CN110746506A - 一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法，该方法包括以下步骤：抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；使用上述抗原乳剂对兔进行多次注射；血清效价检测：注射后8‑10天采血，分离血清，检测其双扩效价；首次注射部位为10个，后足掌及背部皮下选取多个部位点进行注射，第二次到第五次免疫注射部位在背部皮下选取多个部位点进行注射，第六次免疫注射部位为兔耳静脉注射。采用本发明方法，成本低，过程简单，生产抗体质量稳定，抗体生产速度快，抗体水平高，抗原用量小。使大规模生产高质量诊断试剂原料成为可能，更好地服务于诊断行业。

Description

一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体地说是一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法。

背景技术

肌红蛋白是一种小分子蛋白质，其分子结果与血红蛋白相似，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。当心肌或横纹肌有损伤时，肌红蛋白便释放入血中，血清中的肌红蛋白即可明显升高。因此，测定血清肌红蛋白可作为早期诊断心肌梗死的指标。

抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为人工注射某类抗原后制备的动物血清。一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定簇(Antigenic determinant)，另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应。抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性。一般完全抗原免疫动物需加用佐剂，尤其在使用可溶性抗原时，以期得到高效价的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。

目前，国内外多家生物公司开发出了常规科学试验和医学检测用特异性免疫血清，如羊抗人免疫血清、羊抗鼠免疫血清、兔抗人免疫血清、兔抗鼠免疫血清等等。然而，相关的调查研究表明，大概一半左右的常用商业化抗体对目标蛋白的识别能力极低。使用这些低质量的抗体是对着整个诊断试剂行业的污染，而且影响到科学研究的真实性。因此目前市场急需高质量的免疫诊断原料以促进产业的更好发展。

CN107163140A公开了一种羊抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，该方法包括以下步骤：抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；第一次注射后14天进行第二次注射；第二次注射后12天进行第三次注射；第三次注射后10天进行第四次注射；第四次注射后8天进行第五次注射；第五次注射后8天进行第六次注射；第六次注射后8天进行第七次注射；血清效价检测：注射后8-10天采血，分离血清，检测其双扩效价；以上每次免疫注射部位均在动物体上选取24个部位点进行注射。

CN109988241A公开了一种特异性识别人免疫复合物的抗体及其制备方法和用途，所述能够特异性识别人免疫复合物中与抗原结合后的靶标抗体，但不识别游离的人IgG以及游离的靶标抗体，避免非特异性抗体在间接法均相免疫检测中的干扰。

CN110161255A公开了一种肌红蛋白检测试剂盒，应用于胶乳增强免疫比浊法，包括试剂R1、R2，其特征在于：试剂R1为标记了肌红蛋白特异性抗体的胶乳颗粒溶于缓冲液中形成，试剂R2为缓冲液，胶乳颗粒在缓冲液中的浓度为55-90ng/L，胶乳颗粒的粒径为46-77nm，胶乳颗粒与肌红蛋白特异性抗体的质量比为7：4-9。

CN1123771C公开了一种急性心肌梗塞检测试剂盒，包括：多种抗心肌梗塞血液生化标志物的抗体；一微标盘，该微标盘中具有多个第一微标盘孔和多个第二微标盘孔，其中每一第一微标盘孔是用以固定所述抗体中的一种，由此而从一受检体中分离出一种心肌梗塞血液生化标志物，而每一第二微标盘孔是用以固定该受检体中各种心肌梗塞血液生化标志物；以及多种试剂，是用以测定所述每一第一微标盘孔和每一第二微标盘孔中的心肌梗塞血液生化标志物的含量，以得到多个比值。

“兔抗鸡免疫血清的制备及效价测定”，王冬梅等，西北民族大学学报(自然科学版)，2010年第02期，公开了制备高效价兔抗鸡免疫血清，方法包括将抗原鸡血清经弗氏佐剂乳化,采用一定的免疫程序免疫家兔.末次加强免疫后7～9d取兔血清,应用双向免疫扩散法测定其效价，采用沉降与离心方法分离血清.结果:免疫家兔在全程免疫后都产生了高效价抗体，效价达到1∶32，该方法可以用抗原鸡血清免疫家兔，可成功制备高效价的免疫血清。

目前，将人肌红蛋白抗原与佐剂乳化后，按特定的程序免疫动物，可在动物血清中产生抗人的肌红蛋白抗体。虽然目前的生产方法都可以产生一定量的抗体，但是抗体产生速度慢，水平较低，结果不稳定，且抗原用量高。

发明内容

为了解决上述技术问题，即为了获得高效价、高特异性、高亲和力的兔抗人肌红蛋白多克隆抗体，本发明采用少量、多次、长周期的免疫方法，并添加佐剂以增强机体产生的免疫应答，优选以新西兰白兔为免疫动物进行抗体血清制备。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；

(2)使用上述抗原乳剂对兔进行多次注射；

(3)血清效价检测：最后一次注射后8-10天采血，分离血清，进行效价检测。

优选地，本发明采用如下的技术方案：

(1)抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；

(2)第一次注射：使用上述抗原乳剂对新西兰实验兔进行注射；首次免疫注射部位在左右后足掌各1个，兔子背部皮下选取8个部位点进行注射；第二次到第五次免疫注射部位在背部皮下8个部位点进行注射；末次注射为兔耳静脉注射；

(3)第二次注射：第一次注射后14天进行第二次注射；

(4)第三次注射：第二次注射后14天进行第三次注射；

(5)第四次注射：第三次注射后14天进行第四次注射；

(6)第五次注射：第四次注射后12天进行第五次注射；

(7)第六次注射：第五次注射后8天进行第六次注射；

(8)血清效价检测：最后一次注射后8-10天采血，分离血清。

所述注射方法针对新西兰实验兔的特点，能够有效克服各兔只之间的个体差异，抗体效价整齐，能为IVD行业提供稳定的原料，使生物科技在动物抗体制备方面，从而可以实现工业大规模稳定的批量生产。优选地，本发明所使用的兔抗人肌红蛋白多克隆抗体的的制备方法是对以往实验的高效改进：实验兔选用规模化实验兔养殖场的进口新西兰实验兔，兔子品系纯正，以确保实验结果稳定。

更优选地，所述实验兔选用进口新西兰实验兔，兔子品系纯正，选取个体健康的10周龄兔子；实验兔按照SPF实验动物饲育与管理进行严格管理，保证实验结果稳定。优选地，为保证实验效果本发明对注射前乳化进行改进，所述第一次注射前乳化用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次、第五次、第六次注射乳化前的弗氏佐剂为不完全弗氏佐剂。

本领域的一般认识是，所有次数的注射均使用完全弗氏佐剂或均使用不完全弗氏佐剂。在本发明中，通过在不同批次结合使用完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂，可以进一步克服各兔只之间的个体差异，使得抗体效价整齐，从而能够稳定地工业化生产。

优选地，上述抗原乳化前与弗氏佐剂混合比例为1：1(重量)，即所述乳化时抗原与弗氏佐剂混合比例为1：1。

进一步优选地，采用注射器乳化，即用两个10ml注射器，一个吸入人肌红蛋白抗原液，一个吸弗氏佐剂佐剂，两注射器头以胶管连接，来回推注多次，直至推成”油包水”状，达到乳化标准要求。

优选地，为保证实验效果本发明对注射部位进行改进，所述10个皮部位点分别为：左右后足掌各1点，背部脊柱左右两侧各4点。4更优选地，前五次注射均采用皮下注射，第六次注射部位为兔耳静脉注射。

优选地，为保证实验效果本发明对采血量进行改进，采用兔耳静脉取血，取血量保持在2周内体重的1％(即10％总血量)。所述最终采血方式为颈动脉取血。所述取血前麻醉使用含20％氨基酸甲酯的溶液(优选为水溶液)，注射量控制在1g/kg体重。

优选地，血清分离方式为离心分离。

更优选地，为保证实验效果本发明对血液处理方式进行改进，血液离心方式为37℃保存30-60分钟，然后在4℃以2000-3000转速离心15分钟，取上清并以4000转速离心10分钟，如果上清液出现浑浊则继续取上清以4000转速离心10分钟，以保证血清质量。

优选分别进行2-5次以4000转速离心10分钟。经过多个离心循环，可以在相当便宜的离心仪器中成功获得高质量血清。

另外，本发明人发现，不同离心条件对血清质量和效价结果可产生显著影响。因此，有必要仔细标准化离心方案以确保样品的可比性和稳定性。本发明的所述经仔细选择的离心条件，会提高结果再现性。

优选地，如若效价达不到要求，可由静脉追加注射1-2次抗原进行免疫强化。

在本发明的一个优选实施方式中，为了较快产生高效价的抗体，免疫期间应精心饲养，维持安静恒温的全封闭饲养环境。

优选地，采用间接酶联免疫吸附法测定血清效价。

优选地，间接酶联免疫吸附法测定血清效价包括以下步骤：①用包被缓冲液将抗原作1：100稀释，取10个反应孔，酶标板各孔中加稀释抗原200ul，放置4℃过夜。第2天弃去孔中液体，PBST洗涤3次；②各孔加入1％BSA 100ul，放置4℃封闭过夜，甩干，PBST洗涤3次；③各孔分别依次加入倍比稀释的待测兔抗血清100ul(l：2 000，1：4 000，1：8 000，1：l6000，l：32 000，1：64000，1：128 000)，37℃温箱孵育1h，PBST洗涤4次；④每孔加入100ul(1：1500稀释)的HRP-羊抗兔IgG，同上孵育及洗涤；⑤每孔加入底物溶液100ul，室温避光静置10min后，每孔加入终止液50ul，目测观察结果。

更优选地，以上方法均设有2个阴性对照、1个空白对照。

该效价测定方法能够将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，从而具有较高的特异性和敏感性，另外该效价测定方法准确，从而进一步确保了生产稳定性。

在本发明的一个优选实施方式中，所述不完全弗氏佐剂可以为改性的不完全弗氏佐剂，该改性的不完全弗氏佐剂通过如下方法制备：将4体积的含有2.5％v/v吐温80的盐水(优选0.85wt％NaCl)与1体积的含有轻质矿物油和Arlacel C的混合物(优选为由轻质矿物油和Arlacel C组成的混合物)合并，其中所述混合物中轻质矿物油和Arlacel C的体积比为9:1。

使用该改性的佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，与一般市售完全弗氏佐剂相比，可以使抗原在机体内存留的时间延长5-15％。

本发明能克服各兔只之间的个体差异，抗体效价整齐，能为IVD行业提供稳定的原料，使生物科技在动物抗体制备方面，大规模生产成为可能。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细说明。

本发明所用抗原来上游生物公司自主设计的人肌红蛋白抗原；实验兔产自本公司标准化实验兔养殖基地，暂养选择后使用。

实施例1

通过下面方法来制备兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清：

(1)抗原准备：选用上游生物公司自主设计的人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂。鉴定标准：取出一滴混合液滴到冷水中，1min内不会扩散即为乳化成功。

(2)抗原注射：首次使用与等体积弗式完全佐剂乳化后的抗原蛋白1mg，在10周龄的新西兰白兔后足掌及背部皮下多点注射；之后皮下注射与等体积弗式不完全佐剂乳化后的抗原蛋白0.5mg，共5次。

(3)注射部位选择：使用上述抗原乳剂对新西兰实验兔进行注射；免疫注射部位在兔子后足掌及背部皮下选取10个部位点进行注射；末次注射为兔耳静脉注射；

(4)兔子取血方式选择：取血前麻醉使用20％氨基酸甲酯，注射量控制在1g/kg体重。过程中采用兔耳静脉取血，取血量保持在2周内体重的1％(即10％总血量)，最终采血方式为颈动脉取血；

(5)血液离心：血液37℃保存30-60分钟，4℃下2000-3000转离心15分钟，取上清4000转离心10分钟，若上清液出现浑浊，则继续取上清4000转离心10分钟，直至上清液保持清澈；

(6)间接酶联免疫吸附法血清效价：①用包被缓冲液将抗原作1：100稀释，取10个反应孔，酶标板各孔中加稀释抗原200ul，放置4℃过夜，第2天弃去孔中液体，PBST洗涤3次；②各孔加入1％BSA 100ul，放置4℃封闭过夜，甩干，PBST洗涤3次；③各孔分别依次加入倍比稀释的待测兔抗血清100ul(l：2 000，1：4 000，1：8 000，1：l6 000，l：32 000，1：64 000，1：128 000)，37℃温箱孵育1h，PBST洗涤4次；④每孔加入100ul(1：1500稀释)的HRP-羊抗兔IgG，同上孵育及洗涤；⑤每孔加入底物溶液100ul，室温避光静置10min后，每孔加入终止液50ul，目测观察结果，设有2个阴性对照、1个空白对照，以阳性反应的最高稀释倍数作为免疫血清的效价，本实验效价结果1：64 000。

(7)实验动物最终处理：为保证实验动物福利，在最终取血后，应将实验兔进行安乐死。实验方式为，巴比妥钠注射液注射，用量为100-120mg/kg体重。

以上所述的实施实例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (10)

1.一种兔抗人肌红蛋白多克隆抗体血清的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)抗原准备：选用人肌红蛋白抗原，注射前以弗氏佐剂进行乳化得抗原乳剂；

(2)使用上述抗原乳剂对兔进行多次注射；

(3)血清效价检测：最后一次注射后8-10天采血，分离血清，进行效价检测。

2.根据权利要求1所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，所述注射分六次进行。

3.根据权利要求1或2所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，第一次注射前乳化用的弗氏佐剂为完全弗氏佐剂，第二次、第三次、第四次、第五次、第六次注射乳化前的弗氏佐剂为不完全弗氏佐剂。

4.根据前述权利要求中任一项所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，所述乳化时抗原与弗氏佐剂混合比例为1：1。

5.根据前述权利要求中任一项所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，所述采血前麻醉使用含20％氨基酸甲酯的溶液，注射量控制在1g/kg体重。

6.根据前述权利要求中任一项所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，采用兔耳静脉取血，取血量保持在2周内体重的1％(即10％总血量)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，血清分离方式为离心分离。

8.根据权利要求7所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，所述离心分离的条件为：37℃保存30-60分钟，4℃下2000-3000转离心15分钟，取上清4000转离心10分钟，上清液出现浑浊继续取上清4000转离心10分钟。

9.根据前述权利要求中任一项所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，如若效价达不到要求，可由静脉追加注射1—2次抗原进行免疫强化。

10.根据权利要求1所述的兔抗人肌红蛋白抗血清的制备方法，其特征在于，采用间接酶联免疫吸附法进行血清效价。