CN110734861A - 一种猪肠道食糜微生物组的体外保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪肠道食糜微生物组的体外保藏方法。本发明提供一种冷冻保藏生长猪结肠微生物的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜或其接种液通过添加甘油冷冻保藏，实现生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。本方法保藏得到的高相似度水平的微生物组可直接用于粪菌移植与日粮纤维发酵试验，解决了相同微生物组多次利用时出现的成本高、供体少和标准不统一等问题，对猪的生产和畜牧产业的发展起到了积极地推动作用。

Description

一种猪肠道食糜微生物组的体外保藏方法

技术领域

本发明涉及生物技术和畜牧领域，尤其涉及一种猪肠道食糜微生物组的体外保藏方法。

背景技术

动物机体表面分布有多种微生物区系，但是微生物更多的存在动物机体后肠，后肠内的微生物数量甚至超过机体的细胞总量。事实上后肠段的微生物组几乎可以看作是一个具有复杂生理作用的机体器官，对于机体健康具有极其重要的意义，肠道内的微生态平衡是决定肠道健康与否的关键要素。随着人们对于抗生素的大量使用打破了肠道微生态平衡，肠道微生态失衡导致了大量肠道疾病的产生，艰难梭菌感染(CDI)便是其中重要的一种。在过去的20年里艰难梭菌感染已经成为全社会共同关注的健康问题，由于艰难梭菌感染而导致的结肠切除以及死亡人数逐年上升。

通过粪菌移植重建肠道微生态平衡是快速治疗多种肠道疾病的重要手段。粪菌移植通过向宿主肠道内引入一种健康、复杂且稳定的肠道微生物区系来修复或者取代宿主受损的肠道微生物区系，新引入的肠道微生物不仅通过竞争性抑制来干扰宿主肠道有害菌的增殖，它们的代谢产物同样有益于消化系统、肠道黏膜与机体的循环系统(Thomas J，2012)。已有研究表明粪菌移植应用于治疗多种人与动物的临床疾病，包括传染性法氏囊病、肠易激综合征、肥胖、神经性厌食症、系统性自身免疫、食物过敏、胃肠道嗜红细胞疾病以及部分神经变性与神经发育疾病。粪菌移植技术的利用将极大地改善当前的医疗情况，有效地治疗当前难以治疗的部分疾病，节省大量的医疗经费，可以预见粪菌移植技术将在全世界范围内有关肠道微生物治疗与恢复的病例中发挥重要的作用(Thomas J，2012)。

此外粪菌移植是研究微生物机体互作的重要手段，供体的微生物区系引入到受体肠道中，使得接受粪菌移植后的动物还能表现出与供体动物比较一致的健康水平、饲料转化效率和肥胖状况等表型。但粪菌移植的研究当前面临着几个重要的障碍，菌源一致性问题是其中一个最不可忽视的问题。因为涉及到伦理问题，当前粪菌移植的研究与应用更多的是利用健康人或动物的粪便，经过菌群测序与毒性检测后稀释为菌群悬液灌注给患有肠道疾病的人或动物，起到改善与治疗效果。但不容忽视问题是粪便微生物数量与结构与肠道内微生物的数量与结构存在较大的差异。以生长猪后肠道为例，其粪便中纤维分解菌的数量显著高于结肠内容物，而结肠内容物羧甲基纤维素酶活性显著高于粪便。同时由于直肠与结肠肠道生理状态的不同，适宜定植与增殖的菌群同样有较大的差异。这些问题造成粪便中的微生物区系较难在机体肠道中发挥作用，影响粪菌移植的治疗与试验效果。肠道食糜微生物组与粪便微生物组相比菌源一致性高，但由于涉及到伦理与费用问题即便获得适合的肠道食糜微生物组，却因为保存条件的限制使食糜微生物组无法多次利用，同样限制了粪菌移植技术的发展应用。

近几十年来，纤维作为一种重要的碳水化合物引起了人们的广泛关注。日粮纤维在小肠内较难分解和吸收，这些未消化的纤维途经小肠进入到大肠中发酵代谢。日粮纤维的主要发酵产物是气体与挥发性脂肪酸(SCFA)，例如乙酸、丙酸和丁酸等等，这些短链脂肪酸被肠道上皮细胞吸收后经门静脉入肝脏代谢后供机体利用，乙酸和丙酸作为重要的发酵产物可能与机体的脂质与固醇代谢具有重大的关系。丁酸被认为具有一定程度的抗癌以及诱导产生饱腹感等多种有益健康的效果。而不同的日粮纤维因其主要成分结构不同，它们所产生的挥发性脂肪酸的总量以及不同种类脂肪酸的比例是不同的。动物实验固然是探究日粮营养特性最全面的方法，但是也存在很多的不足。例如成本高、试验群体数量大、试验周期长等不容忽视的问题。

因此目前关于日粮纤维在大肠内的发酵研究更多的是使用体外模拟发酵的方法。体外发酵所具有的便捷性是体内试验所不具备的，体外发酵日粮纤维可以不受其他营养组分的影响并且只需少量的样品即可达到试验目的。尽管体外发酵试验有诸多优点，但是缺乏统一的菌源标准同样限制了这一技术的发展。目前大量使用的粪便微生物接种液难以代表后肠内的微生物区系，屠宰动物收取食糜固然具有微生物代表性，但是也存在食糜微生物难以保藏以及不同批次屠宰动物微生物组个体差异等问题。

完整的保藏肠道微生物组是解决菌源标准一致性的有效手段。因此如果选取适当的微生物组保藏方式可以得到统一标准的菌源用于体外肠道微生物功能与机制的研究，一次试验动物屠宰后微生物可以多次长久使用，消除了上述应用问题存在的一系列制约因素。

目前没有比较完善的针对生长猪肠道微生物组体外保藏的方法，对于微生物保藏的研究更多集中于单一与复合菌种，针对复杂微生物组的保藏方法研究较少。相关研究缺乏对于微生物组保藏方法与保护剂浓度系统的探究。更为重要的是以往的研究更多的关注冷藏微生物组的组成变化，缺乏对冷藏后微生物组活力与功能的探究及验证，而活力与功能无疑是选择不同保藏方法最为重要的依据。当前微生物保藏研究系统性与验证的缺乏导致体外研究生长猪结肠微生物的可靠性较差。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜或由其制备的接种液通过添加甘油冷冻保藏，实现生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

上述方法中，所述将生长猪结肠食糜或其接种液通过添加甘油冷冻保藏方法如下：

若短期冷冻保藏，则将生长猪结肠食糜制备为接种液，再将所述接种液与甘油混匀，得到混合物，冷冻保藏所述混合物，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏；

若中长期冷冻保藏，则将生长猪结肠食糜与甘油混匀，得到混合物，再将所述混合物冷冻保藏，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

上述方法中，上述短期冷冻保藏中，接种液与甘油混匀的体积比为10:1；

所述中长期冷冻保藏中，生长猪结肠食糜与甘油混匀的体积比为10:1。

上述方法中，所述短期冷冻保藏为保藏时间小于等于48小时的冷冻保藏；

所述中长期冷冻保藏为保藏时间大于48小时的冷冻保藏；或保藏时间为48小时-18周的冷冻保藏。

本发明另一个目的是提供一种短期冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜制备接种液，再将所述接种液与甘油混匀，得到混合物，冷冻保藏所述混合物，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏；

上述方法中，所述接种液与所述甘油混匀的体积比为10:1；

所述短期冷冻保藏为保藏时间小于等于48小时的冷冻保藏。

本发明第三个目的是提供一种中长期冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜与甘油混匀，得到混合物，再将所述混合物冷冻保藏，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

上述方法中，所述生长猪结肠食糜与所述甘油混匀的体积比为10:1；

所述中长期冷冻保藏为保藏时间大于48小时的冷冻保藏；或所述中长期冷冻保藏为保藏时间为48小时-18周的冷冻保藏。

上述方法中，所述冷冻保藏前的各物质的制备和处理均在37℃严格厌氧环境(AW200SG型，Electrotek公司，英国)下进行；

或，所述冷冻保藏的温度均为﹣80℃；

或各种所述接种液按照如下方法制备：将待制备物质用缓冲液溶解，过滤，收集滤液，得到接种液。

其中，缓冲液为PBS，配方为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，KCL0.2g，纯水定容至1000mL，调pH至7.4。

生长猪结肠食糜制备接种液按照如下方法制备：将生长猪结肠食糜用PBS((NaCl8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，KCL 0.2g，纯水定容至1000mL，调pH至7.4)溶解并稀释10倍(m/v)，四层无菌纱布过滤去掉残渣，形成生长猪结肠食糜的接种液。

食糜甘油混合物制备的接种液按照如下方法制备：将混合物用PBS((NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，KCL 0.2g，纯水定容至1000mL，调pH至7.4)溶解并稀释10倍(m/v)，四层无菌纱布过滤去掉残渣，形成食糜甘油混合物的接种液。

上述方法在保藏猪肠道微生物中的应用也是本发明保护的范围。

上述生长猪结肠食糜为多头生长猪的混合结肠食糜，具体为上述生长猪结肠食糜来自生长期的三元杂交猪，公母各半，禁食8小时后自由采食12小时，屠宰后每头猪取等量的结肠食糜在厌氧条件下充分混匀；其中，生长期的三元猪的体重为30-50kg。

由上述方法制备的冷藏食糜是本发明保护的范围。

由上述方法制备的冷藏接种液也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明通过选择体重适宜且两个月内未经过抗生素处理的生长猪6头，屠宰后分离结肠将结肠食糜在恒温厌氧环境下混匀；混匀后的新鲜食糜经无菌PBS稀释10倍(m/v)后，制备为接种液，接种于体外连续发酵系统中；体外连续发酵系统有较好模拟大肠生理状况，充分使结肠微生物组增殖并保留等优点。因此本试验利用结肠培养基与体外连续发酵系统来验证结肠微生物组的保藏与发酵效果。新鲜食糜制备得到的接种液添加体积比10∶1的保护剂甘油后﹣80℃冰箱中保藏48h，48h后快速解冻复苏同样接种于体外连续发酵系统中，发酵液的菌群结构与接种新鲜食糜得到的发酵液菌群结构相似度高达86％。新鲜混合食糜添加体积比10∶1的保护剂甘油后﹣80℃冰箱中保藏18周，18周后快速解冻复苏亦接种于体外连续发酵系统中，发酵液的菌群结构与接种新鲜食糜得到的发酵液菌群结构相似度高达82％。

本发明极大地提高了长久体外使用和研究生长猪结肠微生物组的可靠性，针对当前缺少猪结肠微生物组保藏的现状提供了一个有效的方法。对于生长猪结肠微生物组保藏后发酵效果的研究更是稀少的情况，本发明更是应用仿生程度高的体外连续发酵系统对微生物组保藏的发酵效果进行验证，试验结果更加可信。其次，本方法保藏得到的高相似度水平的微生物组可直接用于粪菌移植与日粮纤维发酵试验，解决了相同微生物组多次利用时出现的成本高、供体少和标准不统一等问题，对猪的生产和畜牧产业的发展起到了积极地推动作用。

附图说明

图1为体外连续发酵模型示意图。

图2为本发明的技术路线。

图3为A、B、C组体外发酵产物微生物属水平相对含量。

图4为A、B1、B2与C1、C2组体外发酵产物微生物属水平相对含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

甘油，北京索莱宝科技有限公司，G8190

糖蜜，北京索莱宝科技有限公司，FA0070

玉米可溶性淀粉，北京索莱宝科技有限公司，G8300

牛肉浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司，01-008A

酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司，01-012

胰蛋白示，Oxiod公司，LP0047B

葡萄糖，国药，40165664

氯化钠，国药，10019308

L-半胱氨酸-HCL(L－Cysteine-Hcl)，北京索莱宝科技有限公司，C0011

下述实施例中体外连续发酵模型示意图如图1所示，下面发酵在此模型中。

下述实施例的流程图如图2所示。

实施例1、结肠微生物组短期冷冻保藏方法的建立与选择

一、猪结肠新鲜食糜和接种液的获得

1、猪结肠新鲜食糜的获得

使用30-50kg的杜长大三元杂交母猪和去势公猪各3头。先空腹8h，再自由采食12h。颈部放血处死后，迅速打开腹腔，对结肠进行结扎后放入冰盒中立刻运往实验室。肠段表面酒精消毒后放入37℃恒温厌氧操作箱中，将每头猪结肠同一位置的食糜等量混合均匀，得到生长猪新鲜结肠混合食糜。

2、接种液的制备

恒温厌氧操作箱中将上述1获得的生长猪新鲜结肠混合食糜用PBS((NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄ 2.9g，KCL 0.2g，纯水定容至1000mL，调pH至7.4)溶解并稀释10倍(m/v)，四层无菌纱布过滤去掉残渣，形成混合结肠食糜接种液。

3、结肠发酵培养基的制备

结肠发酵培养基:将如下物质按照如下浓度与蒸馏水混合，得到培养基:牛肉浸粉2.4g/L、胰蛋白示20g/L、L-半胱氨酸0.6g/L、葡萄糖2.5g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、淀粉1.0g/L、糖蜜5.0g/L；

将上述结肠发酵培养基分别加入500mL的发酵罐(培养基为300ml)和10L的补料瓶(培养基为6000ml)中，密封，121℃高压灭菌30min后，趁热连入发酵系统中，接入氮气保证厌氧环境。发酵罐中参数设定：液体体积300mL，pH 6.4±0.1、温度37.0±0.1℃、搅拌速度120rpm。

二、方法A、B和C的接种发酵

1、方法A的接种发酵

以体积比1:10的比例将上述一中的2得到的接种液直接接种到上述一中3的发酵罐中，罐内液体体积达到330mL。闷罐培养16h后，再开启进出料，维持罐内体积的恒定，维护发酵设备在运行中各个指标保持在设定值，待稳定后停止发酵，得到A的发酵产物。

整个发酵过程中发酵参数为：发酵体积330mL，pH 6.4±0.1，温度37.0±0.1℃，搅拌速度120rpm，进料和出料速度330mL/天，发酵天数12天，严格厌氧环境。

2、方法B的接种发酵

方法B将上述一的1得到的生长猪新鲜结肠混合食糜在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，食糜与甘油的体积比为10∶1，得到加入甘油的食糜，混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏48h，得到加入甘油短期保藏后的食糜。

加入甘油短期保藏后的食糜在厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，解冻后按照上述一中2的方法制备为接种液进行接种发酵，唯一不同的是，将生长猪新鲜结肠混合食糜替换为加入甘油短期保藏后的食糜，得到加入甘油食糜的接种液。

再将上述加入甘油食糜的接种液替换方法A中的接种液，进行接种发酵，得到B的发酵产物。

3、方法C的接种发酵

方法C将上述一中的2得到的结肠混合食糜接种液在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，结肠混合食糜接种液与甘油的体积比为10∶1。混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏48h，得到加入甘油短期保藏后的食糜接种液。

加入甘油短期保藏后的食糜接种液在厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，再将上述加入甘油食糜的接种液替换方法A中的接种液，进行接种发酵，得到C的发酵产物。

三、检测

1、体外培养后微生物检测

利用16S rRNA二代焦磷酸测序技术，Hiseq2500对上述三的各种接种方法得到的发酵产物中的微生物V3-V4区进行测序，此部分由北京市计算中心完成。

A、DNA的提取

采用CTAB或SDS方法分别提取发酵产物的基因组DNA。

采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。

B、PCR扩增

稀释后的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物341F(5’-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGG CGGGG CGGGGGCA CGGGGGG CCTACGGG AGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’)，使用高效和高保真的酶进行PCR，得到约400bp PCR产物，含有16S rRNA的V3-V4区。

PCR反应体系及反应条件

反应条件：95℃5min；95℃1min，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃7min，4℃∞。

C、PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒回收产物。

D、文库构建和上机测序

使用New England Biolabs公司的NEB

Ultra^TM DNA Library Prep KitforIllumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用Hiseq2500，每个样品单独建库测序，与GenBank上的数据比对，确定每个样品微生物组成和其占全部微生物数量的百分比(即含量)。

A、B和C接种后的发酵产物在属水平含量前25的微生物组成和含量的检测结果如表1和图3所示：

表1为含量前25的微生物含量(％)

用Pearson距离函数计算各组之间的相似度，分析差异菌群，得到A组微生物组和B、C法体外培养后微生物组菌群相似度，结果如表2。

表2为B、C微生物组与A微生物组相似度(％)

根据上述结果可以看出，

在属水平上，B与C方法的发酵样品与A方法相似，均对拟杆菌有富集作用，含量分别为37.6％和23.46％，A法和C法能够较好的培养拟杆菌属和一种未知的微生物属，B法能够富集瘤胃球菌属(10.61％)，A法与C法均不能对此菌属富集。A法与C法可以保藏Rikenellaceae菌属且分布比较均匀；B、C法与A法发酵微生物结构相似度从高到低是C86.8％，B 81.5％。添加保护剂冷冻保藏后发酵的两组与新鲜食糜接种发酵组仍有较高的菌群相似度，说明在有效减少冷冻过程中微生物的死亡发挥重要作用。

C法与A法即新鲜食糜接种液的菌群相似性更高。

上述结果表明，在短期保藏中(低温48小时)C法更利于保藏，制备为接种液后再混合体积比为10∶1的甘油冷冻要比食糜中添加体积比为10∶1的甘油冷冻更加有效地保藏生长猪结肠微生物组。

2、体外培养后微生物代谢产物检测

检测A、B和C法的体外发酵产物中挥发性脂肪酸。

挥发酸测定：离子色谱法

检测方法：称取0.5g上述二得到的发酵产物于10mL聚丙烯离心管中，加入8mL去离子水，超声30min后8000rpm离心10min，取上清液稀释10倍，用0.22μm滤膜过滤待上机。25μL样品溶液经ICS-3000离子色谱仪分析(戴安，美国)电导检测。多种有机酸经AS11分析柱(250mm×4mm)及AG11保护柱分离，流动相洗脱条件：氢氧化钾梯度，0-5min，0.8-1.5mM；5-10min，1.5-2.5mM；10-15min，2.5mM，流速为1mL/min。

结果如表3所示。

表3为A、B与C法发酵产生的挥发性脂肪酸(mg/kg)

总体上，在三种发酵液中乙酸、丙酸、丁酸都是最主要的挥发性脂肪酸，C组乙酸与异戊酸的产生量与A组更加接近。

上述结果均表明，在短期保藏中(低温48小时)C法更利于保藏。

实施例2、结肠微生物组中长期(大于48小时)冷冻保藏方法的建立与选择

一、方法B1、B2与C1、C2的接种发酵与结果检测

方法B1将实施例1的一中的1得到的生长猪新鲜结肠混合食糜在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，食糜与甘油的体积比为10∶1。混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏18周，18周后厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，解冻后的食糜按照实施例1的方法B制备接种液进行接种发酵。

方法B2将将实施例1的一中的1得到的生长猪新鲜结肠混合食糜在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，食糜与甘油的体积比为5∶1。混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏18周，18周后厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，解冻后的食糜按照实施例1的方法B制备接种液进行接种发酵。

方法C1将实施例1的一的2得到接种液在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，接种液与甘油的体积比为10∶1。混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏18周，18周后厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，解冻后的食糜按照实施例1的方法C制备接种液进行接种发酵。

方法C2将上述1(2)中得到接种液在37℃恒温厌氧操作箱中添加一定量的甘油，接种液与甘油的体积比为5∶1。混合均匀后置于﹣80℃的冰箱中保藏18周，18周后厌氧条件下迅速在37℃环境下解冻复苏，解冻后的食糜按照实施例1的方法C制备接种液进行接种发酵。

方法B1、B2与C1、C2得到发酵样品按照上述1(3)中的方法检测微生物结构数量与数据分析，结果如表4和图4所示。

表4为含量前25的微生物含量(％)

用Pearson距离函数计算各组之间的菌群相似度，分析差异菌群，得到A法微生物组和B1、B2与C1、C2法体外培养后微生物组菌群相似度，结果如表5。

表5为B1、B2与C1、C2微生物组与A微生物组相似度(％)

在属水平上，B1、B2与C1、C2方法的发酵均对拟杆菌有富集作用，含量分别为19.88％，15.70％，33.05％，24.32％，C1、C2法的发酵对于Lachnoclostridium菌属和瘤胃球菌属的富集作用要强于B1、B2法，B1法发酵的菌属分布相比其他组更均匀，得到微生物组的一致性较高。在与A法即新鲜食糜接种法发酵的微生物相似度比较上，B1组与A组的菌群相似度是最高的达到81.7％，其他几种方法与A组的菌群相似度从高到低依次是C177.1％，B2 66.6％，C2 65.2％，上述结果表明，在中长期保藏中(18周)，B1组更加有效地保藏生长猪结肠微生物组

采用实施例1的三的2的方法检测B1、B2、B3与C1、C2、C3的体外发酵产物中挥发性脂肪酸，结果如表6所示。

表6为A、B1、B2与C1、C2的体外发酵产生的挥发性脂肪酸(mg/kg)

四组方法发酵液的挥发性脂肪酸主要是以乙酸、丙酸、异丁酸与戊酸为主，甲酸与戊酸的含量相对较低。B1组与A组菌群相似度最高，B1组的乙酸产生量相对接近于A组的乙酸产生量，同样B1组与A组丙酸产生量也是最接近的，B1组异戊酸的产生量相对于其他三组最少却同样最接近A组。与A组菌群相似度最低的B2组产生的挥发性脂肪酸比较单一，主要集中于乙酸与异丁酸。

上述表明，在生长猪结肠微生物组的保藏过程中，甘油浓度与保藏方式对于微生物组的保藏效果影响是巨大的，不同的保藏方式需要添加不同量的甘油。对于中长期保藏来说，混合结肠食糜添加体积比为10∶1的甘油可以有效地的保藏结肠微生物组，甘油添加量太高会使得渗透压太大导微生物脱水大量死亡。而制备为接种液添加甘油的保藏方式更加不同，PBS稀释后含水量增多，需要更多的甘油。

因此，短期保藏时C组新鲜混合食糜制备为接种液再混合体积比为10∶1的甘油，混匀冷冻可以有效地保藏生长猪结肠微生物组，其发酵后微生物菌群相似度与新鲜食糜接种后的发酵微生物组相似度达到86.8％。而在中长期保藏结肠微生物组时，B1组新鲜混合食糜混合体积比为10∶1的甘油混匀冷冻可以有效地保藏生长猪结肠微生物组，发酵后微生物菌群相似度与新鲜食糜接种后的发酵微生物组相似度达到81.7％。

Claims (10)

1.一种冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜或由其制备的接种液通过添加甘油冷冻保藏，实现生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述将生长猪结肠食糜或其接种液通过添加甘油冷冻保藏为如下：

若短期冷冻保藏，则将所述生长猪结肠食糜制备为接种液，再将所述接种液与所述甘油混匀，得到混合物，冷冻保藏所述混合物，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏；

或，若中长期冷冻保藏，则将所述生长猪结肠食糜与所述甘油混匀，得到混合物，再将所述混合物冷冻保藏，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述短期冷冻保藏中，所述接种液与所述甘油混匀的体积比为10:1；

和/或，所述中长期冷冻保藏中，所述生长猪结肠食糜与所述甘油混匀的体积比为10:1。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述短期冷冻保藏为保藏时间小于等于48小时的冷冻保藏；

和/或，所述中长期冷冻保藏为保藏时间大于48小时的冷冻保藏；或保藏时间为48小时-18周的冷冻保藏。

5.一种短期冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜制备接种液，再将所述接种液与甘油混匀，得到混合物，冷冻保藏所述混合物，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述接种液与所述甘油混匀的体积比为10:1；

和/或，所述短期冷冻保藏为小于等于48小时冷冻保藏。

7.一种中长期冷冻保藏生长猪结肠微生物组的方法，包括如下步骤：将生长猪结肠食糜与甘油混匀，得到混合物，再将所述混合物冷冻保藏，实现源于生长猪结肠食糜的生长猪结肠微生物组的冷冻保藏。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述生长猪结肠食糜与所述甘油混匀的体积比为10:1；

和/或，所述中长期冷冻保藏为保藏时间大于48小时的冷冻保藏；或所述中长期冷冻保藏为保藏时间为48小时-18周的冷冻保藏。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述冷冻保藏前的各物质的制备和处理均在37℃严格厌氧环境下进行；

或，所述冷冻保藏的温度均为﹣80℃。

10.由权利要求1-9任一所述方法制备的冷藏食糜或冷藏接种液；

或，权利要求1-9任一所述方法在保藏猪肠道微生物中的应用。

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