性侧视图。步骤A示出了包含50微米亲水孔并且在每一侧具有脊的疏水板内的一个腔室的侧视图。在步骤B中，将板上下翻转并且使用声学微滴喷射用适合于实时扩增(即TaqmanTM反应)的试剂和靶DNA填充。在步骤C中，用疏水矿物油覆盖水层。在步骤D中，将板转移至摆动桶转子(swinging bucket rotor)进行离心。密度更大的水性液体散布至空的微孔。在步骤E中，将板移至热循环器。微滴分离至由矿物油覆盖并且适合于扩增的个别微孔中。
图16说明使用TaqmanTM读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-PCR-qPCR程序。
图17说明使用UniTaq读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-PCR-qPCR程序。
图18说明使用分离探针UniTaq(UniRq)读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-PCR-qPCR程序。
图19说明使用TaqmanTM读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-LDR-qPCR程序。
图20说明使用UniTaq读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-LDR-qPCR程序。
图21说明使用分离探针UniTaq(UniSpTq)读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-LDR-qPCR程序。
图22说明使用通用分离探针读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-qLDR(UniLDq)程序。
图23说明使用靶标特异性分离探针读出来鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-qLDR(TsLDq)程序。
图24说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-UniTaq检测的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重PCR-巢式PCR-实时PCR)，用于未知病原体鉴定和定量。灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。
图25A至图25B说明使用由数千个微孔隙组成的微孔隙板用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针分析操作多重PCR-巢式PCR-实时PCR的筒柱和阀门设置的示意性侧视图。图25A为说明微通道流体连接至具有50微米直径的微孔或微孔隙的阵列的示意性正视图。在图25B中，微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4和5连通。
图26说明使用TaqmanTM读出直接从血液鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-PCR-qPCR程序。
图27说明使用UniTaq读出直接从血液鉴定或相对定量未知病原体的示例性PCR-PCR-qPCR程序。
图28说明使用TaqmanTM读出来鉴定或相对定量低水平突变的示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图29说明使用UniTaq读出来鉴定或相对定量低水平突变的示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图30说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-LDR-UniTaq检测，用于鉴定和定量血浆中的低水平未知突变的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用用突变特异性TaqmanTM探针进行的多重PCR-LDR-实时PCR)。灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。
图31说明使用TaqmanTM读出来鉴定或相对定量低水平甲基化的示例性PCR-LDR-qPCR(在任选遗留预防情况下)反应。
图32说明使用UniTaq读出来鉴定或相对定量低水平甲基化的示例性PCR-LDR-qPCR(在任选遗留预防情况下)反应。
图33说明使用UniTaq读出来鉴定或相对定量野生型以及或者剪接mRNA转录物的示例性RT-PCR-LDR-qPCR反应。
图34说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重RT-PCR-LDR-UniTaq检测以鉴定和定量罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用具有靶标特异性TaqmanTM探针的多重PCR-LDR-实时PCR)。灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。
图35说明使用边合成边测序读出来鉴定未知病原体一条链中的突变的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图36说明片段标识符PCR方法的一个实施方案，其中第一标签引物以比溶液内与(较长)固定化第二标签引物更大的量存在，以使每个微孔隙的产物产率最大化。
图37说明片段标识符PCR方法的另一实施方案，其中溶液内第一标签引物包含两个不同的5'部分，并且具有添加的5'部分引物，所述添加的5'部分引物以比溶液内与(较长)固定化第二标签引物更大的量存在，以使每个微孔隙的产物产率最大化。
图38说明片段标识符PCR方法的另一实施方案，其中溶液内第一标签引物包含dA35，并且具有添加的dA35与富GC支点引物，其存在的量比溶液内与(较长)固定化第二标签引物更大，以使每个微孔隙的产物产率最大化。
图39说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-测序用于未知病原体鉴定的腔室架构和微孔或微孔隙。灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。
图40说明使用边合成边测序读出来鉴定cfDNA的一条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图41说明使用边合成边测序读出在cfDNA的重叠片段上鉴定一条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，第二标签序列引物为生物素化的，并且捕获于链霉亲和素涂布的珠粒上以分布于微孔隙中，或直接位于链霉亲和素涂布的微孔隙上。
图42说明使用边合成边测序读出在cfDNA的重叠片段上鉴定一条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图43说明使用生物素化或固定化第二标签序列引物进行PCR扩增的额外细节，示出了较短扩增子形成不扩增的锅柄状物，而所需较长产物在固体支撑物上扩增。
图44说明使用边合成边测序读出在cfDNA的重叠片段上鉴定一条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法的另一实施方案。在此图式中，说明了包含第二标签序列的两个靶标特异性引物。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图45说明使用边合成边测序读出在cfDNA的重叠片段上鉴定一条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法的另一实施方案。在此图式中，说明了包含第一标签序列的两个靶标特异性引物。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图46说明使用边合成边测序读出在cfDNA的重叠片段上鉴定两条靶标链中的低丰度突变的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第一标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。通过使用含有第二标签序列的不同巢式引物，从上链扩增的区域不同于从下链扩增的区域，并且因此可区分由上链和下链序列产生的读出。
图47说明使用边合成边测序读出来鉴定cfDNA的两条基因座特异性链的SNP和计数拷贝数的示例性片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第一标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。通过使用含有第二标签序列的不同巢式引物，从上链扩增的区域不同于从下链扩增的区域，并且因此可区分由上链和下链序列产生的读出。
图48说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-测序用于鉴定血浆中的低丰度未知突变或用于血浆中的非侵入性三体性产前测试的腔室架构和微孔或微孔隙。灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。
图49A至图49B说明使用片段标识符PCR-测序鉴定血浆中的低丰度未知突变的筒柱和阀门设置的示意性侧视图。图49A为说明微通道流体连接至具有5微米直径的微孔隙的阵列的示意性正视图。图49B为使用由数百万个微孔隙组成的微孔隙板进行片段标识符PCR-测序的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4、5以及6连通。
图50说明使用片段标识符PCR-测序鉴定血浆中的低丰度未知突变的筒柱和阀门设置的示意性侧视图。步骤A涉及提供微通道与具有5微米直径的微孔隙的阵列的微板流体连接。步骤B示出了在单独的孔中进行初始反应，然后使用声学微滴喷射来将适当试剂、酶、缓冲液、靶标和/或预扩增靶标推入通往输入室和包含数百万个微孔隙的列的开口中。步骤C示出了流体连接至4个阀门的板。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(说明为板的顶部)与阀门1和3连通，而第二侧(说明为板的底部)与阀门2和4连通。
图51说明使用边合成边测序读出来鉴定cfDNA的一条靶标链中的低丰度甲基化的示例性Bsh1236I-亚硫酸氢盐-片段标识符PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图52说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-测序和Bsh1236I-亚硫酸氢盐-多重PCR-巢式PCR-测序用于鉴定血浆中的低丰度未知突变和甲基化的腔室架构和微孔或微孔隙。
图53说明使用边合成边测序读出来鉴定从CTC或外泌体分离的低丰度和中等丰度lncRNA、mRNA以及剪接位点变体的示例性片段标识符RT-PCR方法。在此实例中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。
图54说明允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的正视图。此设计说明适合于进行多重RT-PCR-巢式PCR-UniTaq检测用于鉴定从CTC或外泌体分离的低丰度和中等丰度lncRNA、mRNA以及剪接位点变体的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，具有转录物特异性TaqmanTM探针的多重PCR-巢式PCR-实时PCR。)灰色圆形代表用不同引物或探针组预填充行或列的区域。
具体实施方式
本发明的一个方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。此系统包括入口孔和筒柱。筒柱限定含有多个初级反应室的空间，所述多个初级反应室流体连接至入口孔以从入口孔接收材料并且由材料产生初级反应室产物。所述空间还含有产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，初级反应产物在其中进一步反应形成阵列产物。在微孔隙或微孔中检测阵列产物，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过多个初级反应室中的一者的材料。
在一个实施方案中，本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统还包括用于从产物捕获外壳排出材料的出口。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，由筒柱限定的空间还含有一个或多个初始反应室，入口孔将材料排放至所述一个或多个初始反应室中并且材料从所述一个或多个初始反应室排放至多个初级反应室中。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的又一实施方案中，由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室，其中的一者或多者流体连接至多个初级反应室中的一者以从多个初级反应室中的一者接收材料。所述空间还含有多个混合室，所述多个混合室各自流体连接至多个二级反应室中的一者以从多个二级反应室中的一者接收材料并且将材料排放至产物捕获外壳，使得单独产物捕获亚单元的每一列流体连接至一个或多个混合室中的一者以从一个或多个混合室中的一者接收材料。
根据本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的此实施方案，多个初级和二级反应室中的至少一些被配置成维持多个初级和二级反应室中的液体槽。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，多个初级和/或二级反应室各自具有内部挡板以维持多个初级和二级反应室中的液体槽。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的又一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，多个初级和/或二级反应室各自具有一个或多个内部挡板以维持多个初级和二级反应室中的多个液体槽。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，混合室中的每一者包括分隔物，所述分隔物从材料进入混合室处的近端延伸至材料离开混合室处的近端。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，混合室中的每一者包括高度疏水的第一表面和与第一表面隔开并且与第一表面相比疏水性较差的第二表面，其中第一和第二表面从材料进入混合室处的近端延伸至材料离开混合室处的近端。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的又一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，初级反应室和/或二级反应室包含内表面，寡核苷酸引物或探针可点样于所述内表面上。
在根据本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径。
此系统可还包含覆盖产物捕获外壳中的微孔隙的第二末端的网筛或放置于个别微孔隙中的珠粒。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，产物捕获亚单元包括多个个别微孔的阵列，所述多个个别微孔各自具有开放末端和封闭末端。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，其中由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室，产物捕获外壳包括多个流体通道，以容许材料从多个混合室穿过一列产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的微孔隙或微孔的阵列接触。
多个流体通道可定位于固体支撑物上方和/或下方。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，所述系统可还包括一个或多个阀门，用于将试剂或反应物通过入口选择性地引入筒柱或从筒柱中移除。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，所述系统还包括一个或多个阀门，用于将试剂或反应物通过出口孔和/或通过产物捕获外壳中出口孔远端的位置选择性引入产物捕获外壳或从产物捕获外壳中移除。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的又一实施方案中，所述系统还在筒柱中初级反应室和/或产物捕获外壳的近端包括一个或多个加热元件。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，当由筒柱限定的空间还含有一个或多个初始反应室，入口孔将材料排入所述一个或多个初始反应室中并且材料从所述一个或多个初始反应室排入多个初级反应室时，所述系统可还包括在筒柱中初始反应室的近端的一个或多个加热元件。
在本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的另一实施方案中，当由筒柱限定的空间还含有多个二级反应室和多个混合室时，所述系统可还包含在筒柱中二级反应室中的一者和/或混合室中的一者或多者的近端的一个或多个加热元件。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。所述系统包括：入口孔；出口孔；以及筒柱，所述筒柱包括微孔隙或微孔的阵列，并且筒柱流体连接入口孔和出口孔。筒柱限定含有多个初级反应室的空间，所述多个初级反应室流体连接至入口孔以从入口孔接收材料并且由材料产生初级反应室产物。所述空间还含有多个二级反应室，所述多个二级反应室中的一者或多者流体连接至多个初级反应室中的一者以从多个初级反应室中的一者接收材料，并且产生二级反应室产物。多个初级和二级反应室中的至少一些被配置成维持多个初级和二级反应室中的液体槽，以促进样品、试剂和/或产物反应物的混合以便产生后续反应室或阵列产物。所述空间还含有多个混合室，所述多个混合室各自流体连接至多个二级反应室中的一者以从多个二级反应室中的一者接收材料并且将材料排放至产物捕获外壳，使得单独产物捕获亚单元的每一列流体连接至一个或多个混合室中的一者以从一个或多个混合室中的一者接收材料。所述空间还含有产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，二级反应产物在其中进一步反应形成阵列产物。在微孔隙或微孔中检测阵列产物，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过多个初级反应室中的一者的材料。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。所述系统包括：入口孔；第二入口位置；出口孔；以及筒柱，所述筒柱使入口孔、第二入口位置以及出口孔流体连接。筒柱限定含有产物捕获外壳的空间，所述产物捕获外壳用产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列。产物捕获外壳包括多个流体通道以容许材料从入口孔和/或第二入口位置穿过一列产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的微孔隙的阵列接触，并且到达出口孔，其中多个流体通道定位于固体支撑物的上方和下方。使用一个或多个阀门将试剂或反应物通过入口孔、出口孔和/或通过产物捕获外壳中出口孔远端的第二入口位置选择性地引入产物捕获外壳或从产物捕获外壳中移除。
本发明的另一方面涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法。所述方法包括提供本发明的系统以及将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至产物捕获外壳内固体支撑物上的产物捕获亚单元的微孔隙或微孔中。因此，通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留于微孔隙或微孔内。
用于制备本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法可还涉及用初级反应寡核苷酸探针或引物填充一个或多个初级反应室，所述初级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与样品中的靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分。根据此实施方案，初级反应寡核苷酸探针或引物可还包含第二部分，所述第二部分包含与保留在微孔隙或微孔内的通用标签或捕获寡核苷酸引物的一部分相同或互补的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法。所述方法涉及提供本发明的系统，其中系统包括入口孔和筒柱。筒柱限定一个空间，所述空间含有多个初级反应室，所述多个初级反应室流体连接至入口孔以从入口孔接收材料并且由材料产生初级反应室产物；产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个分离产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，其中初级反应产物进一步反应形成阵列产物，所述阵列产物在微孔隙或微孔中检测，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过多个初级反应室中的一者的材料；多个二级反应室，其中的一者或多者流体连接至多个初级反应室中的一者以从多个初级反应室中的一者接收材料；以及多个混合室，所述多个混合室各自流体连接至所述多个二级反应室中的一者以从所述多个二级反应室中的一者接收材料并且将材料排放至所述产物捕获外壳中，使得单独产物捕获亚单元的每一列流体连接至所述一个或多个混合室中的一者以从所述一个或多个混合室中的一者接收材料。此方法还涉及将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至产物捕获外壳内固体支撑物上的产物捕获亚单元的微孔隙或微孔中。因此，通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留于微孔隙或微孔内。
此方法可还涉及将一个或多个初级反应室和/或二级反应室用初级或二级反应寡核苷酸探针或引物填充，所述初级或二级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与样品中的靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分。根据此实施方案，初级或二级反应寡核苷酸探针或引物可还包含第二部分，所述第二部分包含与保留在微孔隙或微孔内的通用标签或捕获寡核苷酸引物的一部分相同或互补的核苷酸序列。
在用于制备本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法的一个实施方案中，产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径，第一通道与微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与微孔隙的第二末端流体连通，其中通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针通过包括以下步骤的方法施加至微孔隙，所述步骤的顺序阐述如下：使通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针穿过第一通道通过第一开放末端进入微孔隙，同时使疏水液体穿过第二通道；使疏水液体穿过第一通道，同时使疏水液体穿过第二通道；使挥发性溶剂穿过第一通道，同时使疏水液体穿过第二通道；以及使空气穿过第一通道，同时使热量、疏水液体、挥发性溶剂、然后空气穿过第二通道。
在用于制备本发明的用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法的另一实施方案中，产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径，第一通道与微孔隙的第一末端流体连通，并且通过覆盖第二末端的网筛与微孔隙的第二末端隔开的第二通道与第二通道流体连通，其中检测或捕获寡核苷酸引物或探针通过包括以下步骤的方法施加至微孔隙，所述步骤的顺序阐述如下：使通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针穿过第一通道通过其第一开放末端进入微孔隙；使疏水液体穿过第一通道以从第一通道排出通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针；使疏水液体穿过第一通道，同时使疏水液体穿过第二通道；使挥发性溶剂穿过第一通道，同时使疏水液体穿过第二通道；以及使空气穿过第一通道，同时使热量、疏水液体、挥发性溶剂、然后空气穿过第二通道。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。在填充一个或多个初级反应室和/或一个或多个二级反应室(若存在)之后，所述方法包括在系统中进行初级和/或二级反应以及基于执行初级和/或二级反应检测在微孔或微孔隙中样品中靶核酸分子的存在。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。在执行初级和/或二级反应之后，在以下条件下在微孔或微孔隙中对此类反应的产物进行扩增，在所述条件下聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶或核糖核酸酶以靶标特异性方式裂解包含淬灭剂和荧光基团的一个或多个探针，使得如果样品中存在靶核酸分子，则释放荧光基团从而产生信号。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。进行初级和/或二级反应的方法涉及提供含有多个靶核酸分子的样品以及使样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第一聚合酶延伸或链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与靶核酸分子的一部分或靶核酸分子的补体互补的第一部分。在一个或多个初始或初级反应室中对此混合物进行第一聚合酶延伸或链反应，以产生第一组延伸或扩增产物。然后使这些产物与一组二级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第二聚合酶链反应混合物，所述二级寡核苷酸引物具有与初级延伸或扩增产物的一部分互补的第一部分。在初级或二级反应室中对此第二混合物进行第二聚合酶链反应，以产生第二组扩增产物，其中每个二级扩增产物包含5'第二部分序列、靶核苷酸序列特异性部分或其补体以及3'第二部分互补序列。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。进行初级和/或二级反应的方法涉及提供含有多个靶核酸分子的样品以及使样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第一聚合酶延伸或链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与靶核酸分子或其延伸产物的一部分互补的部分。在一个或多个初始或初级反应室中对此混合物进行第一聚合酶链反应，以产生第一组延伸或扩增产物。然后使这些产物与一组寡核苷酸探针以及连结酶接触，以形成连结酶检测反应混合物，所述寡核苷酸探针具有与第一组扩增产物的一部分互补的第一部分以及第二部分。在初级或二级反应室中对此第二混合物进行连结酶检测反应，以产生一组连结产物，其中每种连结产物包含5'第二部分序列、靶核苷酸序列特异性部分或其补体以及3'第二部分序列。
本发明的又一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。填充一个或多个初级反应室(如果存在)的方法和在系统中进行初级和/或二级反应的方法是通过涉及以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下。通过入口孔将疏水液体传送至系统中。将初级反应寡核苷酸探针或引物和逆转录和/或聚合酶链反应试剂，然后疏水液体是通过入口孔传送至系统中。在系统中进行聚合酶延伸或链反应并且使材料通过入口孔从系统排放。将疏水液体、聚合酶链反应或连结酶检测反应试剂，然后是疏水液体通过入口孔传送至系统中，并且在系统中进行聚合酶链反应或连结酶检测反应。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列。微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径，第一通道与微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与微孔隙的第二末端流体连通，并且其中所述在系统中进行二级反应是通过涉及以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下。将聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物通过第一通道传送至产物捕获外壳中，同时使疏水液体穿过第二通道。然后使疏水液体穿过第一和第二通道。然后在产物捕获亚单元中的微孔隙内使用通用标签引物和探针对聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物进行聚合酶链反应。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列。微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径，第一通道与微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与微孔隙的第二末端流体连通，并且通过覆盖微孔隙的第二末端的网筛与微孔隙的第二末端隔开，并且其中在系统中进行二级反应的方法是通过涉及以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下。将聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物通过第一通道传送至产物捕获外壳中。使疏水液体穿过第一通道。然后，使疏水液体穿过第一和第二通道。在产物捕获亚单元中的微孔隙内使用通用标签引物和探针对聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物进行聚合酶链反应。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中在样品中鉴定多个核酸分子，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品或其他样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个核苷酸插入或缺失、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列、一个或多个易位和/或一个或多个甲基化残基。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中制备所述系统涉及用初级反应寡核苷酸探针或引物填充一个或多个初级反应室，所述初级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与样品中的靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分。在填充一个或多个初级反应室的过程之后，所述方法还涉及在系统中进行初级反应以及在进行初级反应的过程之后获得样品中靶核酸分子的核苷酸序列。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。所述方法包括提供含有多个靶核酸分子的样品，并且使样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成聚合酶链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与靶核酸分子的一部分互补的第一部分以及第二部分。在初级反应室中对此混合物进行聚合酶链反应，以产生一组扩增产物。将扩增产物传送至产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙含有与第二部分互补的固定化捕获探针。捕获靶核酸分子并且拷贝至固定化捕获探针上。通过在微孔隙中执行测序反应获得固定化靶核酸分子的核苷酸序列。
根据此实施方案，产物捕获亚单元可包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径。所述方法可还涉及覆盖产物捕获外壳中微孔隙的第二末端的网筛。
在另一实施方案中，使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法还涉及放置于个别微孔隙中的含有固定化捕获探针的珠粒。
在另一实施方案中，使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法还涉及在获得核苷酸序列的过程之前和对聚合酶链反应混合物进行聚合酶链反应之后将至少一个第二部分从扩增产物移除。可使用尿嘧啶DNA糖基化酶、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、核酸内切酶III、核酸内切酶IV、核酸内切酶V、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶、甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶或8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶或其组合来执行移除至少一个第二部分的过程。
另一实施方案涉及一种使用本发明的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法。所述方法涉及提供本发明的系统以及将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至产物捕获外壳内固体支撑物上产物捕获亚单元的微孔隙或微孔中，其中通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留在微孔隙或微孔内。所述方法还涉及用初级反应寡核苷酸探针或引物填充一个或多个初级反应室，所述初级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与样品中靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分；以及在系统中进行初级反应。所述方法还涉及在进行初级反应的过程之后获得样品中靶核酸分子的核苷酸序列。产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径，第一通道与微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与微孔隙的第二末端流体连通，并且通过覆盖微孔隙的第二末端的网筛与微孔隙的第二末端隔开，并且其中获得核苷酸序列的方法是通过包括以下步骤的方法来进行，所述步骤的顺序阐述如下。将聚合酶链反应的产物通过所述第一通道传送至产物捕获外壳中。然后使疏水液体穿过第一通道，使得产物分布至个别微孔中。接着，使疏水液体穿过第一和第二通道。在用于产生固定至微孔内部表面的扩增产物的条件下在聚合酶链反应和/或等温反应中使用捕获寡核苷酸引物对产物进行扩增。然后使挥发性溶剂穿过第一通道，同时使疏水液体穿过第二通道。使聚合酶链反应和/或等温反应的产物变性，并且通过第一通道将非锚定核酸分子洗掉，同时使疏水液体穿过第二通道，使得产物在个别微孔中分离。使密度比水高的疏水液体穿过第一通道，同时使挥发性溶剂、空气、然后测序试剂穿过第二通道。然后在产物捕获亚单元中进行测序反应。
本发明还涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的微量滴定板的方法。这涉及为微量滴定板提供多个单独行和列的产物捕获亚单元，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔的阵列。用含有寡核苷酸引物和/或探针的水性液体填充微量滴定板的微孔。将微量滴定板离心以使水性液体散布至微量滴定板中每个单独产物捕获亚单元中的未填充微孔。然后终止离心以促使水性液体不与疏水表面接触。将水性液体蒸发，并且将微孔干燥，使得寡核苷酸引物留在微孔中。
本发明的另一实施方案涉及一种使用本发明的用于在微量滴定板的微孔内制备干燥寡核苷酸引物的方法来鉴定样品中的多个核酸分子的方法。这涉及将水性样品装入微量滴定板中，随后将疏水液体装入微量滴定板中，使得疏水液体在水性样品上方。将微量滴定板离心以使水性液体散布至微量滴定板中的未填充微孔。然后终止离心以促使水性液体不与疏水表面接触。在以下条件下进行核酸分子扩增反应，在所述条件中聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶或核糖核酸酶以靶标特异性方式裂解包含淬灭剂和荧光基团的一个或多个探针，使得如果样品中存在靶核酸分子，则释放荧光基团从而产生信号。
根据此实施方案，鉴定多个核酸分子，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个核苷酸插入或缺失、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列、一个或多个易位和/或一个或多个甲基化残基。
本发明的另一方面涉及一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统。此系统包括入口孔；出口孔；以及筒柱，所述筒柱流体连接至入口孔和出口孔。筒柱限定含有产物捕获外壳的空间，所述产物捕获外壳用产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物。每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙的阵列，所述多个个别亲水微孔隙各自具有相对的第一和第二开放末端，第一末端具有大直径并且第二末端具有比第一末端小的直径。产物捕获外壳包括多个流体通道以容许材料从入口孔穿过一列产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的微孔隙的阵列接触，并且到达出口孔，其中多个流体通道定位于固体支撑物的上方和下方。
在一个实施方案中，用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统还包括一个或多个阀门，用于将试剂和/或反应物通过入口孔或通过出口孔选择性地引入产物捕获外壳或从产物捕获外壳中移除。
在用于鉴定样品中的多个核酸分子的另一实施方案中，所述系统还在筒柱中产物捕获外壳的近端包括一个或多个加热元件。
本发明涉及一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法。此方法涉及提供本发明的系统，其中所述系统包括入口孔、出口孔以及筒柱，所述筒柱流体连接入口孔和出口孔，并且限定如上文所描述的空间。此方法还涉及将捕获寡核苷酸引物或探针施加至产物捕获外壳内固体支撑物上的产物捕获亚单元的微孔隙中，其中捕获寡核苷酸引物或探针保留在微孔隙或微孔内。在一个实施方案中，此方法还涉及在系统中进行反应以及基于进行反应检测微孔隙中样品中靶核酸分子的存在。
本发明提供一组用于直接从血液样品确定疾病原因的装置、腔室以及分析。从临床样品纯化核酸，对靶区域进行一系列扩增反应，并且使用实时PCR或测序作为读出鉴定或计数靶标。表1中呈现了可通过这些装置解决的急迫临床需要的综述。
表1.直接从血液样品确定疾病原因的临床需要的综述.
检测多个未知病原体或突变的主要挑战之一为在避免PCR脱扣同时在多重反应中同时扩增所有潜在和所需片段。多重PCR反应可能难以优化，并且片段脱扣一直是一个恼人的问题。在8-12个循环范围内的初始PCR循环常常可维持相对拷贝数，但是当一些片段更高效地扩增时，它们倾向于过度扩增(out-amplify)并且压倒较不高效的片段从而在随后的循环中导致片段脱扣。此问题的一种解决方案为进行初始有限循环多重扩增，然后将产物分至24至48个反应室中用于以低得多的复杂性进行后续扩增反应。另一解决方案为将初始扩增产物稀释至包含数十、数百或数千个微孔隙或微孔的子部分中。然后可将给定微孔隙或微孔用于1至4个qPCR或个别测序反应，因此允许准确的靶标计数或定量，同时使PCR脱扣的风险最小化。
本发明的一个方面为一组子部分，这些子部分优选以行和列的形式排列，每个子部分包含个位数、数十、数百或数千个微孔隙或微孔用于后续qPCR、UniTaq、FRET、qLDR或测序反应和靶标鉴定。在优选实施方案中，靶标的存在产生荧光读出。在一些实施方案中，对靶标进行扩增并且固定或连接至微孔隙或微孔内的固体支撑物。此类固定可直接在微孔隙或微孔上的内部表面上、在固定至微孔隙或微孔表面的树状聚合引物上或者在扩增之前已分布于微孔隙或微孔内或在初始扩增之后分布至微孔隙或微孔中的微珠粒上进行。固定或连接至固体支撑物使得能够一次或多次地考查扩增的靶标以确定靶标内存在或不存在突变、SNP或序列变异。这包括多轮连结检测反应(LDR)、边合成边测序或边连结边测序。
子部分以行和列的形式排列有助于用通用或靶标特异性引物、酶、试剂、缓冲液、靶标或预扩增靶标填充此类行和列。填充可通过使液体通过流体连接或相连的通道流过给定行或列中的所有子部分或者通过使液体准确分布至个别子部分(例如使用声学微滴喷射(ADE)技术)来实现。ADE设备的一个制造商为Labcyte(Sunnyvale California)。
在本发明的一个实施方案中，此灵活设计架构使得能够对可能呈现384、768或1536个靶标、突变、抗性基因、病理基因和/或菌株或血清型变体的病毒、细菌、原生动物、疟疾或其他病原性核酸进行鉴定、基因分型和/或定量。直接从血液检测细菌DNA为一项特别困难的挑战，因为产率典型地为每毫升血液约1-2个菌落形成单位；然而，空间多路复用法仍可实现32、64或128个潜在靶标的鉴定。当如下文所描述使用测序模块时，所述设计使得能够测定1,536个潜在病原靶标的约150个碱基读段。
所述设计的另一实施方案使用空间稀释(例如稀释至48个部分中)来实现直接由血浆对拷贝数进行准确计数以进行非侵入性三体性产前测试(NIPT)。由于在48个部分(即列)中的每一者中，沃森链应与克立克链相匹配(因为它们由每条链中的一者的给定片段产生)，所以这是链损失或其他错误的内部对照。使用染色体2(对照)、13、18、21、X以及Y上的多个独特基因座来确定拷贝数和鉴别三体性或其他染色体拷贝变化。在一个实施方案中，可在两条链上考查184个基因座区域，但这可增加至368或736个基因座区域。
所述设计的另一实施方案使得能够直接从血浆对多达64或128个潜在靶标进行PCR-LDR-qPCR单分子突变检测，当通过单一信号对基因中的多个突变(即K-ras密码子12和13中的突变)进行评分时具有额外的灵活性。类似水平的灵活性可适用于鉴定和计数所选基因的启动子区域中CpG位点的甲基化。在腔室内进行连续稀释的能力使得能够准确计数384个RNA靶标，包括例如从外泌体或血小板分离的罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体。
所述设计的另一实施方案使得能够测定144个靶区域中的低丰度突变，从而提供两条链的约150个碱基读段，同时准确计数每个突变。对甲基化区域进行测序允许这些区域预富集，使得可考查超过2,000个甲基化CpG启动子区域，即使以低丰度存在。
在本发明的一个实施方案中(参见图1A)，子部分Z以列A1至Aii和行B1至Bv的形式存在并且为400微米宽x 600微米长。子部分Z之间使用额外的100微米宽的脊X和Y以提供子部分的分离和额外结构支撑。可将此类脊设计成具有实现子部分之间的流体运动的凹陷或通道。在固体支撑物中制作微孔隙或微孔，所述固体支撑物可包含复合物、塑料、金属、玻璃、硅、氮化硅或其混合物。微孔隙或微孔的尺寸可为50微米直径，在约50微米深至400微米深范围内，并且在底部可为开放的(即微孔隙)或封闭的(即微孔)。50微米微孔隙的底部可在200至400纳米厚的氮化硅上具有另一层0.5微米孔洞，使得能够从顶部用液体填充50微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。微孔氮化硅膜可通过完全认可的方法来制造，诸如安置于硅晶片衬底上的氮化硅层的光刻图案化和活性离子蚀刻(DesOrmeaux JP等,“Nanoporous Silicon Nitride Membranes Fabricated fromPorous Nanocrystalline Silicon Templates”,Nanoscale 6(18):10798-805(2014)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，每个子部分包含以笛卡尔或六方堆积产生的6x 4＝24个50微米直径的微孔隙或微孔。此类实施方案理想地适合于后续qPCR、UniTaq、FRET或qLDR检测。
表2：筒柱或微量滴定板模式中的微孔或微孔隙的不同实施方案.
在本发明的另一实施方案中(图1B)，子部分Z以列A1至Ai和行B1至Bix的形式存在并且为400微米宽x 600微米长。子部分Z之间使用额外的100微米宽的脊X和Y以提供子部分的分离和额外结构支撑。可将此类脊设计成具有实现子部分之间的流体运动的凹陷或通道。在固体支撑物中制作微孔隙或微孔，所述固体支撑物可包含复合物、塑料、金属、玻璃、硅、氮化硅或其混合物。微孔隙或微孔的尺寸可为5微米直径，在约5微米深至40微米深范围内，并且在底部可为开放的(即微孔隙)或封闭的(即微孔)。5微米微孔隙的底部可在200至400纳米厚的氮化硅上具有另一层0.5微米孔洞，使得能够从顶部用液体填充5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。在一个实施方案中，每个子部分包含以六方堆积产生的60x 46＝2,760个5微米直径的微孔隙或微孔。此类实施方案理想地适合于后续边合成边测序或边连结边测序。
在以上实施方案的另一变化形式中，子部分Z为400微米宽x 600微米长，子部分之间具有100微米宽的脊X和Y。微孔隙或微孔的尺寸可为2.5微米直径，在约2.5微米深至20微米深范围内，并且在底部可为开放的(即微孔隙)或封闭的(即微孔)。2.5微米微孔隙的底部可在200至400纳米厚的氮化硅上具有另一层0.5微米孔洞，使得能够从顶部用液体填充2.5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。在一个实施方案中，每个子部分包含以六方堆积产生的100x 92＝11,040个2.5微米直径的微孔隙或微孔。此类实施方案理想地适合于后续边合成边测序或边连结边测序。
在本发明的另一实施方案中(参见图1C)，子部分Z以列A1至Ai和行B1至Bii的形式存在并且为800微米宽x 1200微米长。子部分Z之间使用额外的200微米宽的脊X和Y以提供子部分的分离和额外结构支撑。可将此类脊设计成具有实现子部分之间的流体运动的凹陷或通道。在固体支撑物中制作微孔，所述固体支撑物可包含复合物、塑料、金属、玻璃、硅、氮化硅或其混合物。微孔的尺寸可为50微米直径，在约50微米深至400微米深范围内。在一个实施方案中，每个子部分包含以笛卡尔或六方堆积产生的12x 8＝96个50微米直径的微孔隙或微孔。此类实施方案理想地适合于后续qPCR、UniTaq、FRET或qLDR检测。
在本发明的另一实施方案中(参见图1D)，子部分Z以列A1至Aii和行B1至Bv的形式存在并且为400微米宽x 600微米长。子部分Z之间使用额外的100微米宽的脊X和Y以提供子部分的分离和额外结构支撑。可将此类脊设计成具有实现子部分之间的流体运动的凹陷或通道。在固体支撑物中制作微孔隙，所述固体支撑物可包含复合物、塑料、金属、玻璃、硅、氮化硅或其混合物。微孔隙的尺寸可为5微米直径，在约5微米深至40微米深范围内。5微米微孔隙的底部可在200至400纳米厚的氮化硅上具有另一层0.5微米孔洞，使得能够从顶部用液体填充5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。在一个实施方案中，每个子部分包含以六方堆积产生的60x 46＝2,760个5微米直径的微孔隙或微孔。此类实施方案理想地适合于后续边合成边测序或边连结边测序。
在以上实施方案的另一变化形式中，子部分为400微米宽x 600微米长，子部分之间具有100微米宽的脊。微孔隙或微孔的尺寸可为2.5微米直径，在约2.5微米深至20微米深范围内。2.5微米微孔隙的底部可在200至400纳米厚的氮化硅上具有另一层0.5微米孔洞，使得能够从顶部用液体填充2.5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部的0.5微米孔隙逃脱。在一个实施方案中，每个子部分包含以六方堆积产生的100x 92＝11,040个2.5微米直径的微孔隙。此类实施方案理想地适合于后续边合成边测序或边连结边测序。
设想装置包含流体连接至微流体通道的微孔隙或微孔的阵列。在一个实施方案中，流体连接的通道将各种试剂和酶馈入一系列反应室中以实现预扩增反应，然后使产物移动至微孔隙或微孔的阵列中，用于后续TaqmanTM或测序读出。
图2的左侧(底部)部分为说明微通道流体连接至具有50微米直径的微孔或微孔隙的阵列的示意性正视图。在图2的此部分中，微通道存在于由具有入口2和出口8的筒柱4限定的空间6中。图2的右侧(顶部)部分提供筒柱内组件的更详细视图并且说明允许液体流体移动至包含数千个微孔或微孔隙的腔室中的示例性前腔室设计的示意性正视图。此设计说明如下文将描述适合于进行多重RT-PCR-巢式PCR-UniTaq检测以鉴定从CTC或外泌体分离的低丰度和中等丰度lncRNA、mRNA以及剪接位点变体的腔室架构。在此说明中，样品输入通过入口12流体连接至六边形室10(底部)，所述六边形室10通过导管14流体连接至第一组的12个菱形室16(每组4个，分别含有大槽18c、中槽18b以及小槽18a)，所述12个菱形室16通过导管20流体连接至第二组的24个菱形室22(每组2个，分别含有大槽24a和小槽24b)，所述24个菱形室22通过导管26流体连接至24个长较窄混合室28，所述24个长较窄混合室28通过导管30流体连接至包含微孔或微孔隙的子部分32(图的顶部，仅说明2行)。可设计蛇形路径以限制流体流动，使得所有腔室在给定水平下均等填充。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。
图3的左侧(底部)部分为说明微通道流体连接至具有5微米直径的微孔隙的阵列的示意性正视图。在图3的此部分中，微通道存在于由具有入口102和出口108的筒柱104限定的空间106中。图3的右侧(顶部)部分提供筒柱内组分的更详细视图并且说明允许液体流体移动至包含数百万个适合于TaqmanTM或测序反应的微孔隙的腔室的另一示例性前腔室设计的示意性正视图。在此说明中，输入样品通过入口112流体连接至六边形室110(底部)，所述六边形室110通过导管114流体连接至第一组的8个六方形室116(每组4个，分别含有大槽118a和小槽118b)，所述8个六方形室116通过导管120流体连接至第二组的16个六方形室122(每组2个，分别含有大槽124a和小槽124b)，所述16个六方形室122通过导管126流体连接至16个长较窄混合室128，所述16个长较窄混合室128通过导管130流体连接至包含微孔隙的子部分132(图的顶部，仅说明2行)。第二组的16个六方形室122被说明为彼此稍微错开的，以允许每个腔室中的液体体积更大，同时维持紧密的架构。可设计流体路径以限制流体流动，使得所有腔室在给定水平下均等填充。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。
图4A至图4C提供固体支撑物子部分232中的50微米微孔的示意性正视图(图4A)、沿图4A中的线B-B取得的示意性顶部剖视图(图4B)以及沿图4A中的线C-C取得的示意性侧面剖视图(图4C)，具有板204帮助引导流体流动。所述说明还与5或2.5微米微孔隙202有关，除了每个腔室内将说明更多微孔隙。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。它提供孔的六方间隔的实例。在此实施方案中，微孔的内部表面具有亲水表面，而外表面为疏水的，使得当使含有靶标或预扩增靶标和/或引物的水性液体在微孔上流过(例如从底部到顶部)时水性液体填充每个微孔。当随后使疏水液体(即矿物油、硅油、氟化油或全氟萘烷)在孔上流过时，水性液体将保留在由疏水液体覆盖的单独孔中，从而允许后续酶反应或扩增反应在每个单独孔中独立地进行。
在图4的一个实施方案中，板的表面为疏水的。在另一实施方案中，板的表面为亲水的。在一个实施方案中，液体从底部流入并且通过顶部流出，一个或多个阀门控制腔室的输入和输出。可通过从底部施加正压(即在顶部部分对空气开放的情况下将液体泵入腔室中)和/或通过从顶部施加负压(即抽拉注射器或部分真空)促进水性液体从底部流入微孔到达顶部。可通过使用不同压力组合来调节流速。
图5A至图5C提供固体支撑物中子部分232中的50微米微孔隙202的示意性正视图(图5A)、沿图5A中的线B-B取得的示意性顶部剖视图(图5B)以及沿图5A中的线C-C取得的示意性侧面剖视图(图5C)，这类似于图4A至图4C，但具有正面板204和背面板206。在此说明中，腔室的正面为正面板与具有较宽直径的微孔隙之间的区域，而腔室的背面为背面板与具有较窄直径的微孔隙之间的区域。可将背面板压在加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。
图4A至图4C与5A至图5C均说明子部分之间的脊如何连接至板204和206以帮助引导流体流动和提供结构稳定性。所述说明还与5或2.5微米微孔隙有关，除了每个腔室内将说明更多微孔隙。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在一个实施方案中，竖直脊与板齐平，同时水平脊具有凹陷或通道，使得液体能够沿所述列向上流动，但不从一列流至下一列。在适合于最初在行中预填充特异性引物的另一实施方案中，将临时和互补板与具有凸缘以封闭列间通道的水平脊一起使用，并且提供额外的高度以使液体能够流经所述行，并且不从一行流至下一行。在用所需引物组填充所述行之后，随着液体蒸发，引物浓缩至微孔隙内的亲水表面上，可将板移除以促进所述蒸发，然后将最后的板添加回去，以使得能够沿所述列向上流动，穿过所述行，但不从一列流至下一列。含有微孔隙的固体支撑物背面的脊在连接至背面板方面也具有类似架构，使得液体在背面同样沿所述列向上流。水平脊中通道或凹陷的位置可为错开的以提供所需结构支撑。可对在水平脊中脊、凹陷或通道的确切尺寸进行优化以避免具有次最佳流体流动的死空间(即在给定腔室的角内)。
图6A至图6C提供固体支撑物232中的50、5或2.5微米微孔隙202的视图的示意性正视图(图6A)、沿图6A中的线B-B取得的示意性顶部剖视图(图6B)以及沿图6A中的线C-C取得的示意性侧面剖视图(图6C)，这类似于图5A至图5C，但现在说明50、5或2.5微米微孔隙的底部如何具有在200至400纳米厚的氮化硅上的另一层238的0.5微米孔洞，使得能够用液体从正面填充50、5或2.5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过背面的0.5微米孔隙逃脱。在这些说明中，腔室的正面为正面板204与具有较宽直径的微孔隙之间的区域，而腔室的背面为背面板206与具有较窄直径的微孔隙之间的区域。可将背面板206压在加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。在一个实施方案中，板204与206的表面为疏水的。在另一实施方案中，一个板的表面为亲水的，而另一个板的表面为疏水的。在另一实施方案中，两个板的表面均为亲水的。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。
在以下部分中，提供对不同微流体室架构的描述，以及各种腔室、微孔和/或微孔隙如何用适合于后续核酸扩增、检测和/或测序反应的液体填充的说明。
图7A至图7I提供各种前腔室设计的示意性正视图，所述前腔室设计可经历各种任务，所述任务涉及混合不同试剂、经历各种扩增反应或省略所述扩增反应的一部分供随后在下一反应中使用，或用于使液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室。一般来说，流体从底部端口进入并且从顶部端口离开。在若干随访实例中，同时填充相同尺寸和类型的多个腔室。在这些实例中，腔室由总体上疏水材料制成，液体为亲水的，并且在所述实例中，使用少量低密度疏水油(即矿物油)密封每个腔室的顶部以允许在不损失液体的水性部分的情况下进行热循环。任选地，在水性液体后面驱出的可为更高密度的疏水液体，诸如氟化油或全氟萘烷，以密封这些腔室的底部。另外，可使用诸如甘油(当使用超过10％v/v时它确实影响酶活性)等添加剂或增强酶稳定性或增强富GC靶标的扩增的其他化合物(诸如甜菜碱、四氢嘧啶(ectoine)、羟基四氢嘧啶(hydroxyectoine)、甘露糖基甘油酸酯、甘露糖基甘油酰胺、双甘油磷酸酯或其他糖或糖衍生物)来调节水层的密度和粘度。在图7A中，在液体泵入腔室中时小矿物油塞引导水性反应组分。矿物油达到顶部出口孔并且将腔室密封，腔室用水性液体填充，并且底部入口孔用氟化油密封。在热循环(或其他反应)之后，将液体排出，留下保持在入口端左侧的浅槽中的小体积水性液体。当引入新试剂时，它们将与先前反应的扩增产物混合。图7B与图7A相同；然而，更大量的产物保留在槽中。图7C与图7A相同；然而，几乎一半的产物保留在槽中。图7D为图7A的变化形式，其中可将一些引物组印刷在右侧的第二槽中。在这些条件下，可将下部腔室中的第一反应的产物流体地推至此第二腔室中，使得它们填充第一(左侧)槽，但不去到上方的第二槽。移除流体，留下保持在入口端左侧的浅槽中的小体积水性液体。当引入新试剂时，它们将与前一反应的扩增产物以及沉积于第二槽中的引物混合。以此方式，初级PCR随后可为二级LDR或PCR反应。注意，当将液体从二级反应排出时，产物留在左侧与右侧槽中。图7E为图7D的变化形式，其中第一槽更大以保留更多的第一组产物。图7F类似于图7C，除了第二片塑料确保第二反应流体向下引导以与先前从第一反应剩余的产物充分混合。图7G类似于图7A，除了从侧面而非底部引入试剂，使得腔室可保留第一反应的一些产物用于后续与第二反应物混合。图7H类似于图7G；然而，更大量的产物保留于腔室底部。在图7I中，腔室类似于图7H，具有一些添加物。当将矿物油沿入口向上推进时，一些进入两个细疏水管，而其余部分进入腔室侧面。这随后为水性液体，所述水性液体不进入细疏水开口，而是完全推至反应室中，它前面具有小矿物油塞。矿物油到达顶部出口孔并且将腔室密封，腔室用水性液体填充，两个细管也用矿物油填充，并且底部入口端用氟化油密封。在反应之后，当排出液体时，矿物油从两个细管中排空，并且空气跟随而来。无论腔室中形成什么产物均留在那里。当添加充足的水性流体来推动穿过顶部空气开口的液体时这些产物可流体地推入下一腔室中。
图8A至图8C提供允许导管14、20、26以及30中的液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室中的各种前腔室设计的示意性正视图。图8A为流体连接8个腔室16内的引物和/或探针(灰色圆形17)的实例，所述引物和/或探针然后通过导管26注入更长更窄腔室28和具有微孔或微孔隙的子部分32，最终在微孔或微孔隙内干燥或共价连接至微孔或微孔隙的内部表面。在一个实施方案中，在制造筒柱期间，将各行用1-4个UniTaq引物组(或者，1-4个通用标签引物组加上靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在一个实施方案中，使用临时板来提供穿过微孔或微孔隙的行的流体路径，同时将每一行彼此分离。图式顶部的灰色圆形说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷引物组的可能位置。在印刷之后，可使用微流体通道使引物组分布至每一行中并且干燥至个别微孔或微孔隙中。在适当递送和在适当位置干燥引物组后，将临时板移除，并且换成永久性覆盖物以提供沿微孔或微孔隙的列向上的流体路径，同时将每一列与其相邻列分离。图8B为使试剂与具有槽18和24以及挡板23的4+4个腔室16和22流体连接的实例，所述试剂然后注入更长更窄腔室28，然后到达导管30和子部分32。在此说明中，灰色圆形25代表适合于基于聚合酶和/或连结酶的DNA扩增反应的特异性引物。更长腔室的左侧涂有非常疏水的塑料或由其制成，而右侧为几乎不疏水的，或略亲水的。当小矿物油塞从初始室推出时，它自然地移向左侧，从而允许随后的水性反应物直接涌入包含微孔或微孔隙(图的顶部部分)的列。因此，如果通过首先暴露于水性液体(以避免夹带的空气泡阻挡液体移动)最佳地对微孔或微孔隙进行填充，则此方式将矿物油移开。图8C为类似于图8B的示意图，其中使试剂流体连接至具有槽18和挡板19的4个腔室16，所述试剂然后注入更长更窄腔室28，然后到达子部分32。在此说明中，灰色圆形17代表适合于基于聚合酶和/或连结酶的DNA扩增反应的特异性引物。图8C说明帮助保持疏水油与后续水溶液在向上泵送穿过腔室时分隔开并且不与其混合的额外塑料脊或分隔物29。
图9A至图9B提供如由图5B和图6B所说明填充微孔隙的实施方案的示意性侧视图。在这些说明中，微孔隙202的内部侧面为亲水的，而其他表面为疏水的。在一个实施方案中，在适合于流体移动至微孔隙阵列中的前腔室中，例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来印刷不同引物和探针(参见图8A)。在图9A和图9B中正面板204被显示在通道240上方。图9A说明固体支撑物232内顶部与底部开放的微孔隙202。从顶部通道240将引物(和探针)流体引入微孔隙中，同时从与背面板206形成的底部通道242引入油(优选具有比水溶液高的密度)。随后，从顶部通道240用油(具有较低密度)驱出水溶液，使得引物/探针流体分离。如果引物要共价固定至表面，则所述化学过程可在顶部通道240与底部通道242均用油填充时进行。或者，可通过捕获来固定引物，例如生物素化引物可通过链霉亲和素涂布的表面来捕获。如果引物-探针用于后续干燥，则它们可在挥发性盐(诸如乙酸铵)中进行配制，或者，可具有包含甜菜碱、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甘露糖基甘油酸酯、甘露糖基甘油酰胺、双甘油磷酸酯或其他糖或糖衍生物的稳定缓冲液。随后，可用不可与微孔隙中的水溶液混溶的挥发性有机物(即己醇)驱出顶部油。可用空气驱出挥发性有机物，并且在存在温和加热的情况下，水性物蒸发，留下干燥至微孔隙内部表面的所需引物和探针。底部的油也可用挥发性有机物驱出，随后使用空气以干燥阵列腔室。或者，当引物固定至微孔隙202的内部表面时，将过量引物洗掉，然后添加任选挥发性有机物(即乙醇)并且进行干燥。图9B说明固体支撑物232内的微孔隙202，所述微孔隙202由顶部通道240(与板202形成)开放并且具有200至400纳米厚的氮化硅上的另一层238的0.5微米孔洞，使得能够从正面经由通道240用液体填充50、5或2.5微米微孔隙，从而允许空气，但不允许液体通过底部通道242(与背面板206形成)处的0.5微米孔隙逃脱。在此说明中，将油添加至底部通道242以使得能够随后在任选引物固定步骤期间加热微孔隙202内的反应物(如果需要)。在其他实施方案中，例如在没有固定的情况下添加引物/探针，底部和/或顶部腔室中油的使用可为任选的。
图10提供在填充子部分32的微孔或微孔隙之前填充反应室的实施方案的示意性正视图。所述装备包括通过导管14和20馈料的两组反应室16和22，这两组反应室16和22各自具有槽18和24，并且第二组用适当的连结探针寡核苷酸(灰色圆形25)预点样。左侧说明在微孔隙阵列中的TaqmanTM读出之前用于初始多重PCR预扩增和后续连结酶检测反应(LDR)的微流体学和腔室的一部分的示意图。在下一图中，在底部将轻油盖引入导管14，这然后接着为包含靶标、PCR引物以及PCR试剂的水性液体，并且然后使用重油使水性反应混合物流体移动至第一组反应室16中。在PCR热循环步骤之后，使油和大多数水性反应物通过导管14排放，但一小部分的PCR产物保留在两个初始室16中的每一者的槽18中。再次通过导管14用轻油填充腔室，随后添加LDR试剂和酶，并且然后使用重油使此水性反应混合物流体移动至第二组反应室22中(在此处它与预点样的LDR引物混合)。反应室22通过导管26注入反应室28(反应室28被塑料脊或分隔物29分开)并且通过导管30注入具有微孔或微孔隙的子部分32。在LDR热循环步骤之后，再一次，使试剂排放，但LDR产物保留在槽24中。如图11A至图11B中所解释，此产物现在适合于与PCR预混液流体组合并且移动至微孔隙阵列中用于后续TaqmanTM反应。
图11A至图11B提供如图5C和图6C所说明填充微孔隙202以进行实时PCR反应(诸如TaqmanTM或UniTaq反应)的实施方案的示意性侧视图。在图11A至图11B中，正面板204显示在通道240的左侧并且背面板206显示在通道242的右侧。所述说明从已用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充并且已干燥的固体支撑物232中的微孔隙202开始。在一个实施方案中，微孔隙202的内部表面具有亲水表面，而外部的正面244和背面246表面为疏水的，使得当含有靶标或预扩增靶标和/或引物的水性液体在微孔隙上流动时(例如从底部穿过通道242从孔隙具有更宽直径的正面244穿过通道240到达顶部)，水性液体填充每个微孔隙。在一个实施方案中，液体从底部流入通道240或242并且分别在通道240或242中通过顶部流出，一个或多个阀门控制腔室的输入和输出。在一个实施方案中，通过单独的阀门或施加单独的压力来调节或控制腔室正面和背面的流体输入和输出。可通过从底部通过通道240或242施加正压(即在顶部部分对空气开放的情况下将液体泵入腔室中)和/或通过从顶部施加负压(即抽拉注射器或部分真空)促进水性液体从底部流入微孔隙到达顶部。可通过使用顶部、底部、正面或背面的压力的不同组合来调节流速。出于说明的目的，考虑用适合于在微孔隙202内进行后续个体化扩增的水性液体填充微孔隙202的任务。在图11A中，包括正面244和背面246的所有表面均为疏水的，除了微孔隙202的内表面。在使用正压从底部正面泵送水性流体时，它从正面244通过通道240进入微孔隙202，从背面246通过通道242排出空气并且在孔隙202的背面形成弯月面。为避免随着在正面上升形成水性液体的重量从而形成充足的压力将液体推出最初被填充的微孔隙的背面，从底部背面246通过通道242泵送疏水液体，因此它在孔隙202背面的水性弯月面形成后不久将其覆盖。最佳压力高度差异可实验测定，并且将随液体粘性、液体密度、液体体积差异以及具有微孔隙的固体支撑物的外表面的疏水性而变化。在水性液体从正面244通过通道240填充微孔隙202时，使疏水液体(即重油)从正面244通过通道240流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出至微孔隙202中，同时用油覆盖正面244的每个单独微孔隙202。因此，将微孔隙各自用水性液体填充，并且在正面244和背面246用疏水液体密封。每个微孔隙202流体分离并且适合于后续的独立扩增和热循环反应。在图11B中，所有表面为疏水的，除了微孔隙202的内表面以及具有0.5微米孔洞的氮化硅238。当使用正压从底部正面244通过通道240泵送水性流体时，它从正面244进入微孔隙202，通过通道242从背面246排出空气并且不推动液体穿过0.5微米氮化硅孔隙。当水性液体从正面244填充微孔隙202时，使油从正面244通过通道240流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出至微孔隙202中，同时用油覆盖正面244的每个单独微孔隙202。腔室的背面可用湿润空气填充并且加热以最终加热微孔隙中的水性液体。或者，还可如所说明通过通道242用油填充腔室的背面246。因此，将微孔隙202各自用水性液体填充，并且在正面和背面用油密封。每个微孔隙流体分离并且适合于后续的独立扩增和热循环反应。
图12提供如图6A至图6C所说明填充微孔隙以进行测序反应的实施方案的示意性侧视图。在图12中，正面板204显示于通道240的左侧并且背面板206显示于通道242的右侧。在此实例中，包括正面244和背面246的所有表面为疏水的，除了微孔隙202的内表面以及具有0.5微米孔洞的氮化硅238。当使用正压从底部正面244通过通道240泵送水性流体时，它从正面244进入微孔隙202，通过通道242从背面246排出空气并且不推进穿过0.5微米氮化硅孔隙。当水性液体从正面244填充微孔隙202时，使油从正面244流入，以将水性液体从非生产体积中驱出出来并且驱出至微孔隙中，同时用油覆盖正面244的每个单独微孔隙。背面246在通道242中也用油填充。因此，微孔隙202各自用水性液体填充，并且在正面244和背面246用油密封。每个微孔隙202流体分离并且适合于后续的独立热循环反应以扩增模板链并且将其固定至固体支撑物上的孔隙的内部表面上。将油从正面244通过通道240驱出，同时使相对链产物变性并且将其他产物和引物洗掉。使用重油塞在通道240处堵塞正面244的底部，同时通过通道242冲洗(例如乙醇)背面246，任选进行空气干燥，并且现在阵列具有在适合于测序的微孔隙202内克隆扩增的固定化靶标链。可通过从底部施加正压(即在顶部部分对空气开放的情况下将液体泵入通道240和242)和/或通过从顶部施加负压(即抽拉注射器或部分真空)促进水性液体在背面246从底部流入微孔隙到达顶部正面244和背面246。可通过使用不同压力组合或限制顶部背面的开口来调节流速，因此确保大多数测序试剂体积通过底部背面246进入，但流经微孔隙202并且从顶部正面244出来。在微孔隙202的背侧使用氮化硅层238的另一优点为从正面244添加的水性液体将不会破坏背面246的空气界面，但如果背面246在通道242处填充有水性液体，则它们将自由地流过0.5微米孔洞到达微孔隙202的正面244。这在试剂添加和在后续测序反应中洗进或洗出不同试剂方面提供增加的灵活性。
图13A至图13B提供使用如图1和图6A至图6C中所描述的微孔或微孔隙的腔室模式的示意性正视图。图13A示出了微孔模式的总览，其中在限定空间306的筒柱304内子部分332为800微米宽x 1200微米长(画为矩形部分)，包含96个具有50微米直径的微孔。子部分332之间使用额外的200微米宽的脊350以提供子部分的分离和额外结构支撑。这些脊表示为矩形子部分332的行与列之间的“白色”区域。在此示意图中，为简单起见，示出了32列x32行；其他实施方案包括48列x 48行，以及64列x 64行。图13B示出了用于在微量滴定板模式中在微孔隙的阵列上进行测序的微流体室的总览。在此示意图中，在限定空间406的筒柱404内示出了32个双列x 32个双行，并且在放大图中，仅示出了2个双列和1个双行的各自包含2,072个微孔隙的子部分432(由白色脊450隔开)；其他实施方案包括48个双列x 48个双行，64个双列x 64个双行；而其他实施方案包括96列x 96行以及128列x 128行。在一个实施方案中，通过入口馈入含有微孔隙的腔室的为一系列个别开口，所述个别开口可为流体封闭的或开放的，以使用声学微滴喷射使试剂、酶、靶标或预扩增靶标向上进入一个列中的所有腔室。可通过从另一侧施加负压(即真空)和/或通过将导管455中的微滴馈入一系列亲水输入室452和导管454以及过渡过分456，随后馈入具有所述列的微孔隙的子部分432来促进流体在使用声学微滴喷射时通过入口402进入个别开口。在此示意图中，每个个别开口连接至亲水输入室452，所述亲水输入室馈入两列含有微孔隙的子部分432。此外，腔室也为流体连接的以允许试剂从一个入口孔进入所有腔室并且在另一侧离开进入单个废料孔或出口孔408。在亲水输入室452适当地用试剂、酶、靶标或预扩增靶标填充后，所述开口关闭，然后通过所述一个入口端添加油或其他试剂以使输入溶液流体移动至微孔隙中用于进一步的反应。
还可考虑微孔或微孔隙的替代配置。通过ThermoFisher(Carlsbad,CA)可获得OpenArray技术。此技术使用具有3,072个通孔的金属显微镜载玻片尺寸板，所述金属显微镜载玻片尺寸板可以多种不同方式加以配置。举例来说，可将板分成48个具有64个通孔或微孔隙的子阵列(每个子阵列呈与传统的384孔微量滴定板相同的间隔。如当前所配置，每个通孔为直径300微米并且300微米深，其中通孔为亲水的或具有亲水涂层，但板的正面和背面具有疏水涂层。因此，经由表面张力水性试剂保留在通孔中。在用适当的扩增和检测引物填充通孔之后，可将这些引物干燥至通孔的内表面上。随后，添加样品、酶以及适当缓冲液将引物溶解，同时在两侧使用疏水液体(即矿物油)将反应物密封在每个通孔中的适当位置。可通过制造具有60微米直径的通孔将此技术延伸，此举将实现每个子阵列约1,225个通孔，每个显微镜载玻片尺寸板总共58,800个通孔或微孔隙。还由ThermoFisher开发的另一系统为QuantStudio 3D数字PCR 20K芯片，所述芯片包含已经蚀刻含有20,000个60微米直径的微孔的硅衬底。添加引物、试剂以及酶，将板密封以使液体分布至微孔中，并且操作反应，限制为芯片上仅可进行单一反应。另一系统由Formulatrix(Bedford,MA)开发并且称为Constellation数字PCR系统。在此系统中，将标准微量滴定板分成24个包含32,000个微孔(约50微米直径)的腔室或96个包含8,000个微孔的腔室。此设计还与使用24个包含200,000个微孔(约20微米直径)的腔室、96个包含50,000个微孔的腔室或384个包含12,500个微孔的腔室相容。每个腔室具有输入孔，所述输入孔流体连接至输入通道，所述输入通道流体连接至许多包括个别分区的连接通道，然后所有连接通道流体连接至输出通道，所述输出通道具有通风孔或空气孔。通道底部为适合于对板密封的透明塑料。将引物、试剂以及酶添加至输入孔中并且流体地泵送穿过输入通道和连接通道，过量移动至输出通道和通风孔中。随后，使用滚筒来压制底部密封物，所述底部密封物阻挡通道，使得每个分区变为适合于热循环和数字PCR读出的分离的微孔。可对此系统进行修改，通过使用压力仅在扩增反应期间暂时阻挡连接通道并且形成分区(微孔)或使用可随后溶解的暂时性密封胶使得底部塑料仅形成临时密封。对于后续测序反应，在个别分区(微孔)中扩增和固定靶标之后，可将底部塑料开封，可使未反应的试剂和未共价固定的产物变性并且洗掉。所得克隆扩增的单链靶标适合于如下文所描述或如本领域中已知的后续边合成边测序反应。
图14提供使用适合于用适当的引物和探针预填充的如图13A中所描述的固体支撑物332中的微孔302的微量滴定板模式500的示意性侧视图。步骤A示出了包含50微米亲水孔并且在每一侧具有脊350的疏水板内的一个腔室的侧视图。在步骤B中，将板上下翻转并且使用声学微滴喷射用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与突变或甲基化特异性TaqmanTM探针)填充。在步骤C中，将板离心，使水性液体散布至空的微孔，而步骤D说明在离心之后，微孔上将形成微滴，因为水溶液避开疏水表面。在步骤E中，水溶液蒸发，孔中留下干燥的引物/探针组(说明于步骤F中)。
图15提供使用如图13图A中所描述的固体支撑物332中的微孔302和脊350并且任选预填充有适当的TaqmanTM或UniTaq引物和探针(如所说明)的微量滴定板模式的示意性侧视图。步骤A示出了包含50微米亲水孔并且在每一侧具有脊的疏水板内的一个腔室的侧视图。在步骤B中，将板上下翻转并且使用声学微滴喷射用适合于实时扩增(即TaqmanTM反应)的试剂和靶DNA填充。可先前已将PCR引物和一个或多个TaqmanTM探针添加至腔室中并且干燥(如图14中所说明)，或者与靶标、酶以及试剂一起添加。在步骤C中，用疏水矿物油覆盖水层。在步骤D中，将板转移至摆动桶转子进行离心。密度更大的水性液体散布至空的微孔。在步骤E中，将板移至热循环器。微滴分离至由矿物油覆盖并且适合于扩增的个别微孔中。
本发明的一个方面是关于一种在样品中鉴定多个核酸分子的方法，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品或其他样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。此方法涉及提供可能含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。提供一个或多个初级寡核苷酸引物组，每个初级寡核苷酸引物组包含(a)第一初级寡核苷酸引物，所述第一初级寡核苷酸引物包含与靠近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，以及(b)第二初级寡核苷酸引物，所述第二初级寡核苷酸引物包含与由第一初级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将所接触的样品与一个或多个初级寡核苷酸引物组、脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶掺混，以形成聚合酶链反应混合物，并且对聚合酶链反应混合物进行一个或多个聚合酶链反应循环，包含变性处理、杂交处理以及延伸处理，由此形成包含靶核苷酸序列或其补体的初级延伸产物。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级PCR反应室中。所述方法还涉及将初级延伸产物与聚合酶和一个或多个二级寡核苷酸引物组掺混以形成二级聚合酶反应混合物。每个二级寡核苷酸引物组包含(a)第一二级寡核苷酸引物，所述第一二级寡核苷酸引物包含5'引物特异性部分和与靠近和/或包含靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，以及(b)第二二级寡核苷酸引物，所述第二二级寡核苷酸引物包含5'引物特异性部分和与由第一二级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将所接触的样品与一个或多个二级寡核苷酸引物组、脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶掺混，以形成聚合酶链反应混合物，并且对聚合酶链反应混合物进行一个或多个聚合酶链反应循环，包含变性处理、杂交处理以及延伸处理，由此形成包含靶核苷酸序列或其补体的初级延伸产物。检测和区分样品中的二级延伸产物序列以鉴定一个或多个核酸分子的存在，所述一个或多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。
图16至图18说明本发明的此方面的各个实施方案。
图16(步骤A-F)说明用于未知病原体鉴定的示例性PCR-PCR-qPCR。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图16(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。使用基因座特异性引物和脱氧核苷酸混合物进行多重PCR扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级PCR反应室中。
如图16步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物并且使用聚合酶(实心菱形)来扩增所关注的含有靶标的区域。如此图步骤C中所说明，可通过在二级引物中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生聚合酶延伸胜任型3’OH基团(图16，步骤C)。第一二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(Ai)，并且第二二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(Ci)，从而容许二级扩增产物的后续扩增。在二级扩增反应之后，使每个初级PCR反应室的延伸产物分布至384或768个含有一个或多个标签特异性引物对的微孔或微孔隙中，每对包含匹配的引物Ai和Ci，PCR扩增，并且检测。如图16步骤E和F中所示，PCR产物的检测可使用传统的TaqmanTM检测分析来执行(参见Whitcombe等的美国专利号6,270,967和Anderson等的美国专利号7,601,821，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。对于使用TaqManTM检测，将跨越靶区域的寡核苷酸探针与适合于在二级PCR产物的引物特异性部分上杂交的引物结合用于扩增和检测。TaqManTM探针含有在一个末端的荧光报导基团(F1)和在另一末端的淬灭剂分子(Q)，在完整探针中它们足够接近地靠近彼此，使得淬灭剂分子淬灭报导基团的荧光。在扩增期间，TaqManTM探针和上游引物杂交至其在连结产物中的互补区域。聚合酶的5'→3'核酸酶活性延伸杂交的引物并且释放TaqManTM探针的荧光基团以产生可检测信号(图16，步骤F)。
图17(步骤A-F)说明用于未知病原体鉴定的示例性PCR-PCR-qPCR。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图17(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。使用基因座特异性引物和脱氧核苷酸混合物进行多重PCR扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级PCR反应室中。
Spier的美国专利申请公布号2011/0212846中充分描述了UniTaq系统，所述专利申请公布以全文引用的方式并入本文中。UniTaq系统涉及使用三个独特的“标签”序列，其中如图17步骤C中所示独特标签序列中的至少一者(Ai)存在于第一寡核苷酸引物中，并且第二和第三独特的标签部分(Bi和Ci)位于第二寡核苷酸引物序列中。在引物组中的寡核苷酸引物的PCR扩增后，所得延伸产物将含有Ai序列-靶标特异性序列-Bi’序列-Ci’序列。UniTaq方法的精髓在于PCR引物组的两种二级寡核苷酸引物需要为正确匹配的组以产生正信号，这允许高度多重核酸检测。举例来说并且如本文所描述，这通过要求两个部分(即两个标签)彼此杂交来实现。
如图17步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物并且使用聚合酶(实心菱形)来扩增所关注的含有靶标的区域。如此图步骤C中所说明，可通过在二级引物中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生聚合酶延伸胜任型3'OH基团(图17，步骤C)。第一二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(Ai)，并且第二二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(Bi、Ci)，从而容许二级扩增产物的后续扩增和检测。在二级扩增反应之后，使每个初级PCR反应室的延伸产物分布至384或768个含有一个或多个标签特异性引物对的微孔或微孔隙中，每对包含匹配的引物(F1-Bi-Q-Ai和Ci)。对于检测，在两条链上使用具有与Ai相同的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物以及与Ci'互补的第二寡核苷酸引物(即Ci)引发含有Ai(第一引物特异性部分)、Bi'(UniTaq检测部分)以及Ci'(第二引物特异性部分)的二级PCR产物。第一寡核苷酸引物还包括UniTaq检测探针(Bi)，所述UniTaq检测探针具有在一个末端的可检测标记F1和在另一末端的淬灭剂分子(Q)(F1-Bi-Q-Ai)。任选定位于淬灭剂近端的为聚合酶阻断单元，例如HEG、THF、Sp-18、ZEN或本领域中已知足以停止聚合酶延伸的任何其他阻断剂。如图17步骤F)中所示PCR扩增使得形成双链产物。在此实例中，聚合酶阻断单元阻止聚合酶拷贝第一通用引物的5'部分(Bi)，使得产物的下链在其变为单链时不能形成发夹。此类发夹的形成将使得茎的3'末端退火至扩增子，使得此3'末端的聚合酶延伸将终止PCR反应。
使双链PCR产物变性，并且当温度随后降低时，产物的上部链形成具有在第一寡核苷酸引物的5'部分(Bi)与在链的相对末端的部分Bi'之间的茎的发夹(图17，步骤G)。另外，在此步骤期间，第二寡核苷酸引物退火至发夹产物的5'-引物特异性部分(Ci’)。在步骤G中第二通用引物的延伸后，聚合酶的5'核酸酶活性将可检测标记D1或淬灭剂分子从扩增子5'末端裂解，由此增加标记与淬灭剂之间的距离并且容许对标记进行检测。
图18(步骤A-F)说明用于未知病原体鉴定的示例性PCR-PCR-qPCR(UniRq)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图18(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。使用基因座特异性引物和脱氧核苷酸混合物进行多重PCR扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级PCR反应室中。
Barany等的美国专利号9,598,728中充分描述了分离探针系统，所述专利以全文引用的方式并入本文中。在本文中，分离探针系统被设计成用于PCR扩增，所述PCR扩增涉及使用四个独特“标签”序列，其中如图18步骤C中所示，第一独特标签序列(Ai)以及第二和第三独特标签部分的分离部分(Bi'、ti')存在于第一二级寡核苷酸引物中，并且第二和第三独特标签部分的其他分离部分(tj和Bj)以及第四独特标签序列(Ci)位于第二二级寡核苷酸引物序列中。在引物组中的寡核苷酸引物的PCR扩增后，所得延伸产物将含有Ai序列-Bi'和ti'序列-靶标特异性序列-ti'，Bj'序列-Ci'序列。分离探针法的精髓为PCR引物组的两个二级寡核苷酸引物需要为正确的以获得正信号，这允许高度多重核酸检测。举例来说并且如本文所描述，这通过要求两个部分(即两个标签)彼此杂交来实现。
如图18步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物并且使用聚合酶(实心菱形)来扩增所关注的含有靶标的区域。如此图步骤C中所说明，可通过在二级引物中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生聚合酶延伸胜任型3’OH基团(图18，步骤C)。第一二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(Ai、Bi’、ti’)，并且第二二级寡核苷酸引物含有5'引物特异性部分(tj、Bj、Ci)，从而容许二级扩增产物的后续扩增和检测。在二级扩增反应之后，使每个初级PCR反应室的延伸产物分布至384或768个含有一个或多个标签特异性引物对的微孔或微孔隙中，每对包含匹配的引物(F1-r-Bj，Bi-Q-Ai和Ci)。对于检测，在两条链上使用具有与Ai相同的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物以及与Ci'互补的第二寡核苷酸引物(即Ci)引发含有Ai(第一引物特异性部分)、Bi'(分离UniTaq检测部分)、ti'(与靶序列互补的区域)、包括内部ti、tj序列的靶序列、tj'(与靶序列互补的区域)、Bi'(分离UniTaq检测部分)以及Ci'(第二引物特异性部分)的二级PCR产物。第一寡核苷酸引物还包括UniTaq检测探针(Bj、Bi加上内部核糖碱基)，所述UniTaq检测探针具有在一个末端的可检测标记F1和在另一末端的淬灭剂分子(Q)(F1-r-Bj，Bi-Q-Ai)。任选定位于淬灭剂近端的为聚合酶阻断单元，例如HEG、THF、Sp-18、ZEN或本领域中已知足以停止聚合酶延伸的任何其他阻断剂。如图18步骤F)中所示PCR扩增使得形成双链产物。在此实例中，聚合酶阻断单元阻止聚合酶拷贝第一通用引物的5'部分(Bj、Bi)，使得产物的下链在其变为单链时不能形成发夹。此类发夹的形成将使得茎的3'末端退火至扩增子，使得此3'末端的聚合酶延伸将终止PCR反应。
使双链PCR产物变性，并且当温度随后降低时，产物的上部链形成在病原体特异性序列(ti和ti'；tj和tj')、Bi和Bi'以及Bj和Bj'之间形成的4个发夹。这使得Bj序列中的核糖碱基为双链的，使RNA酶H2能够使荧光基团F1标记从产物释放，由此增加标记与淬灭剂之间的距离并且容许对标记的检测(图18，步骤G)。分离探针设计的一个优点在于由引物二聚体形成所产生的伪产物，即(F1-r-Bj，Bi-Q-Ai-Bi’-ti’-引物二聚体-tj’，Bj’-Ci’)将不给出伪正信号，因为它将不形成ti和ti’；tj和tj’发夹，仅留下Bi和Bi’茎以及r-Bj和Bj’序列，这些序列在用于扩增反应的杂交温度下将不形成茎。
本发明的另一方面是关于一种在样品中鉴定多个核酸分子的方法，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品或其他样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。此方法涉及提供可能含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。提供一个或多个初级寡核苷酸引物组，每个初级寡核苷酸引物组包含(a)第一初级寡核苷酸引物，所述第一初级寡核苷酸引物包含与靠近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，以及(b)第二初级寡核苷酸引物，所述第二初级寡核苷酸引物包含与由第一初级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将所接触的样品与一个或多个初级寡核苷酸引物组、脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶掺混，以在初始反应室中形成聚合酶链反应混合物，并且对聚合酶链反应混合物进行一个或多个聚合酶链反应循环，包含变性处理、杂交处理以及延伸处理，由此形成包含靶核苷酸序列或其补体的初级延伸产物。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级LDR反应室中。所述方法还涉及将初级延伸产物与连结酶以及一个或多个寡核苷酸探针组掺混以形成连结反应混合物。每个寡核苷酸探针组包含(a)具有靶核苷酸序列特异性部分的第一寡核苷酸探针，以及(b)具有靶核苷酸序列特异性部分的第二寡核苷酸探针，其中探针组的第一和第二寡核苷酸探针被配置成以碱基特异性方式彼此靠近杂交于初级延伸产物的互补靶核苷酸序列上，它们之间具有接点。使一个或多个寡核苷酸探针组的第一和第二寡核苷酸探针连结在一起以形成连结反应混合物中的连结产物序列，并且检测和区分样品中的连结产物序列以鉴定一个或多个核酸分子的存在，所述一个或多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列和/或一个或多个甲基化残基。
图19至图23说明本发明的此方面的各个实施方案。
图19(步骤A-F)说明用于未知病原体鉴定的示例性PCR-LDR-qPCR(TaqmanTM)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图19(步骤B)中所示，在初始PCR反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。使用基因座特异性引物和脱氧核苷酸混合物进行多重PCR扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增所关注的区域。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级LDR反应室中(步骤C)。
如图19步骤D中所示，使靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物并且连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起。上游寡核苷酸探针含有5'引物特异性部分(Ai)，并且下游寡核苷酸探针含有3'引物特异性部分(Ci')，从而容许连结产物的后续扩增。在连结之后，使来自每个初级LDR反应室的连结产物分布至384或768个含有一个或多个标签特异性引物对的微孔或微孔隙中，每对包含匹配的引物Ai和Ci，PCR扩增，并且检测。如图19步骤E和F中所示，连结产物的检测可使用传统的TaqManTM检测分析来执行(参见Whitcombe等的美国专利号6,270,967和Anderson等的美国专利号7,601,821，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。对于使用TaqManTM检测，将跨越连结接点的寡核苷酸探针与适合于杂交于连结产物的引物特异性部分上的引物结合用于扩增和检测。TaqManTM探针含有在一个末端的荧光报导基团(F1)和在另一末端的淬灭剂分子(Q)，在完整探针中它们足够接近地靠近彼此，使得淬灭剂分子淬灭报导基团的荧光。在扩增期间，TaqManTM探针和上游引物杂交至其在连结产物中的互补区域。聚合酶的5'→3'核酸酶活性延伸杂交的引物并且释放TaqManTM探针的荧光基团以产生可检测信号(图19，步骤F)。
图20说明用于未知病原体鉴定的另一示例性PCR-LDR-qPCR(UniTaq)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图20(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。在此实施方案中，将连结探针设计成含有UniTaq引物和标签序列以促进检测。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级LDR反应室中(步骤C)。
Spier的美国专利申请公布号2011/0212846中充分描述了UniTaq系统，所述专利申请公布以全文引用的方式并入本文中。UniTaq系统涉及使用三个独特的“标签”序列，其中如图20步骤D中所示独特标签序列中的至少一者(Ai)存在于第一寡核苷酸探针中，并且第二和第三独特标签部分(Bi'和Ci')位于第二寡核苷酸探针序列中。在探针组中的寡核苷酸探针的连结后，所得连结产物将含有Ai序列-靶标特异性序列-Bi'序列-Ci'序列。UniTaq方法的精髓在于连结探针组的两个寡核苷酸探针需要为正确的以得到正信号，这允许高度多重核酸检测。举例来说并且如本文所描述，这通过要求两个部分(即两个标签)彼此杂交来实现。
在连结之后，使每个初级LDR反应室的连结产物分布至384或768个含有适当UniTaq引物对的微孔或微孔隙中(图20，步骤E)。对于检测，在两条链上使用具有与Ai相同的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物以及与Ci’互补的第二寡核苷酸引物(即Ci)引发含有Ai(第一引物特异性部分)、Bi'(UniTaq检测部分)以及Ci’(第二引物特异性部分)的连结产物。第一寡核苷酸引物还包括UniTaq检测探针(Bi)，所述UniTaq检测探针具有在一个末端的可检测标记F1和在另一末端的淬灭剂分子(Q)(F1-Bi-Q-Ai)。任选定位于淬灭剂近端的为聚合酶阻断单元，例如HEG、THF、Sp-18、ZEN或本领域中已知足以停止聚合酶延伸的任何其他阻断剂。如图20步骤F)中所示PCR扩增使得形成双链产物。在此实例中，聚合酶阻断单元阻止聚合酶拷贝第一通用引物的5'部分(Bi)，使得产物的下链在其变为单链时不能形成发夹。此类发夹的形成将使得茎的3'末端退火至扩增子，使得此3'末端的聚合酶延伸将终止PCR反应。
使双链PCR产物变性，并且当温度随后降低时，产物的上部链形成具有在第一寡核苷酸引物的5'部分(Bi)与在链的相对末端的部分Bi'之间的茎的发夹(图20，步骤G)。另外，在此步骤期间，第二寡核苷酸引物退火至发夹产物的5'-引物特异性部分(Ci’)。在步骤G中第二通用引物的延伸后，聚合酶的5'核酸酶活性将可检测标记D1或淬灭剂分子从扩增子5'末端裂解，由此增加标记与淬灭剂之间的距离并且容许对标记进行检测。
图21说明用于未知病原体鉴定的另一示例性PCR-LDR-qPCR(UniSpTq)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图20(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。在此实施方案中，将连结探针设计成含有分离探针和标签序列以促进检测。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至24、36或48个初级LDR反应室中(步骤C)。
Barany等的美国专利号9,598,728中充分描述了分离探针系统，所述专利以全文引用的方式并入本文中。分离探针系统涉及使用四个独特“标签”序列，其中如图21步骤D中所示，第一独特标签序列(Ai)以及第二和第三独特标签部分的分离部分(Bi'、zi)存在于第一寡核苷酸探针中，并且第二和第三独特标签部分的其他分离部分(zi'、Bj')以及第四独特标签序列(Ci')位于第二寡核苷酸探针序列中。在探针组中的寡核苷酸探针的连结后，所得连结产物将含有Ai序列-Bi'和zi序列-靶标特异性序列-zi'，Bj'序列-Ci'序列。分离探针法的精髓在于连结探针组的两个寡核苷酸探针需要为正确的以获得正信号，这允许高度多重核酸检测。举例来说并且如本文所描述，这通过要求两个部分(即两个标签)彼此杂交来实现。
在连结之后，使每个初级LDR反应室的连结产物分布至384或768个含有适当UniTaq引物对的微孔或微孔隙中(图21，步骤E)。对于检测，在两条链上使用具有与Ai相同的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物以及与Ci'互补的第二寡核苷酸引物(即Ci)引发含有Ai(第一引物特异性部分)、Bi’(第一分离探针检测部分)、Bj’(第二分离探针检测部分)以及Ci’(第二引物特异性部分)的连结产物。第一寡核苷酸引物还包括UniTaq检测探针(Bj、Bi)，所述UniTaq检测探针具有在一个末端的可检测标记F1以及在另一末端的淬灭剂分子(Q)(F1-Bj，Bi-Q-Ai)。任选定位于淬灭剂近端的为聚合酶阻断单元，例如HEG、THF、Sp-18、ZEN或本领域中已知足以停止聚合酶延伸的任何其他阻断剂。如图21，步骤F)中所示PCR扩增使得形成双链产物。在此实例中，聚合酶阻断单元阻止聚合酶拷贝第一通用引物的5'部分(Bj、Bi)，使得产物的下链在其变为单链时不能形成发夹。此类发夹的形成将使得茎的3'末端退火至扩增子，使得此3'末端的聚合酶延伸将终止PCR反应。
使双链PCR产物变性，并且当温度随后降低时，产物的上部链在Bi和Bi'、zi和zi'以及Bj和Bj'之间形成3个发夹(图21，步骤G)。另外，在此步骤期间，第二寡核苷酸引物退火至发夹产物的5'-引物特异性部分(Ci')。在步骤G中第二通用引物的延伸后，聚合酶的5'核酸酶活性将可检测标记D1或淬灭剂分子从扩增子5'末端裂解，由此增加标记与淬灭剂之间的距离并且容许对标记进行检测。一旦聚合酶已穿过Bj’，短zi-zi’茎就破裂并且聚合酶持续延伸以形成dsDNA产物。
UniTaq探针与分离探针法两者均提供允许在适当微孔隙或微孔中印刷标准引物/探针组的优点。注意，Ci引物将形成下游LDR探针的拷贝，这与它是否连结形成产物或仍未连结无关。如果使用UniTaq探针设计所述延伸产物在不存在靶标的情况下与上游探针/引物形成引物二聚体，则此类产物(F1-Bi-Q-Ai-部分靶标-Bi'-Ci')将允许在杂交温度下形成Bi和Bi'发夹，然后给出伪正信号。分离探针设计的一个优点为此类伪产物(F1-Bj，Bi-Q-Ai-部分靶标-zi'，Bj'-Ci')将不给出伪正信号，因为它将不形成Bi和Bi'、zi和zi'发夹，仅留下Bj和Bj'序列，所述序列在用于扩增反应的杂交温度下将不形成茎。
如以下在图22和图23中所例示，还可以称为PCR-qLDR的方法使用连结产物直接产生信号。Barany等的WO/2016/057832中描述了一种此类方法，所述专利以全文引用的方式并入本文中，该方法使用在连结之后产生FRET或荧光信号的连结检测探针。
在一个实施方案中，分别地，第一连结探针含有3'靶标特异性区域和具有供体或受体部分的5'尾部序列，并且探针组中的第二连结探针含有5'靶标特异性区域和具有受体或供体部分的3'尾部序列。探针组中的连结探针的5'和3'尾部序列彼此互补，并且受体和供体基团在紧密地靠近彼此时经由福斯特共振能量传递(
Resonance EnergyTransfer，FRET)产生可检测信号。在连结之后，将未连结的寡核苷酸探针洗掉，并且从固定化扩增产物使连结产物变性。在变性后，使连结产物的互补5'和3'尾部序列彼此杂交，从而使供体和受体基团紧密地靠近彼此以产生可检测FRET信号。
在另一实施方案中，上游探针在5'末端可含有荧光报导基团，随后为尾部序列部分、淬灭基团(例如ZEN)以及靶标特异性部分。在单链形式中，荧光基团由Zen基团淬灭。在上游和下游连结探针的连结以及所得连结产物的变性后，使连结产物的互补5'和3'尾部部分杂交以形成短双链部分。在这些条件下，报导基团不再由淬灭基团淬灭并且产生可检测信号。这称为杂交非淬灭探针(HuQP)。
不需要PCR的qLDR方法称为“用于SNP检测的多重连结酶反应和探针裂解”-(Kim,“PCR Free Multiple Ligase Reactions and Probe Cleavages for the SNP Detectionof KRAS Mutation with Attomole Sensitivity,”Analyst 141(16):6381-6386(2016)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。在此方法中，如果在接点处与靶标存在完美互补性，则两个引物杂交至靶标并且连结至靶标上。两个引物还在其非连结3'和5'末端含有非互补序列。在连结之后，连结产物(LP)与链置换发夹(SDH)复合，因为LP与SDH的熔解温度(Tm)比与靶标的高。游离靶标然后可再循环以在两个引物存在下进行新的连结。向连结酶反应中添加SDH允许两个引物在等温条件期间对每个单个靶标的多次酶连结。为产生可检测信号，在SNP特异性连结后使用金纳米粒子进行改良的循环探针分析(AuNP)。在循环探针分析中，将在任一末端具有荧光供体和淬灭剂的靶标结合嵌合探针用RNA酶H消化。RNA酶H仅在其存在于RNA-DNA异源双链体中时裂解RNA磷酸二酯键；它不消化异源双链体中的DNA，它也不消化单链或双链RNA或DNA。将循环探针分析设计成利用RNA酶H的这些特性。当靶标DNA链在RNA降解后变得游离时，另一完整RNA分子可与DNA杂交，从而引起线性信号扩增。
图22说明用于未知病原体鉴定的另一示例性PCR-qLDR(UniLDq)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图22(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。在此实施方案中，将连结探针设计成含有标签序列以促进检测。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至384或768个微孔或微孔隙中(步骤C)。
病原体特异性连结寡核苷酸具有标签(Bi’-ti’-上游靶序列；下游靶序列-tj’-Bj’)用于后续检测。在连结接点处ti'和tj'序列与靶标中的序列ti、tj互补。当检测特异性SNP或突变时，阻断LNA或PNA野生型探针抑制与野生型序列连结。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3'OH基团(图22，步骤D)。在靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物并且任选RNaseH步骤释放3'OH基团后，连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起(图22，步骤E)。
在存在探针(F1-r-Bj，Bi-Q)的情况下并且在变性步骤之后，当温度降低时，探针与病原体特异性序列(ti和ti'；tj和tj')、Bi和Bi'以及Bj和Bj'之间形成4个双链茎。这使得Bj序列中的核糖碱基为双链的，使RNA酶H2能够释放荧光基团并且产生信号(图22，步骤F)。裂解的探针从产物解离并且新的探针可杂交以产生额外的信号。未连结的LDR引物将不形成所有发夹，并且因此RNA酶H2将不释放信号。在此方法的一个实施方案中，在PCR反应之后，使产物分布至微孔或微孔隙中，所述微孔或微孔隙已含有靶标特异性LDR引物以及一个或多个通用探针。
图23说明用于未知病原体鉴定的另一示例性PCR-qLDR(TsLDG)。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。如果病原体为RNA病毒，则使用初始逆转录酶步骤来产生cDNA。如图23(步骤B)中所示，在初始反应室中对样品进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。在此实施方案中，将连结探针设计成含有标签序列以促进检测。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。使初始PCR产物分布至384或768个微孔或微孔隙中(步骤C)。
病原体特异性连结寡核苷酸具有标签(Bi’-上游靶序列；下游靶序列-tj’)用于后续检测。在连结接点处tj'序列与靶标中的tj序列互补。当检测特异性SNP或突变时，阻断LNA或PNA野生型探针抑制与野生型序列连结。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3'OH基团(图23，步骤D)。在靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物并且任选RNaseH步骤释放3'OH基团后，连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起(图23，步骤E)。
在存在探针(F1-r-病原体序列-Bi-Q)的情况下并且在变性步骤之后，随温度降低，病原体特异性序列(ti、tj以及ti'、tj')以及Bi和Bi'之间形成2个双链茎。这使得病原体序列中的核糖碱基为双链的，使RNA酶H2能够释放荧光基团并且产生信号。裂解的探针从产物解离并且新的探针可杂交以产生额外的信号。未连结的LDR引物将不形成两个茎，并且因此RNA酶H2将不释放信号。在此方法的一个实施方案中，在PCR反应之后，使产物分布至微孔或微孔隙中，所述微孔或微孔隙已含有靶标特异性LDR引物以及一个或多个病原体序列特异性探针。
使用可裂解探针(cP)的qLDR产生的信号比使用用FRET探针或杂交非淬灭(HuQP)探针进行的LDR时多到什么程度。后者产生作为循环的函数的线性信号，即如果操作“X”个LDR循环，则产生的荧光信号的量“F”与X成比例；即F＝f(X)。当如图22和图23中使用可裂解探针时，产生的信号的量为单一LDR循环期间的探针裂解次数“C”与循环次数X两者的函数；即F＝f(X)(X-1)C。在实践水平上，50个循环的LDR-FRET或LDR-HuQP将给出具有50倍信号变化的动态范围，而50个循环的LDR-cP将给出具有1,225倍信号变化的动态范围。
图24为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-UniTaq检测的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重PCR-巢式PCR-实时PCR)，用于未知病原体鉴定和定量。在图24中，输入样品流体连接至六边形室16(含有槽18；底部，初始反应室)，所述六边形室16通过导管20流体连接至六方形室22(含有大槽24和挡板23，初级PCR反应室)，所述六方形室22通过导管26流体连接至长较窄混合室28，所述长较窄混合室28通过导管30流体连接至包含具有微孔或微孔隙的子部分32的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将子部分行用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在制造筒柱期间，将向上通往微孔或微孔隙的所述列的初级PCR反应室用在5'末端具有UniTaq或通用标签序列的巢式PCR引物组预填充。图式右侧的灰色圆形25说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷探针组的可能位置。在此说明性实例中，示出了所计划的24列32行(各4个)等于768个子部分，每个子部分包含24个微孔或微孔隙，初始多重PCR扩增(或对于RNA靶标为逆转录PCR)持续9个循环以在初始反应室中产生每个原始靶标的最多512个拷贝。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，并且将初始多重反应物分至初级PCR反应室(如上文所描述用巢式PCR引物预填充)中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体的20个拷贝。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有UniTaq或通用标签的靶标特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行5个循环的巢式PCR，以产生每个初级PCR反应室每个病原体特异性靶标平均640个拷贝。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的巢式PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。微孔隙中的泊松分布将计数最初以低丰度存在的病原体特异性靶标，而每个子部分中的微孔隙的Ct值将提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
还可使用图24的筒柱设计来进行多重PCR-LDR-UniTaq检测。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重PCR-LDR-实时PCR)，用于未知病原体鉴定和定量。在制造筒柱期间，将向上通往各列微孔或微孔隙的初级LDR反应室用在非连结5'(上游)和3'(下游)末端具有UniTaq或通用标签序列的LDR探针组预填充。图式右侧的灰色圆形25说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷探针组的可能位置。将探针干燥，并且组装筒柱的覆盖部分以将探针组密封在其适当位置。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始反应室向上穿过初级LDR反应室、混合室，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上流体移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的24列(4个)和32行(8个)等于768个子部分，每个子部分包含24个微孔或微孔隙，初始多重PCR扩增(或对于RNA靶标为逆转录PCR)持续30个循环以在初始反应室中扩增原始靶标。将聚合酶去活化(例如通过加热杀死或蛋白酶消化)，将多重产物稀释10倍至包含连结酶、ATP或NAD的连结酶反应混合物中，并且分布至初级LDR反应室(如上文所描述用LDR探针预填充)中。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的PCR引物和/或LDR上游探针仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有UniTaq或通用标签的等位基因特异性探针以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。添加新鲜PCR试剂，与每个初级LDR反应室的LDR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。每个子部分中的24个微孔隙的Ct值将提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
在一个替代实施方案中，使用48列和48行等于2,304个子部分，每个子部分包含96个微孔，通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷将1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)直接递送至每一行中的适当子部分，然后干燥至个别微孔中。初始多重PCR扩增(或对于RNA靶标为逆转录PCR)持续10个循环以在初始反应室或孔中产生每个原始靶标的最多1,024个拷贝。如果需要，则使用“串联”PCR引物。添加新鲜PCR试剂，并且使初始多重反应物分布至48个孔或初级PCR反应室(具有使用声学微滴喷射添加的巢式PCR引物)中，每个孔或初级PCR反应室平均分布每个原始病原体的20个拷贝。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有UniTaq或通用标签的靶标特异性引物以24或48个引物组的群组进行3-4个巢式PCR循环，以产生每个孔或初级PCR反应室每个病原体特异性靶标平均160-320个拷贝。添加新鲜PCR试剂，与每个孔或初级PCR反应室的巢式PCR产物混合，并且使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至2组或4组分别含有96个微孔的24或12个子部分中。当使用2组时，第二组为第一组的100/1稀释。当使用4组时，每一组为前一组的20/1稀释。这允许涵盖以许多数量级存在的病原体。每个初始子部分平均将得到每个原始病原体的12个拷贝，给定微孔得到原始病原体的一个或零个拷贝。如果病原体以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。96个微孔中的泊松分布将计数最初以低丰度存在的病原体特异性靶标，而子部分中微孔的Ct值将提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
图25A至图25B为用于以下情况的筒柱4、阀门以及试剂设置的示意性侧视图：用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针使用多重PCR-巢式PCR-实时PCR鉴定和定量未知病原体；用UniTaq或突变-特异性TaqmanTM探针使用多重PCR-LDR-实时PCR鉴定和定量血浆中的低水平未知突变；以及用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针使用多重PCR-LDR-实时PCR鉴定和定量血浆中的低水平甲基化和未知突变。图25A为说明微通道流体连接至具有50微米直径的微孔或微孔隙的阵列的示意性正视图。为简单起见，所述图说明一个初始多重反应室10、16个具有槽18的初级多重PCR反应室16、16个具有槽24和挡板23的二级多重反应室22、16个窄混合室28以及一个包含具有16个列以及数千个微孔隙或微孔的子部分32的主室。如图所示这些腔室通过导管14、20、26以及30连接在一起。流体通过入口2进入筒柱4并且通过出口8离开。然而，也可使用其他腔室配置，例如描述于图24中的用于病原体检测的多重PCR-巢式PCR-实时PCR将不需要二级多重反应室。图25B说明使用由数千个微孔隙202组成的微孔隙板系统(如图11至图12中总体描述)用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针进行多重PCR-巢式PCR-实时PCR的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4和5连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过初始多重反应室、初级PCR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、PCR反应室以及初始多重反应室。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配初始多重PCR引物、PCR预混液、初始逆转录引物、逆转录预混液、洗涤物、EtOH以及空气，穿过初始多重反应室、PCR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门4分配空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门5到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门5反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表3：多重PCR-巢式PCR-实时PCR的试剂设置
图25B说明若干加热元件1-4，所述加热元件1-4将被设计成向初始多重反应室10、初级24-48个多重PCR反应室16、二级24-48个多重反应室22以及包含子部分32的24-48列和数千个微孔隙或微孔202的主室28提供独立加热/冷却。可将背面板206(与正面板204相对)或一个或多个微孔隙或微孔通道240和242的一个或多个平面表面244和246以及反应室压在这些加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。如图25中所说明，初级24-48个多重PCR反应室16、二级24-48个多重反应室22后面的两个加热元件将被设计成两个矩形(水平)条带以独立于所有二级室对所有初级室进行控制。还可使用替代配置，例如对于任一腔室/或者初始反应室10、初级室16、二级室22、混合室28以及包含具有数千个微孔或微孔隙的子部分的主室，使每个初级室具有独立加热元件、使额外行的腔室(即初级、二级、三级等)具有额外行的加热元件和/或使24-48空间多重排列呈不同于行或列的几何形状。举例来说，板可包含24个单独输入孔，每个输入孔流体连接至个别初级多重PCR反应室16、个别二级多重反应室22、个别混合室28以及包含具有数百至数千个微孔隙或微孔的子部分的个别腔室。样品可经历任选的初始多重反应，然后经由声学微滴喷射或其他流体方式输入24个个别输入孔。
图26(步骤A-F)说明用于直接从血液进行未知细菌病原体鉴定的示例性PCR-PCR-qPCR。此方法如步骤A中所示通过分离病原体基因组DNA开始。任何直接从血液对细菌的预捕获(即通过使用适配体或抗体)均将有助于检测。挑战为使罕见细菌DNA从大量过量的WBCDNA中扩增出来。如图26(步骤B)中所示，使样品分布至24、36或48个初级PCR反应室中，对其中的每一者进行扩增反应，例如聚合酶链反应(PCR)以扩增所关注的含有靶标的区域。使用靶标特异性引物和脱氧核苷酸混合物进行多重PCR扩增反应。任选地，使用链置换聚合酶，以及用于每个靶标的串联引物或多个引物。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)。在另一实施方案中，引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体扩增。
如图26步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物并且在二级PCR反应室中使用聚合酶(实心菱形)扩增所关注的含有靶标的区域。如此图步骤C中所说明，可通过在二级引物中包括3'可裂解阻断基(Blk3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生聚合酶延伸胜任型3'OH基团(图26，步骤C)。在巢式引物扩增之后，使每个二级PCR反应室的产物分布至384或768个微孔或微孔隙中。可如上文关于图16所描述使用匹配引物对Ai和Ci以及跨越连结接点的TaqmanTM探针来检测PCR产物(参见图26，步骤D-F)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
图27(步骤A-F)说明用于直接从血液进行未知细菌病原体鉴定的另一示例性PCR-PCR-qPCR。此方法与图26中所说明相同以靶核酸初始分布至初级PCR反应室中和多重PCR扩增开始，除了它使用UniTaq读出。
如图27步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物并且在二级PCR反应室中使用聚合酶(实心菱形)扩增所关注的含有靶标的区域。如此图步骤C中所说明，可通过在二级引物中包括3'可裂解阻断基(Blk3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生聚合酶延伸胜任型3’OH基团(图27，步骤C)。在巢式引物扩增之后，使每个二级PCR反应室的产物分布至384或768个微孔或微孔隙中。使用UniTaq特异性引物(即，F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增PCR产物并且如上文关于图17所描述进行检测(参见图27，步骤D-G)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
还可使用图24的筒柱设计直接从血液进行未知细菌病原体的多重PCR-巢式PCR-UniTaq检测。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重PCR-巢式PCR-实时PCR)。在制造筒柱期间，将各行用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始反应室向上穿过初级PCR反应室、混合室，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上流体移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，在24列和32行等于768个子部分，每个子部分包含24个微孔或微孔隙的情况下，将样品分至24列中，并且用链置换聚合酶以及大组的具有10-12bp尾部的串联引物或更多引物组进行初始多重PCR扩增，持续20个循环以产生每个原始靶标的1,000,000个拷贝(如果存在)。含有RNA碱基和3'阻断基的巢式引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有UniTaq或通用标签的靶标特异性引物以16、32或64个引物组的群组在每个初级PCR反应室中进行10个巢式PCR循环。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的巢式PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔或微孔隙。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。对靶标进行预扩增和使用尾部来防止引物二聚体形成将允许在单细胞水平鉴定细菌病原体。
在一个替代实施方案中，使用48列和48行等于2,304个子部分，每个子部分包含96个微孔，通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷将1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)直接递送至每一行中的适当子部分，然后干燥至个别微孔中。使初始样品分布至48个孔中。在孔或初始反应室中进行9个多重PCR循环，每个原始病原体最多512个拷贝(如果存在)。使用“串联”PCR引物或更多PCR引物组。另外，所有PCR引物包括相同的5'尾部序列，优选为10-12个碱基以抑制引物二聚体的扩增。每个初始子部分平均将得到每个原始病原体的10个拷贝，给定微孔得到原始病原体的一个或零个拷贝。如果病原体以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。96个微孔中的泊松分布将计数最初以低丰度存在的病原体特异性靶标，而微孔的Ct值将提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
图28说明用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR反应(加上任选的遗留预防)。分离基因组或cfDNA(图28，步骤A)，并且在PCR之前分布至24、36、48或64个孔或初级PCR反应室中。将分离的DNA样品任选用UDG处理以消化可存在于样品中的含有dU的核酸分子(图28，步骤B)。使用基因座特异性上游引物、基因座特异性下游引物、包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针以及任选包括dUTP的脱氧核苷酸混合物将所关注的区域选择性扩增。在此实施方案中，可通过在上游引物中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以释放3’OH基团，3’OH基团在突变上游的几个碱基处，并且适合于聚合酶延伸(图28，步骤B)。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针将优先于上游引物竞争结合于野生型序列，但不同样多地结合于突变体DNA，并且因此抑制野生型DNA在各轮PCR期间的扩增。扩增的产物如图28步骤C中所示任选含有dU，这允许随后用UDG或类似酶处理用于遗留预防。使来自每个初级PCR反应室的产物分布至对应二级LDR反应室中。
如图28步骤D中所示，使靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物，并且连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起。在此实施方案中，具有对检测所关注的突变具特异性的序列的上游寡核苷酸探针还含有5'引物特异性部分(Ai)以促进连结产物的后续检测。再一次，在PCR扩增步骤期间在突变体序列富集之后，包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针的存在抑制与野生型靶序列(如果存在)的连结。具有突变体与野生型序列共同拥有的序列的下游寡核苷酸探针含有3'引物特异性部分(Ci')，所述3'引物特异性部分与具有对检测突变具特异性的序列的上游探针的5'引物特异性部分(Ai)一起容许仅突变体连结产物的后续扩增和检测。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3’OH基团(图28，步骤D)。在连结之后，使每个二级LDR反应室的产物分布至384或768个微孔或微孔隙中。可如上文关于图19所描述使用匹配引物对Ai和Ci以及跨越连结接点的TaqmanTM探针检测连结产物(参见图28，步骤E-G)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
图29说明用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR反应(加上任选的遗留预防)。分离基因组或cfDNA(图29，步骤A)，并且在PCR之前分布至24、36、48或64个孔或初级PCR反应室中。将分离的DNA样品任选用UDG处理以消化可存在于样品中的含有dU的核酸分子(图29，步骤B)。将上游基因座特异性引物设计成位于突变上游几个碱基处，并且包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以释放适合于聚合酶延伸的3’OH(图29，步骤B)。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针将优先于上游引物竞争结合于野生型序列，但不同样多地结合于突变体DNA，并且因此抑制野生型DNA在各轮PCR期间的扩增。扩增的产物如图29步骤C中所示任选含有dU，这允许随后用UDG或类似酶处理用于遗留预防。使来自每个初级PCR反应室的产物分布至对应二级LDR反应室中。
如图29步骤D中所示，使靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物，并且连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起。在此实施方案中，具有对检测所关注的突变具特异性的序列的上游寡核苷酸探针还含有5'引物特异性部分(Ai)以促进连结产物的后续检测。再一次，在PCR扩增步骤期间在突变体序列富集之后，包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针的存在抑制与野生型靶序列(如果存在)的连结。具有突变体与野生型序列共同拥有的序列的下游寡核苷酸探针含有3'引物特异性部分(Bi'-Ci')，所述3'引物特异性部分与具有对检测突变具特异性的序列的上游探针的5'引物特异性部分(Ai)一起容许仅突变体连结产物的后续扩增和检测。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3’OH基团(图29，步骤D)。在连结之后，使每个二级LDR反应室的产物分布至384或768个微孔或微孔隙中。使用UniTaq特异性引物(即，F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连结产物并且如上文关于图20所描述进行检测(参见图29，步骤E-H)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
图30为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-LDR-UniTaq检测，用于鉴定和定量血浆中的低水平未知突变的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用用突变特异性TaqmanTM探针进行的多重PCR-LDR-实时PCR)。在图30中，输入样品通过入口12流体连接至初始反应室10(底部)并且与其中的适当试剂混合。初始反应室10(底部)通过导管14流体连接至第一组的六方形室16(含有小槽18，初级PCR反应室)，所述六方形室16通过导管20流体连接至第二组的六方形室22(含有大槽24和挡板23，二级LDR反应室)，所述六方形室22通过导管26流体连接至长较窄混合室28，所述长较窄混合室28通过导管30流体连接至包含具有微孔或微孔隙的子部分32的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将各行用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在制造筒柱期间，将向上通往微孔或微孔隙的子部分的列的二级LDR反应室22任选用在非连结5'(上游)和3'(下游)末端具有UniTaq或通用标签序列的LDR探针组预填充。图式左侧的灰色圆形25说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷探针组的可能位置。将探针干燥，并且组装筒柱的覆盖部分以将探针组密封在其适当位置。或者，当在每个前腔室中使用相同LDR引物组时，它们可在PCR步骤之后添加，不需要起初将其印刷在筒柱中。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始反应室10向上流体移动穿过初级PCR反应室16，穿过二级LDR反应室22，并且最终沿混合室28向上并且穿过各列子部分32的微孔或微孔隙，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的24列和32行(各4个)等于768个子部分，每个子部分包含24个微孔或微孔隙，在初始初级PCR反应室16中的每一者中在存在抑制野生型序列扩增但不抑制突变体序列扩增的PNA或LNA的情况下重复初始多重PCR扩增持续10-40个循环。在另一实施方案中，为使多重PCR期间片段的脱扣降至最低程度，在初始反应室10中进行初始“预扩增”多重PCR持续8-20个循环。然后使这些产物分布至初级PCR反应室16中。在一种变化形式中，初级反应室中的每一者含有1-4个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行单一或多重PCR再持续10-30个循环，以在单一初级反应室中实现含有潜在突变的1-4个不同片段的扩增。在另一变化形式中，6组4个初级反应室含有4-16个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行多重PCR再持续10-30个循环，以在单一初级反应室中实现含有潜在突变的4-16个不同片段的扩增。将聚合酶去活化(例如通过加热杀死或蛋白酶消化)，将每个腔室的多重产物稀释10倍至包含连结酶、ATP或NAD的连结酶反应混合物中，并且分布至对应二级LDR反应室22(如上文所描述用LDR探针预填充)中。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的PCR引物和/或LDR上游探针仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有UniTaq或通用标签的等位基因特异性探针以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。可设计用于相同基因的不同突变的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。添加新鲜PCR试剂，与每个二级LDR反应室22的LDR产物混合，并且分布在混合室28中，然后进入每一列的微孔隙。每一行的每个子部分中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。所述列中的每一者中存在或不存在特异性突变允许计数血浆中的低水平突变的数目。
在一个替代实施方案中，使用48列和48行等于2,304个子部分，每个子部分包含96个微孔，通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷将1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)直接递送至每一行中的适当子部分，然后干燥至个别微孔中。使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室16中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室16每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。在阻断PNA或LNA以减少野生型DNA扩增的情况下进行10-40个基因座特异性PCR循环。任选：在PCR反应期间使用dUTP(并且用UDG预处理以避免初始样品的遗留污染)。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的PCR引物和/或LDR上游探针仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。另外，所有下游PCR引物包括相同的5'尾部序列，优选为8-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。在另一实施方案中，为使多重PCR期间片段的脱扣降至最低程度，在初始孔或反应室中进行初始“预扩增”多重PCR持续8-20个循环。然后使这些产物分布至48个孔或初级PCR反应室16中。在一种变化形式中，48个孔或初级反应室中的每一者含有1-4个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行单一或多重PCR再持续10-30个循环，以在单一孔或初级反应室中实现含有潜在突变的1-4个不同片段的扩增。在另一变化形式中，12组4个初级反应室含有4-16个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行多重PCR再持续10-30个循环，以在单一孔或初级反应室中实现含有潜在突变的4-16个不同片段的扩增。用LDR引物和缓冲液将每个孔的产物稀释。使用具有UniTaq尾部的等位基因特异性引物以16、32或64个引物组的群组在孔或二级LDR反应室22中进行20个LDR循环。可设计用于相同基因的不同突变的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。可在同一反应室中或在2个单独反应室中进行LDR反应，然后再组合。添加UniTaq预混液和UDG并且使每个孔或二级LDR反应室22的产物分布至分别含有96个微孔隙的48个子部分中。子部分已用适当的UniTaq引物和/或探针预点样；(参见图28和图29)。使用预点样的引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
还可使用图25的筒柱和阀门设置用UniTaq或突变特异性TaqmanTM探针使用进行多重PCR-LDR-实时PCR来定量血浆中的低水平未知突变。此图还说明使用由数千个微孔隙组成的微孔隙板用UniTaq或突变特异性TaqmanTM探针进行多重PCR-LDR-实时PCR的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4和5连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过初始24-48个多重PCR反应室、24-48个LDR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、LDR反应室以及初始多重PCR反应室。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配初始多重PCR引物、任选LDR引物、PCR预混液、LDR预混液、UDG预混液、缓冲液、洗涤物、EtOH以及空气，穿过初始24-48个多重PCR反应室、24-48个LDR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门4分配空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门5到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门5反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表4：多重PCR-LDR-实时PCR的试剂设置
| 端口 | 阀门1 | 阀门2 | 阀门4 | 阀门3/5 | |
| 1 | 溶解/蛋白酶缓冲液 | 初始PCR引物 | 空气 | 废料 | |
| 2 | 洗涤物 | 任选LDR探针 | 轻油 | 空气 | |
| 3 | 洗脱缓冲液 | PCR预混液 | 重油 | 或连接 | |
| 4 | 来自阀门2的酶/引物 | LDR预混液 | 空的 | 空气/废料 | |
| 5 | 空的(混合前) | UDG预混液 | 阀门1/4 | ||
| 6 | 废料 | 缓冲液 | |||
| 7 | 缓冲液 | 洗涤物 | |||
| 8 | ETOH | ETOH | |||
| 9 | 空气 | 空气 | |||
| 10 | 轻油 | 空的 | |||
| 11 | 重油 | 空的 | |||
| 12 | 己醇 | 空的 |
图25B说明若干加热元件，所述加热元件将被设计成向初始多重反应室10、初级24-48个多重PCR反应室16、二级24-48个多重反应室22以及包含具有24-48列和数千个微孔隙或微孔的子部分的主室提供独立加热/冷却。可将背面板或微孔隙或微孔腔室的一个或多个平面表面以及反应室压在这些加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。如图25中所说明，初级24-48个多重PCR反应室10、二级24-48个多重反应室22后面的两个加热元件将被设计成两个矩形(水平)条带以独立于所有二级室对所有初级室进行控制。还可使用替代配置，例如可将初始多重PCR分成两个步骤：(i)在阻断引物以抑制野生型DNA延伸或不阻断引物的情况下进行单侧多重引物线性延伸，以及(ii)添加互补引物用于初始延伸产物的有限或延长的PCR扩增。此类配置在(i)初级24-48个多重聚合酶延伸反应室，(ii)二级24-48个多重反应室，(iii)三级24-48个多重反应室以及(iv)包含24-48列和数千个微孔隙或微孔的主室后面将需要至少四个独立控制的加热元件。
图31说明用于检测甲基化的另一示例性PCR-LDR-qPCR反应(加上任选的遗留预防)。分离基因组或cfDNA(图31，步骤A)，并且在初始反应室中用Bsh1236I(CG^CG)处理以完全消化未甲基化DNA。将分离的DNA样品任选用UDG处理以消化可存在于样品中的含有dU的核酸分子(图31，步骤B)。将酶处理的DNA用亚硫酸氢盐处理，亚硫酸氢盐将C但不将5meC转化为U，并且使得链为非互补的。然后使亚硫酸氢盐处理的DNA分布至24、36、48或64个孔或初级PCR反应室中，并且使用PCR将含有所关注的甲基化CpG的基因座特异性区域扩增(图31，步骤B)。在此实施方案中，可通过在上游引物中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以释放3'OH基团，3'OH基团在突变上游的几个碱基处，并且适合于聚合酶延伸(图31，步骤B)。下游引物在其5'末端含有相同的8-11碱基尾部以防止引物二聚体。扩增的产物如图31步骤C中所示任选含有dU，这允许随后用UDG或类似酶处理用于遗留预防。
如图31步骤D中所示，使靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物，并且连结酶(实心圆形)在二级LDR反应室中在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起。在此实施方案中，具有对检测所关注的CpG的甲基化状态具特异性的序列的上游寡核苷酸探针还含有5'引物特异性部分(Ai)以促进连结产物的后续检测。下游寡核苷酸探针含有3'引物特异性部分(Ci')，所述3'引物特异性部分与具有对检测突变具特异性的序列的上游探针的5'引物特异性部分(Ai)一起容许仅甲基化特异性连结产物的后续扩增和检测。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk 3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3'OH基团(图31，步骤D)。在连结之后，可如上文关于图19所描述使用匹配引物对Ai和Ci以及跨越连结接点的TaqManTM探针检测连结产物(参见图31，步骤E-G)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
图32说明用于检测甲基化的另一示例性PCR-LDR-qPCR反应(加上任选的遗留预防)，使用与图31步骤A-C中相同的初始步骤。如图32步骤D中所示，使靶标特异性寡核苷酸探针杂交至扩增产物，并且连结酶(实心圆形)在两个寡核苷酸杂交至其互补序列时将其共价密封在一起。在此实施方案中，具有对检测所关注的CpG的甲基化状态具特异性的序列的上游寡核苷酸探针还含有5'引物特异性部分(Ai)以促进连结产物的后续检测。下游寡核苷酸探针含有3'引物特异性部分(Bi’-Ci’)，所述3'引物特异性部分与具有对检测突变具特异性的序列的上游探针的5'引物特异性部分(Ai)一起容许仅甲基化特异性连结产物的后续扩增和检测。如此图步骤D中所说明，可通过在上游连结探针中包括3'可裂解阻断基(Blk3'，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性合并至方法中。在靶标特异性杂交后，RNA酶H(星形符号)移除RNA碱基以产生连结胜任型3’OH基团(图32，步骤D)。在连结之后，使用UniTaq特异性引物(即，F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连结产物并且如上文关于图20所描述进行检测(参见图32，步骤E-H)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
还可使用图30的筒柱设计来进行多重PCR-LDR-UniTaq检测，用于鉴定和定量血浆中的低水平甲基化和未知突变。(或者，使用用突变或甲基化特异性TaqmanTM探针进行的多重PCR-LDR-实时PCR)。
还可使用图25的筒柱和阀门设置用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针使用多重PCR-LDR-实时PCR定量血浆中的低水平甲基化和未知突变。此图还说明使用由数千个微孔隙组成的微孔隙板用UniTaq或靶标特异性TaqmanTM探针进行多重PCR-LDR-实时PCR的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4和5连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过亚硫酸氢盐反应室、初始24-48个多重PCR反应室、24-48个LDR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、LDR反应室、初始多重PCR反应室以及亚硫酸氢盐反应室。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配用于甲基化靶标的初始多重PCR引物、用于突变靶标的初始多重PCR引物、任选LDR引物、PCR预混液、LDR预混液、UDG预混液、Bsh1236I、亚硫酸氢盐、缓冲液、洗涤物、EtOH以及空气，穿过亚硫酸氢盐反应室、初始24-48个多重PCR反应室、24-48个LDR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门4分配空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门5到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门5反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表5：多重PCR-LDR-实时-PCR(使用亚硫酸氢盐)的试剂设置.
| 端口 | 阀门1 | 阀门2 | 阀门4 | 阀门3/5 |
| 1 | 溶解/蛋白酶缓冲液 | PCR引物-甲基化 | 空气 | 废料 |
| 2 | 洗涤物 | PCR引物-突变 | 轻油 | 空气 |
| 3 | 洗脱缓冲液 | 任选LDR探针 | 重油 | 或连接 |
| 4 | 来自阀门2的酶/引物 | PCR预混液 | 空的 | 空气/废料 |
| 5 | 空的(混合前) | LDR预混液 | 阀门1/4 | |
| 6 | 废料 | UDG预混液 | ||
| 7 | 缓冲液 | Bsh1236I | ||
| 8 | ETOH | 亚硫酸氢盐 | ||
| 9 | 空气 | 缓冲液 | ||
| 10 | 轻油 | 洗涤物 | ||
| 11 | 重油 | ETOH | ||
| 12 | 己醇 | 空气 |
图25B说明若干加热元件，所述加热元件将被设计成向初始多重反应室10、初级24-48个多重PCR反应室16、二级24-48个多重反应室22以及包含具有24-48列和数千个微孔隙或微孔的子部分的主室提供独立加热/冷却。可将背面板或微孔隙或微孔腔室的一个或多个平面表面以及反应室压在这些加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。如图25中所说明，初级24-48个多重PCR反应室10、二级24-48个多重反应室22后面的两个加热元件将被设计成两个矩形(水平)条带以独立于所有二级室对所有初级室进行控制。还可使用替代配置。举例来说，可使用针对甲基化DNA的甲基特异性结合蛋白或抗体替代Bsh1236I选择过程对甲基化DNA进行富集。此步骤可在筒柱内或在使甲基富集的DNA进入筒柱中之前进行。在亚硫酸氢盐处理之后，可将初始多重PCR分成两个步骤：(i)在阻断引物以抑制未甲基化DNA DNA延伸或不阻断引物的情况下进行单侧多重引物线性延伸，以及(ii)添加互补引物用于初始延伸产物的有限或延长的PCR扩增。此类配置在(i)初级24-48个多重聚合酶延伸反应室，(ii)二级24-48个多重反应室，(iii)三级24-48个多重反应室以及(iv)包含24-48列和数千个微孔隙或微孔的主室后面将需要至少四个独立控制的加热元件。
图33说明用于检测低水平或者剪接转录物的RT-PCR-PCR-qPCR反应。图33步骤A说明含有外显子3a的野生型转录物(顶部)以及所要检测的含有外显子3b的低水平或者剪接转录物(底部)。此方法涉及分离mRNA以及在初始反应室中使用3'转录物特异性引物(即对外显子4)用逆转录酶产生cDNA拷贝。将Taq聚合酶活化以进行有限循环PCR扩增(即7个循环)从而维持不同扩增子的相对比率(图33，步骤B)。在一个实施方案中，使初始多重反应物分布至6个初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始转录物的20个拷贝。
如图33步骤C中所示，使靶标特异性寡核苷酸二级引物杂交至初级扩增产物，并且在初级PCR反应室中使用聚合酶(填充菱形)PCR扩增所关注的含有靶标的区域(即10个循环)。在此实施方案中，利用对可变剪接变体(即，外显子3b)具特异性并且不杂交至野生型变体(即，外显子3a)的引物以仅产生对应于可变剪接变体的扩增产物。将来自6个腔室中的每一者的产物差异稀释至4个更小的二级反应/稀释室中，总计24个腔室。在巢式引物扩增之后，将来自每个二级反应/稀释室的PCR产物差异稀释并且分布至384或768个微孔隙中。将产物使用UniTaq特异性引物(即，F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增并且如上文关于图20所描述进行检测(参见图33，步骤D-F)，或使用本领域中已知的其他适合的方式。
图34为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重RT-PCR-巢式PCR-UniTaq检测以计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重RT-PCR-巢式PCR-实时PCR)。在图34中，输入样品通过入口12流体连接至初始反应室10(底部)。初始反应室10通过导管14流体连接至六方形室16(含有大槽18，包含初级PCR反应室)。初级PCR反应室16通过导管20流体连接至第二组的六方形室22(每个初始室连接至4个腔室，这4个腔室分别含有大槽24a、中槽24c、小槽24b以及极小槽24d，包含二级反应/稀释室22)，所述六方形室22通过导管26流体连接至长较窄混合室28，所述长较窄混合室28通过导管30流体连接至具有包含微孔或微孔隙的子部分32的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将各行用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在制造筒柱期间，将向上通往微孔或微孔隙的列的腔室用在5'末端具有UniTaq或通用标签序列的巢式PCR引物组预填充。图式左侧的灰色圆形17说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷引物组的可能位置。将引物干燥，并且组装筒柱的覆盖部分以将探针组密封在其适当位置。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始室沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的24列和32行(各4个)等于768个子部分，每个子部分包含24个微孔或微孔隙，初始多重逆转录PCR持续7个循环以在初始反应室中扩增原始靶标。使初始多重产物分布至初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始转录物的20个拷贝。使用具有UniTaq或通用标签的靶标特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行10个巢式PCR循环。将每个初级PCR反应室设计成在排放之后保留某一百分比的液体体积。进行3个填充和排放循环以将产物差异稀释。使来自初级PCR反应室中的每一者的产物分布至二级反应/稀释室中。将每个二级反应/稀释室设计成在排放之后保留某一百分比的液体体积。进行3个填充和排放循环以将产物差异稀释。使巢式PCR产物分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙中。每一行中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。微孔隙中的泊松分布将计数低拷贝、中拷贝以及高拷贝lncRNA、mRNA或剪接变体。
在一个替代实施方案中，使用48列和48行等于2,304个子部分，每个子部分包含96个微孔，通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷将1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)直接递送至每一行中的适当子部分，然后干燥至个别微孔中。进行10个多重RT-PCR循环，初始反应室或孔中每个原始RNA分子最多1,024个拷贝。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物可包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。使初始多重产物分布至48个孔或初级PCR反应室中。每个孔中平均分布每个原始RNA靶标的20个拷贝。使用具有UniTaq尾部的引物以24或48个引物组的群组进行3-4个巢式PCR循环，每个原始病原体最多160-320个拷贝。使每个孔的产物分布至2组或4组分别含有96个微孔隙的24或12个子部分中。当使用2组时，第二组为第一组的100/1稀释。当使用4组时，每一组为前一组的20/1稀释。这允许涵盖以许多数量级存在的RNA分子。每个初始子部分平均将得到每个原始RNA分子的12个拷贝，给定微孔隙得到原始RNA的一个或零个拷贝。如果RNA以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。使用预点样的UniTaq引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。2组或4组稀释中96个微孔隙中的泊松分布将提供样品中非常低拷贝RNA以及较高拷贝RNA的一定程度的计数。
本发明的另一实施方案为一种用于通过合成或通过将靶标分子连结于固体支撑物上进行测序的系统。例如如图1中所描述在5微米直径微孔隙内扩增一个或多个靶分子。将靶标扩增并且固定或连接至微孔隙或微孔内的固体支撑物上。此类固定可直接在微孔隙或微孔上的内部表面上、在固定至微孔隙或微孔表面的树状聚合引物上或者在扩增之前已分布于微孔隙或微孔内或在扩增之后分布至微孔隙或微孔中的微珠粒上进行。微珠粒可为多孔的，具有大得多的表面积用于与在单独微孔隙内表面可实现的相比更高水平的扩增。固定或连接至固体支撑物使得能够一次或多次地考查扩增的靶标以确定靶标内存在或不存在突变、SNp或序列变异。
用于检测边合成边测序荧光产物的标准方法依赖于每孔仅扩增一个靶标并且使用单一通用引物来产生测序读段。用于扩增单一靶分子的一种方法为将正向与反向引物固定于固体支撑物上，称为簇扩增。然而，此方法限制簇内链的总产率，因为延伸产物倾向于彼此而非与新鲜引物再杂交。一种替代方法为在珠粒上在由油包围的水性微滴内扩增DNA。在本文中，提出一种更简单的方法，其中扩增在溶液中进行，并且然后将产物捕获于固体支撑物上或固定化引物上，然后延伸以形成扩增产物的拷贝。这允许反应以更大体积进行，从而使得多种扩增产物的产率更高，所述多种扩增产物可然后使用所选靶标特异性引物或者包含共同区和可变区的不同测序引物组进行测序。对于各轮测序，使用适当的加载和引物选择，约30％-35％的微孔隙将提供独特测序读段。
将微孔隙和微孔构建成内部具有亲水表面并且外部具有疏水表面。此架构适合于将样品流体吸入离散分离体积的液体中，从而在微孔隙或微孔之间没有串扰的情况下实现扩增。另外，可对亲水表面进行官能化以使引物附着/固定于微孔隙或微孔内，但不附着/固定于外部，因此就不会有串扰。
当固体支撑物包含聚(甲基丙烯酸甲酯)(也称为PMMA、树脂玻璃(Plexiglass)、璐彩特(Lucite))、环状烯烃共聚物(COC)、聚乙烯或聚丙烯薄片时，一种方法为经由UV激光烧蚀形成微孔隙或微孔。或者，经由注射模制、印记、热压印或蚀刻，并且使用遮蔽法使所述特定表面暴露于UV光来形成微孔隙和微孔。这些方法产生甲酸酯表面，所述甲酸酯表面适合于EDC/NHS介导的5'氨基封端寡核苷酸的共价连接以产生微阵列(Situma等,“Fabricationof DNA Microarrays onto Poly(methyl Methacrylate)with Ultraviolet Patterningand Microfluidics for the Detection of Low-abundant Point Mutations,”AnalBiochem340(1):123-35(2005)；McCarley等,“Resist-free Patterning of SurfaceArchitectures in Polymer-based Microanalytical Devices,”J Am Chem Soc.127(3):842-3(2005)；Soper等,“Fabrication of DNA Microarrays onto Polymer SubstratesUsing UV Modification Protocols With Integration Into Microfluidic Platformsfor the Sensing of Low-abundant DNA Point Mutations,”Methods 37(1):103-13(2005)；Wang等,“Microarrays Assembled in Microfluidic Chips Fabricated FromPoly(Methyl Methacrylate)for the Detection of Low-Abundant DNA Mutations,”Anal Chem.75(5):1130-40(2003)，这些参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
在一个替代实施方案中，通过原子转移自由基聚合(ATRP)使共价连接的聚合物刷在PMMA的表面上生长(Balamurugan等,“Aqueous-based Initiator Attachment and ATRPGrafting of Polymer Brushes from Poly(Methyl Methacrylate)Substrates,”Langmuir 28(40):14254-60(2012)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。此方法是基于ATRP引发剂共价固定于PMMA表面以及后续表面引发水性ATRP形成聚(N异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。简单来说，对PMMA的所选区域进行UV改性以引入甲酸官能团，甲酸官能团随后通过与EDC/NHS中的乙二胺反应转化为氨基。这些胺官能化PMMA表面然后与ATRP引发剂的活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺基-2-溴-2-甲基丙酸酯)反应。由共价连接的引发剂表面，在水中进行原子转移聚合以生长PNIPAAm刷。此从表面接枝聚合物的水基途径可适合于多种衬底和水溶性ATRP单体。
在一个替代实施方案中，使用两步顺序法为COC表面光致接枝聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA)：在第一步中形成共价结合表面引发剂并且然后在第二步中从这些位点进行PEGMA的接枝聚合。(Stachowiak等,“Hydrophilic Surface Modification of CyclicOlefin Copolymer Microfluidic Chips Using Sequential Photografting,”J SepSci.30(7):1088-93(2007)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。类似方法还用于低密度聚乙烯薄膜。(Wang等,“Surface Modification of Low-Density PolyethyleneFilms by UV-Induced Graft Copolymerization and Its Relevance toPhotolamination,”Langmuir 14(4):921-927(1998)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
在一个替代实施方案中，使用亲水涂层将疏水表面转化为亲水表面(Zilio等,“Universal Hydrophilic Coating of Thermoplastic Polymers Currently Used inMicrofluidics,”Biomed Microdevice.16(1):107-14(2014)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。在另一变化形式中，使用光反应性涂层在空间上控制装置的可润湿性以产生亲水表面(Abate等,“Photoreactive Coating for High-Contrast SpatialPatterning of Microfluidic Device Wettability,”Lab Chip 8(12):2157-60(2008)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，固体支撑物的表面还可含有一层接头分子，所述接头分子使寡核苷酸连接至固体支撑物，不过应了解，接头分子不为本发明所需的元件。接头分子优选足够长以容许完整衬底中的聚合物与暴露于衬底的分子自由地相互作用。接头分子应长6-50个原子，以提供充足的暴露。适合的接头分子可基于其亲水/疏水特性进行选择。接头分子可为例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。
接头分子可使用例如(聚)三-氟氯乙烯表面经由碳-碳键连接至衬底。接头分子可任选以有序阵列连接，即，作为聚合单层中的头部基团的一部分。在替代实施方案中，接头分子吸附至衬底的表面。
本发明的装置可根据应用包含各种类型的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，装置的寡核苷酸为如Barany等的美国专利号6,852,487和7,455,965中所描述的捕获寡核苷酸探针，所述专利以全文引用的方式并入本文中。因此，本发明还涵盖一种将多个靶核苷酸序列捕获于固体支撑物上的方法。
Morris等的美国专利号6,017,738、Gormley等的美国专利号7,741,463、Rigatti等的美国专利号7,754,429以及Chee等的美国专利号6,355,431以及Sabot等的美国专利公布号2009/0226975、Yu等的美国专利公布号2001/0036632、Sundararajan等的2008/0108149以及Gunderson等的美国专利公布号2005/0053980中描述了可使用本发明的装置进行的其他适合的固相扩增方法，所述专利以全文引用的方式并入本文中。本发明的装置还适合于执行其他多重核酸反应，包括但不限于单碱基或多碱基延伸反应、引物延伸分析、固相测序、固相寡核苷酸连结分析、配对末端读段、RNA测序、拷贝数分析、ChIP测序以及如Oliphant等的美国专利申请公布号2010/0015626中所描述的其他多重核酸反应，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，本发明的一个方面涉及使寡核苷酸附着于固体支撑物上的微孔或微孔隙内的方法。这些方法中的第一种涉及提供具有基底表面、顶部表面以及在基底与顶部表面之间延伸的多个侧面的固体支撑物。基底表面、顶部表面以及多个侧面共同在固体支撑物上形成多个微孔或微孔隙。施加遮蔽物以覆盖固体支撑物的基底表面，并且使遮蔽的装置暴露于活化剂以活化固体支撑物的未遮蔽表面，而固体支撑物的遮蔽表面为未活化的。将遮蔽物从固体支撑物移除，并且使暴露的固体支撑物与多个寡核苷酸在对寡核苷酸附着至固体支撑物的活化表面但不附着至固体支撑物的未活化表面有效的条件下接触，由此使寡核苷酸附着于固体支撑物上的微孔或微孔隙内。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，根据本发明的此方面，固体支撑物优选包含聚合物材料。适合的聚合物包括但不限于聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚砜、弹性体以及聚合有机硅。具有基底表面、顶部表面以及在基底与顶部表面之间延伸的多个侧面的固体支撑物由具有平面表面的固体支撑物形成，其中平面表面已经处理以形成基底、顶部以及多个侧面以在固体支撑物上产生微孔或微孔隙。在一个实施方案中，如Soper等的美国专利号8,758,974中所描述对平面表面进行热压印，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。当固体支撑物包含聚合物材料时此方法为优选的。在本发明的此方面的一个替代实施方案中，对平面表面进行光刻以在固体支撑物上产生微孔或微孔隙。
Soper等的美国专利号8,758,974中描述了对聚合物表面进行改性用于附着包括寡核苷酸的生物分子的方法，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。为实现寡核苷酸在固体支撑物上的微孔或微孔隙内的选择性活化和附着，将固体支撑物上的多个图案化位置选择性遮蔽和暴露于活化剂，例如UV光。在本发明的此方面的一个实施方案中，活化剂为光化性光。优选地，暴露于光化性光在氧化气氛中进行。在许多应用中，普通空气为适合的，不过如果需要也可能使用具有更高或更低氧(或其他氧化剂)浓度的气氛来改变图案化。可代替氧使用或除氧外还使用本领域中已知的其他氧化剂，例如SO2、NO2或CNBr(参见例如Kavc等,"Surface Modification of Polyethylene by PhotochemicalIntroduction of Sulfonic Acid Groups,"Chem.Mater.12:1053-1059(2000)；Meyer等,"Surface Modification of Polystyrene by Photoinitiated Introduction of CyanoGroups,"Macromol.Rapid Commun.20:515-520(1999)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。光化性光暴露活化聚合物表面，从而促进光氧化并且在暴露的表面上产生羧基。适合用于光化性光活化的表面包括但不限于丙烯酸酯聚合物(例如PMMA)、芳族聚合物(例如聚苯乙烯、苯氧基树脂)、聚酰胺、聚砜以及共聚物。
使用光化性光作为活化剂活化阵列表面可经由暴露于宽带紫外光、窄带UV灯(例如254nm)或频率由所用聚合物吸收的UV激光来实现。或者，可使用氧等离子体作为活化剂来实现阵列表面的活化。环状烯烃共聚物(COC)为优选聚合物，这是归因于其非常低的自体荧光水平以及其在UV或氧等离子体暴露之后产生高密度官能团的能力。
如以全文引用的方式并入本文中的Soper等的美国专利号8,758,974中所描述，使用本领域中熟知的方法(例如使用乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)作为交联剂以及中间酯N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的点击化学)使寡核苷酸(优选为胺封端寡核苷酸)附着于表面的活化区域。然而，其他附着化学同样可使用，诸如二硫化物、马来酰亚胺或硅氧烷。当形成含有多个微孔或微孔隙的阵列时，使寡核苷酸附着于孔的活化侧面和底部表面(如果存在)，但不附着于遮蔽的顶部表面。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，在固体支撑物上形成寡核苷酸阵列的另一方法涉及提供具有平面衬底以及衬底表面上的感光层的固体支撑物。在固体支撑物上有效形成微孔或微孔隙的条件下对固体支撑物进行光刻处理。使固体支撑物与寡核苷酸在对寡核苷酸附着于因光刻处理而暴露或未暴露的感光层部分但分别不附着于未暴露或暴露的感光层部分有效的条件下接触，由此使寡核苷酸附着于固体支撑物上的微孔或微孔隙内。
在光敏表面(即，SU-8或其变体中的一者)产生官能团以允许寡核苷酸共价连接至固体支撑物的各种方法为本领域中已知的。适合的官能团包括但不限于羧基、羰基、羟基、氨基、环氧基以及硅醇基。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，SU-8为优选表面材料，它包含适合于在不额外活化或改性的情况下共价连接寡核苷酸的环氧化物环(还参见Wang等,“Surface Graft Polymerization of SU-8for Bio-MEMS Applications,”J.Micromech.Microeng.17:1371-1380(2007)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，可使用碱性溶液(pH约12)将胺封端的寡核苷酸添加至SU-8表面，碱性溶液水解表面环氧基并且与带有伯胺的寡核苷酸形成仲胺。或者，将SU-8微孔或微孔隙用硝酸处理以产生表面限制羟基，表面限制羟基随后与含有伯胺的寡核苷酸反应(图24；Wang等,“Surface Graft Polymerization of SU-8forBio-MEMS Applications,”J.Micromech.Microeng.17:1371-1380(2007)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。在又一实施方案中，使SU-8聚合物微孔或微孔隙暴露于UV放射线(254nm)以产生表面羟基和羧酸基团。这些方法不需要接触式光学遮蔽物，因为固体支撑物衬底包含在暴露于活化剂之后不改变表面化学的材料。
与基于环氧基的抗蚀剂(诸如SU-8)相容的替代附着化学也适合用于使寡核苷酸附着于微孔或微孔隙的内表面。举例来说，在一个实施方案中，使用交联试剂对存在于支撑物表面的官能团进行改性。如Barany等的美国专利申请公布号2015/0099642中所描述，适合的交联试剂包括但不限于甘氨酸、戊二醛以及氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。
在用于将树状聚体固定于固体支撑物上的一个实施方案中，通过一系列称为bDNA的分枝寡脱氧核苷酸将多个引物附着于固体表面(Horn等,“An Improved DivergentSynthesis of Comb-type Branched Oligodeoxyribonucleotides(bDNA)ContainingMultiple Secondary Sequences,”Nucleic Acids Res.25(23):4835-41(1997)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。在此方法中，bDNA含有一个独特寡核苷酸(初级序列)，所述独特寡核苷酸通过梳状分枝网络共价连接至不同寡核苷酸的许多相同拷贝(二级序列)。适合于靶标扩增的复合寡核苷酸的多个拷贝杂交至bDNA网络，然后与bDNA网络共价交联。以下提供适合于链间交联的核苷酸类似物。或者，可使用酶法(诸如DNA连结酶)连接各链。将复合寡核苷酸的5'末端设计成与二级序列互补并且适合于交联，而3'末端适合于用作用于所需靶标的扩增的标签序列。
用于树状聚体样DNA的受控组装的通用和创造性实施方案使用通过杂交形成的Y形DNA分子(Li等,“Controlled Assembly of Dendrimer-like DNA,”Nat Mater.3(1):38-42(2004)；Um等,“Dendrimer-like DNA-based Fluorescence Nanobarcodes,”NatProtoc.1(2):995-1000(2006)；Campolongo等,“DNA Nanomedicine:Engineering DNA asa Polymer for Therapeutic and Diagnostic Applications,”Adv Drug Deliv Rev.62(6):606-16(2010)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。此类分子可通过受控杂交来组装，更小的Y形分子彼此连结以形成多臂树状聚体结构，然后通过使DNA链彼此交联变得更永久。使用在5'或3'末端具有氨基、生物素基团或其他部分的未端DNA分子的一部分使得树状聚体复合物适合共价或非共价固定至固体支撑物。使适合于靶标扩增的复合寡核苷酸的多个拷贝杂交至bDNA网络，然后与bDNA网络共价交联或连结。将复合寡核苷酸的5'末端设计成与二级序列互补并且适合于交联或连结，而3'末端适合于用作用于所需靶标的扩增的标签序列。
在另一实施方案中，使用“逐步和双击”化学通过环加成作用由三炔丙基化寡核苷酸合成分枝DNA。(Xiong等,“Construction and Assembly of Branched Y-shaped DNA:"click"Chemistry Performed on Dendronized 8-aza-7-deazaguanineOligonucleotides,”Bioconjug Chem.23(4):856-70(2012)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。将用带有两个末端三键的7-三炔丙基胺侧链装饰的树状化寡核苷酸用双叠氮化物进一步官能化，得到具有两个末端叠氮基的衍生物。随后，将具有两个叠氮基或两个三键的分枝侧链与提供对应可点击功能的DNA片段组合。同样地，可使用包含可商购获得的叠氮化物、炔或DBCO部分的寡核苷酸。这些方法产生分枝(Y形)三臂DNA。分枝DNA与第一组互补寡核苷酸退火产生超分子组装，所述超分子组装可通过使用本文所描述的交联方法变为热稳定的。使第二组互补复合寡核苷酸杂交至超分子bDNA网络，然后与超分子bDNA网络共价交联或连结。将复合寡核苷酸的5'末端设计成与第一组互补寡核苷酸互补并且适合于交联或连结，而3'末端适合于用作用于所需靶标的扩增的标签序列。
在另一实施方案中，将树状聚体直接组装在固体支撑物上(Benters等,“DNAMicroarrays with PAMAM Dendritic Linker Systems,”Nucleic Acids Res.30(2):E10(2002)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。此方法使用预先制造的聚酰胺基胺(PAMAM)放射状树状聚体作为固体支撑物与适合用作用于所需靶标的扩增的标签序列的所需寡核苷酸之间的介体部分。使外层含有64个伯氨基的树状聚体共价连接至甲硅烷基化玻璃支撑物，并且随后，将树状大分子用戊二酸酐修饰并且用N-羟基琥珀酰亚胺活化。现在可将活化表面用氨基修饰的DNA寡聚物装饰，产生具有高加载密度的所需寡核苷酸引物的高度稳定的表面。
在另一实施方案中，可使用用于无铜点击化学(对叠氮化物)的二苯并环辛基(DBCO)；用于点击化学(对叠氮化物)的5-辛二炔基dU；氨基修饰剂C6 dT(用于肽键)；或用于对炔或DBCO的点击化学的叠氮化物将引物共价连接至固体表面、另一寡核苷酸或树状聚体寡核苷酸。包含适合于与其他寡核苷酸或与固体支撑物交联的经修饰碱基的寡核苷酸为可商购获得的，例如来自IDT(Integrated DNA technologies,Coralville,Iowa 52241,USA)。
在另一实施方案中，使用含有呋喃部分的经修饰碱基合成寡核苷酸。在存在亚甲基蓝的情况下暴露于可见光后，这诱导单重态氧形成，单重态氧形成触发呋喃氧化，并且所得醛然后快速地与互补的A或C反应以形成稳定的链间加合物。(Op de Beeck等,“SequenceSpecific DNA Cross-linking Triggered by Visible Light,”J Am Chem Soc.134(26):10737-40(2012)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
用于稳定树状聚体结构的另一方法为使用光交联。(Rajendran等,“Photo-cross-linking-assisted Thermal Stability of DNA Origami Structures and itsApplication for Higher-temperature Self-assembly,”J Am Chem Soc.133(37):14488-91(2011)，其以全文引用的方式并入本文中)。在此方法中，使用8-甲氧基补骨脂素使嘧啶碱基在暴露于UV光后彼此交联。
在另一实施方案中，使用具有无碱基位点的核苷酸类似物来促进链间交联(Ghosh等,“Synthesis of Cross-linked DNA Containing Oxidized Abasic Site Analogues,”J Org Chem.79(13):5948-57(2014)，其以全文引用的方式并入本文中)。
在另一实施方案中，使用4-乙烯基取代的嘧啶和6-乙烯基嘌呤核苷酸类似物来形成链间交联(Nishimoto等,“4-vinyl-substituted pyrimidine Nucleosides Exhibitthe Efficient and Selective Formation of Interstrand Cross-links with RNA andDuplex DNA,”Nucleic Acids Res.41(13):6774-81(2013)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。这些类似物包括2-氨基-6-乙烯基嘌呤衍生物(用于与胞嘧啶交联)以及4-乙烯基取代的嘧啶衍生物T-乙烯基和U-乙烯基。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等WO 2016/057832中所描述，可使用用于无铜点击化学(对叠氮化物)的二苯并环辛基(DBCO)；用于点击化学(对叠氮化物)的5-辛二炔基dU；氨基修饰剂C6 dT(用于肽键)；或用于对链烯或DBCO的点击化学的叠氮化物将寡核苷酸共价连接至固体表面。或者，寡核苷酸可包含存在于固体支撑物上的微孔或微孔隙内的捕获部分，诸如将分别由固定化链霉亲和素或NTA基质捕获的生物素基团或His-标签。
形成具有有限(短)RCA扩增子的共价连接的相同拷贝的表面的替代方式包括红杉扩增(Sequoia amplification)(Barany等的WO2013/012440，所述专利以全文引用的方式并入本文中)和野火扩增(wildfire amplification)(Ma等,“Isothermal AmplificationMethod for Next-Generation Sequencing,”Proc Natl Acad Sci USA 10(35):14320-3(2013)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的WO 2015/188192中所描述，固体支撑物可由多种材料制成。衬底可为生物的、非生物的、有机的、无机的或这些中的任一者的组合，以粒子、链、沉淀、凝胶、薄板、管、球、珠粒、容器、毛细管、垫、薄片、薄膜、板、透明片、圆片、膜等形式存在。衬底可具有任何方便的形状，诸如圆片、方块、环形等。衬底优选为平的，但可呈现多种替代表面配置。举例来说，衬底可含有进行杂交的升高或下降的区域。衬底和其表面优选形成执行本文所描述的测序反应的刚性支撑。
在本发明的系统和方法中可利用用于模板制备的可商购获得的下一代测序固体支撑物平台。举例来说，本发明的系统和方法中可使用
流动池、Life
IonSphereTM以及乳液PCR珠粒和454乳液PCR珠粒。因此，将圆形嵌合单链核酸构建体的第一固体支撑物引物特异性部分设计成与固定于可商购获得的NGS固体支撑物上的引物相同。因此，含有第一固体支撑物引物特异性部分的补体的延伸产物能够杂交至NGS固体支撑物表面上的引物。
图35提供用于对一条靶标链中的病原体进行测序和鉴定的引物设计的一个实施方案。分离基因组DNA，同时对于RNA病毒，初始逆转录酶步骤产生cDNA。可使用PCR在初始反应室中预扩增靶DNA(图35，步骤A)。在一种变化形式中，使PCR扩增的DNA或cDNA分布至24、36或48个初级PCR反应室中。提供巢式基因座特异性引物对以扩增靶序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含第二5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3’OH(图35，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、内部片段标识符以及第二5'通用或标签序列的产物。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图35，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。(图35，步骤D)。
对于最佳测序信号，尤其是如果在微孔隙或珠粒中扩增多种产物，则需要对产物进行扩增，使得大多数固定化引物被延伸，从而将其转化为适合于测序的包含靶标的链。图36、图37以及图38提供三种不同实施方案，这三种不同实施方案可个别或组合使用或与其他方法一起使用。
图36说明第一标签引物以比溶液内与固定化第二标签引物大的量存在的一个实施方案。固定化引物比溶液内第二标签引物长。任选地，在PCR或其他扩增循环结束时，杂交温度超过较短标签引物的Tm以有利于合成单链产物从而杂交至固定化引物并且驱使此类引物延伸完成。
图37说明另一实施方案，其中溶液内第一标签引物包含两个不同的5'部分，并且具有添加的5'部分引物，所添加的5'部分引物以比两种第二标签引物更大的量存在。固定化引物比溶液内第二标签引物长。使用缺乏5'-3'核酸酶活性的链置换聚合酶，进行组合的等温和热循环扩增。产物与不同的5'部分再退火在末端产生Y形结构并且实现链置换扩增。这有助于驱使固定化引物延伸完成。
图38说明另一实施方案，其中溶液内第一标签引物包含dA35，并且具有添加的dA35与富GC立足点引物，其存在的量比两种第二标签引物大。固定化引物比溶液内第二标签引物长。使用缺乏5'-3'核酸酶活性的链置换聚合酶，进行等温和/或热循环扩增。引物立足点仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下释放。过量单链产物杂交至固定化引物并且有助于驱使固定化引物延伸完成。
固定化延伸产物的测序可使用如本文所描述和展示的边合成边测序来实现。边合成边测序包括基于荧光的边合成边测序和基于离子的边合成边测序。还可采用其他适合的测序方法，包括例如但不限于荧光引物杂交、分子信标杂交、引物延伸、基于核酸外切酶的测序、连结酶检测反应、连结酶链反应、焦磷酸测序、基于荧光的边连结边测序、基于纳米孔和纳米管的测序以及基于离子的边连结边测序。
如以全文引用的方式并入本文中的Barany等的WO 2016/154337中更充分描述，上文了描述适合用于将靶核酸分子固定于固体支撑物上的捕获分子和方法。类似地，上文还描述了使用固相扩增产生与靶核酸分子互补的固定化延伸产物的方法。
根据本发明的此方面，对固定化靶核酸分子或其固定化延伸产物进行核苷酸延伸反应处理。核苷酸延伸反应混合物包含核苷三磷酸的集合，其中集合中的每种类型的核苷三磷酸具有(i)不同可裂解荧光标记基团，以及(ii)抑制添加后续核苷三磷酸的可裂解阻断部分。
核苷三磷酸的阻断部分可直接阻断后续核苷三磷酸在其3’OH基团处的添加。在此实施方案中，将阻断部分在核糖的2'-O或脱氧核糖的3'-O处附加至核苷三磷酸。这些核苷三磷酸与荧光边合成边测序相同或类似(Ju等,“Four-color DNA Sequencing bySynthesis Using Cleavable Fluorescent Nucleotide Reversible Terminators,”ProcNatl Acad Sci USA 103(52):19635-40(2006)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。在3'-O阻断基的情况下，在文献中存在若干充分证实的实例，诸如但不限于氨基、叠氮基甲基以及氰乙基。应针对酶合并效率与解阻断步骤期间的移除容易性的组合对基团的特定性质加以选择。阻断基的移除是特定于阻断基的化学性质的，但实例将为在保留引物-模板双链体并且不引起归因于引物-模板双链体熔解的信号丢失的温度下使用温和水性试剂(即，还原剂)。
或者，核苷三磷酸的阻断部分可逆地抑制后续核苷三磷酸在其3’OH基团处的添加。这些阻断部分可在核苷的C5或C7位置(即分别为嘧啶或嘌呤)处附加至核苷三磷酸。这些核苷三磷酸与Lightning TerminatorsTM(LaserGen,Inc.)(Gardner等,“RapidIncorporation Kinetics and Improved Fidelity of a Novel Class of 3’OHUnblocked Reversible Terminators,”Nucleic Acids Research 40(15):7404-15(May2012)和Litosh等,“Improved Nucleotide Selectivity and Termination of 3’-OHUnblocked Reversible Terminators by Molecular Tuning of 2nitrobenzylAlkylated HOMedU Triphosphates,”Nucleic Acids Research 39(6):e39(2011)，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)以及Virtual TerminatorTM(Helicos BioSciences)(Bowers等,“Virtual Terminator Nucleotides for Next-Generation DNASequencing,”Nat.Methods 6:593-595(2003)、Efcavitch等的美国专利号8,071,755、Siddiqi等的美国专利号8,114,973、Siddiqi等的WO 2008/0169077，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)相同或类似。可使用利用空间体积或带电荷的抑制或两者的组合妨碍通过模板依赖性DNA聚合酶合并dNTP的化学部分。抑制部分的实例为二肽Glu-Glu或Asp-Asp。
在所有这些实施方案中，可使用基因特异性引物来起始边合成边测序以确定靶标的独特序列。在一个实施方案中，用于初始巢式扩增中的上游基因座特异性引物可兼作测序引物。由于这些引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，所以基本上消除来自不恰当引物结合的潜在伪读段。
或者，将基因座特异性引物设计成包含可变区。个别靶标将含有独特可变区并且然后通过使用个别引物进行测序。在一个实施方案中，第一组的8-16个测序引物包含共同5'序列(16个碱基)和可变3'序列(8个碱基)。或者，第二组的64-256个测序引物包含共同5'序列(8个碱基)、可变中间序列(8个碱基、8-16个变体)以及超可变3'序列(8个碱基、64-256个变体)。一种方法为使用分离和汇集合成策略。举例来说，16个变体引物的家族的合成将包括合成基因座特异性3'区，分成4等份，每份得到额外四个碱基，汇集，并且再次分成4等份，每份得到额外四个碱基，然后汇集以及以5'末端具有共同序列的16个碱基完成合成。考虑3'侧的初始4个碱基为GTCA、ACTG、TGAC以及CAGT，接下来四个碱基为GCTA、ATCG、TAGC以及CGAT，随后为5'侧的16个碱基。然后，可使用一组16个测序引物唯一地对每个扩增子进行测序，同时使来自结合于错配补体的一个引物的错误引发降至最低程度。
01.(16碱基共同序列)-GTCA-GCTA(SEQ ID No:1)
02.(16碱基共同序列)-GTCA-ATCG(SEQ ID No:2)
03.(16碱基共同序列)-GTCA-TAGC(SEQ ID No:3)
04.(16碱基共同序列)-GTCA-CGAT(SEQ ID No:4)
05.(16碱基共同序列)-ACTG-GCTA(SEQ ID No:5)
06.(16碱基共同序列)-ACTG-ATCG(SEQ ID No:6)
07.(16碱基共同序列)-ACTG-TAGC(SEQ ID No:7)
08.(16碱基共同序列)-ACTG-CGAT(SEQ ID No:8)
09.(16碱基共同序列)-TGAC-GCTA(SEQ ID No:9)
10.(16碱基共同序列)-TGAC-ATCG(SEQ ID No:10)
11.(16碱基共同序列)-TGAC-TAGC(SEQ ID No:11)
12.(16碱基共同序列)-TGAC-CGAT(SEQ ID No:12)
13.(16碱基共同序列)-CAGT-GCTA(SEQ ID No:13)
14.(16碱基共同序列)-CAGT-ATCG(SEQ ID No:14)
15.(16碱基共同序列)-CAGT-TAGC(SEQ ID No:15)
16.(16碱基共同序列)-CAGT-CGAT(SEQ ID No:16)
图39为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重PCR-巢式PCR-测序以进行未知病原体鉴定的腔室架构和微孔或微孔隙。在图39中，输入样品流体连接至六边形室116(底部，初始反应室)，所述六边形室116通过导管120流体连接至一组六方形室122(含有大槽124和挡板123，初级PCR反应室)，所述六方形室122通过导管126流体连接至长较窄混合室128，所述长较窄混合室128通过导管130流体连接至具有包含微孔隙的子部分132的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将各行用一个或多个通用标签引物组预填充，其中一个引物固定至固体支撑物并且另一引物为结合的，但是所述引物在较高温度下释放。在制造筒柱期间，将向上通向微孔或微孔隙的列的腔室用在5'末端具有通用标签序列的巢式PCR引物组预填充。图式左侧的灰色圆形125说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷引物组的可能位置。将引物干燥，并且组装筒柱的覆盖部分以将引物组密封在其适当位置。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始室沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的48列和64行(各4个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，初始多重PCR扩增(或对于RNA靶标为逆转录PCR)持续10个循环，以在初始反应室中产生每个原始靶标的最多1,024个拷贝。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，并且使初始多重反应物分布至初级PCR反应室(如上文所描述用巢式PCR引物预填充)中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用具有通用标签的靶标特异性引物以32或64个引物组的群组进行5个巢式PCR循环，以产生每个初级PCR反应室每个病原体特异性靶标平均640个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物的一侧产生单链尾部，这有助于杂交至微孔隙中的固定化引物。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的巢式PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。PCR扩增每个微孔隙中的一种或多种产物，并且熔解掉非锚定链。每一行的每个子部分中的通用引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。添加靶标特异性或通用标签特异性测序引物。进行边合成边测序。微孔隙中的泊松分布将计数靶序列，而直接序列信息将鉴定变体病原体。
还可在用于进行多重PCR-巢式PCR-测序的不同实施方案中使用图39的筒柱设计以进行未知病原体鉴定。在此实施方案中，将所有微孔隙用固定化单一通用引物预填充，并且将微孔隙干燥。由于所有子部分含有相同引物，所以它们可通过所述列或通过其他方式添加。在此说明性实例中，示出了所计划的48列和64行(各4个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，初始多重PCR扩增(或对于RNA靶标为逆转录PCR)持续10个循环，以在初始反应室中产生每个原始靶标的最多1,024个拷贝。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，并且将初始多重反应分至初级PCR反应室(如上文所描述用巢式PCR引物预填充)中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。任选地，含有RNA碱基和3'阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。使用在组中一个引物上具有8-12个独特标签序列并且在5'末端具有通用序列的靶标特异性引物进行5个巢式PCR循环，以产生每个初级PCR反应室每个病原体特异性靶标平均640个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物的一侧产生单链尾部，这有助于杂交至微孔隙中的固定化引物。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的巢式PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。PCR扩增每个微孔隙中的一种或多种产物，并且熔解掉非锚定链。每一行的每个子部分中的通用引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。添加具有独特标签特异性部分的靶标特异性或通用引物作为测序引物。进行边合成边测序。微孔隙中的泊松分布将计数靶序列，而直接序列信息将鉴定变体病原体。
在一个替代实施方案中，使用48个双列和48个双行等于2,304个子部分，每个子部分包含11,040个微孔隙，每个双列具有529,920个微孔隙。对样品进行初始多重扩增持续10个PCR循环在孔或初始反应室中提供每个原始病原体的最多1,024个拷贝。使初始多重产物分布至48个孔或初级PCR反应室中，例如如图50中所说明通过使用声学微滴喷射与基因座特异性引物、缓冲液以及聚合酶混合至初级PCR反应室中。每个孔或初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体的20个拷贝。以32个一组的群组进行2-3个巢式PCR循环，每个原始病原体靶标最多80至160个拷贝。任选用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除以改善产物在微孔隙中与固定化引物的杂交。使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。PCR扩增每个微孔隙中的多种产物，并且熔解掉非锚定链。进行边合成边测序。微孔隙中的泊松分布将计数靶序列，而直接序列信息将鉴定变体病原体。
图40提供用于对一条靶标链中的突变进行测序和鉴定的引物设计的一个实施方案。在此实施方案和以下实施方案中，原始基因组区段包含cfDNA的区段(约160bp)或含有例如肿瘤特异性突变的剪切的基因组DNA的区段(约160bp)(图40，步骤A)。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度突变，每个突变体片段位于不同的初级PCR反应室中。因此，当突变存在于两个或更多个初级PCR反应室中时，它很可能为真实突变而不是聚合酶错误。提供巢式基因座特异性引物对以扩增靶序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含第二5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3'OH(图40，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、内部片段标识符以及第二5'通用或标签序列的补体的产物。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图40，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。(图40，步骤D)。在另一变化形式中，使含有第二标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成片段的全长双链拷贝。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(未示出，但类似于以下图41)。
图41和图42提供用于对重叠片段上一条靶标链中的突变进行测序和鉴定的引物设计的实施方案。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度突变，每个突变体片段位于不同的初级PCR反应室中。在重叠区上(即针对癌症特异性基因的一个或多个外显子)提供巢式基因座特异性引物对以扩增重叠靶序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含稍微不同于第一通用或标签序列的第二5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3’OH(图41，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生重叠产物，较短(比引物二聚体稍长)与较长产物(包含靶序列的100或更多个碱基)均含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、内部片段标识符以及第二5'通用或标签序列的补体。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图41，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。在一种变化形式中，将含有第二标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成片段的全长双链拷贝(图41，步骤D)。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。较短产物形成锅柄状物并且不扩增。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(图41，步骤E)。图43步骤A特写说明较长产物而非较短产物如何扩增。在另一变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。较短产物形成锅柄状物并且不扩增。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。(图42，步骤D)。图43步骤B特写说明当一个引物被固定时较长产物而非较短产物如何扩增。
图44和图45提供用于对重叠片段上一条靶标链中的突变进行测序和鉴定的引物设计的一个实施方案。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度突变，每个突变体片段位于不同的初级PCR反应室中。在重叠区上(即针对癌症特异性基因的一个或多个外显子)提供巢式基因座特异性引物对以扩增重叠靶序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含第二5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。将引物对设计成使得重叠组呈反向取向，即较短产物(约为引物二聚体尺寸)将由具有相同标签序列的引物产生，而较长产物将由具有两个不同标签序列的引物产生。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3'OH(图44、图45，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生重叠产物，较短(比引物二聚体稍长，具有相同标签)与较长产物(包含靶序列的100或更多个碱基)均含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、内部片段标识符以及第二5'通用或标签序列的补体。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图44、图45，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。较短产物丢失第二标签序列(图44，步骤D)，或形成锅柄状物，所述锅柄状物不扩增，并且另外不连接至固体支撑物(图45，步骤D)。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。(图44和图45，步骤D)。在另一变化形式中，使含有第二标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成片段的全长双链拷贝。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。较短产物丢失第二标签序列，或形成锅柄状物，所述锅柄状物不扩增，并且另外不连接至固体支撑物。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(未示出，但类似于图41)。
图46提供用于对重叠片段上两条靶标链中的突变进行测序和鉴定的引物设计的一个实施方案。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度突变，每个突变体片段位于不同的初级PCR反应室中。在重叠区上(即针对癌症特异性基因的一个或多个外显子)提供巢式基因座特异性引物对以扩增重叠靶序列，每个引物对包含：(i)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、片段标识序列、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含相同或稍有不同的第一5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3’OH(图46，步骤B)。使用热稳定性聚合酶，优选为Taq DNA聚合酶进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生重叠产物，较短产物(但大部分由Taq聚合酶的5'-＞3'核酸外切酶活性破坏，因为上游引物的延伸将进入较短延伸产物)与较长产物(包含靶序列的100或更多个碱基)两者均含有第一5'通用或标签序列部分、内部片段标识符、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、另一内部片段标识符以及相同或稍有不同的第一5'通用或标签序列的补体。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图46，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的两个末端的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(图46，步骤E)。在另一变化形式中，使含有第一标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成每个片段的两条链的全长双链拷贝。添加第三组巢式基因座特异性引物，所述巢式基因座特异性引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。第三组基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸，优选适合于使用链置换聚合酶的1-2个PCR循环的3’OH。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对较长产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。
图47提供用于对两条基因座链的SNP进行测序和鉴定以及计数其拷贝数的引物设计的一个实施方案。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度突变，每个突变体片段位于不同的初级PCR反应室中。提供基因座特异性引物对以扩增含有SNP的靶序列，每个引物对包含：(i)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、片段标识序列、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含相同或稍有不同的第一5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3’OH(图47，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生含有第一5'通用或标签序列部分、内部片段标识符、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、另一内部片段标识符以及相同或稍有不同的第一5'通用或标签序列的补体的产物。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图47，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的两个末端的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序。(图47，步骤E)。在另一变化形式中，使含有第一标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成每个片段的两条链的全长双链拷贝。添加第三组巢式基因座特异性引物，所述巢式基因座特异性引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。第三组基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸，优选适合于使用链置换聚合酶的1-2个PCR循环的3’OH。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(未示出，但类似于图41)。
图48为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于鉴定血浆中的低丰度未知突变的腔室架构和微孔或微孔隙；使用片段标识符PCR-测序。在图48中，输入样品通过导管120流体连接至一组六方形室122(含有大槽124和挡板123，初级PCR反应室)，所述六方形室122通过导管126流体连接至长较窄混合室128，所述长较窄混合室128通过导管130流体连接至包含具有微孔隙的子部分232的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将微孔隙用固定化单一通用引物预填充，并且将微孔隙干燥。由于所有子部分含有相同引物，所以它们可通过所述列或通过其他方式添加。在使用筒柱期间，使反应物沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的48列和64行(各4个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，将初始血浆DNA(最高水平为10,000个基因组当量)与缓冲液、酶、片段标识符引物组合，均等分离，并且流体移动至菱形室组中，分布至初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室平均分布每个靶标的200个拷贝，具有最多1个突变。任选地，含有RNA碱基和3’阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物的一侧或两侧产生单链尾部，这有助于杂交至微孔隙中的固定化引物。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个微孔隙中的一种或多种产物并且熔解掉非锚定链。添加具有独特标签特异性部分的靶标特异性或通用引物作为测序引物。进行边合成边测序。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基，用于准确计数每个突变，并且在两条链上验证。在一个实施方案中，使用72个测序引物来覆盖沃森与克立克链的36个靶区域，必要时包括重叠区。如果需要，则可再使用72个测序引物。在另一实施方案中，将筒柱设计成有空间进行4轮测序＝288个引物，覆盖144个靶区域，两条链，并且准确计数每个突变。在另一实施方案中，原始巢式引物还可用作测序引物。另外，可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-12个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对72种产物进行测序。任选地，使用下一测序引物重复以对接下来的72个片段进行测序。
在一个替代实施方案中，使用48个双列和48个双行等于2,304个子部分鉴定和计数低丰度突变，每个子部分包含11,040个微孔隙，每个双列具有529,920个微孔隙。使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中，例如如图50中所说明通过使用声学微滴喷射与基因座特异性引物、缓冲液以及聚合酶混合至48个初级PCR反应室中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个子部分每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1处理，并且使产物分布至具有529,920个微孔隙的部分(列)中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约1200个拷贝，并且如果突变存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个微孔隙中的多种产物，并且随后熔解掉非锚定链。在一个实施方案中，添加256个测序引物，覆盖沃森与克立克链的128个靶区域，必要时包括重叠区。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。529,920个微孔隙中约307,200个微孔隙将产生序列信息，其中的约75％提供每轮测序的单一PCR产物的读段。每当需要时就再添加256个测序引物以对与所需的一样多的靶区域进行测序。在一个实施方案中，原始巢式引物还可用作测序引物。在另一实施方案中，可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-16个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对256种产物进行测序。任选地，使用下一测序引物重复以对接下来的256个片段进行测序。
图48中说明的设计还适合于血浆中的非侵入性三体性产前测试(NIPT)；使用片段标识符PCR-测序。基本思路是为计数存在每条链的多少个拷贝。由于在初级PCR反应室中的每一者中沃森链应与克立克链相匹配(因为它们由每条链中的一者的给定片段产生)，所以这是链损失或其他错误的内部对照。使用染色体2(对照)、13、18、21、X以及Y上的多个独特基因座来确定拷贝数以及鉴别三体性或其他染色体拷贝变化。
在制造筒柱期间，将微孔隙用固定化单一通用引物预填充，并且将微孔隙干燥。由于所有子部分含有相同引物，所以它们可通过所述列或通过其他方式添加。在使用筒柱期间，使反应物沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的48列64行(各4个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，将初始血浆DNA(调节至2,000个基因组当量)与缓冲液、酶、片段标识符引物组合，均等分离，并且流体移动至菱形室组中，分至48个初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室平均分布每个基因座的40个拷贝，具有不同的SNP。任选地，含有RNA碱基和3’阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物的两侧产生单链尾部，这有助于杂交至微孔隙中的固定化引物。如果需要，则添加新鲜PCR试剂，与每个初级PCR反应室的PCR产物混合，并且分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个微孔隙中的一种或多种产物并且熔解掉非锚定链。添加具有独特标签特异性部分的靶标特异性或通用引物作为测序引物。进行边合成边测序。产生序列信息的约50个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基，用于准确计数每个SNP和染色体拷贝数，并且在两条链上验证。
在一个替代实施方案中，为鉴定NIPT中的染色体拷贝变化，使用48个双列和48个双行等于2,304个子部分，每个子部分包含11,040个微孔隙，每个双列具有529,920个微孔隙。使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。将血浆/样品中的DNA调节至2,000个基因组当量。例如如图50中所说明通过使用声学微滴喷射使与基因座特异性引物、缓冲液以及聚合酶混合的初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室每个基因座平均40个拷贝，具有不同的SNP。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1处理，并且使每个初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定基因座将具有每个子部分约240个拷贝(沃森链120个并且克立克链120个)。使用巢式基因座特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物，并且熔解掉非锚定链。在一个实施方案中，添加2,208个测序引物(或一个引物，参见下文)，覆盖沃森与克立克链的1,104个基因座区域。产生序列信息的约50个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。任选再添加2,208个测序引物(或一个引物，参见下文)。以上计算是基于平均填充约50％的微孔隙。(泊松分布：平均λ＝0.4；初始百分比x＝0)。在此类条件下，约60％的微孔隙将不给出任何测序读段，约30％为独特的(即单读段)，约7.5％将给出双读段，并且约1.3％将给出三重读段。在实践水平上，单读段明确用于区分SNP。双读段可用于确定基因座，但双读段不得用于区分SNP。在单读段与双读段之间，超过90％的链被覆盖，并且由于所述分布为基本上随机的，所以此方法会提供存在于初始样品中的每条链的高度准确的计数。在一个实施方案中，原始巢式引物还可用作测序引物。在另一实施方案中，可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-16个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对368种产物进行测序。使用下一测序引物重复以对接下来的1,104个片段进行测序。
准确计数临床样品中的拷贝数的能力同样具有额外用途。在NIPT领域，可能有机会从头检测杜兴氏肌营养不良(DMD)。此疾病可归因于DMD基因的一部分的缺失偶发地产生。覆盖SNP与DMD上的所有外显子将允许准确评估拷贝损失。
准确计数拷贝数与SNP两者的能力的另一实施方案将为最初在循环肿瘤细胞(CTC)中，但最终同样在cfDNA中鉴定LOH或基因扩增。通过确定所述患者正常细胞中的二倍体基因组的单倍型将促进此方法，这可通过标准方法由从血沉棕黄层级分(多形核白细胞，PMN)分离的DNA来实现。为实现统计显著性将需要足够的DNA，但简单来说，如果在给定染色体臂上存在所有SNP的一致不足计数或过量计数(即8p，在癌症中常常损失；或20q，在癌症中常常增加)，则将分别表明临床样品中所述臂的损失或增加。根据血浆样品中肿瘤源性cfDNA的百分比，此技术可对癌症检测(即在设法鉴定cfDNA中的LOH时)足够敏感，并且它可帮助指导治疗决定，或监测疗法功效(即在直接由CTC针对拷贝变化进行评分时)。
图49A至图49B为用于以下情况的筒柱104和阀门设置的示意性侧视图：使用片段标识符PCR-测序鉴定血浆中的低丰度未知突变；使用多重PCR-巢式PCR-测序鉴定未知病原体；以及使用片段标识符PCR-测序鉴定血浆中的低丰度甲基化和未知突变。图49A为说明微通道流体连接至具有5微米直径的微孔隙202的阵列的子部分的示意性正视图。微孔隙阵列的底部具有另一层238。为简单起见，所述图说明一个初始多重反应室110、16个初级多重PCR反应室116(含有槽118)、16个二级多重反应室122(含有槽124和挡板123)、16个窄混合室128以及包含具有16列和数百万个微孔隙或微孔的子部分232的一个主室。如图所示这些腔室通过导管114、120、126以及130连接在一起。流体通过入口102进入筒柱104并且通过出口108离开。然而，还可使用其他腔室配置，例如描述于图48中的用于病原体检测的多重PCR-巢式PCR-测序将不需要二级多重反应室。图49B示出了使用由数百万个微孔隙202组成的微孔隙板进行片段标识符PCR-测序的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧244(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧246(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4、5以及6连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过初始反应室110、48个初级PCR反应室116以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、初级PCR反应室116以及初始反应室110。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配片段标识符PCR引物、PCR预混液、UDG/APE1预混缓冲液、巢式和通用引物、洗涤物、EtOH以及空气，穿过初始多重反应室、PCR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门5分配测序引物组1、2以及3、缓冲液、EtOH、空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门6到达废料处。阀门5还可选择阀门4。阀门4分配包括用于边合成边测序的聚合酶和适当荧光标记核苷酸的延伸混合物、冲洗缓冲液、成像缓冲液、裂解缓冲液以及洗涤物。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门6反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表6：片段标识符PCR-测序(突变)的试剂设置
图49B说明若干加热元件，所述加热元件将被设计成向初始多重反应室110、初级24-48个多重PCR反应室116、二级24-48个多重反应室122以及包含具有24-48列和数千个微孔隙或微孔的子部分232的主室提供独立加热/冷却。可将背面板206(与正面板204相对)或微孔隙或微孔腔室的一个或多个平面表面以及反应室压在这些加热元件上，以允许温度控制、加热和/或热循环。如图49中所说明，初级24-48个多重PCR反应室116、二级24-48个多重反应室122后面的两个加热元件将被设计成两个矩形(水平)条带以独立于所有二级室对所有初级室进行控制。还可使用替代配置。举例来说，对于任一腔室/或初始反应室110、初级室116、二级室118、混合室120以及包含具有数千个微孔或微孔隙的子部分232的主室，使每个初级室具有独立加热元件、使额外行的腔室(即初级、二级、三级等)具有额外行的加热元件和/或使24-48空间多重排列呈不同于行或列的几何形状。还可使用替代配置，例如可将初始有限循环PCR分成两个步骤：(i)在阻断引物以抑制野生型DNA延伸或不阻断引物的情况下进行单侧多重引物线性延伸，以及(ii)添加互补引物用于初始延伸产物的一个或两个PCR扩增循环。作为另一实例，板可包括24个单独输入孔，每个输入孔流体连接至个别初级多重PCR反应室116、个别二级多重反应室122、个别混合室128以及包含具有数千至数百万个微孔隙或微孔的子部分232的个别腔室。样品可经历任选的初始多重反应，然后经由声学微滴喷射或其他流体方式输入24个个别输入孔。
还可使用图49的筒柱和阀门设置使用多重PCR-巢式PCR-测序来鉴定未知病原体。此图说明使用由数百万个微孔隙组成的微孔隙板进行多重PCR-巢式PCR-测序的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部244，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部246，说明于板的右侧)与阀门4、5以及6连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过初始多重反应室110、48个PCR反应室116以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、初级PCR反应室116以及初始反应室110。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配初始多重PCR引物、PCR预混液、初始逆转录引物、逆转录预混液、UDG/APE1预混缓冲液、巢式和通用引物、洗涤物、EtOH以及空气，穿过初始反应室110、初级PCR反应室116以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门5分配测序引物组1、2以及3、缓冲液、EtOH、空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门6到达废料处。阀门5还可选择阀门4。阀门4分配包括用于边合成边测序的聚合酶和适当荧光标记核苷酸的延伸混合物、冲洗缓冲液、成像缓冲液、裂解缓冲液以及洗涤物。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门6反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表7：PCR-测序(未知病原体)的试剂设置
图50为用于鉴定血浆中的低丰度未知突变的具有入口402和出口408的替代筒柱404以及阀门设置的示意性视图；使用片段标识符PCR-测序。图A示出了微通道流体连接至具有5微米直径的微孔隙的阵列的示意性正视图。此设置是用于上文所描述的替代实施方案，即当使用48个双列和48个双行等于2,304个子部分，每个子部分包含11,040个微孔隙，每个双列具有529,920个微孔隙时。在这些实施方案中，在单独的孔或反应室452中进行初始反应，然后利用通过导管455进行声学微滴喷射来推动适当试剂、酶、缓冲液、靶标和/或预扩增靶标穿过导管454进入开口456，所述开口456通往输入具有包含微孔隙的列的腔室和子部分432。随后，板流体连接至4个阀门(图C)。离开子部分432的液体穿过导管454、腔室467以及通往出口405的导管457。微孔隙板为从孔隙两侧通过通道240和242流体可及的：第一侧206(说明为板的顶部)与阀门1和3连通，而第二侧204(说明为板的底部)与阀门2和4连通。阀门1分配包括用于边合成边测序的聚合酶和适当荧光标记核苷酸的延伸混合物、冲洗缓冲液、成像缓冲液、裂解缓冲液、洗涤物、轻油以及ETOH。阀门2分配洗涤物、冲洗缓冲液、裂解缓冲液、ETOH、重油以及空气。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门4反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
图51提供用于对一条靶标链中的甲基化进行测序和鉴定的引物设计的一个实施方案。将cfDNA用Bsh1236I(CG^CG)处理以完全消化初始反应室中的未甲基化DNA。用亚硫酸氢盐处理，亚硫酸氢盐将C但不将5meC转化为dU，并且使得所述链为非互补的。使样品分布至48个初级PCR反应室中。空间分布将确保对于低丰度甲基化，每个甲基化片段位于不同的初级PCR反应室中。因此，当甲基化存在于两个或更多个初级PCR反应室中时，它很可能为真实甲基化而不是归因于不完全裂解或亚硫酸氢盐转化。提供巢式基因座特异性引物对以扩增靶序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含第二5'通用或标签序列部分、片段标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3’OH(图51，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的靶序列、内部片段标识符以及第二5'通用或标签序列的补体的产物。使用以下物质破坏原始亚硫酸氢盐转化的DNA、引物以及产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图51，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(图51，步骤D)。在另一变化形式中，使含有第二标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成片段的全长双链拷贝。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但所述微孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(未示出，但类似于图41)。
图52为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于鉴定血浆中的低丰度甲基化和未知突变的腔室架构和微孔或微孔隙；使用片段标识符PCR-测序。在图52中，输入样品通过入口112流体连接至六边形室110(底部，初始反应室)，所述六边形室110通过导管114流体连接至第一组的六方形室116(含有小槽118，初级PCR反应室)，所述六方形室116通过导管120流体连接至第二组的六方形室122(含有大槽124和挡板123，二级反应室)，所述六方形室122通过导管126流体连接至长较窄混合室128，所述长较窄混合室128通过导管130流体连接至包含具有微孔隙的子部分232的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将微孔隙用固定化单一通用引物预填充，并且将微孔隙干燥。由于所有子部分含有相同引物，所以它们可通过所述列或通过其他方式添加。在使用筒柱期间，使反应物沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的48列和64行(各4个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，将初始血浆DNA(最高水平为10,000个基因组当量)对半分成两份，第二半暂时储存。将第一半与缓冲液、酶、片段标识符引物组合，均等分离，并且流体移动至第一组的菱形室中，分布至48个初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室平均分布每个靶标的200个拷贝，具有最多1个突变。任选地，含有RNA碱基和3’阻断基的引物仅在结合于正确靶标时在RNA酶H2存在下解锁，从而提供额外特异性并且避免伪产物。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物的一侧或两侧产生单链尾部，这有助于杂交至微孔隙中的固定化引物。使产物流体移动到二级反应室，并且对较早的腔室进行排放和洗涤。在初始反应室中用Bsh1236I消化第二半的样品。用亚硫酸氢盐处理消化过的DNA，并且将DNA链再纯化。将亚硫酸氢盐处理的DNA与引物、试剂以及聚合酶混合，并且分布至第一组的48个初级PCR反应室中。在限制性核酸内切酶裂解之后血浆中DNA的最高水平为约200个基因组当量。在核酸内切酶处理之后，每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生最初甲基化的DNA的上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除，以在PCR产物一侧或两侧产生单链尾部。将这些甲基化特异性初级PCR产物与早期突变特异性产物在二级反应室中组合，然后向上移动至长(较窄)混合室中，同时与新鲜缓冲液、引物以及聚合酶混合，然后，最后使产物分布至包含每一列的微孔隙的腔室中。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个微孔隙中的一种或多种产物并且熔解掉非锚定链。添加具有独特标签特异性部分的靶标特异性或通用引物作为测序引物。进行边合成边测序。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基，用于准确计数每个突变，并且在两条链上验证。在一个实施方案中，使用72个测序引物来覆盖36个靶区域以鉴定和验证沃森与克立克链两者中的突变，必要时包括重叠区。如果需要，则可再使用72个测序引物。在另一实施方案中，将筒柱设计成有空间进行4轮测序＝288个引物，覆盖144个靶区域，两条链，并且准确计数每个突变。在另一实施方案中，原始巢式引物还可用作测序引物。另外，可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-12个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对72种产物进行测序。任选地，使用下一测序引物重复以对接下来的72个片段进行测序。在一个实施方案中，以与含潜在突变的区域相同的一轮测序对甲基化区域进行测序。在另一实施方案中，独立测序操作中的一者中覆盖甲基化区域，所述独立测序操作理论上可覆盖2,760个甲基化区域，并且准确计数每个甲基化区域。
在一个替代实施方案中，使用48个双列和48个双行等于2,304个子部分对低丰度甲基化和突变进行鉴定和计数，每个子部分包含11,040个微孔隙，每个双列具有529,920个微孔隙。将初始血浆样品对半分成两份，然后使一半分布至48个孔或初级PCR反应室中，例如如图50中所说明通过使用声学微滴喷射与基因座特异性引物、缓冲液以及聚合酶混合至48个子部分中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1处理以将通用引物序列从产物中移除。在孔或初始反应室中用Bsh1236I消化第二半的样品。用亚硫酸氢盐处理消化过的DNA，并且将DNA链再纯化。将亚硫酸氢盐处理的DNA与引物、试剂以及聚合酶混合，并且分布至48个孔或初级PCR反应室中。在限制性核酸内切酶裂解之后血浆中DNA的最高水平为约200个基因组当量。在核酸内切酶处理之后，每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生最初甲基化的DNA的上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。用UDG/APE1处理以将通用引物序列从产物中移除。将来自每个初级PCR反应室的甲基化和突变靶标产物组合并且分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定突变靶标将具有每部分(列)约1200个拷贝，并且如果突变存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。假设75％捕获，给定甲基化靶标将具有每部分(列)约16个拷贝，并且如果甲基化区域存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个微孔隙中的多种产物，并且熔解掉非锚定链。在一个实施方案中，添加256个测序引物，覆盖沃森与克立克链的128个靶区域，必要时包括重叠区。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。529,920个微孔隙中约307,200个微孔隙将产生序列信息，其中的约75％提供每轮测序的单一PCR产物的读段。每当需要时就再添加256个测序引物以对与所需的一样多的靶区域进行测序。在一个实施方案中，原始巢式引物还可用作测序引物。在另一实施方案中，可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-16个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对256种产物进行测序。任选地，使用下一测序引物重复以对接下来的256个片段进行测序。在一个实施方案中，以与含潜在突变的区域相同的一轮测序对甲基化区域进行测序。在另一实施方案中，独立测序操作中的一者中覆盖甲基化区域，所述独立测序操作理论上可覆盖19,200个甲基化区域，并且准确计数每个甲基化区域。因此，如果仅对甲基化区域使用主通用序列，则此单一引物可在单一操作中涵盖所有甲基化区域。
还可使用图49的筒柱和阀门设置来鉴定血浆中的低丰度甲基化和未知突变；使用片段标识符PCR-测序。此图说明使用由数百万个微孔隙组成的微孔隙板进行片段标识符PCR-测序的流体学系统。微孔隙板为从孔隙两侧流体可及的：第一侧(板的顶部，说明于板的左侧)与阀门1、2以及3连通，而第二侧(板的底部，说明于板的右侧)与阀门4、5以及6连通。阀门1分配溶解/蛋白酶缓冲液、酶、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、缓冲液、EtOH、轻油以及重油，按需要穿过初始反应室、48个初级PCR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门3反向引入空气来腾出微孔隙板的第一侧、其他腔室、初级PCR反应室以及初始反应室。阀门1还可选择阀门2。阀门2分配片段标识符PCR引物1、PCR预混液、UDG/APE1预混缓冲液、巢式和通用引物1、Bsh1236I、亚硫酸氢盐、片段标识符PCR引物2、巢式和通用引物2、洗涤物、EtOH以及空气，穿过初始多重反应室、PCR反应室以及额外腔室，穿过微孔隙板的第一侧通过阀门3到达废料处。阀门5分配测序引物组1、2以及3、缓冲液、ETOH、空气、轻油、重油以及废料，穿过微孔隙板的第二侧通过阀门6到达废料处。阀门5还可选择阀门4。阀门4分配包括用于边合成边测序的聚合酶和适当荧光标记核苷酸的延伸混合物、冲洗缓冲液、成像缓冲液、裂解缓冲液以及洗涤物。此外，阀门1可选择废料口，所述废料口可用于通过经阀门6反向引入空气来腾出第二侧微孔隙板。
表8：片段标识符PCR-测序(突变和甲基化)的试剂设置
图49B说明若干加热元件，所述加热元件将被设计成向初始多重反应室110、初级24-48个多重PCR反应室116、二级24-48个多重反应室122以及包含具有24-48列和数千个微孔隙或微孔的子部分232的主室提供独立加热/冷却。可将背面板或微孔隙或微孔腔室的一个或多个平面表面以及反应室压在这些加热元件上以允许温度控制、加热和/或热循环。如图49中所说明，初级24-48个多重PCR反应室116、二级24-48个多重反应室122后面的两个加热元件将被设计成两个矩形(水平)条带以独立于所有二级室对所有初级室进行控制。还可使用替代配置，例如对于任一腔室/或者初始反应室110、初级室116、二级室122、混合室128以及包含具有数千个微孔或微孔隙的子部分232的主室，使每个初级室具有独立加热元件、使额外行的腔室(即初级、二级、三级等)具有额外行的加热元件和/或使24-48空间多重排列呈不同于行或列的几何形状。还可使用替代配置，例如可使用针对甲基化DNA的甲基特异性结合蛋白或抗体替代Bsh1236I选择过程来富集甲基化DNA。此步骤可在筒柱内或在使甲基富集的DNA进入筒柱中之前进行。在亚硫酸氢盐处理之后，可将初始有限循环多重PCR分成两个步骤：(i)在阻断引物以抑制未甲基化DNA DNA延伸或不阻断引物的情况下进行单侧多重引物线性延伸，以及(ii)添加互补引物用于初始延伸产物的一个或两个PCR扩增循环。
图53提供用于对低丰度和中等丰度lncRNA、mRNA以及剪接变体进行测序的引物设计的一个实施方案。在初始反应室中使用逆转录酶用3'转录物特异性引物形成cDNA拷贝(图53，步骤A)。使样品分布至24个初级PCR反应室中。提供巢式转录物特异性引物对以扩增转录物序列，每个引物对包含：(i)第一基因座特异性引物，所述引物包含第一5'通用或标签序列部分、基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基；以及(ii)在整个引物序列中具有两个或更多个dU碱基的第二基因座特异性引物，所述引物包含第二5'通用或标签序列部分、转录物标识序列和基因座特异性3'部分、可裂解碱基(诸如核糖核苷酸)以及3'末端的阻断基。基因座特异性引物仅在结合于cDNA或补体时在RNA酶H2存在下解锁，释放适合于聚合酶介导的延伸的3'OH(图53，步骤B)。使用热稳定性聚合酶(优选为链置换聚合酶)进行两个或三个PCR扩增循环。这些扩增循环产生含有第一5'通用或标签序列部分、两个基因座特异性引物部分之间的转录物序列、内部转录物标识符以及第二5'通用或标签序列的补体的产物。使用以下物质破坏原始引物和产物中引物的部分：UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)以及任选的APE1(人无嘌呤核酸内切酶；图53，步骤C)。这使得每种双链扩增产物的末端中的一者的一部分为单链的。在一种变化形式中，使产物分布至含有固定化第二标签序列引物的微孔隙中或微孔隙中的珠粒中。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定孔通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但是所述孔隙可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(图53，步骤D)。在另一变化形式中，使含有第二标签序列的生物素化引物退火至单链区域。链置换聚合酶延伸以形成片段的全长双链拷贝。延伸与游离生物素化引物两者均捕获于要分布于微孔隙中的链霉亲和素涂布的珠粒上，或直接捕获于链霉亲和素涂布的微孔隙上。在存在第一与第二标签引物的情况下，在微孔隙中对产物进行PCR扩增，使得给定微孔隙通常含有给定区域的零个或一个克隆扩增物，但可含有来自不同区域的多个克隆扩增子。在变性和移除未结合片段之后，剩余的拴系的单链靶DNA适合于引物引导的测序(未示出，但类似于图41)。
图54为允许液体流体移动至包含微孔或微孔隙的腔室的示例性前腔室加载设计的一部分的示意性正视图。此设计说明适合于进行多重RT-PCR-巢式PCR-UniTaq检测以计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA、剪接变体或基因融合物的腔室架构和微孔或微孔隙。(或者，使用靶标特异性TaqmanTM探针的多重RT-PCR-巢式PCR-实时PCR)。输入样品通过入口12流体连接至六边形室10(底部，初始反应室)，所述六边形室10通过导管14流体连接至第一组的六方形室16(每组8个，分别含有大槽18c、中槽18b以及小槽18a(大槽18a在图54中示出)，初级PCR反应室)，所述六方形室16通过导管20流体连接至第二组的六方形室22(每组2个，分别含有大槽24a和小槽24b，二级反应室)，所述六方形室22通过导管26流体连接至长较窄混合室28，所述长较窄混合室28通过导管30流体连接至包含具有微孔或微孔隙的子部分32的腔室(图的顶部，仅说明4行)。所述图未按比例绘制并且用于说明目的。在制造筒柱期间，将各行用1-4组UniTaq引物(或者，1-4组通用标签引物与靶标特异性TaqmanTM探针)预填充。在制造筒柱期间，将向上通往微孔或微孔隙的列的腔室用在5'末端具有UniTaq或通用标签序列的巢式PCR引物组预填充。图式左侧的灰色圆形17说明用于例如通过声学微滴喷射、毛细管、喷墨或羽毛管印刷来递送或印刷引物组的可能位置。将引物干燥，并且组装筒柱的覆盖部分以将探针组密封在其适当位置。在使用筒柱期间，反应物从筒柱的初始室沿筒柱向上流体移动，并且最终沿微孔或微孔隙的列向上移动，其中每一列与其相邻列分离。在此说明性实例中，示出了所计划的48列(4个)和64行(8个)等于3,072个子部分，每个子部分包含2,760个微孔隙，阵列中总计8,478,720个微孔隙，初始多重逆转录PCR持续9个循环，以在初始反应室中产生每个原始转录物的512个拷贝。使初始多重产物分布至初级PCR反应室中，每个初级PCR反应室中平均分布每个原始转录物的20个拷贝。使用具有UniTaq或通用标签的靶标特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行10个巢式PCR循环。将每个初级PCR反应室设计成在排放之后保留某一百分比的液体体积。进行3个填充和排放循环以将产物差异稀释。将来自初级PCR反应室中的每一者的产物稀释至2个二级反应室中。将每个二级反应室设计成在排放之后保留某一百分比的液体体积。进行2个填充和排放循环以将产物差异稀释。使巢式PCR产物分布至混合室中，然后进入每一列的微孔隙。每一行中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。微孔隙中的泊松分布将计数低拷贝、中拷贝以及高拷贝lncRNA、mRNA、剪接变体或基因融合物。
实施例
预测实施例1--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预点样阵列)：请参见图16、图17、图18以及图24。
可将分析设计成用于检测和定量384、768或1,536个潜在靶标。筒柱的制备将需要将24x 16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面，以直角添加UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-384、768或1536个潜在靶标。在初始反应室中进行9个多重PCR循环，产生每个原始病原体的最多512个拷贝。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物可包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至24个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。使用具有UniTaq尾部的引物以16、32或64个引物组的群组进行5个巢式PCR循环，每个原始病原体最多640个拷贝。
3.使每个初级PCR反应室的产物分布至384个微孔或微孔隙中。每个子部分(包含24个微孔或微孔隙)平均将得到每个原始病原体的40个拷贝，给定孔得到原始病原体的一个或两个拷贝。如果病原体以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。使用UniTaq引物组PCR扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。24个微孔或微孔隙(每个子部分)中的泊松分布(Poisson distribution)将计数最初以低丰度存在的病原体特异性靶标，而24个微孔或微孔隙(每个子部分)的Ct值将提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
注释1：此分析模式的成功取决于不存在由UniTaq引物形成的引物二聚体，尤其当使用巢式引物时。使用3'-阻断的UniTaq引物和RNA酶H2在RNA碱基处解锁将解决此问题(参见图17)。也可对巢式引物组使用相同的3'阻断/RNA酶方式，然而存在微小的风险，此类引物将不太有效，因为病原体的序列偏移可能会阻止引物扩增所述特定靶标。
注释2：用于避免来自引物二聚体的非靶标依赖性信号的另一方法为使用在标签区域中包含部分靶序列的巢式引物并且使用缺乏5'-3'核酸酶活性的链置换聚合酶扩增靶标内的互补区域。在UniTaq扩增步骤和双链产物的变性之后，标记的产物形成苜蓿叶式结构，从而将探针中的RNA碱基带到双链形式中并且适合于在RNA酶H2存在下释放荧光基团(参见图18)。然而，若在不存在病原体的情况下形成引物二聚体，则它将缺乏产物的病原体特异性序列，因此不形成苜蓿叶式结构，因此不由RNA酶H2裂解。对于病毒病原体应注意，存在微小的风险，此类引物在鉴定靶标时可能不太有效，因为靶标的序列偏移可能会妨碍形成所需苜蓿叶式结构。
注释3：对于RNA病毒，将包括初始逆转录酶步骤或可将含Tth DNA聚合酶和Mn2+的扩增缓冲液用于单一步骤RT-PCR。还应注意，可将样品分开，并且一个等分试样用于扩增潜在RNA靶标，持续10个循环，而第二个等分试样用于扩增潜在低水平细菌靶标，例如持续20个循环。然后将两种单独PCR扩增产物混合，稀释至PCR缓冲液中，并且分布至24个子部分中用于巢式PCR反应。
注释4：使用UniTaq引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标扩增子的多个巢式产物。这允许引物设计具有每个病原体2、3或4个初始靶标，随后每个靶标片段内2、3或4个巢式引物组。如果在4至16种可能的信号中观测到最少2或3种，则病原体将仅被称为阳性的。此方法的另一优点为它将限制初始多重反应中PCR引物的数目。另一优点为可将所述引物设计成使得所述信号展示于不同子部分中以缓解任何非靶标依赖性(伪)信号。
预测实施例2--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于221,1846微孔阵列模式的48x 48＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分96个微孔，并且每列4,608个微孔(声学微滴喷射至微量滴定阵列板中)：请参见图16、图17以及图18。
可将分析设计成用于检测和定量576或1,152个潜在靶标。微量滴定板的制备将需要对UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组进行点样并且在使用微量滴定板之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-576或1,152个潜在靶标。在孔或初始反应室中进行10个多重PCR循环，每个原始病原体最多1,024个拷贝。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物可包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至48个孔或初级PCR反应室中。每个孔或初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。使用具有UniTaq尾部的引物以24或48个引物组的群组进行3-4个巢式PCR循环，每个原始病原体最多160-320个拷贝。
3.使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至2组或4组分别含有96个微孔的24或12个子部分中。当使用2组时，第二组为第一组的100/1稀释。当使用4组时，每一组为前一组的20/1稀释。这允许涵盖以许多数量级存在的病原体。每个初始子部分平均将得到每个原始病原体的12个拷贝，给定微孔得到原始病原体的一个或零个拷贝。如果病原体以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。使用预点样的UniTaq引物组PCR扩增每个微孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。2组或4组稀释中96个微孔中的泊松分布将提供样品中的非常低拷贝病原体以及较高拷贝病原体的一定程度的计数。
还参见以上实施例1中的注释1-4。
预测实施例3--PCR-LDR-TaqmanTM、PCR-LDR Unitaq或PCR-LDR-分离UniTaq(UniSpTq)检测用于未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预点样阵列)：请参见图19、图20、图21以及图24。
可将分析设计成用于检测和定量384、768或1,536个潜在靶标。筒柱的制备将需要将24x 16、32或64个LDR引物对点样于阵列的正面，以直角添加UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-384、768或1536个潜在靶标。在初始反应室中进行30个PCR循环，以提供每个原始病原体的最大扩增。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至24个初级LDR反应室中，同时稀释10倍。每个初级LDR反应室中将平均分布每个原始病原体靶标的数百万个拷贝。使用具有UniTaq尾部的等位基因特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。
3.使每个初级LDR反应室的LDR产物分布至384个微孔隙中。使用UniTaq引物组PCR扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。24个微孔或微孔隙(每个子部分)的Ct值提供最初以高丰度存在的病原体特异性靶标的近似拷贝信息。
注释1：此分析模式的成功取决于不存在由UniTaq引物形成的引物二聚体，例如在存在下游LDR引物的情况下。此问题已如下得到解决：初始PCR反应包括UDG以破坏在原始样品中任何意外的遗留污染，并且PCR产物中合并dUTP。在LDR之后，UniTaq预混液含有UDG，并且将破坏任何PCR产物，使得仅LDR产物的扩增可进行(还参见图19和图20)。
注释2：当在最后一个扩增步骤中使用UniTaq引物时，所述扩增步骤可使用简单探针设计(图20)或分离探针设计(图21)来进行。如果下游连结引物的延伸产物与上游F1-Bi-Q-Ai UniTaq标签引物形成引物二聚体(图20)，则原始探针设计具有形成非连结依赖性引物二聚体的可能。引物二聚体问题可通过使用图21中所示的分离探针设计来解决。在UniTaq扩增步骤和双链产物的变性之后，标记的产物形成茎环结构，允许Taq聚合酶的5'-3'核酸酶活性延伸引物Ci并且释放荧光基团以产生信号。一旦聚合酶穿过第一茎区，则第二较短(zi-zi’)茎破裂，并且聚合酶持续延伸以形成dsDNA产物。如果存在由下游连结引物的延伸产物与上游F1-Bi-Q-Ai UniTaq标签引物产生的非连结依赖性引物二聚体产物，则所述产物将丢失zi序列，并且因此将不形成完整的茎环结构，因此当Ci延伸时，Bj探针区将不杂交至Bj'序列，荧光基团(F1)将不从淬灭剂(Q)释放。
注释3：对于RNA病毒，将包括初始逆转录酶步骤或可将含Tth DNA聚合酶和Mn2+的扩增缓冲液用于单一步骤RT-PCR。还应注意，可将样品分开，并且一个等分试样用于扩增潜在RNA靶标，持续30个循环，而第二个等分试样用于扩增潜在低水平细菌靶标，例如持续40个循环。然后将两种单独PCR扩增产物混合，稀释至LDR缓冲液中，并且分布至24个二级LDR反应室中用于LDR反应。
注释4：使用LDR引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标扩增子的多种、甚至重叠的LDR产物。这允许引物设计具有每个病原体2、3或4个初始靶标，随后每个靶标片段内2、3或4个LDR引物组。如果在4至16种可能的信号中观测到最少2或3种，则病原体将仅被称为阳性的。此方法的另一优点为它将限制初始多重反应中PCR引物的数目。另一优点为可将所述引物设计成使得所述信号展示于不同子部分中以缓解任何非靶标依赖性(伪)信号。
预测实施例4--使用通用或靶标特异性探针(例如UniLDq或TsLDq)的PCR-PCR-qLDR检测或PCR-qLDR检测用于未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预点样阵列)：请参见图22和图23。
可将分析设计成用于检测和定量384、768或1,536个潜在靶标。筒柱的制备将需要将24x 16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面，以直角添加qLDR引物和探针组，并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-384、768或1536个潜在靶标。在初始反应室中进行10-15个PCR循环，以提供每个原始病原体靶标的1,000至32,000倍扩增。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至24个初级PCR反应室中，同时稀释10倍。每个初级PCR反应室中将平均分布每个原始病原体靶标的4至130个拷贝。使用以上引物的子集或巢式引物以16、32或64个引物组的群组进行20-30个PCR循环。另外，所有PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
3.使每个初级PCR反应室的PCR产物分布至384个微孔或微孔隙中。使用如下文所描述的引物组iLDR(“i”用于等温)扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物，并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
或者，对于直接从血液进行的未知细菌病原体鉴定(使用PCR-qLDR检测)：
1.使初始样品分布至24个初级PCR反应室中。样品的初始多重扩增-32、64或128个潜在靶标。进行30-40个多重PCR循环，以提供每个原始靶标的数十亿个拷贝(如果存在)。使用“串联”PCR引物或更多PCR引物组。另外，所有PCR引物包括相同的5'尾部序列，优选为10-12个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使每个初级PCR反应室的PCR产物分布至384个微孔隙中。使用如下文所描述的引物组iLDR(i用于等温)扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物，并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
注释1：作为使用UniTaq来产生荧光信号的替代方案，引入新方法；称为“iLDR”(i用于等温)，参见图22和图23。此方法的第一种型式使用通用标签和探针序列(图22)。在此，LDR引物含有两个标签序列(Bi'；Bj')，以及与连结接点区域互补的序列(ti'，tj')。在存在PCR扩增产物的情况下，连结探针彼此邻近杂交并且使用热稳定性连结酶共价连接。在存在探针(F1-r-Bj，Bi-Q)的情况下并且在变性步骤之后，当温度降低时，探针与病原体特异性序列(ti和ti'；tj和tj')、Bi和Bi'以及Bj和Bj'之间形成4个双链茎。这使得Bj序列中的核糖碱基为双链的，使RNA酶H2能够释放荧光基团(F1)并且产生信号。裂解的探针从产物解离并且新的探针可杂交以产生额外的信号。未连结的LDR引物将不形成所有发夹，并且因此RNA酶H2将不释放信号。产生的信号量随每个杂交至先前LDR步骤中形成的累积LDR产物的步骤期间裂解多少探针而变化。举例来说，如果每种所形成的LDR产物释放10个荧光分子，则在5个LDR循环之后，信号将增加10倍，在15个循环之后，增加100倍，并且在46个循环之后，增加1,000倍。所形成的产物量为约4至5x(循环数目)^2。使用PCR-iLDR的潜在优点为所述程序仅需要2个步骤(而不是PCR-LDR-UniTaq所需的3个)。如果通过用于检测的iLDR步骤产生充足的信号，则它将总体方案简化。
注释2：iLDR的第二种型式使用序列特异性探针。在此，LDR引物含有一个标签序列(Bi’)和一个与连结接点区域互补的序列(tj’)。在存在探针(F1-r-病原体序列-Bi-Q)的情况下并且在变性步骤之后，随温度降低，病原体特异性序列(ti、tj和ti’、tj’)以及Bi和Bi'之间形成2个双链茎。这使得病原体序列中的核糖碱基为双链的，使RNA酶H2能够释放荧光基团并且产生信号。裂解的探针从产物解离并且新的探针可杂交以产生额外的信号。未连结的LDR引物将不形成两个茎，并且因此RNA酶H2将不释放信号。如上所述，产生的信号量随每个杂交至先前LDR步骤中形成的累积LDR产物的步骤期间裂解多少探针而变化。
注释3：对于RNA病毒，将包括初始逆转录酶步骤或可将含Tth DNA聚合酶和Mn2+的扩增缓冲液用于单一步骤RT-PCR。还应注意，可将样品分开，并且一个等分试样用于扩增潜在RNA靶标，持续30个循环，而第二个等分试样用于扩增潜在低水平细菌靶标，例如持续40个循环。然后将两种单独PCR扩增产物混合，稀释至LDR缓冲液中，并且分布至24个二级LDR反应室中用于LDR反应。
注释4：使用LDR引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标扩增子的多种、甚至重叠的LDR产物。这允许引物设计具有每个病原体2、3或4个初始靶标，随后每个靶标片段内2、3或4个LDR引物组。如果在4至16种可能的信号中观测到最少2或3种，则病原体将仅被称为阳性的。此方法的另一优点为它将限制初始多重反应中PCR引物的数目。另一优点为可将所述引物设计成使得所述信号展示于不同子部分中以缓解任何非靶标依赖性(伪)信号。
预测实施例5--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于直接从血液进行未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预点样阵列)：请参见图26和图27。
可将分析设计成用于检测和定量32、64或128个潜在靶标。筒柱的制备将需要将16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面，以直角添加UniTaq或通用标签和靶标特异性探针和引物组并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.使初始样品分布至24个初级PCR反应室中。样品的初始多重扩增-32、64或128个潜在靶标。进行20个多重PCR循环，每个原始靶标最多1,000,000个拷贝(如果存在)。使用“串联”PCR引物或更多PCR引物组。另外，所有PCR引物包括相同的5'尾部序列，优选为10-12个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.在二级PCR反应室中使用具有UniTaq尾部的引物以16、32或64个引物组的群组进行10个巢式PCR循环。用RNA酶H2使引物仅在结合于正确靶标时解锁。
3.使每个二级PCR反应室的PCR产物分布至384个微孔隙中。每一行中的通用引物或UniTaq引物将仅扩增来自具有正确标签的每一列的那些产物。对靶标进行预扩增和使用尾部来防止引物二聚体形成将允许在单细胞水平鉴定细菌病原体。
注释1：此分析模式的成功取决于不存在由UniTaq引物形成的引物二聚体，例如在存在巢式引物的情况下。使用3'-阻断的UniTaq引物和RNA酶H2在RNA碱基处解锁将解决此问题。也可对巢式引物组使用相同的3'阻断/RNA酶方式；然而存在微小的风险，此类引物将不太有效，因为病原体的序列偏移可能会阻止引物扩增所述特定靶标。
注释2：使用UniTaq引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标扩增子的多个巢式产物。这允许引物设计具有每个病原体2、3或4个初始靶标，随后每个靶标片段内2、3或4个巢式引物组。如果在4至16种可能的信号中观测到最少2或3种，则病原体将仅被称为阳性的。
预测实施例6--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于直接从血液进行未知病原体鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于221,1846微孔阵列模式的48x 48＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分96个微孔，并且每列4,608个微孔(声学微滴喷射至微量滴定阵列板中)：请参见图26和图27。
可将分析设计成用于检测和定量48、96或192个潜在靶标。微量滴定板的制备将需要对UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组进行点样，并且在使用微量滴定板之前将其干燥。
1.使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。样品的初始多重扩增-48、96或192个潜在靶标。进行9个多重PCR循环，每个原始病原体最多512个拷贝(如果存在)。使用“串联”PCR引物或更多PCR引物组。另外，所有PCR引物包括相同的5'尾部序列，优选为10-12个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至分别含有96个微孔的48个子部分中。子部分已用适当的巢式靶标特异性引物、UniTaq引物和/或探针预点样；(参见图16、图17以及图18)。每个初始子部分平均将得到每个原始病原体的10个拷贝，给定微孔得到原始病原体的一个或零个拷贝。如果病原体以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。使用预点样的引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。96个微孔中的泊松分布将提供非常低拷贝病原体的一定程度的计数。
参见以上实施例5的注释1-2。
预测实施例7--PCR-LDR-TaqmanTM或PCR-LDR Unitaq检测用于直接从血浆进行低丰度突变和/或CpG甲基化鉴定和定量.
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预定位阵列)：请参见图28、图29以及图30。
可将分析设计成用于检测和定量64或128个潜在靶标，允许通过单一荧光色对多个突变进行评分。筒柱的制备将需要将16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面，以直角添加UniTaq或通用标签和靶标特异性探针和引物组并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.使初始样品分布至24个初级PCR反应室中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均400个拷贝，具有最多1个突变。在阻断PNA或LNA以减少野生型DNA扩增的情况下进行10-40个基因座特异性PCR循环。任选：在PCR反应期间使用dUTP(并且用UDG预处理以避免初始样品的遗留污染。另外，所有下游PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为8-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.将每个初级PCR反应室的产物用LDR引物和缓冲液稀释，并且使产物分布至二级LDR反应室中。使用具有UniTaq尾部的等位基因特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。可设计用于相同基因的不同突变的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。可在同一反应室中或在2个单独反应室中进行LDR反应，然后再组合。
3.添加UniTaq预混液和UDG并且使每个二级LDR反应室的产物分布至384个微孔隙中。使用UniTaq引物组PCR扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
注释1.此设计提供以下选择：在板上使用相同LDR引物组或印刷不同LDR引物组，然后将其与PCR反应的等分试样组合，然后在分布至微孔隙上之前再次将产物组合。
注释2.可通过在上游引物中包括3'阻断基和RNA碱基向所述方法中合并另一层选择性。在靶标特异性杂交后，RNA酶H2移除RNA碱基以释放3'OH基团，3'OH基团在突变上游几个碱基处，并且适合于聚合酶延伸。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针将优先于上游引物竞争结合于野生型序列，但不同样多地结合于突变体DNA，并且因此抑制野生型DNA在各轮PCR期间的扩增。
注释3.同样地，可通过在下游引物中包括3'阻断基和RNA碱基向所述方法中合并另外的选择性，所述RNA碱基在靶标特异性杂交后由RNA酶H2移除。另外，可将相同的5'尾部延伸至约24-30个碱基。所述序列将允许添加“通用”引物(还包括3'阻断基和RNA碱基)，所述通用引物与用于初始PCR扩增步骤的基因座特异性引物相比将以更高浓度存在。通用引物将有助于所有PCR产物在多重扩增期间的扩增。
注释4.或者，为使多重PCR期间片段的脱扣降至最低程度，在初始反应室中进行初始“预扩增”多重PCR持续8-20个循环。然后使这些产物分布至24个初级PCR反应室中。在一种变化形式中，24个初级反应室中的每一者含有1-4个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行单一或多重PCR再持续10-30个循环以在单一初级反应室中实现含有潜在突变的1-4个不同片段的扩增。在另一变化形式中，6组4个初级反应室含有4-16个具有PNA或LNA以抑制野生型序列扩增的PCR引物组，并且进行多重PCR再持续10-30个循环，以在单一初级反应室中实现含有潜在突变的4-16个不同片段的扩增。
注释5.此设计还允许与甲基化检测组合。
关于血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量(当与突变组合时；使用亚硫酸氢盐-PCR-LDR-TaqmanTM或亚硫酸氢盐-PCR-LDR-Unitaq检测。参见图31、图32以及图30)：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将DNA链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至24个初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。在任选阻断PNA或LNA以减少野生型DNA扩增(如果需要)的情况下进行0-40个基因座特异性PCR循环。在PCR反应期间使用dUTP。另外，所有下游PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为8-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.将每个初级PCR反应室的产物用LDR引物和缓冲液稀释，并且使产物分布至二级LDR反应室中。使用具有UniTaq尾部的甲基特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。可设计用于不同甲基化区域(即相同启动子区域的上链和下链)的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。可在同一反应室中或在2个单独反应室中进行LDR反应，然后再组合。
3.添加UniTaq预混液和UDG并且使每个二级LDR反应室的产物分布至384个微孔隙中。使用UniTaq引物组PCR扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
注释1.此设计提供以下选择：在板上使用相同LDR引物组或印刷不同LDR引物组，然后将其与PCR反应的等分试样组合，然后在分布至微孔隙上之前再次将产物组合。
注释2.可通过在上游引物中包括3'阻断基和RNA碱基向所述方法中合并另一层选择性。在靶标特异性杂交后，RNA酶H2移除RNA碱基以释放3’OH基团，3’OH基团在突变上游几个碱基处，并且适合于聚合酶延伸。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针将优先于上游引物竞争结合于野生型序列，但不同样多地结合于突变体DNA，并且因此抑制野生型DNA在各轮PCR期间的扩增。
注释3.同样地，可通过在下游引物中包括3'阻断基和RNA碱基向所述方法中合并另外的选择性，所述RNA碱基在靶标特异性杂交后由RNA酶H2移除。另外，可将相同的5'尾部延伸至约24-30个碱基。所述序列将允许添加“通用”引物(还包括3'阻断基和RNA碱基)，所述通用引物与用于初始PCR扩增步骤的基因座特异性引物相比将以更高浓度存在。通用引物将有助于所有PCR产物在多重扩增期间的扩增。
注释4.在另一实施方案中，为使多重PCR期间片段的脱扣降至最低程度，在初始反应室中进行初始“预扩增”多重PCR持续8-20个循环。然后使这些产物分布至24个初级PCR反应室中。在一种变化形式中，24个初级反应室中的每一者含有1-4个PCR引物组，并且进行单一或多重PCR再持续10-30个循环以在单一初级反应室中实现含有潜在甲基化的1-4个不同片段的扩增。在另一变化形式中，6组4个初级反应室含有4-16个PCR引物组的，并且进行多重PCR再持续10-30个循环以在单一初级反应室中实现含有潜在甲基化的4-16个不同片段的扩增。
注释5.此设计还允许与突变检测组合。
预测实施例8--PCR-LDR-TaqmanTM或PCR-LDR Unitaq检测用于直接从血浆进行低丰度突变和/或CpG甲基化鉴定和定量。
下文所描述的分析将使用具有用于221,1846微孔阵列模式的48x 48＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分96个微孔，并且每列4,608个微孔(声学微滴喷射至微量滴定阵列板中)：请参见图28和图29。
可将分析设计成用于检测和定量48、96或192个潜在靶标。微量滴定板的制备将需要对UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组进行点样，并且在使用微量滴定板之前将其干燥。
1.使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。在阻断PNA或LNA以减少野生型DNA扩增的情况下进行10-40个基因座特异性PCR循环。任选：在PCR反应期间使用dUTP(并且用UDG预处理以避免初始样品的遗留污染)。
2.将每个孔或初级PCR反应室的产物用LDR引物和缓冲液稀释，并且分布至二级LDR反应室中。使用具有UniTaq尾部的等位基因特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。可设计用于相同基因的不同突变的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。可在同一反应室中或在2个单独反应室中进行LDR反应，然后再组合。
3.添加UniTaq预混液和UDG并且使每个孔或二级LDR反应室的产物分布至分别含有96个微孔隙的48个子部分中。子部分已用适当的UniTaq引物和/或探针预点样；(参见图28和图29)。使用预点样的引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
关于血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量(当与突变组合时；使用亚硫酸氢盐-PCR-LDR-TaqmanTM或亚硫酸氢盐-PCR-LDR-Unitaq检测。参见图31和图32)：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将DNA链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。在任选阻断PNA或LNA以减少野生型DNA扩增的情况下进行10-40个基因座特异性PCR循环。任选：在PCR反应期间使用dUTP。
3.将每个孔或初级PCR反应室的产物用LDR引物和缓冲液稀释，并且分布至二级LDR反应室中。使用具有UniTaq尾部的甲基特异性引物以16、32或64个引物组的群组进行20个LDR循环。可设计用于不同甲基化区域(即相同启动子区域的上链和下链)的LDR引物以在相同子部分中给出相同信号。可在同一反应室中或在2个单独反应室中进行LDR反应，然后再组合。
4.添加UniTaq预混液和UDG并且使每个孔或二级LDR反应室的产物分布至分别含有96个微孔隙的48个子部分中。子部分已用适当的UniTaq引物和/或探针预点样；(参见图31和图32)。使用预点样的引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。
还参见以上实施例7的注释1-5。
预测实施例9--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于准确计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体。
下文所描述的分析将使用具有用于9,216微孔或微孔隙阵列模式的24x 16＝384(或任选768)个子部分的筒柱，每个子部分24个微孔或微孔隙，并且每列384个微孔或微孔隙(使用预定位阵列)：请参见图33(对于剪接变体情况下的实施例)和图34。
可将分析设计成用于检测和定量384个潜在靶标。筒柱的制备将需要将16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面，以直角添加UniTaq或通用标签和靶标特异性探针和引物组并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重逆转录/扩增-384个潜在靶标。在初始反应室中进行7个多重RT-PCR循环，每个原始转录物最多128个拷贝。所有逆转录和PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至6个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室中平均分布每个原始转录物的20个拷贝。对于每个初级PCR反应室使用具有UniTaq尾部的引物以16、32或64个独特引物组的群组进行10个巢式PCR循环，每个原始转录物最多20,480个拷贝。对于此实施例，将准确定量三组不同的转录物，其中最小数目将大概为1个原始RNA转录物产生20,480个拷贝，100个原始RNA转录物产生2,048,000个拷贝，并且10,000个原始RNA转录物产生204,800,000个拷贝。
3.将六个初级PCR反应室设计成在排放之后保留反应中某一体积百分比的液体。对于此实施例，巢式PCR反应的整个体积将被指定为80单位，并且保留的量为40单位或更少。对于此说明，用于初级PCR反应室1和2的多重扩增引物组是用于低水平转录物(保留40单位的液体)，对于初级PCR反应室3和4是用于中等水平转录物(保留10单元的液体)，并且对于初级PCR反应室5和6是用于高水平转录物(保留3单元的液体)。在第一次排放之后，以下为剩余的液体和最少拷贝数的计算：
将含用于抑制聚合酶的抗体的新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且再次排放：
将含用于抑制聚合酶的抗体的新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且再次排放：
将新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且现在向上推进，平分到4个二级反应/稀释室A、B、C以及D中，这4个二级反应/稀释室的总体积为20单位，并且可保留10单位或更少。
SR-腔室3和4以及腔室5和6将具有约两倍于以上分子数目的分子数目
将新鲜10μ预混液添加至上部腔室中的剩余液体中，并且再次排放：
SR-腔室3和4以及腔室5和6将具有约两倍于以上分子数目的分子数目
将新鲜10μ预混液添加至上部腔室中的剩余液体中，并且再次排放：
SR-腔室3和4以及腔室5和6将具有约两倍于以上分子数目的分子数目
最后，在所有剩余产物和试剂移动到更大的混合室时添加充足的预混液，为移动至微孔隙中作准备。
4.使每个二级反应/稀释室的产物分布至384个微孔或微孔隙中。每个A二级反应/稀释室平均将得到每个原始转录物的5个拷贝，B、C以及D二级反应/稀释室中逐渐减少。使用UniTaq引物组PCR扩增每个孔中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。24个微孔隙中的泊松分布将提供A二级反应/稀释室中非常低拷贝转录物的计数，而B、C以及D二级反应/稀释室中的24个微孔隙中的泊松分布将提供三个至四个数量级的高拷贝转录物的计数。
二级反应/稀释室1和2将准确地计数在1个(平均填充“A”列的24个微孔隙中的约5个)至约1,500-3,000个(平均填充“D”列的24个微孔或微孔隙中的约15-21个)范围内的起始转录物。
二级反应/稀释室3和4将准确地计数在100个(平均填充“A”列的24个微孔隙中的约10个)至约150,000-300,000个(平均填充“D”列的24个微孔或微孔隙中的约15-21个)范围内的起始转录物。
二级反应/稀释室5和6将准确地计数在10,000个(平均填充“A”列的24个微孔隙中的约10个)至约15,000,000-30,000,000个(平均填充“D”列的24个微孔或微孔隙中的约15-21个)范围内的起始转录物。
注释1：此分析模式的成功取决于不存在由UniTaq引物形成的引物二聚体，例如在存在巢式引物的情况下。使用3'-阻断的UniTaq引物和RNA酶H2在RNA碱基处解锁将解决此问题。也可对巢式引物组使用相同的3'阻断/RNA酶方式；然而存在微小的风险，此类引物将不太有效，因为病原体的序列偏移可能会阻止引物扩增所述特定靶标。
注释2：使用UniTaq引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标转录物的多个巢式产物。这允许引物设计在每个转录物区域内具有2个巢式引物组。这将允许给定转录物的双重验证。此方法的另一优点为它将限制初始多重反应中PCR引物的数目。另一优点为可将所述引物设计成使得所述信号展示于不同子部分中以缓解任何非靶标依赖性(伪)信号。
注释3：作为设计具有不同稀释的不同腔室组的替代方案，单独的加热元件可在不同条件下操作不同腔室，包括改变PCR循环的数目。
预测实施例10--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于准确计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体。
下文所描述的分析将使用具有用于221,1846微孔阵列模式的48x 48＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分96个微孔，并且每列4,608个微孔(声学微滴喷射至微量滴定阵列板中)：对于剪接变体情况下的实施例请参见图33。
可将分析设计成用于检测和定量576或1,152个潜在靶标。微量滴定板的制备将需要对UniTaq或通用标签引物和靶标特异性探针组进行点样，并且在使用微量滴定板之前将其干燥。
1.样品的初始多重逆转录/扩增-576或1,152个潜在靶标。进行10个多重PCR循环，初始反应室中每个原始RNA分子最多1,024个拷贝。如果需要，则使用“串联”PCR引物。另外，所有PCR引物可包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至48个孔或初级PCR反应室中。每个孔中平均分布每个原始RNA靶标的20个拷贝。使用具有UniTaq尾部的引物以24或48个引物组的群组进行3-4个巢式PCR循环，每个原始RNA分子最多160-320个拷贝。
3.使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至2组或4组分别含有96个微孔隙的24或12个子部分中。当使用2组时，第二组为第一组的100/1稀释。当使用4组时，每一组为前一组的20/1稀释。这允许涵盖以许多数量级存在的RNA分子。每个初始子部分平均将得到每个原始RNA分子的12个拷贝，给定微孔隙得到原始RNA的一个或零个拷贝。如果RNA以更高数目存在，则每个子部分将得到额外的拷贝。使用预点样的UniTaq引物组PCR扩增每个微孔隙中的1、2或4种潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。对UniTaq引物使用一种、两种或四种不同荧光染料。2组或4组稀释中96个微孔隙中的泊松分布将提供样品中非常低拷贝RNA以及较高拷贝RNA的一定程度的计数。
还参见以上实施例9的注释1-2。
预测实施例11--PCR-PCR-测序用于未知病原体鉴定和基因分型。
下文所描述的分析将使用具有用于4,239,360微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48x 32＝1,536个子部分的筒柱，每个子部分2,760个微孔隙，并且每列88,320个微孔隙。对于使用固定化引物的多重扩增，参见图35。关于驱使扩增在固体表面上完成的细节，参见图36、图37以及图38。
可将分析设计成用于对1,536个潜在靶标进行鉴定和基因分型。筒柱的制备将需要将48x 32个PCR引物对点样于阵列的正面，背面具有32x 48个PCR测序引物并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-1,536个潜在靶标。在初始反应室中进行10个PCR循环，每个原始病原体最多1,024个拷贝。
2.使初始多重产物分布至48个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。巢式基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。以32个一组的群组进行5个巢式PCR循环，每个原始病原体最多640个拷贝。任选用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除以改善产物在微孔隙中与固定化引物的杂交。
3.使每个初级PCR反应室的产物分布至88,320个微孔隙中。每个子部分(包含2,760个微孔隙)平均将得到每个原始病原体的20个拷贝。PCR扩增每个微孔隙中的多种产物，然后熔解掉非锚定链。
4.以直角为32个子部分中的48个靶标中的每一者添加48个测序引物。允许同时对1,536个潜在靶标进行测序。2,760个微孔隙中的泊松分布使得能够计数低丰度靶标。
在相同的48个子部分处添加测序引物的情况下用于未知病原体鉴定和基因分型的PCR-PCR-测序(参见图49)：
如果以相同取向添加测序引物，即没有子部分，则存在48x n个潜在靶标，每个子部分n个微孔隙88,320个。
存在若干方式来接近此目的。一种方法为大体上细菌病原体以比病毒病原体低的水平存在。原始PCR循环可包括在不存在第二引物的情况下用于病毒病原体的RT步骤，使得它们的扩增不像细菌片段那样多。另外，原始PCR步骤可持续较少的循环，并且巢式PCR步骤也可持续更少的循环。那么，即使一些病原体以较高数目存在，在每部分(即列)88,320个微孔隙的情况下，即使一些以2,000个拷贝存在，而其他以5个拷贝存在，对每个子部分32个靶标进行测序仍将不为不合理的。注意，32个测序引物x 48的组也将被印刷于装置上。这将允许在单一测序操作中同时检测1,536个潜在靶标，并且利用2,760个微孔隙中的泊松分布。
另一方法为在通用引物与不连接至固体支撑物的一侧的巢式PCR引物的靶标特异性序列之间合并8-12个碱基的独特序列。这将允许通过使用更多通用测序引物的3'侧的8-12个碱基对各组潜在靶标进行测序。
另一方法为每组巢式PCR引物使用不同通用引物，然后在32个部分中在微孔隙内印刷所需通用组。这将有效确保每种扩增产物去到确定的行和列。此方法的优点为它还允许各种产物的单独TaqmanTM或LDR检测。
在此想法的一种变化形式中，通用引物序列为UniTaq序列。将所需UniTaq引物以32组印刷于孔隙内。此方法不需要固定所有引物，不过使用杂交至树状聚体可使其暂时固定不动。
注意到在分离至48个部分中的4色LDR-FRET检测情况下，这仍允许同时高度准确地计数192个靶标。由于48个部分中的每一者具有不同组的所扩增靶标(例如16个)，可同时添加所有384个LDR引物，并且它们将把自身分选出来。这将允许在仅仅4个LDR反应中准确定量和计数768个靶标。
预测实施例12--PCR-PCR-测序用于未知病原体鉴定和基因分型。
下文所描述的分析将使用具有用于25,436,160微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48个双列x 48个双行＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分11,040个微孔隙，并且每列529,920个微孔隙。对于使用固定化引物的多重扩增，参见图35。关于驱使扩增在固体表面上完成的细节，参见图36、图37以及图38。
可将分析设计成用于对2,304至9,216个潜在靶标进行鉴定和基因分型。筒柱的制备将需要将48x 48个PCR引物对点样于阵列的正面，背面具有48x48个PCR测序引物并且在筒柱组装之前将其干燥。
1.样品的初始多重扩增-2,304至9,216个潜在靶标。在初始反应室中进行10个PCR循环，每个原始病原体最多1,024个拷贝。
2.使初始多重产物分布至48个孔或初级PCR反应室中。每个孔或初级PCR反应室中平均分布每个原始病原体靶标的20个拷贝。巢式基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。以32个一组的群组进行2-3个巢式PCR循环，每个原始病原体最多80至160个拷贝。任选用UDG/APE1将通用引物序列从产物中移除以改善产物在微孔隙中与固定化引物的杂交。
3.使每个孔或初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。PCR扩增每个微孔隙中的多种产物，并且熔解掉非锚定链。
在相同的48个子部分处添加测序引物的情况下用于未知病原体鉴定和基因分型的PCR-PCR-测序：
如果以相同取向添加测序引物，即没有子部分，则存在48x n个潜在靶标，每个子部分n个微孔隙529,920个。
存在若干方式来接近此目的。一种方法为大体上细菌病原体以比病毒病原体低的水平存在。原始PCR循环可包括在不存在第二引物的情况下用于病毒病原体的RT步骤，使得它们的扩增不像细菌片段那样多。另外，原始PCR步骤可持续更少的循环。那么，即使一些病原体以较高数目存在，在每部分(即列)529,920个微孔隙的情况下，即使一些以2,000个拷贝存在，而其他以5个拷贝存在，对每部分(列)32个靶标进行测序仍将不为不合理的。注意，192个测序引物x 48的组也将被分布至装置中。这允许在单一测序操作中同时检测9,216个潜在靶标，并且利用529,920个微孔隙中的泊松分布。
另一方法为在通用引物与不连接至固体支撑物的一侧的巢式PCR引物的靶标特异性序列之间合并8-16个碱基的独特序列。这将允许通过使用更多通用测序引物的3'侧的8-16个碱基对各组潜在靶标进行测序。
第一组的8-16个测序引物可包含共同5'序列(16个碱基)和可变3'序列(8个碱基)。或者，第二组的64-256个测序引物可包含共同5'序列(8个碱基)、可变中间序列(8个碱基，8-16个变体)以及超可变3'序列(8个碱基，64-256个变体)。
预测实施例13--PCR-PCR-测序用于直接从血浆进行低丰度突变和/或CpG甲基化鉴定和计数。
下文所描述的分析将使用具有用于4,239,360微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48x 32＝1,536个子部分的筒柱，每个子部分2,760个微孔隙，并且每列88,320个微孔隙。参见图40至图46以及图48。
1.使初始样品分布至48个初级PCR反应室中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
2.用UDG/APE1处理，并且使每个初级PCR反应室的产物分布至88,320个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约1200个拷贝，并且如果突变存在，则将存在“沃森链(Watson strand)”的约3个拷贝和“克立克链(Crick strand)”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
3.添加72个测序引物，覆盖沃森链与克立克链的36个靶区域，必要时包括重叠区。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。
4.再添加72个测序引物。当前的筒柱容易地有空间进行4轮测序＝288个引物，涵盖144个靶区域，两条链，并且准确计数每个突变。
注释1：原始巢式引物还可用作测序引物。
注释2：可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-12个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对72种产物进行测序。使用下一测序引物重复以对接下来的72个片段进行测序。
关于血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量(当与突变组合时；使用亚硫酸氢盐-PCR-PCR测序。参见图51和图52)：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至48个初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生最初甲基化的DNA的上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
3.用UDG/APE1处理，并且使每个初级PCR反应室的产物分布至88,320个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每个初级PCR反应室约16个拷贝，并且如果甲基化区域存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
4.添加与所需的一样多的测序引物以涵盖甲基化区域。(理论上，在一次测序操作中可涵盖2,760个甲基化区域，并且准确计数每个甲基化区域。)
注释1.原始巢式引物还可用作测序引物。
关于使用亚硫酸氢盐-PCR-PCR测序(当单独进行时)对血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至48个初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对一条链进行11个片段标识符PCR循环。产生最初甲基化DNA的一条链的1,024个拷贝。
3.用UDG/APE1处理，并且使每个初级PCR反应室的产物分布至88,320个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约100个拷贝，并且如果甲基化区域存在，则将存在所述链的约24个拷贝。PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
4.以直角对32个子部分中每12个靶标添加12个测序引物。允许同时对384个潜在甲基化靶标进行测序。2,760个微孔隙中的泊松分布使得能够计数甲基化靶标。可同时评估总计384个潜在甲基化靶区域，并且准确计数每个甲基化区域。
注释1.原始靶标特异性第二引物还可用作测序引物。
预测实施例14--PCR-PCR-测序用于直接从血浆进行低丰度突变和/或CpG甲基化鉴定和计数。
下文所描述的分析将使用具有用于25,436,160微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48个双列x 48个双行＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分11,040个微孔隙，并且每列529,920个微孔隙。参见图40至图46以及图48。
1.使初始样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。血浆中DNA的最高水平＝10,000个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均200个拷贝，具有最多1个突变。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
2.用UDG/APE1处理并且使每个初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约1200个拷贝，并且如果突变存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
3.添加256个测序引物，涵盖沃森链与克立克链的128个靶区域，必要时包括重叠区。产生序列信息的约80个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。529,920个微孔隙中约307,200个微孔隙将产生序列信息，其中的约75％提供每轮测序的单一PCR产物的读段。
4.每当需要时就再添加256个测序引物以对与所需的一样多的靶区域进行测序。
注释1：原始巢式引物还可用作测序引物。
注释2：可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-16个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对256种产物进行测序。使用下一测序引物重复以对接下来的256个片段进行测序。
关于血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量(当与突变组合时；使用亚硫酸氢盐-PCR-PCR测序。参见图51)：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生最初甲基化的DNA的上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
3.用UDG/APE1处理并且使每个初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约16个拷贝，并且如果甲基化区域存在，则将存在“沃森链”的约3个拷贝和“克立克链”的约3个拷贝。使用巢式靶标特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
4.添加与所需的一样多的测序引物以涵盖甲基化区域。(理论上，在一次测序操作中可涵盖19,200个甲基化区域，并且准确计数每个甲基化区域。)因此，如果仅对甲基化区域使用主通用序列，则此单一引物可在单一操作中涵盖所有甲基化区域。
注释1.原始巢式引物还可用作测序引物。
关于使用亚硫酸氢盐-PCR-PCR测序(当单独进行时)对血浆中低丰度CpG甲基化的鉴定和定量：
1.在初始反应室中用Bsh1236I消化样品。用亚硫酸氢盐处理。将链再纯化。
2.使亚硫酸氢盐处理的样品分布至48个孔或初级PCR反应室中。RE裂解之后血浆中DNA的最高水平＝200个基因组当量。每个初级PCR反应室每个靶标平均4个拷贝，其中最多1个为甲基化的。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对一条链进行11个片段标识符PCR循环。产生最初甲基化DNA的一条链的1,024个拷贝。
3.用UDG/APE1处理并且使每个初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定靶标将具有每部分(列)约100个拷贝，并且如果甲基化区域存在，则将存在所述链的约24个拷贝。PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
4.添加与所需的一样多的测序引物以涵盖甲基化区域。(理论上，在一次测序操作中可涵盖19,200个甲基化区域，并且准确计数每个甲基化区域。)因此，如果仅对甲基化区域使用主通用序列，则此单一引物可在单一操作中涵盖所有甲基化区域。
注释1.原始靶标特异性第二引物还可用作测序引物。
预测实施例15--PCR-PCR-测序用于非侵入性产前测试(直接从血浆进行的三体性的NIPT。
下文所描述的分析将使用具有用于4,239,360微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48x 32＝1,536个子部分的筒柱，每个子部分2,760个微孔隙，并且每列88,320个微孔隙。参见图50。
1.将血浆/样品中的DNA调节至2,000个基因组当量。使初始样品分布至48个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室每个基因座平均40个拷贝，具有不同的SNP。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
2.用UDG/APE1处理并且使每个初级PCR反应室的产物分布至88,320个微孔隙中。假设75％捕获，给定基因座将具有每部分(即列)约240个拷贝(沃森链120个并且克立克链120个)。使用巢式基因座特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
3.添加368个测序引物(或一个引物，参见以下注释2)，涵盖沃森链与克立克链的184个基因座区域。产生序列信息的约50个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。
4.再添加368个测序引物(或一个引物，参见以下注释2)。当前的筒柱有空间进行4轮测序，＝涵盖736个基因座区域，两条链，并且准确计数沃森链与克立克链上的每个SNP。
基本思路是为计数存在每条链的多少个拷贝。由于在48个部分(即列)中的每一者中，沃森链应与克立克链相匹配(因为它们由每条链中的一者的给定片段产生)，所以这是链损失或其他错误的内部对照。使用染色体2(对照)、13、18、21、X以及Y上的多个独特基因座来确定拷贝数以及鉴定三体性或其他染色体拷贝变化。
以上计算是基于平均填充约50％的微孔隙。(泊松分布：平均λ＝0.4；初始百分比x＝0)。在此类条件下，约60％的微孔隙将不给出任何测序读段，约30％为独特的(即单读段)，约7.5％将给出双读段，并且约1.3％将给出三重读段。在实践水平上，单读段明确用于区分SNP。双读段可用于确定基因座，但双读段不得用于区分SNP。在单读段与双读段之间，超过90％的链被覆盖，并且由于所述分布为基本上随机的，所以此方法会提供存在于初始样品中的每条链的高度准确的计数。
注释1：原始巢式引物还可用作测序引物。
注释2：可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-12个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对368种产物进行测序。使用下一测序引物重复以对接下来的368个片段进行测序。
预测实施例16--PCR-PCR-测序用于非侵入性产前测试(直接从血浆进行的三体性的NIPT。
下文所描述的分析将使用具有用于25,436,160微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48个双列x 48个双行＝2,304个子部分的筒柱，每个子部分11,040个微孔隙，并且每列529,920个微孔隙。参见图50。
1.将血浆/样品中的DNA调节至2,000个基因组当量。使初始样品分布至48个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室每个基因座平均40个拷贝，具有不同的SNP。基因座特异性引物仅在结合于靶标时在RNA酶H2存在下解锁。对两条链进行3个片段标识符PCR循环，每条链涵盖稍有不同的序列。产生上链的4个拷贝，以及下链的4个拷贝。
2.用UDG/APE1处理并且使每个初级PCR反应室的产物分布至529,920个微孔隙中。假设75％捕获，给定基因座将具有每部分(即列)约240个拷贝(沃森链120个并且克立克链120个)。使用巢式基因座特异性引物和通用引物PCR扩增每个孔中的多种产物并且熔解掉非锚定链。
3.添加2,208个测序引物(或一个引物，参见以下注释2)，涵盖沃森链与克立克链的1,104个基因座区域。产生序列信息的约50个碱基，加上独特片段标识条形码的10个碱基。
4.再添加2,208个测序引物(或一个引物，参见以下注释2)。
基本思路是为计数存在每条链的多少个拷贝。由于在48个部分(即列)中的每一者中，沃森链应与克立克链相匹配(因为它们由每条链中的一者的给定片段产生)，所以这是链损失或其他错误的内部对照。使用染色体2(对照)、13、18、21、X以及Y上的多个独特基因座来确定拷贝数以及鉴定三体性或其他染色体拷贝变化。
以上计算是基于平均填充约50％的微孔隙。(泊松分布：平均λ＝0.4；初始百分比x＝0)。在此类条件下，约60％的微孔隙将不给出任何测序读段，约30％为独特的(即单读段)，约7.5％将给出双读段，并且约1.3％将给出三重读段。在实践水平上，单读段明确用于区分SNP。双读段可用于确定基因座但不得用于区分SNP。在单读段与双读段之间，超过90％的链被覆盖，并且由于所述分布为基本上随机的，所以此方法会提供存在于初始样品中的每条链的高度准确的计数。
注释1：原始巢式引物还可用作测序引物。
注释2：可将巢式引物设计成含有包含主通用序列的不同组的通用序列以及3'末端的8-16个碱基以唯一地对不同片段进行测序，使得每个个别测序引物平均对368种产物进行测序。使用下一测序引物重复以对接下来的1,104个片段进行测序。
预测实施例17--PCR-PCR-TaqmanTM或PCR-PCR Unitaq检测用于准确计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体。
下文所描述的分析将使用具有用于4,239,360微孔隙阵列模式以进行靶向测序的48x 32＝1,536个子部分的筒柱，每个子部分2,760个微孔隙，并且每列88,320个微孔隙。请参见图53和图54。可将分析设计成用于检测和定量1,536个潜在靶标。
1.样品的初始多重逆转录/扩增-1,536个潜在靶标。在初始反应室中进行9个PCR循环，每个原始转录物最多512个拷贝。所有逆转录和PCR引物应包括相同的5'尾部序列，优选为10-11个碱基以抑制引物二聚体的扩增。
2.使初始多重产物分布至24个初级PCR反应室中。每个初级PCR反应室中平均分布每个原始转录物的20个拷贝。对于每个初级PCR反应室，使用具有UniTaq尾部的引物以32个独特引物组的群组进行10个巢式PCR循环，每个原始转录物最多20,480个拷贝。对于此实施例，将准确定量三组不同的转录物，其中最小数目将大概为1个原始RNA转录物产生20,480个拷贝，100个原始RNA转录物产生2,048,000个拷贝，并且10,000个原始RNA转录物产生204,800,000个拷贝。
3.将24个初级PCR反应室设计成在排放之后保留反应中某一体积百分比的液体。对于此实施例，巢式PCR反应的整个体积将被指定为80单位，并且保留的量为40单位或更少。对于此说明，用于初级PCR反应室1-8的多重扩增引物组是用于低水平转录物(保留40单位的液体)，对于初级PCR反应室9-16是用于中等水平转录物(保留10单位的液体)，并且对于初级PCR反应室17-24是用于高水平转录物(保留3单位的液体)。在第一次排放之后，以下为剩余的液体和最少拷贝数的计算：
将含用于抑制聚合酶的抗体的新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且再次排放：
将含用于抑制聚合酶的抗体的新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且再次排放：
将新鲜40μ预混液添加至剩余液体中，并且现在向上推进，平分到二级反应/稀释室A和B中，所述二级反应/稀释室的总体积为20单位，并且可保留10单位或更少。
SR-腔室9-16以及腔室17-24将具有约两倍于以上分子数目的分子数目
将新鲜10μ预混液添加至上部腔室中的剩余液体中，并且再次排放：
SR-腔室9-16以及腔室17-24将具有约两倍于以上分子数目的分子数目
最后，在所有剩余产物和试剂移动到更大的混合室时添加充足的预混液，为移动至微孔隙中作准备。
4.使每个二级反应/稀释室的产物分布至88,320个微孔隙中。每个A二级反应/稀释室平均将得到每个原始转录物的5个拷贝，B二级反应/稀释室中少约200倍。使用UniTaq引物组PCR扩增每个微孔隙中的潜在产物并且测定每个子部分的每个微孔隙的Ct值。(任选：通过对UniTaq引物使用两种或四种不同荧光染料可使转录物的总数目为双倍或四倍的)。在A二级反应/稀释室中2,760个微孔隙中的泊松分布将提供非常低拷贝转录物的计数，而B二级反应/稀释室中2,760个微孔隙的泊松分布将提供三个数量级的高拷贝转录物的计数。
二级反应/稀释室1-8将准确计数在1个(平均填充“A”列的2,760个微孔隙中的约5个)至约110,000-220,000个(平均填充“B”列的2,760个微孔隙中的约1,766-2,290个)范围内的起始转录物。
二级反应/稀释室3和4将准确计数在100个(平均填充“A”列的2,760个微孔隙中的约10个)至约11,000,000-22,000,000个(平均填充“B”列的2,760个微孔隙中的约1,766-2,290个)范围内的起始转录物。
二级反应/稀释室5和6将准确计数在10,000个(平均填充“A”列的2,760个微孔隙中的约10个)至约1,100,000,000-2,200,000,000个(平均填充“B”列的2,760个微孔隙中的约1,766-2,290个)范围内的起始转录物。
注释1：此分析模式的成功取决于不存在由UniTaq引物形成的引物二聚体，例如在存在巢式引物的情况下。使用3'-阻断的UniTaq引物和RNA酶H2在RNA碱基处解锁将解决此问题。也可对巢式引物组使用相同的3'阻断/RNA酶方式，然而存在微小的风险，此类引物将不太有效，因为病原体的序列偏移可能会阻止引物扩增所述特定靶标。
注释2：使用UniTaq引物的一个优点为它们可彼此非常靠近地放置，使得可产生单一初始靶标转录物的多个巢式产物。这允许引物设计在每个转录物区域内具有2个巢式引物组。这将允许给定转录物的双重验证。此方法的另一优点为它将限制初始多重反应中PCR引物的数目。另一优点为可将所述引物设计成使得所述信号展示于不同部分(列)中以缓解任何非靶标依赖性(伪)信号。
注释3：作为设计具有不同稀释的不同腔室组的替代方案，单独的加热元件可在不同条件下操作不同腔室，包括改变PCR循环的数目。
以在相同的48个部分(即列)添加测序引物来准确计数罕见与过表达的lncRNA、mRNA或剪接变体：
如果以相同取向添加测序引物，即没有子部分，则存在48x n个潜在靶标，每个子部分n个微孔隙88,320个。
存在两种方式来接近此目的。一种方法为大体上细菌病原体以比病毒病原体低的水平存在。原始PCR循环可包括在不存在第二引物的情况下用于病毒病原体的RT步骤，使得它们的扩增不像细菌片段那样多。另外，原始PCR步骤可持续较少的循环，并且巢式PCR步骤也可持续更少的循环。然后，即使一些病原体以较高数目存在，在每部分(即列)88,320个微孔隙的情况下，即使一些以2,000个拷贝存在，而其他以5个拷贝存在，对每部分32个靶标进行测序仍将不为不合理的。注意，32个测序引物x 48的组也将被印刷于装置上。这将允许在单一测序操作中同时检测1,536个潜在靶标，并且利用2,760个微孔隙中的泊松分布。
另一方法为在通用引物与不连接至固体支撑物的一侧的巢式PCR引物的靶标特异性序列之间合并8-12个碱基的独特序列。这将允许通过使用更多通用测序引物的3'侧的8-12个碱基对各组潜在靶标进行测序。
另一方法为每组巢式PCR引物使用不同的通用引物，然后在32个部分中在孔隙内印刷所需通用组。这将有效确保每种扩增产物去到确定的行和列。此方法的优点为它还允许各种产物的单独TaqmanTM或LDR检测。
在此想法的一种变化形式中，通用引物序列为UniTaq序列。将所需UniTaq引物以32组印刷于孔隙内。此方法不需要固定所有引物，不过使用杂交至树状聚体可使其暂时固定不动。
注意到在分离至48个部分中的4色LDR-FRET检测情况下，这仍允许同时高度准确地计数192个靶标。由于48个部分中的每一者具有不同组的所扩增靶标(例如16个)，可同时添加所有384个LDR引物，并且它们将把自身分选出来。这将允许在仅仅4个LDR反应中准确定量和计数768个靶标。
关于384个潜在靶标.(以直角添加UniTaq引物组，并且在组装之前将其干燥。)
需要将24x 16、32或64个巢式PCR引物对点样于阵列的正面。
预测实施例18--使用分离UniTaq探针(UniRq)的PCR引物设计的实例
使用图18的分离UniTaq探针(UniRq)的PCR引物设计的实例：(Tm＝64.6)(总计186bp；28+28bp TS DNA)
正向引物序列：
反向引物序列：(Ci-Bj-tj-TS)
第1UniTaq引物：(F1-Bj，Bi-Q-Ai)
第2UniTaq引物：Ci
5’-TCGACGATAGGTTTCCGCAC-3’(SEQ ID NO:20)
完整PCR产物(
杂交至
的Tm＝64.6)
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
内部粗体序列ti和ti’发夹在62.6℃下，整个结构被给予53.1℃的Tm值
内部斜体序列tj和tj’发夹在59.7℃下，整个结构被给予53.1℃的Tm值
单独粗体序列ti和ti’在38.6℃下杂交
单独斜体序列tj和tj’在37.2℃下杂交
单独
分别具有30.2和47.6的Tm
将四个发夹区域组合给出、产生64.6的总发夹Tm。
潜在引物-二聚体PCR产物(
杂交至
的Tm＝54.4)
(注释：由于引物二聚体缺乏真正的靶序列
所以PCR引物杂交至此类产物将不释放3'阻断，并且因此将不扩增。)
预测实施例19--使用单独分离UniTaq探针(UniSpTq)的PCR引物设计的实例
使用单独分离UniTaq探针的PCR引物设计的实例：(Tm＝62.6)(总计156bp；28+28bp TS DNA)
正向引物序列：
反向引物序列：(Ci-Bj-tj-TS)
第1UniTaq引物：(Ai)
5’-TCAGTATCGGCGTAGTCACC-3’(SEQ ID NO:29)
第2UniTaq引物：Ci
5’-TCGACGATAGGTTTCCGCAC-3’(SEQ ID NO:30)
UniTaq探针：(F1-Bj，Bi-Q)
完整PCR产物(
杂交至
的Tm＝62.6)
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
内部粗体序列ti和ti’发夹在62.6℃下，整个结构被给予53.1℃的Tm值
内部斜体序列tj和tj’发夹在59.7℃下，整个结构被给予53.1℃的Tm值
单独粗体序列ti和ti'在38.6℃下杂交
单独斜体序列tj和tj'在37.2℃下杂交
单独
分别具有36.4和42.7的Tm
组合四个发夹区域给出在62.6下的总发夹。
潜在引物-二聚体PCR产物(
杂交至
的Tm＝51.4)
(注释：由于引物二聚体缺乏真正的靶序列
所以PCR引物杂交至此类产物将不释放3'阻断，并且因此将不扩增。)
预测实施例20--使用分离UniTaq探针(UniSpTq)的LDR引物设计的实例
使用图21的分离UniTaq探针(UniSpTq)的LDR引物设计的实例：(Tm＝66.6)(总计170bp；60bp TS DNA)
上游LDR引物序列：
下游LDR引物序列：
第1UniTaq引物：(F1-Bj，Bi-Q-Ai)
第2UniTaq引物：Ci
5’-TCGACGATAGGTTTCCGCAC-3’(SEQ ID NO:43)
全长PCR产物：
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
内部粗体序列zi和zi'发夹在64℃下；整个结构被给予57.4℃的Tm值
单独地，粗体序列zi和zi’在42.9℃下杂交
单独
分别具有35.1和50.3的Tm。
组合三个发夹区域产生66.6的Tm
此实施例展示如何使用如在传统的UniTaq中具有连接至引物中的一者的探针的分离zip-code设计。在此，优点为探针寡核苷酸将杂交至上游LDR引物或下游LDR引物，但将仅在两个单独LDR探针共价连接并且可彼此杂交时杂交至两者。如上所述，在10nM探针下进行LDR反应，并且在进入UniTaq反应时将产物稀释10倍，这意味着最大LDR引物浓度为1nM，或比UniTaq探针浓度低约250至500倍。因此，如上所述，当探针中的两者在1nM下时三路杂交的可能性降为零。然而，当存在LDR产物时，它得到扩增，从而增加产物的总浓度，并且现在仅单一分子杂交至自身(扩增的LDR产物含有所连接的UniTaq探针)。
预测实施例21--使用单独分离UniTaq探针(UniSpTq)的LDR引物设计的实例
使用单独分离UniTaq探针的LDR引物设计的实例：(Tm＝65.2)(总计150bp；60bpTS DNA)
上游LDR引物序列：
下游LDR引物序列：
第1UniTaq引物：(Ai)
5’-TCAGTATCGGCGTAGTCACC-3’(SEQ ID NO:48)
第2UniTaq引物：Ci
5’-TCGACGATAGGTTTCCGCAC-3’(SEQ ID NO:49)
UniTaq探针：(F1-Bj，Bi-Q)
全长PCR产物：
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
内部粗体序列zi和zi'发夹在64℃下；整个结构被给予56.3℃的Tm值
单独地，粗体序列zi和zi’在44.7℃下杂交
单独
分别具有43.0和45.9的Tm。
组合三个发夹区域给出65.2的Tm。
此实施例展示如何使用具有单独探针的分离zip-code设计。在此，优点为探针寡核苷酸将杂交至上游LDR引物或下游LDR引物，但将仅在两个单独LDR探针共价连接并且可彼此杂交时杂交至两者。更重要地，认为虽然一般的PCR实验使用100至500nM引物浓度，但本文所描述的LDR反应使用10nM引物浓度。当进入UniTaq反应时将产物稀释10倍，这意味着最大LDR引物浓度为1nM，或比UniTaq探针浓度低约250至500倍。因此，当探针中的两者在1nM下时三路杂交的可能性降为零。然而，当存在LDR产物时，它得到扩增，从而增加产物的总浓度，并且现在仅两个分子彼此杂交(扩增的LDR产物和UniTaq探针)。
预测实施例22--使用所添加的通用探针(UniLDq)的等温RNA酶H2裂解的qLDR引物设计的实例
使用所添加的通用探针(UniLDq；图22)的等温RNA酶H2裂解的qLDR引物设计的实例：(Tm＝64.8)；(总计145bp；60bp TS DNA)
上游LDR引物序列：
下游LDR引物序列：
可裂解探针：(F1-Bj，Bi-Q)
全长LDR产物：
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
内部粗体序列ti和ti'发夹在67℃下，整个结构被给予67.7℃的Tm值
内部斜体序列tj和tj’发夹在63.7℃下，整个结构被给予67.7℃的Tm值
单独粗体序列ti和ti’在38.6℃下杂交
单独斜体序列tj和tj’在37.2℃下杂交
单独
分别具有36.4和42.7的Tm。
组合4个双链茎区域给出64.8的Tm值。
预测实施例23--使用所添加的靶标特异性探针(TsLDq)的等温RNA酶H2裂解的qLDR引物设计
使用所添加的靶标特异性探针(TsLDq；图23)的等温RNA酶H2裂解的qLDR引物设计的实例：(Tm＝62)(总计84bp，B-raf V600E突变的实例)。
上游LDR＝U1-BRAF(52个碱基)
完整
产物：84bp
可裂解
基于OligoAnalyzer 3.1Tm计算的注释：
组合2个双链茎区域给出62℃的Tm值
虽然本文中已展示并且详细描述了优选实施方案，但对相关领域技术人员来说将显而易见是可在不背离本发明的精神的情况下作出各种修改、添加、取代等，并且这些修改、添加、取代因此被视为在如以下权利要求书中所确定的本发明范围内。
Claims (54)
1.一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统，所述系统包括：
入口孔，和
筒柱，所述筒柱限定含有以下部分的空间：
多个初级反应室，所述多个初级反应室流体连接至所述入口孔以从所述入口孔接收材料并且由所述材料产生初级反应室产物，以及
产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙或微孔的阵列，初级反应产物在所述多个个别亲水微孔隙或微孔中进一步反应以形成在所述微孔隙或所述微孔中检测的阵列产物，其中单独产物捕获亚单元的所述列中的一者或多者接收已穿过所述多个初级反应室中的一者的材料。
2.如权利要求1所述的系统，其还包括：
出口，所述出口用于将材料从所述产物捕获外壳排出。
3.如权利要求1所述的系统，其中由所述筒柱限定的所述空间还包括：
一个或多个初始反应室，所述入口孔将材料排入所述一个或多个初始反应室并且材料从所述一个或多个初始反应室排入所述多个初级反应室。
4.如权利要求1所述的系统，其中由所述筒柱限定的所述空间还包括：
多个二级反应室，其中一者或多者流体连接至所述多个初级反应室中的一者以从所述多个初级反应室中的一者接收材料，以及
多个混合室，所述多个混合室各自流体连接至所述多个二级反应室中的一者以从所述多个二级反应室中的一者接收材料并且将材料排放至所述产物捕获外壳，使得单独产物捕获亚单元的每一列流体连接至所述一个或多个混合室中的一者以从所述一个或多个混合室中的一者接收材料。
5.如权利要求4所述的系统，其中所述多个初级反应室和二级反应室中的至少一些被配置成维持所述多个初级反应室和二级反应室中的液体槽。
6.如权利要求4所述的系统，其中所述多个初级反应室和二级反应室各自具有内部挡板以维持所述多个初级反应室和二级反应室中的液体槽。
7.如权利要求4所述的系统，其中所述多个初级和/或二级反应室各自具有一个或多个内部挡板以维持所述多个初级和二级反应室中的多个液体槽。
8.如权利要求4所述的系统，其中所述混合室中的每一者包括从材料进入所述混合室处的近端延伸至材料离开所述混合室处的近端的分隔物。
9.如权利要求4所述的系统，其中所述混合室中的每一者包括高度疏水的第一表面以及与所述第一表面隔开并且与所述第一表面相比疏水性较差的第二表面，其中所述第一表面和所述第二表面从材料进入所述混合室处的近端延伸至材料离开所述混合室处的近端。
10.如权利要求4所述的系统，其中所述初级反应室和/或所述二级反应室包括内表面，寡核苷酸引物或探针可点样于所述内表面上。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径。
12.如权利要求11所述的系统，其还包括：
网筛，所述网筛覆盖所述产物捕获外壳中的所述微孔隙的所述第二末端。
13.如权利要求11所述的系统，其还包括：
放置于所述个别微孔隙中的珠粒。
14.如权利要求1所述的系统，其中所述产物捕获亚单元包括多个个别微孔的阵列，所述多个个别微孔各自具有开放末端和封闭末端。
15.如权利要求4所述的系统，其中所述产物捕获外壳包括：
多个流体通道，以容许材料从所述多个混合室穿过一列所述产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的所述微孔隙或微孔阵列接触。
16.如权利要求15所述的系统，其中所述多个流体通道定位于所述固体支撑物上方和下方。
17.如权利要求15所述的系统，其中所述多个流体通道定位于所述固体支撑物上方。
18.如权利要求1所述的系统，其还包括：
一个或多个阀门，用于将试剂或反应物通过所述入口选择性地引入所述筒柱或从所述筒柱中移除。
19.如权利要求1所述的系统，其还包括：
一个或多个阀门，用于将试剂或反应物通过所述出口孔和/或通过所述产物捕获外壳中所述出口孔远端的位置选择性地引入所述产物捕获外壳或从所述产物捕获外壳中移除。
20.如权利要求1所述的系统，其还包括：
一个或多个加热元件，所述一个或多个加热元件位于所述筒柱中所述初级反应室和/或所述产物捕获外壳的近端。
21.如权利要求3所述的系统，其还包括：
一个或多个加热元件，所述一个或多个加热元件位于所述筒柱中所述初始反应室的近端。
22.如权利要求4所述的系统，其还包括：
一个或多个加热元件，所述一个或多个加热元件位于所述筒柱中所述二级反应室中的一者和/或所述混合室中的所述一者或多者的近端。
23.一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1所述的系统，以及
将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至所述产物捕获外壳内所述固体支撑物上的所述产物捕获亚单元的所述微孔隙或所述微孔中，借此所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留在所述微孔隙或所述微孔内。
24.如权利要求23所述的方法，其还包括：
将所述一个或多个初级反应室用初级反应寡核苷酸探针或引物填充，所述初级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与所述样品中的靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述初级反应寡核苷酸探针或引物还包含第二部分，所述第二部分包含与保留在所述微孔隙或所述微孔内的通用标签或捕获寡核苷酸引物的一部分相同或互补的核苷酸序列。
26.一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法，所述方法包括：
提供如权利要求4所述的系统，以及
将通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针施加至所述产物捕获外壳内所述固体支撑物上的所述产物捕获亚单元的所述微孔隙或所述微孔中，借此所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针保留在所述微孔隙或所述微孔内。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括：
将所述一个或多个初级反应室和/或二级反应室用初级或二级反应寡核苷酸探针或引物填充，所述初级或二级反应寡核苷酸探针或引物各自具有包含与所述样品中的靶核酸的一部分互补的核苷酸序列的第一部分。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述初级或二级反应寡核苷酸探针或引物还包含第二部分，所述第二部分包含与保留在所述微孔隙或所述微孔内的通用标签或捕获寡核苷酸引物的一部分相同或互补的核苷酸序列。
29.如权利要求23或权利要求26所述的方法，其中所述产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，第一通道与所述微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与所述微孔隙的所述第二末端流体连通，其中所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针通过包括以下步骤的方法施加至所述微孔隙中，所述步骤的顺序阐述如下：
使所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针穿过所述第一通道通过第一开放末端进入所述微孔隙，同时使疏水液体穿过所述第二通道；
使疏水液体穿过所述第一通道，同时使所述疏水液体穿过所述第二通道；
使挥发性溶剂穿过所述第一通道，同时使所述疏水液体穿过所述第二通道；以及
使空气穿过所述第一通道，同时使热量、疏水液体、挥发性溶剂、然后空气穿过所述第二通道。
30.如权利要求23或权利要求26所述的方法，其中所述产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，第一通道与所述微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道通过覆盖所述第二末端与第二通道流体连通的网筛与所述微孔隙的所述第二末端隔开，其中所述检测或捕获寡核苷酸引物或探针通过包括以下步骤的方法施加至所述微孔隙，所述步骤的顺序阐述如下：
使所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针穿过所述第一通道通过第一开放末端进入所述微孔隙；
使疏水液体穿过所述第一通道以使所述通用标签或捕获寡核苷酸引物或探针从所述第一通道排除；
使疏水液体穿过所述第一通道，同时使疏水液体穿过所述第二通道；
使挥发性溶剂穿过所述第一通道，同时使疏水液体穿过所述第二通道；以及
使空气穿过所述第一通道，同时使热量、疏水液体、挥发性溶剂、然后空气穿过所述第二通道。
31.一种使用通过如权利要求25或权利要求28所述的方法制备的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中在所述填充所述一个或多个初级反应室以及如果存在则任选地所述填充所述一个或多个二级反应室之后，所述方法还包括：
在所述系统中进行初级反应和/或二级反应，以及
基于所述执行所述初级反应和/或二级反应检测所述微孔或所述微孔隙中所述样品中靶核酸分子的存在。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述检测包括：
将所述微孔或所述微孔隙中所述初级反应和/或二级反应的所述产物在以下条件下扩增，在所述条件中聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶或核糖核酸酶以靶标特异性方式裂解包含淬灭剂和荧光基团的一个或多个探针，使得如果所述样品中存在所述靶核酸分子，则释放荧光基团从而产生信号。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述进行所述初级反应和/或二级反应包括：
提供包含多个靶核酸分子的样品；
使所述样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第一聚合酶延伸或链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与所述靶核酸分子的一部分或所述靶核酸分子的补体互补的第一部分；
在所述一个或多个初始或初级反应室中对所述第一聚合酶延伸或链反应混合物进行第一聚合酶延伸或链反应，以产生第一组延伸或扩增产物；
使所述第一组延伸或扩增产物与一组二级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第二聚合酶链反应混合物，所述二级寡核苷酸引物具有与初级延伸或扩增产物的一部分互补的第一部分；以及
在所述初级反应室或所述二级反应室中对所述二级聚合酶链反应混合物进行第二聚合酶链反应，以产生第二组扩增产物，其中每种二级扩增产物包含5'第二部分序列、靶核苷酸序列特异性部分或其补体以及3'第二部分互补序列。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述进行所述初级反应和/或二级反应包括：
提供包含多个靶核酸分子的样品；
使所述样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成第一聚合酶链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与所述靶核酸分子或其延伸产物的一部分互补的部分；
在所述一个或多个初始或初级反应室中对所述第一聚合酶链反应混合物进行第一聚合酶链反应，以产生第一组扩增产物；
使所述第一组扩增产物与一组寡核苷酸探针以及连结酶接触，以形成连结酶检测反应混合物，所述寡核苷酸探针具有与所述第一组扩增产物的一部分互补的第一部分以及第二部分；以及
在所述初级反应室或所述二级反应室中对所述连结酶检测反应混合物进行连结酶检测反应，以产生一组连结产物，其中每种连结产物包含5'第二部分序列、靶核苷酸序列特异性部分或其补体以及3'第二部分序列。
35.如权利要求31所述的方法，其中在所述系统中所述填充所述一个或多个初级反应室、如果存在则所述填充所述一个或多个二级反应室以及所述进行所述初级反应和/或二级反应通过包括以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下：
将疏水液体通过所述入口孔传送至所述系统中；
将初级反应寡核苷酸探针或引物以及逆转录和/或聚合酶链反应试剂然后将疏水液体通过所述入口孔传送至所述系统中；
在所述系统中执行聚合酶延伸或链反应；
使材料通过所述入口孔从所述系统排放；
将疏水液体、聚合酶链反应物或连结酶检测反应试剂，然后将疏水液体通过所述入口孔传送至所述系统中；以及
在所述系统中执行聚合酶链反应或连结酶检测反应。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，第一通道与所述微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与所述微孔隙的所述第二末端流体连通，并且其中所述在所述系统中进行所述二级反应通过包括以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下：
将聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物通过所述第一通道传送至所述产物捕获外壳中，同时使疏水液体穿过所述第二通道；
使疏水液体穿过所述第一通道和所述第二通道；以及
使用通用标签引物和探针在所述产物捕获亚单元中的所述微孔隙内对聚合酶链反应或连结酶检测反应的所述产物进行聚合酶链反应。
37.如权利要求31所述的方法，其中所述产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，第一通道与所述微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与所述微孔隙的所述第二末端流体连通，并且通过覆盖所述微孔隙的所述第二末端的网筛与所述微孔隙的所述第二末端隔开，并且其中所述在所述系统中进行所述二级反应通过包括以下步骤的方法来执行，所述步骤的顺序阐述如下：
将聚合酶链反应或连结酶检测反应的产物通过所述第一通道传送至所述产物捕获外壳中；
使疏水液体穿过所述第一通道；
使疏水液体穿过所述第一通道和所述第二通道；以及
使用通用标签引物和探针在所述产物捕获亚单元中的所述微孔隙内对聚合酶链反应或连结酶检测反应的所述产物进行聚合酶链反应。
38.如权利要求31所述的方法，其中在样品中鉴定多个核酸分子，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与所述样品或其他样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个核苷酸插入或缺失、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列、一个或多个易位和/或一个或多个甲基化残基。
39.一种使用通过如权利要求24所述的方法制备的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中在所述填充所述一个或多个初级反应室之后，所述方法还包括：
在所述系统中进行所述初级反应，以及
在所述进行所述初级反应之后获得所述样品中的靶核酸分子的核苷酸序列。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述进行所述初级反应包括：
提供包含多个靶核酸分子的样品；
使所述样品与一组初级寡核苷酸引物以及聚合酶接触，以形成聚合酶链反应混合物，所述初级寡核苷酸引物具有与所述靶核酸分子的一部分互补的第一部分以及第二部分；
在所述初级反应室中对所述聚合酶链反应混合物进行聚合酶链反应，以产生一组扩增产物；以及
将所述扩增产物传送至所述产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用多个捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙含有与所述第二部分互补的固定化捕获探针，其中所述获得所述样品中靶核酸分子的所述核苷酸序列在所述微孔隙中执行。
41.如权利要求40所述的方法，所述产物捕获亚单元包括多个个别微孔隙的阵列，所述多个个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径。
42.如权利要求41所述的方法，其还包括：
网筛，所述网筛覆盖所述产物捕获外壳中的所述微孔隙的所述第二末端。
43.如权利要求40所述的方法，其还包括：
珠粒，所述珠粒含有所述固定化捕获探针并且放置于所述个别微孔隙中。
44.如权利要求40所述的方法，其还包括：
在所述获得所述核苷酸序列之前和所述对所述聚合酶链反应混合物进行聚合酶链反应之后从所述扩增产物移除至少一个第二部分。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述移除使用尿嘧啶DNA糖基化酶、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶、核酸内切酶III、核酸内切酶IV、核酸内切酶V、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶、甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶或8-氧基鸟嘌呤DNA糖基化酶或其组合来执行。
46.如权利要求39所述的方法，其中所述产物捕获亚单元包括个别微孔隙的阵列，所述个别微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，第一通道与所述微孔隙的第一末端流体连通，并且第二通道与所述微孔隙的所述第二末端流体连通，并且通过覆盖所述微孔隙的所述第二末端的网筛与所述微孔隙的所述第二末端隔开，并且其中所述获得所述核苷酸序列通过包括以下步骤的方法来进行，所述步骤的顺序阐述如下：
将聚合酶链反应的所述产物通过所述第一通道传送至所述产物捕获外壳中；
使疏水液体穿过所述第一通道，使得所述产物分布至个别微孔中；
使疏水液体穿过所述第一通道和所述第二通道；
在用于产生固定至所述微孔的内部表面的扩增产物的条件下使用所述捕获寡核苷酸引物对聚合酶链反应和/或等温反应中的所述产物进行扩增；
使挥发性溶剂穿过所述第一通道，同时使疏水液体穿过所述第二通道；
使所述聚合酶链反应和/或等温反应的所述产物变性并且通过所述第一通道洗掉非锚定核酸分子，同时使疏水液体穿过所述第二通道，使得所述产物在个别微孔中分离；
使密度比水高的疏水液体穿过所述第一通道，同时使挥发性溶剂、空气、然后测序试剂穿过所述第二通道；以及
在所述产物捕获亚单元中执行测序反应。
47.一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的微量滴定板的方法，所述方法包括：
为微量滴定板提供多个单独行和列的产物捕获亚单元，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔的阵列；
用含有寡核苷酸引物和/或探针的各组水性液体填充所述微量滴定板的各组所述微孔；
将所述微量滴定板离心以使所述水性液体散布至所述微量滴定板中每个单独产物捕获亚单元中的未填充微孔；
终止所述离心以促使所述水性液体不与所述疏水表面接触；
蒸发所述水性液体；以及
干燥所述微孔，使得所述寡核苷酸引物留在所述微孔中。
48.一种使用通过如权利要求47所述的方法制备的微量滴定板鉴定样品中的多个核酸分子的方法，所述方法包括：
将水性样品装入所述微量滴定板中；
将疏水液体装入所述微量滴定板中，使得所述疏水液体在所述水性样品上；
将所述微量滴定板离心以使所述水性液体散布至所述微量滴定板中的未填充微孔；
终止所述离心以促使所述样品不与所述疏水表面接触；以及
在以下条件下执行核酸分子扩增反应，在所述条件中聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶或核糖核酸酶以靶标特异性方式裂解包含淬灭剂和荧光基团的一个或多个探针，使得如果所述样品中存在所述靶核酸分子，则释放荧光基团从而产生信号。
49.如权利要求48所述的方法，其中在样品中鉴定多个核酸分子，所述多个核酸分子所含的靶核苷酸序列与所述样品或其他样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的不同之处为一个或多个核苷酸、一个或多个核苷酸插入或缺失、一个或多个拷贝数、一个或多个转录物序列、一个或多个易位和/或一个或多个甲基化残基。
50.一种用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统，所述系统包括：
入口孔；
出口孔；以及
筒柱，所述筒柱流体连接所述入口孔和所述出口孔并且限定含有以下部分的空间：
产物捕获外壳，所述产物捕获外壳用产物捕获亚单元的多个单独列包围固体支撑物，每个单独产物捕获亚单元包括由疏水表面隔开的多个个别亲水微孔隙的阵列，所述多个个别亲水微孔隙各自具有相对的第一开放末端和第二开放末端，所述第一末端具有大直径并且所述第二末端具有比所述第一末端小的直径，所述产物捕获外壳包括多个流体通道以容许材料从所述入口孔穿过一列所述产物捕获亚单元从而与所述亚单元中的所述微孔隙阵列接触，并且到达所述出口孔，其中所述多个流体通道定位于所述固体支撑物上方和下方。
51.如权利要求50所述的系统，其还包括：
一个或多个阀门，用于将试剂和/或反应物通过所述入口孔或通过所述出口孔选择性地引入所述产物捕获外壳或从所述产物捕获外壳中移除。
52.如权利要求50所述的系统，其还包括：
一个或多个加热元件，所述一个或多个加热元件位于所述筒柱中所述产物捕获外壳的近端。
53.一种制备用于鉴定样品中的多个核酸分子的系统的方法，所述方法包括：
提供如权利要求50所述的系统，以及
将捕获寡核苷酸引物或探针施加至所述产物捕获外壳内所述固体支撑物上的所述产物捕获亚单元的所述微孔隙中，借此所述捕获寡核苷酸引物或探针保留在所述微孔隙或所述微孔内。
54.一种使用通过如权利要求53所述的方法制备的系统鉴定样品中的多个核酸分子的方法，其中在所述将捕获寡核苷酸引物或探针施加至所述微孔隙中之后，所述方法包括：
在所述系统中进行所述反应，以及
基于所述进行所述反应检测所述微孔隙中所述样品中靶核酸分子的存在。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115364734A (zh) * | 2022-10-24 | 2022-11-22 | 北京剂泰医药科技有限公司 | 纳米颗粒制备 |
| WO2024087239A1 (en) * | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Beijing Jitai Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | Nanoparticle preparation |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11130986B2 (en) | 2015-05-20 | 2021-09-28 | Quantum-Si Incorporated | Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins |
| US10391493B2 (en) | 2017-08-29 | 2019-08-27 | Celsee Diagnostics, Inc. | System and method for isolating and analyzing cells |
| DE102018203047A1 (de) * | 2018-03-01 | 2019-09-05 | Robert Bosch Gmbh | Mikrofluidische Vorrichtung |
| WO2019232485A1 (en) * | 2018-05-31 | 2019-12-05 | Nvigen, Inc. | Accurate blood test to predict cancer incidence, recurrence, guide and monitor treatment intervention |
| GB2588716B (en) * | 2018-12-07 | 2023-11-01 | Element Biosciences Inc | Flow cell device and use thereof |
| WO2020157262A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Samplix Aps | A microfluidic device and a method for provision of double emulsion droplets |
| US11654435B2 (en) | 2019-03-29 | 2023-05-23 | Boe Technology Group Co., Ltd. | Detection chip, method for operating detection chip, and reaction system |
| AU2019453690B2 (en) * | 2019-06-26 | 2024-04-04 | Mgi Tech Co., Ltd. | Method for preparing nested multiplex PCR high-throughput sequencing library and kit |
| KR20220101108A (ko) | 2019-10-29 | 2022-07-19 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 유체의 연동 펌핑 및 연관 방법, 시스템, 및 디바이스 |
| WO2021086945A1 (en) * | 2019-10-29 | 2021-05-06 | Quantum-Si Incorporated | Systems and methods for sample preparation |
| US20210171939A1 (en) * | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sample processing barcoded bead composition, method, manufacturing, and system |
| WO2021144396A1 (en) * | 2020-01-17 | 2021-07-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Microfluidic device and method for automated split-pool synthesis |
| TWI803855B (zh) * | 2020-04-21 | 2023-06-01 | 美商西方數位科技公司 | 用於定序核酸之系統及裝置、定序複數個ｓ個核酸股之方法及減輕由於使用單分子感測器陣列之核酸定序程序而產生之定序資料之錯誤之方法 |
| EP4150124A4 (en) * | 2020-05-13 | 2024-07-03 | Accuragen Holdings Ltd | CELL DNA SIZE DETECTION |
| US20210402396A1 (en) * | 2020-06-30 | 2021-12-30 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Microfluidic chip, and apparatus and method for detecting biomolecules |
| KR102365010B1 (ko) * | 2020-07-30 | 2022-02-21 | 주식회사 진시스템 | 멀티플렉스 pcr 칩 및 이를 이용한 멀티플렉스 pcr 방법 |
| CN112275336B (zh) * | 2020-10-20 | 2021-11-19 | 大连理工大学 | 一种多通道集成微流控芯片及其高通量制备单分散凝胶微球的方法 |
| US20220193674A1 (en) * | 2020-12-23 | 2022-06-23 | Imec Vzw | Microfluidic Device Unit |
| CN113092461B (zh) * | 2021-04-09 | 2023-08-22 | 四川大学华西医院 | 一种均相二维可视化/荧光分析方法及应用 |
| WO2023283537A2 (en) * | 2021-07-07 | 2023-01-12 | Institute For Systems Biology | Cell analysis methods, compositions, and uses |
| WO2023283452A2 (en) * | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Cepheid | High-level multiplexing reaction vessel, reagent spotting device and associated methods |
| WO2024044764A2 (en) * | 2022-08-26 | 2024-02-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Microfluidic system and method for dna methylation sample preparation |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5827480A (en) * | 1993-07-28 | 1998-10-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nucleic acid amplification reaction apparatus |
| US20050082204A1 (en) * | 1995-04-03 | 2005-04-21 | Schwartz David C. | Micro-channel long molecule manipulation system |
| CN1942590A (zh) * | 2004-02-18 | 2007-04-04 | 周小川 | 多元化学和生化反应的流体装置和方法 |
| US20110008223A1 (en) * | 2009-04-10 | 2011-01-13 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Fluid interface cartridge for a microfluidic chip |
| US20150099642A1 (en) * | 2011-07-21 | 2015-04-09 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Methods and devices for dna sequencing and molecular diagnostics |
| US9333463B2 (en) * | 2013-07-26 | 2016-05-10 | General Electric Company | Devices and systems for elution of biomolecules |
| US20160319334A1 (en) * | 1996-02-09 | 2016-11-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| US9518299B2 (en) * | 2000-02-18 | 2016-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5726026A (en) * | 1992-05-01 | 1998-03-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes |
| JPH0751099A (ja) | 1993-08-11 | 1995-02-28 | Toyobo Co Ltd | 核酸配列検査方法及び検査装置 |
| CN1110369C (zh) * | 1994-11-14 | 2003-06-04 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | 用于测定和加工分析物的中尺度样品制备设备和系统 |
| US6074827A (en) * | 1996-07-30 | 2000-06-13 | Aclara Biosciences, Inc. | Microfluidic method for nucleic acid purification and processing |
| US6143496A (en) * | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| AU6291301A (en) * | 2000-02-22 | 2001-09-03 | Genospectra, Inc. | Microarray fabrication techniques and apparatus |
| US8048386B2 (en) | 2002-02-25 | 2011-11-01 | Cepheid | Fluid processing and control |
| WO2002030561A2 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-18 | Biotrove, Inc. | Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof |
| US20040109793A1 (en) * | 2002-02-07 | 2004-06-10 | Mcneely Michael R | Three-dimensional microfluidics incorporating passive fluid control structures |
| JP2004279336A (ja) | 2003-03-18 | 2004-10-07 | Olympus Corp | 生体関連物質の反応容器 |
| CA2587085C (en) | 2004-10-27 | 2017-08-08 | Cepheid | Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions |
| US7763453B2 (en) * | 2005-11-30 | 2010-07-27 | Micronics, Inc. | Microfluidic mixing and analytic apparatus |
| WO2007106580A2 (en) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Micronics, Inc. | Rapid magnetic flow assays |
| US8900828B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-12-02 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| JP5298718B2 (ja) * | 2008-09-12 | 2013-09-25 | セイコーエプソン株式会社 | 生体試料反応用チップに反応液を充填する遠心装置 |
| US20120071358A1 (en) * | 2008-12-04 | 2012-03-22 | Xiaochuan Zhou | Fluidic devices and methods for multiplex chemical and biochemical reactions |
| JP5691187B2 (ja) * | 2010-02-10 | 2015-04-01 | ソニー株式会社 | 核酸増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法 |
| JP5786295B2 (ja) * | 2010-06-22 | 2015-09-30 | ソニー株式会社 | 核酸等温増幅反応用マイクロチップ及びその製造方法並びに核酸等温増幅方法 |
| DE102011054101A1 (de) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen |
| US9914968B2 (en) | 2012-09-26 | 2018-03-13 | Cepheid | Honeycomb tube |
| ES2701235T3 (es) * | 2012-09-28 | 2019-02-21 | Bna Inc | Método de abrazadera de BNA |
| US9932626B2 (en) * | 2013-01-15 | 2018-04-03 | Quanterix Corporation | Detection of DNA or RNA using single molecule arrays and other techniques |
| CN114272964B (zh) | 2013-06-25 | 2024-04-23 | 华盛顿大学商业中心 | 样品体积的自数字化 |
| AU2015286488B2 (en) | 2014-07-08 | 2020-07-16 | Japan Science And Technology Agency | Substance sealing method and target molecule detecting method |
| EP3274293A4 (en) * | 2015-03-23 | 2018-08-22 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Method for identification and enumeration of nucleic acid sequences, expression, splice variant, translocation, copy, or dna methylation changes using combined nuclease, ligase, polymerase, terminal transferase, and sequencing reactions |
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2022
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5827480A (en) * | 1993-07-28 | 1998-10-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nucleic acid amplification reaction apparatus |
| US20050082204A1 (en) * | 1995-04-03 | 2005-04-21 | Schwartz David C. | Micro-channel long molecule manipulation system |
| US20160319334A1 (en) * | 1996-02-09 | 2016-11-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| US9518299B2 (en) * | 2000-02-18 | 2016-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions |
| CN1942590A (zh) * | 2004-02-18 | 2007-04-04 | 周小川 | 多元化学和生化反应的流体装置和方法 |
| US20110008223A1 (en) * | 2009-04-10 | 2011-01-13 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Fluid interface cartridge for a microfluidic chip |
| US20150099642A1 (en) * | 2011-07-21 | 2015-04-09 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Methods and devices for dna sequencing and molecular diagnostics |
| US9333463B2 (en) * | 2013-07-26 | 2016-05-10 | General Electric Company | Devices and systems for elution of biomolecules |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115364734A (zh) * | 2022-10-24 | 2022-11-22 | 北京剂泰医药科技有限公司 | 纳米颗粒制备 |
| CN115364734B (zh) * | 2022-10-24 | 2023-11-14 | 北京剂泰医药科技有限公司 | 纳米颗粒制备 |
| WO2024087239A1 (en) * | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Beijing Jitai Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | Nanoparticle preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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