CN110734975A - Mtr4基因在肿瘤治疗中的用途 - Google Patents

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CN110734975A CN201911002901.3A CN201911002901A CN110734975A CN 110734975 A CN110734975 A CN 110734975A CN 201911002901 A CN201911002901 A CN 201911002901A CN 110734975 A CN110734975 A CN 110734975A
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tumor
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徐洋
喻莉莉
陈万城
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Abstract

本发明涉及一种MTR4基因在肿瘤治疗中的用途，属于基因治疗和医学诊断领域。本发明提供了MTR4基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用shRNA进行基因进行敲低，降低MTR4在肝癌细胞的表达，有效抑制了肿瘤细胞的生长、增殖；由此，MTR4可在肿瘤治疗中作为肿瘤靶向治疗的应用，通过敲低其表达来达到治疗肿瘤的效果。

Description

MTR4基因在肿瘤治疗中的用途
技术领域
本发明涉及一种MTR4基因在肿瘤治疗中的用途，属于基因治疗和医学诊断领域。
背景技术
癌基因与抑癌基因的发现在肿瘤研究室史上具有划时代的意义，是人类在癌症的病因研究上认识的不断丰富完善的结果，也是人们开始从分子水平认识肿瘤的重要标志。它们广泛的存在于细胞内，参与细胞的增殖、分化及凋亡等正常的生理过程调节，是细胞生命活动中不可缺少的重要组成成分。
癌基因是通过其表达产物可在体外引起正常细胞转化、在体内引起癌瘤的一类基因。癌基因被发现存在于病毒中，随后在正常细胞基因组中也存在，以及与病毒癌基因相似的同源，这类基因无促癌活性的被成为原癌基因，其表达产物参与细胞增殖、分化等重要的生理调节过程。当细胞受到各种生物、理化作用时，原癌基因可通过突变、重组等发生结构或表达水平异常，成为促进细胞转化的癌基因，最终引起肿瘤的发生。因此，癌基因的研究可以让我们对肿瘤的发生、发展有更深的认识，对肿瘤的诊断、分型、治疗方案的选择、治疗反应和预后判断上有广阔的应用前景,为临床上肿瘤的治疗提供进一步的策略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种MTR4基因在肿瘤治疗中的用途，通过降低MTR4基因在肿瘤细胞中的表达，可有效地抑制肿瘤细胞生长、增殖，从而达到抗肿瘤的目的。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了MTR4基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
研究表明，MTR4基因在肝癌细胞中过表达，当降低MTR4基因在肝癌细胞中的表达时，可有效抑制肿瘤细胞的生长、增殖，从而达到抗肿瘤的目的。由此，可将MTR4基因作为靶标用于筛选肿瘤治疗药物。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述肿瘤为肝癌。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述肿瘤治疗药物包含shRNA，所述shRNA的碱基序列为GGAAGGATTTCCGATGGATTT(如SEQ ID NO：2所示)。shRNA即短发夹RNA。shRNA可通过RNA干扰降低目的基因的表达来引起表型改变。本发明利用shRNA敲底MTR4基因在肝癌细胞中的表达。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述肿瘤治疗药物还包含可诱导shRNA在体内表达的诱导剂。
第二方面，本发明提供了可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂包括但不限于使MTR4基因表达敲底的试剂。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述肿瘤为肝癌。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂包含shRNA，所述shRNA的碱基序列为GGAAGGATTTCCGATGGATTT(如SEQ ID NO：2所示)。
第三方面，本发明还提供了一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物包含可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂包含shRNA，所述shRNA的碱基序列为GGAAGGATTTCCGATGGATTT(如SEQ ID NO：2所示)。
作为上述技术方案的优选实施方式，所述肿瘤治疗药物还包含可诱导shRNA在体内表达的诱导剂；更优选地，所述可诱导shRNA在体内表达的诱导剂为强力霉素(Doxycycline)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：MTR4在肝癌细胞中过表达，本发明利用shRNA进行基因进行敲低，降低MTR4在肝癌细胞的表达，有效抑制了肿瘤细胞的生长、增殖。由此，MTR4可在肿瘤治疗中作为肿瘤靶向治疗的应用，通过敲低其表达来达到治疗肿瘤的效果。
本发明还根据敲低后观察对肿瘤的表型变化来研究MTR4在肿瘤发生发展中作用，以此来阐明其对肿瘤的作用模式和调控机制，为开发临床的肿瘤治疗的靶点奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1条件性敲低(条件性即指四环素调控表达系统)MTR4表达对人肝癌细胞株HEPG2体内成瘤性的影响示意图；
图2为本发明实施例1条件性敲低(条件性即指四环素调控表达系统)MTR4表达对人肝癌细胞株PLC/RPF/5体内成瘤性的影响示意图；
图3为本发明实施2敲低MTR4表达对人肝癌细胞株HEPG2及PLC/RPF/5体外对肿瘤增殖及集落形成的影响示意图；
图4为MTR4 shRNA与对照组对人肝癌细胞株HepG2和PLC/RPF/5的影响结果示意图；其中，SC表示scrambled；KD表示knockdown。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明MTR4基因在肿瘤治疗中的用途的一种实施例，本实施例采用shRNA降低肿瘤细胞中MTR4基因的表达，本实施例的具体实验步骤如下：
A、动物模型建立
a、实验动物
动物6～8周龄的NOD/SCID小鼠10只，体重20～25g，由北京实验动物中心提供。
b、分实验组和对照组
对照组：转入含有条件性(条件性即指四环素调控表达系统)敲低MTR4载体(该载体含有ShMTR4靶向序列，ShMTR4靶向序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GGAAGGATTTCCGATGGATTT)的HepG2、PLC/RPF/5细胞株；
实验组：转入含有条件性(条件性即指四环素调控表达系统)敲低MTR4载体(该载体含有shMTR4靶向序列，ShMTR4靶向序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GGAAGGATTTCCGATGGATTT)的HepG2、PLC/RPF/5细胞株，药物诱导目标基因敲低。
c、皮下成瘤
取10只小鼠(20～25g/只)，将转入含有条件性MTR4敲低载体的HepG2、PLC/RPF/5细胞收集，并用冷的150ulPBS重悬，分别接种于左右下肢皮下。
当移植后第2-3周左右长出移植瘤，当移植瘤长到5mm3左右时，分为两组，一组给Doxycycline(强力霉素)诱导shRNA的体内表达，一组不给Doxycycline(强力霉素)，连续给药12天，解剖后拍照并剥下皮下瘤体，称瘤重，拍照。
实验结果
敲低MTR4表达对人肝癌细胞株HEPG2体内成瘤性的影响如图1所示，敲低MTR4表达对人肝癌细胞株PLC/RPF/5体内成瘤性的影响如图2所示。由图1和图2可见，加诱导剂Doxycycline，诱导MTR4表达降低组，移植瘤其大小和重量比对照组低和轻，其生长也相对缓慢。
结论：
上述实验结果表明：利用基因敲低技术，降低MTR4基因的表达量，可有效地抑制肿瘤细胞的生长、增殖。本实验采用体内外结合的方法，从体外细胞和体内小鼠实验来验证及人外周血液样本，MTR4可做为肿瘤治疗及诊断的靶标。
实施例2
本发明MTR4基因在肿瘤治疗中的用途的一种实施例，MTR4本实施例考察了MTR4shRNA基因对人肝癌细胞株HepG2、PLC/RPF/5增殖的影响，本实施例的具体步骤如下：将MTR4 shRNA(实验组，序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GGAAGGATTTCCGATGGATTT)与对照组(Scramble，序列为CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG)分别转入人肝癌细胞HepG2、PLC/RPF/5中，建立稳转细胞系。测定实验组和对照组对小鼠肝癌细胞的影响，结果如图3所示。
A.实验材料
a.细胞株对人肝癌细胞株HepG2、PLC/RPF/5
b.试剂和仪器
胎牛血清(Gemini Bio公司)，DMEM培养基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，PBS(Gibco公司)，Cell Counting Kit-8(DOJINDO公司)，结晶紫染色液(Beyontime公司)，BioTek ELx800酶标仪(美国BioTek公司)，低速台式自动平衡离心机(Eppendorf 5702)，血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)，倒置荧光显微镜(NIKON-Ti-U)。
B.实验方法
a.对照组和实验组HepG2、PLC/RPF/5细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用10％FBS的DMEM培养基重悬，用血球计数板计数，96孔板每孔接种5000个细胞，接种4天的细胞孔，同时6孔板接种500个细胞，置于37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养。
b、分实验组和对照组
对照组：转入含有Control shRNA载体的HepG2、PLC/RPF/5细胞株；Control shRNA靶向序列为CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG。
实验组：转入含有敲低MTR4shRNA载体的HepG2、PLC/RPF/5细胞株；ShMTR4靶向序列为GGAAGGATTTCCGATGGATTT。
c.分别收集实验组及对照最蛋白，检测MTR4在两组的表达水平。
细胞培养24h、48h、72h、96h后向每孔加入10ulCCK-8溶液，在培养箱中培养1h，用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(OD)。
细胞培养2周后，每孔加入2ml甲醇固定15min，然后用结晶紫染色30min，PBS洗涤数遍，晾干6孔板，拍照。
C.实验结果
结果如图3所示，由图4可见：敲掉MTR4基因后能抑制肿瘤细胞的增殖及细胞活力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> MTR4基因在肿瘤治疗中的用途
<130> 南方医科大学
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4222
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cttgagtcgc cagctgcctg ccacacgcca ggcgccacgc gccgccctcg ctctttatcc 60
actgagcagc ttatccactt taggtcggaa aggaaaggaa agaaaagcag gaaaaaaaaa 120
aaaagtcagg ggaacatttt tgtcggctgc gcgactcgac tacttttgtc tcctgcgggc 180
cactgttgag ccttcacgag acgtcactgt cttcggtcgc ggggcatcgt gggtaggagg 240
gagatttgct ctcactgctc ccaaaaatgg cggacgcatt cggagatgag ctgttcagcg 300
tgttcgaggg cgactcgacc actgcggcgg gaaccaaaaa agacaaggaa aaggacaagg 360
ggaaatggaa ggggcctcca gggtctgcag acaaggcagg gaaacgtttt gatggtaaat 420
tacaatcaga atcaactaat aatggaaaaa ataagagaga tgtagatttc gaaggtacag 480
atgaacccat ttttggaaag aagcccagga tagaagagtc aataactgaa gacttaagtt 540
tggcagacct gatgcccaga gtcaaggtac aatcagttga aactgttgaa gggtgtacac 600
atgaggttgc acttcctgca gaagaggatt atttaccact taaaccacga gttggaaaag 660
ctgctaagga atacccgttc attcttgatg cttttcaaag agaggccatt cagtgtgttg 720
acaataatca gtctgttcta gtatctgcac atacctcagc gggaaaaaca gtatgcgccg 780
agtatgccat tgcattggcc ttaagggaaa agcagcgtgt aatatttacc agcccaatta 840
aggctctgag taaccaaaaa taccgtgaaa tgtatgaaga atttcaagat gttggtttga 900
tgactggtga tgttactatt aatcctacgg catcttgtct tgttatgacc acagagattt 960
tgagaagtat gctttacaga ggttccgaag ttatgagaga agttgcttgg gttatatttg 1020
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cagctagaac tgttttattt acaaatgccc gcaaatttga tgggaaggat ttccgatgga 1800
tttcttctgg tgaatacatt cagatgtctg gtcgtgctgg aaggagagga atggatgata 1860
gaggaattgt aattcttatg gtagatgaaa agatgagccc aacaattgga aaacaattac 1920
ttaagggctc cgctgatcct ctaaatagtg ctttccattt gacctacaac atggttttga 1980
acttactacg tgtagaagaa attaatcctg agtacatgtt ggaaaaatcc ttctaccagt 2040
ttcagcatta tagagcaatt ccaggagtag tagagaaggt aaagaattca gaagaacagt 2100
ataataaaat agtaattccc aatgaagaaa gtgtggttat ctattataag attagacagc 2160
agcttgccaa attgggtaaa gaaattgaag aatatattca caaaccaaaa tactgcttac 2220
cttttctaca accaggtcgt ttggtaaagg taaagaatga aggagatgac tttggctggg 2280
gagtagtggt gaatttctca aaaaagtcaa atgttaagcc taactctggt gaactggatc 2340
ctttgtatgt agtagaagta cttctgcgct gtagcaaaga gagcttgaaa aattcagcta 2400
cagaagctgc aaaaccagct aaacctgatg agaaaggaga gatgcaggtt gtcccagttt 2460
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aatgtcgcaa acgtgtttta agaaggttgg gatttgctac ttcttctgat gtaatagaga 2880
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tgtttaatgg ccttttcaat gacctttctg cagaacaggc aacagcatta ttaagctgct 3000
ttgtgtttca agagaattct agtgagatgc ccaaattaac agaacaatta gcaggaccac 3060
ttcgtcaaat gcaggaatgt gctaaaagaa ttgcaaaagt ttcagcagaa gccaaattgg 3120
aaattgatga ggaaacttat ctaagctcat ttaaacctca cttaatggat gtagtatata 3180
cctgggcaac tggagctaca tttgcccata tctgcaaaat gacagatgtc tttgaaggca 3240
gcataattcg ttgtatgagg cgcctggaag aattgcttcg acaaatgtgt caagcagcaa 3300
aagccattgg aaacactgag ctggaaaata aatttgcaga aggaatcacc aaaatcaaga 3360
gagatattgt gtttgctgcc agcctctact tgtagagtca gctaaaggaa tgtgagattt 3420
taaattattg accacctgtt tgattacagt tgactacaaa tgcctgcaag tgtggatttg 3480
gttctcccat acattttaat atgtattata tttaaatcaa acatcattca tagaaagcat 3540
attacataca tgtttataca taagcattac atttttttaa taaaaatgta tacaggtggg 3600
gcactgtttt ggtggaaggc ttggagtttt tttaatgagt ttagagctat tagataacca 3660
ctgagttaaa ggtaactatg tacacacaaa gtgtgcatcc aagaggcata gcagcagcag 3720
aagtctttaa aggcttgtac accaggaaga aagatgcatc ctcttgcctt gtggcaatca 3780
ttttccttta gaaaacaggc cagcttcacc tgggcaccct gctgcctttc aaggctggtg 3840
attgctcgga tagtgattcc cagttgttgg tgtttcatgc agagttgtat gagagtcctc 3900
ctcttttctt tctttaaaag aagttctttc tttgaagaaa tccgatacat atacagccta 3960
cagtgcaaaa tatttaatgg tataatttag atcaagttaa aaactacata caaagttgtg 4020
atcaacagca tcctaagata aatataaaca aaaggatata ctttgaggtg tacagattaa 4080
gcatataaaa aattagagac taactgggat tttttaaaga ttattccaaa ttaagagttg 4140
ctttgttatg ccttcagcaa atagcttcat tttgccaata ctgaataaaa gagttatttc 4200
tacaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4222
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggaaggattt ccgatggatt t 21

Claims (10)

1.MTR4基因作为靶标在筛选肿瘤治疗药物中的用途，所述MTR4基因的DNA序列如SEQID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物包含shRNA，所述shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物还包含可诱导shRNA在体内表达的诱导剂。
5.可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂在制备肿瘤治疗药物中的用途，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂包含shRNA，所述shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
8.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤治疗药物包含可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂，所述MTR4基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
9.如权利要求8所述的肿瘤治疗药物，其特征在于，所述可降低肿瘤细胞中MTR4基因表达的试剂包含shRNA，所述shRNA的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
10.如权利要求9所述的肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤治疗药物还包含可诱导shRNA在体内表达的诱导剂；优选地，所述可诱导shRNA在体内表达的诱导剂为强力霉素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008000126A (ja) * 2006-05-24 2008-01-10 Kanazawa Univ 遺伝子発現プロファイルによるｃ型肝硬変及び肝癌の検出
CN110423812A (zh) * 2019-07-02 2019-11-08 南方医科大学 Skiv2l2（MTR4）基因在肿瘤治疗中的用途

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Title
江艳等: "MALAT-1与肿瘤", 《生命的化学》 *

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