CN110731422A - 一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用；所述含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物由发酵混合物和百里香酚混合而成；所述发酵混合物通过发酵用量的驯化粪肠球菌对由炒麦芽和炒焦大豆组成的营养混合物进行发酵得到；所述驯化粪肠球菌由含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基传代培养得到。使用所述制备方法得到的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物作为饲料添加剂的应用。本发明使粪肠球菌的保存期大大延长，作为饲料添加剂用于促进动物生长和生产其性能远远高于单独使用百里香酚或粪肠球菌。

Description

一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于粪肠球菌驯化技术领域，具体涉及一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用。
背景技术
随着限抗减抗政策的发布实施，抗菌药将逐步退出饲料添加剂的队伍。为了满足高度集中饲养条件下的保健需求，为了满足畜牧业高度集约化下高产、保健，同时又满足天然、无公害要求的需求，需要从天然产物出发，寻找相应的品种或相关产物的组合物。
百里香酚具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗痉挛、抗氧化活性等作用。研究显示百里香酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、寄生曲霉菌等具有明显抑制作用。有研究表明，百里香酚具有很强的抗氧化性，抗氧化能力高于维生素E。通过其抗氧化、免疫调节和改善肠道菌群等功能对动物的作用，百里香酚能够有效改善动物的生产性能；但是，以作为生长促进剂使用，对畜禽日增重、日采食量、料肉比的影响差异无统计学意义。
粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一，其能产生天然抗生素，有利于机体健康；同时还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。《饲料添加剂品种目录(2013)》将粪肠球菌规定为可以添加到饲料中的菌种，其在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，并且发育、生长和繁殖。这种生存方式可形成乳酸菌屏障，抵御外来细菌、病毒及霉菌毒素等的副影响；同时有利于改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌群紊乱。肠道中，粪肠球菌能够软化饲料纤维，提高饲料的转化率，分解蛋白质为小肽、合成B族维生素，增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平；能分解部分蛋白质成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物转化为L型乳酸，合成乳酸钙，促进钙质吸收；能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对动物体内常见的致病菌具有良好的抑制作用。
在现有的技术中，并没有发现百里香酚与粪肠球菌混合使用的情况，究其原因，主要是因为粪肠球菌活菌制剂易受抗菌剂的影响，百里香酚作为一种具有抗菌功能的成分，难免会对粪肠球菌的存活带来不利的影响。但是，就从促进动物生产的功能方向来说，两者的作用是相通的，因此，现有技术急需一种能够将两者结合起来从而促进动物生长的技术工艺。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用。
本发明所采用的技术方案为：
一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物，所述含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物由发酵混合物和百里香酚混合而成；所述发酵混合物通过发酵用量的驯化粪肠球菌对由炒麦芽和炒焦大豆组成的营养混合物进行发酵得到；所述驯化粪肠球菌由含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基传代培养得到。
进一步的，所述营养组合物由90-99重量份的炒麦芽和1-10重量份的炒焦大豆组成；所述营养组合物和百里香酚的重量比为100：1-10。
进一步的，所述含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基中微量百里香酚与粪肠球菌培养基的重量比为0.09-0.2：1。
一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物的制备方法，包括步骤：
驯化粪肠球菌：向含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基中加入粪肠球菌，传代培养后得到传代驯化粪肠球菌液；
发酵：将所述营养混合物与酵母发酵物混合后，加入传代驯化粪肠球菌液进行发酵，得到发酵混合物；
复配：将发酵混合物与百里香酚混合均匀后，得到含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物。
进一步的，所述传代驯化粪肠球菌液为第I代-第X代驯化粪肠球菌液。
进一步的，得到第I代-第X代驯化粪肠球菌液的具体步骤如下：
执行步骤：取粪肠球菌培养基加水溶解，调节pH值为6.5，灭菌，凉至室温后加入上一代驯化粪肠球菌液，振摇,30～38℃培养24～48h，即得下一代驯化粪肠球菌液；
重复步骤：将下一代驯化粪肠球菌液作为上一代驯化粪肠球菌液，重复执行所述执行步骤，得到第I代-第X代驯化粪肠球菌液。
进一步的，当上一代驯化粪肠球菌液为粪肠球菌标准菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第I代驯化粪肠球菌液，百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.01：1：99：1；
当上一代驯化粪肠球菌液为第I代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第II代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.02：2：98：2；
当上一代驯化粪肠球菌液为第II代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第III代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.03：3：97：3；
当上一代驯化粪肠球菌液为第III代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第IV代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.04：4：96：4；
当上一代驯化粪肠球菌液为第IV代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第V代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.05：5：95：5；
当上一代驯化粪肠球菌液为第V代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VI代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.06：6：94：6；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VI代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VII代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.07：7：93：7；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VII代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VIII代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.08：8：92：8；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VIII代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第IX代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.09：9：91：9；
当上一代驯化粪肠球菌液为第IX代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第X代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.10：10：90：10。
进一步的，所述发酵步骤中酵母发酵物包括如下重量份数的组分：糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份和水50份；所述发酵步骤的具体步骤如下：将酵母发酵物混匀，加热灭菌，凉至室温后与灭菌的营养混合物混匀，加入传代驯化粪肠球菌液，密闭发酵，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎，得到发酵混合物。
进一步的，所述发酵步骤加入的传代驯化粪肠球菌液为第I代-第X代驯化粪肠球菌液中的任意一项时；复配步骤相应得到含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物I-含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物X中的所述任意一项。
使用所述的制备方法得到的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物作为饲料添加剂的应用。
本发明的有益效果为：本发明的一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物及其制备方法与应用，通过将微量百里香酚加入粪肠球菌培养基，对粪肠球菌进行传代驯化，用驯化后的粪肠球菌对炒麦芽与炒焦大豆的混合物进行发酵，再将经发酵后得到的混合物与适量百里香酚混合得到含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物；通过实验证实，本发明的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物中百里香酚和粪肠球菌不仅没有表现出相互不利影响使双方功能降低，反而表现出高度功能协同性；同时，使粪肠球菌的保存期大大延长；本发明作为饲料添加剂用于促进动物生长和生产，其性能远远高于单独使用百里香酚或粪肠球菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
本发明中发酵用量指的是驯化粪肠球菌在用于发酵使用时，能起到发酵作用的用量；本发明中的下一代和上一代用于表示相邻的两代驯化粪肠球菌液；如第III代驯化粪肠球菌液的上一代为第II代驯化粪肠球菌液，以此类推。
实施例1
材料：粪肠球菌标准菌株(广东环凯微生物科技有限公司)；标准MRS培养基(广东环凯微生物科技有限公司),百里香酚(江西百草药业有限公司)，炒麦芽(四川科伦中药饮片有限公司)，其他均为市售产品。
MRS培养基配方：蛋白胨10.0g,牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，MgSO4 0.1g，MnSO4 0.05g，K2HPO4 2.0g，吐温-80 1.0g。
取标准MRS培养基55g，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加粪肠球菌冻存菌种一支，80～120r/min振摇,30～38℃培养24～48h，既得活化菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽94份、大豆(炒焦)4份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.01份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加活化菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚5份，混匀，得菌酚复合对照物。
实施例2
材料：与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚50mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加粪肠球菌冻存菌种一支，80～120r/min振摇,30～38℃培养24～48h,既得第Ⅰ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽99份、大豆(炒焦)1份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.01份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅰ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚1份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ。
实施例3
材料：第Ⅰ代驯化粪肠球菌液(实施例2制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚40mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅰ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇,30～38℃培养24～48h,既得第Ⅱ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽98份、大豆(炒焦)2份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.02份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅱ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚2份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅱ。
实施例4
材料：第Ⅱ代驯化粪肠球菌液(实施例3制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚60mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅱ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇,30～38℃培养24～48h,既得第Ⅲ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽97份、大豆(炒焦)3份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.03份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅲ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚3份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅲ。
实施例5
材料：第Ⅲ代驯化粪肠球菌液(实施例4制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚50mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅲ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇,30～38℃培养24～48h,既得第Ⅳ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽96份、大豆(炒焦)4份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.04份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅳ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚4份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅳ。
实施例6
材料：第Ⅳ代驯化粪肠球菌液(实施例5制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚80mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅳ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h,既得第Ⅴ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽95份、大豆(炒焦)5份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.05份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅴ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚5份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅴ。
实施例7
材料：第Ⅴ代驯化粪肠球菌液(实施例6制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚70mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅴ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h，既得第Ⅵ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽94份、大豆(炒焦)6份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.06份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅵ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚6份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅵ。
实施例8
材料：第Ⅵ代驯化粪肠球菌液(实施例7制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚100mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅵ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h,既得第Ⅶ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽93份、大豆(炒焦)7份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.07份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅶ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚7份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅶ。
实施例9
材料：第Ⅶ代驯化粪肠球菌液(实施例8制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚90mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅶ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h,既得第Ⅷ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽92份、大豆(炒焦)8份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.08份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅷ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚8份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅷ。
实施例10
材料：第Ⅷ代驯化粪肠球菌液(实施例9制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚120mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅷ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h,既得第Ⅸ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽91份、大豆(炒焦)9份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.09份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅸ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚9份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅸ。
实施例11
材料：第Ⅸ代驯化粪肠球菌液(实施例10制备)；其他与实施例1相同。
取标准MRS培养基55g，加百里香酚110mg，加水1000ml使溶解，调节pH值为6.5，121℃灭菌15min，凉至室温，加第Ⅸ代驯化粪肠球菌液10ml，80～120r/min振摇，30～38℃培养24～48h,既得第Ⅹ代驯化粪肠球菌液。取出于4～6℃保存备用。
取炒麦芽90份、大豆(炒焦)10份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.10份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅹ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h，40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚10份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅹ。
表1实施例1～11中所用主要物料及其量的变化
Figure BDA0002292082590000111
Figure BDA0002292082590000121
实施例12
材料：试验大鼠130只(四川省医学科学院)，雌雄各半；环磷酰胺(市售)；菌酚复合对照物(实施例1制备)；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号(实施例13中序号5至序号9的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物)。
将大鼠随机分为13组(每组10只，雌雄各半)，依次为空白组、阴性对照组、阳性对照组、试验Ⅰ～Ⅹ组。其中，空白组常规饲养；阴性对照组添加了环磷酰胺；阳性对照组加菌酚复合对照物，试验Ⅰ～Ⅹ组依次添加含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号。
除空白组外，其它组在试验期间每天向各组大鼠腹腔注射环磷酰胺0.1ml/d；三天后，除空白组与阴性对照组外，每天在各组大鼠饮水中依次加1％的对应实验品。7天后分别测定各组大鼠脾脏指数、胸腺指数和免疫细胞CD4+/CD8+，结果见表2。
表2不同实验组大鼠脾、胸腺重量及其指数比较
组别 CD4+/CD8+ 脾脏指数 胸腺指数
空白组 2.57 0.0027 0.0016
阴性对照组 1.57 0.0024 0.0011
阳性对照组 2.24 0.0025 0.0019
试验Ⅰ组 2.24 0.0030 0.0020
试验Ⅱ组 2.26 0.0029 0.0020
试验Ⅲ组 2.40 0.0029 0.0023
试验Ⅳ组 2.58 0.0030 0.0021
试验Ⅴ组 2.38 0.0027 0.0019
试验Ⅵ组 2.48 0.0027 0.0019
试验Ⅶ组 2.58 0.0030 0.0021
试验Ⅷ组 2.34 0.0028 0.0021
试验Ⅸ组 2.20 0.0025 0.0018
试验Ⅹ组 2.23 0.0026 0.0016
从表2中结果来看，试验Ⅲ～Ⅷ组的数据中，无论是脾脏指数、胸腺指数，还是免疫调节作用，都明显优于阳性对照组与阴性对照组。
实施例13
材料：试验小鼠130只(四川省医学科学院)，雌雄各半；菌酚复合对照物(实施例1制备)；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号(实施例13中序号5至序号9的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物)。
将大鼠随机分为13组(每组10只，雌雄各半)，依次为空白组、阴性对照组、阳性对照组、试验Ⅰ～Ⅹ组。其中，空白组常规饲养；阴性对照组添加了环磷酰胺；阳性对照组加菌酚复合对照物，试验Ⅰ～Ⅹ组依次添加含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号。
第一天测定所有组中小鼠的空腹体重。第二天起，除空白组外，每天向各组小鼠饮水中依次加1％的对应实验品，连续7天。并于第8天早上测定实验组小鼠空腹体重，并计算其平均日增重，单位为克，结果见表3。
表3小鼠平均日增长对照表
组别 平均初重 平均终重 平均日增重 平均日采食 料重比
空白组 20.53 23.72 0.46 5.95 13.06
对照组 20.17 23.36 0.46 5.86 12.86
试验Ⅰ组 20.19 23.8 0.52 6.55 12.70
试验Ⅱ组 20.17 23.92 0.54 6.39 11.93
试验Ⅲ组 19.75 24.03 0.61 5.63 9.21
试验Ⅳ组 20.39 24.56 0.60 5.67 9.52
试验Ⅴ组 20.03 24.48 0.64 6.03 9.49
试验Ⅵ组 20.27 24.64 0.62 6.12 9.80
试验Ⅶ组 20.63 24.72 0.58 5.37 9.19
试验Ⅷ组 19.99 23.99 0.57 5.33 9.33
试验Ⅸ组 20.41 24.08 0.52 6.22 11.86
试验Ⅹ组 20.43 23.96 0.50 5.92 11.74
从表3中结果来看，试验Ⅴ组的平均日增重最高，试验Ⅶ组的料重比最低，综合两方面结果来，实验Ⅲ～Ⅷ组都明显优于空白组和对照组。
实施例14
材料：试验大鼠130只(四川省医学科学院)，雌雄各半；环磷酰胺(市售)；菌酚复合对照物(实施例1制备；密闭，室温下在干燥通风处储存6个月)；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号(实施例13中序号5至序号9的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物；密闭，室温下在干燥通风处储存6个月)。
将大鼠随机分为13组(每组10只，雌雄各半)，依次为空白组、阴性对照组、阳性对照组、试验Ⅰ～Ⅹ组。其中，空白组常规饲养；阴性对照组添加了环磷酰胺；阳性对照组加菌酚复合对照物，试验Ⅰ～Ⅹ组依次添加含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号。
除空白组外，其它组在试验期间每天向各组大鼠腹腔注射环磷酰胺0.1ml/d；三天后，除空白组与阴性对照组外，每天在各组大鼠饮水中依次加1％的对应实验品。7天后分别测定各组大鼠脾脏指数、胸腺指数和免疫细胞CD4+/CD8+，结果见表2。
表4不同实验组大鼠脾、胸腺重量及其指数比较
组别 CD4+/CD8+ 脾脏指数 胸腺指数
空白组 2.53 0.0025 0.0019
阴性对照组 1.58 0.0021 0.0014
阳性对照组 2.26 0.0019 0.0017
试验Ⅰ组 2.13 0.0022 0.0017
试验Ⅱ组 2.19 0.0021 0.0014
试验Ⅲ组 2.43 0.0028 0.0022
试验Ⅳ组 2.56 0.0027 0.0024
试验Ⅴ组 2.45 0.0028 0.002
试验Ⅵ组 2.39 0.0026 0.0019
试验Ⅶ组 2.52 0.0026 0.0022
试验Ⅷ组 2.47 0.0025 0.0021
试验Ⅸ组 2.17 0.002 0.0018
试验Ⅹ组 2.17 0.0018 0.0015
从表2中结果来看，经过3个月的常温储藏之后，试验Ⅲ～Ⅷ组的数据中，无论是脾脏指数、胸腺指数，还是免疫调节作用，都明显优于阳性对照组与阴性对照组；而试验Ⅰ～Ⅱ组和试验Ⅸ～Ⅹ的数据与阴性对照组相似。由此可知，经过驯化，试验Ⅲ～Ⅷ组所得的发明物稳定性更高，有利于发明产品的长期保存。
实施例15
材料：试验小鼠130只(四川省医学科学院)，雌雄各半；菌酚复合对照物(实施例1制备；密闭，室温下在干燥通风处储存6个月)；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号(实施例13中序号5至序号9的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物；密闭，室温下在干燥通风处储存6个月)。
将大鼠随机分为13组(每组10只，雌雄各半)，依次为空白组、阴性对照组、阳性对照组、试验Ⅰ～Ⅹ组。其中，空白组常规饲养；阴性对照组添加了环磷酰胺；阳性对照组加菌酚复合对照物，试验Ⅰ～Ⅹ组依次添加含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物Ⅰ～Ⅹ号。
第一天测定所有组中小鼠的空腹体重。第二天起，除空白组外，每天向各组小鼠饮水中依次加1％的对应实验品，连续7天。并于第8天早上测定实验组小鼠空腹体重，并计算其平均日增重，单位为克，结果见表5。
表5小鼠平均日增长对照表
组别 平均初重 平均终重 平均日增重 平均日采食 料重比
空白组 20.35 23.68 0.48 5.85 12.30
对照组 21.71 25.12 0.49 5.83 11.97
试验Ⅰ组 20.23 23.81 0.51 6.25 12.22
试验Ⅱ组 20.22 23.94 0.53 6.39 12.02
试验Ⅲ组 19.78 24.08 0.61 5.73 9.33
试验Ⅳ组 20.41 24.59 0.60 5.76 9.65
试验Ⅴ组 20.04 24.52 0.64 6.13 9.58
试验Ⅵ组 20.31 24.65 0.62 6.17 9.95
试验Ⅶ组 20.68 24.74 0.58 5.42 9.34
试验Ⅷ组 20.02 24.04 0.57 5.33 9.28
试验Ⅸ组 20.43 24.11 0.53 6.22 11.83
试验Ⅹ组 20.44 24.01 0.51 5.92 11.61
从表3中结果来看，经过3个月的常温储藏之后，试验Ⅲ～Ⅷ组的数据中，平均日增重与料重比都明显优于阳性对照组与阴性对照组；而试验Ⅰ～Ⅱ组和试验Ⅸ～Ⅹ的数据与阴性对照组相似。由此可知，经过驯化，试验Ⅲ～Ⅷ组所得的发明物稳定性更高，有利于发明产品的长期保存。
实施例16
材料：第Ⅷ代驯化粪肠球菌液(实施例9制备)；其他与实施例1相同。
取炒麦芽92份、大豆(炒焦)8份，粉碎为10目粉，混匀，通蒸汽灭菌30分钟；与此同时，取糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份、百里香酚0.01份，加水50份，煮沸30分钟；趁热，将两者混合，凉至室温，加第Ⅷ代驯化粪肠球菌液20份，密闭，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎(温度不超过55℃)为40～60目粉，加百里香酚8份，混匀，得含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物实验品。
实验例一含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物对仔鸡免疫功能与生长性能的影响
材料：1日龄AA+商品肉仔鸡180只(成都某种鸡场)；饲料添加剂粪肠球菌(山东鹤来生物科技有限公司)；饲料添加剂百里香酚(湖南百康生物工程有限公司)；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物实验品(实施例16制备)；鸡新城疫活疫苗(北京华都诗华生物制品有限公司)；鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原(中国兽医药品监察所)。
方法：将180只1日龄非免疫AA+肉仔鸡随机分为3个组，即免疫对照组(不添加药物)、阳性对照组(分别添加饲料添加剂粪肠球菌与饲料添加剂百里香酚，添加量均为200mg/kg)和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物实验品(添加量为200mg/kg)，每组3个重复，每重复20只鸡。定时加料，肉仔鸡自由采食，自由饮水。3组肉仔鸡的免疫程序见表6。
表6肉仔鸡免疫程序
日龄 疫苗 接种方法 倍量
1～7 新城疫+传支 滴鼻及点眼 1.2～1.5
14～16 传染性法氏囊 饮水 1.2
21～23 新城疫 饮水 1.2
相关考察指标及其考察方法与结果如下。
于肉仔鸡饲养1、7、14、21、28和35日龄早上饲喂前，称取各组肉仔鸡的空腹体重并记录数据，并分别记录每组肉仔鸡的日均采食量，计算肉仔鸡在各日龄段的平均体重(见表7)和料肉比(见表8)。
表7不同日龄肉仔鸡平均体重(g)
Figure BDA0002292082590000181
从表7可见，14日龄后，阳性对照组和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组肉仔鸡的平均体重均显著高于免疫对照组，含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组肉仔鸡的平均体重均显著高于阳性对照组。
表8不同日龄肉仔鸡的料重比
Figure BDA0002292082590000182
从表8可见，饲养28日龄后，阳性对照组和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组的料肉比均显著低于免疫对照组，含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组的料肉比均显著低于阳性对照组。
分别于14、21、28和35日龄时，每组随机抽取6只鸡，翅静脉采血，分离血清，按国家标准《GB/T16550-2008新城疫诊断技术》中相应的方法检测新城疫抗体效价(结果见表9)。
表9肉仔鸡血清中新城疫抗体水平
Figure BDA0002292082590000191
从表9可见，阳性对照组和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组在不同日龄时血清中新城疫抗体水平均高于免疫对照组。在14和21日龄时，阳性对照组和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组的新城疫抗体水平均高于免疫对照组，且差异显著；在28和35日龄时，含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组的新城疫抗体水平显著高于阳性对照组；在35日龄时，含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组新城疫抗体水平显著高于其他各组。
于35日龄时各组随机抽取6只肉仔鸡，空腹称质量后解剖，完整摘取3种免疫器官：胸腺、法氏囊和脾，剔除表面筋膜后立刻称鲜质量并记录，计算免疫器官指数：免疫器官指数＝器官质量÷体重(结果见表10)。
表10 35日龄时肉仔鸡免疫器官指数g/kg
Figure BDA0002292082590000192
从表10可见，阳性对照组和含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组肉仔鸡的免疫器官指数显著高于免疫对照组；含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组免疫器官指数略高于阳性对照组，但差异不显著，含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物组的胸腺指数高于其他各组，且差异显著。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.一种含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物，其特征在于：所述含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物由发酵混合物和百里香酚混合而成；所述发酵混合物通过发酵用量的驯化粪肠球菌对由炒麦芽和炒焦大豆组成的营养混合物进行发酵得到；所述驯化粪肠球菌由含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基传代培养得到。
2.根据权利要求1所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物，其特征在于：所述营养组合物由90-99重量份的炒麦芽和1-10重量份的炒焦大豆组成；所述营养组合物和百里香酚的重量比为100：1-10。
3.根据权利要求2所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物，其特征在于：所述含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基中微量百里香酚与粪肠球菌培养基的重量比为0.09-0.2：1。
4.一种权利要求1-3任意一项所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物的制备方法，其特征在于：包括步骤：
驯化粪肠球菌：向含有微量百里香酚的粪肠球菌培养基中加入粪肠球菌，传代培养后得到传代驯化粪肠球菌液；
发酵：将所述营养混合物与酵母发酵物混合后，加入传代驯化粪肠球菌液进行发酵，得到发酵混合物；
复配：将发酵混合物与百里香酚混合均匀后，得到含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物。
5.根据权利要求4所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物的制备方法，其特征在于：所述传代驯化粪肠球菌液为第I代-第X代驯化粪肠球菌液。
6.根据权利要求5所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物的制备方法，其特征在于：得到第I代-第X代驯化粪肠球菌液的具体步骤如下：
执行步骤：取粪肠球菌培养基加水溶解，调节pH值为6.5，灭菌，凉至室温后加入上一代驯化粪肠球菌液，振摇,30～38℃培养24～48h，即得下一代驯化粪肠球菌液；
重复步骤：将下一代驯化粪肠球菌液作为上一代驯化粪肠球菌液，重复执行所述执行步骤，得到第I代-第X代驯化粪肠球菌液。
7.根据权利要求6所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物制备方法，其特征在于：
当上一代驯化粪肠球菌液为粪肠球菌标准菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第I代驯化粪肠球菌液，百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.01：1：99：1；
当上一代驯化粪肠球菌液为第I代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第II代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.02：2：98：2；
当上一代驯化粪肠球菌液为第II代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第III代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.03：3：97：3；
当上一代驯化粪肠球菌液为第III代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第IV代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.04：4：96：4；
当上一代驯化粪肠球菌液为第IV代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第V代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.05：5：95：5；
当上一代驯化粪肠球菌液为第V代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VI代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.06：6：94：6；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VI代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VII代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.07：7：93：7；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VII代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第VIII代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.08：8：92：8；
当上一代驯化粪肠球菌液为第VIII代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第IX代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.09：9：91：9；
当上一代驯化粪肠球菌液为第IX代驯化粪肠球菌液时，下一代驯化粪肠球菌液为第X代驯化粪肠球菌液；百里香酚、微量百里香酚、炒麦芽和炒焦大豆的重量比为0.10：10：90：10。
8.根据权利要求7所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物制备方法，其特征在于：所述发酵步骤中酵母发酵物包括如下重量份数的组分：糖蜜2份、酵母粉0.25份、硫酸镁0.25份、硫酸锰0.01份和水50份；所述发酵步骤的具体步骤如下：将酵母发酵物混匀，加热灭菌，凉至室温后与灭菌的营养混合物混匀，加入传代驯化粪肠球菌液，密闭发酵，30～38℃培养24～48h,40～55℃晾干，粉碎，得到发酵混合物；
9.根据权利要求5-8任意一项所述的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物制备方法，其特征在于：所述发酵步骤加入的传代驯化粪肠球菌液为第I代-第X代驯化粪肠球菌液中的任意一项时；复配步骤相应得到含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物I-含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物X中的所述任意一项。
10.使用权利要求4-8任意一项所述的制备方法得到的含百里香酚与粪肠球菌活菌的发酵物作为饲料添加剂的应用。
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