CN110720393A - 一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：（1）琴叶榕茎段的消毒和接种：取当年抽出的琴叶榕新茎，剪成带腋芽茎段进行接种；（2）丛生芽的诱导；（3）不定芽的增殖；（4）再生植株的生根培养；（5）炼苗移栽。在上述步骤中采用了不同处理、不同成分及配比的培养基。采用本发明的方法，能够快速地获得琴叶榕植株，利于产业化生产。采用本发明方法，琴叶榕丛生芽的不定芽诱导率高达80.0%，不定芽数6.6，不定芽增殖倍数可达6.4，生根率达97.5%，植株移栽成活率可达98%以上。

Description

一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，具体涉及琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法。
背景技术
琴叶榕(Ficus pandurata Hance)，又名鸡公木、筛箕子木、牛奶柴、水榕、牛奶树、小牛奶树、倒吊葫芦，因其叶形状似西洋乐器的提琴而得名，为桑科榕属小灌木，产广东、海南、广西、福建、湖南、湖北、江西、安徽(南部)、浙江。生于山地、旷野或灌丛林下。其根和叶入药，名琴叶榕，又名山甘草、山沉香、过山香、铁牛入石、牛根子。其性平，味甘、微辛，具祛风除湿、解毒消肿、活血通经。主治风湿痹痛、黄疸、疟疾、百山咳、乳汁不通、乳痈、痛经、痛经、痈疖肿痛、跌打损伤和毒蛇咬伤。目前琴叶榕基本处于野生状态，而野生状态的琴叶榕呈零星状分布，说明其靠种子繁殖的效率并不高。目前尚无琴叶榕快速繁殖的研究报道。申请号为CN201310534804.5的专利和两篇发表的学术论文所用的材料琴叶榕实际上均为国外引进的大琴榕(Ficus lyrata)。
目前榕属植物的组织培养与快速繁殖的研究报道多集中于橡皮树、菩提树、富贵榕、大琴榕等园艺用植物和无花果等果树上，所用外植体多为茎段、茎尖和叶片，但不定芽的诱导率和增殖率普遍不高，且实验所用的基本培养基普遍使用高离子浓度的MS。桑科植物尤其是榕属植物，茎和叶中分布大量的乳汁管，乳汁管里乳汁含有大量多酚类物质，在受伤或离体培养时，很易流出在空气中氧化成褐色的醌类物质，导致培养基的褐变，从而影响了组织培养的顺利进行。而如何防止褐变在文献里基本无涉及。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法。
为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：
(1)琴叶榕茎段的消毒
取琴叶榕的当年生茎段，放入适量的洗洁精溶液浸泡2分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后放入冰箱4℃低温冷藏0-48小时，取出后在超净台浸入滴加有1滴吐温-80，质量分数为0.1％的升汞溶液内浸泡消毒10-12分钟，然后用无菌水充分浸洗3次，于无菌滤纸上切去头尾并切成带一腋芽的茎段，转入过滤灭菌的0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡0-60分钟，用无菌水充分浸洗3次后得到消毒完的外植体材料；
(2)丛生芽的诱导
将上一步得到的外植体材料按生长极性接种到WPM培养基中培养，该培养基添加不超过2.0毫克/升的ZT、不超过5.0毫克/升的6-BA、不超过1.0克/升的CH、不超过5.0克/升的PVP、30克/升的蔗糖、9.0克/升的琼脂，pH值为5.8-6.0；接好外植体的培养基置先于黑暗中培养1天，培养温度为21-25℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
(3)不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到WPM培养基中进行培养，该培养基添加有不超过1.0毫克/升的NAA、不超过5.0毫克/升的6-BA、不超过1.0毫克/升的CH、不超过5.0克/升的PVP、30克/升的蔗糖、9.0克/升的琼脂，pH值为5.8-6.0，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
(4)再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入12.5％-100％浓度的WPM培养基中生根培养，该培养基添加有不超过2.0毫克/升的NAA、不超过5.0克/升的AC、20-30克/升的蔗糖、8.0克/升的琼脂，pH值为5.8-6.0，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
(5)炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长3厘米以上，当根长超过5厘米时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40微摩尔/米2·秒光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的加入蛭石的菜园土中，株距2厘米以上，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在18-22℃之间。3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。
作为优选方案：所述步骤(1)中接种的茎段经清洗后于冰箱4℃低温冷藏24小时，在升汞溶液消毒并清洗后再浸于0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡10分钟。
作为优选方案：所述步骤(2)中的WPM基本培养基添加有ZT 0.4毫克/升的ZT、2.0毫克/升的6-BA、CH 0.5克/升的CH、PVP 1.0克/升的PVP。
作为优选方案：所述步骤(3)中WPM基本培养基添加有0.1毫克/升的NAA、1.0毫克/升的6-BA、0.5克/升的CH、1.0克/升的PVP。
作为优选方案：所述步骤(4)中生根培养基配方浓度为50％的WPM添加有0.2毫克/升的NAA、2.0克/升的AC。
作为优选方案：所述步骤(5)中消毒菜园土中添加的蛭石体积占比为1/20。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，可尽可能减少褐变、提高增殖系数，快速获得琴叶榕再生植株，利于产业化生产。采用本发明方法，琴叶榕茎段的丛生芽诱导率高达80.0％，不定芽数6.6，不定芽增殖倍数可达6.4，生根率达97.5％，植株移栽成活率可达98％以上。
具体实施方式
缩写的注解分别为：HgCl2氯化汞，AC活性炭，6-BA 6-苄氨基腺嘌呤，CH水解酪蛋白，NAA萘乙酸，ZT玉米素，PVP聚乙烯吡咯烷酮。
实施例1
一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：
(1)琴叶榕茎段的消毒
取琴叶榕的当年生茎段，放入适量的洗洁精溶液浸泡2分钟，用流水冲洗0.5小时后，沥干后放入冰箱4℃低温冷藏24小时，取出后在超净台浸入滴加有1滴吐温-80，质量分数为0.1％的升汞溶液内浸泡消毒10分钟，然后用无菌水充分浸洗3次，于无菌滤纸上切去头尾并切成带一腋芽的茎段，转入过滤灭菌的0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡10分钟，用无菌水充分浸洗3次后得到消毒完的外植体材料。接种后20天统计的褐变率低于5％。
(2)丛生芽的诱导
将上一步得到的外植体材料按生长极性接种到添加0.4毫克/升的ZT、2.0毫克/升的6-BA、0.5克/升的CH，1.0克/升的PVP的WPM基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30克/升，琼脂添加量为9.0克/升，pH值为5.8-6.0。接好外植体的培养基置先于黑暗中培养1天，培养温度为21-25℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；10天腋芽开始萌发，16天开始可见丛生芽，30天时统计发现每个外植体的不定芽数量为6.6。未见培养基发生褐化现象。
(3)不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到添加有NAA 0.1毫克/升，6-BA 1.0毫克/升，CH 0.5克/升，PVP 1.0克/升的WPM基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；30天后统计发现，不定芽的增殖倍数为6.4。未见培养基发生褐化现象。
(4)再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入添加有NAA 0.2毫克/升，AC2.0克/升的50％浓度的WPM基本培养基中生根，培养基中添加的蔗糖为20克/升，琼脂添加量为8.0克/升，pH值为5.8-6.0，并曾于121℃下灭菌20分钟；14天开始生根，30天生根率为97.5％。
(5)炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长3厘米以上，当根长超过5厘米时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40微摩尔/米2·秒光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的加入蛭石的菜园土中，体积比分别为1：20，株距2厘米以上，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在18-22℃。3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田，移栽成活率可达98％以上。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于步骤(1)：琴叶榕茎的消毒：取琴叶榕的当年生茎段，放入适量的洗洁精溶液浸泡2分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后放入冰箱4℃低温冷藏0-48小时，取出后在超净台浸入滴加有1滴吐温-80，质量分数为0.1％的升汞溶液内浸泡消毒10分钟，然后用无菌水充分浸洗3次，于无菌滤纸上切去头尾并切成带一腋芽的茎段，转入过滤灭菌的0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡0-60分钟，用无菌水充分浸洗3次后得到消毒完的外植体材料。温度变化可调控酶的活性，而在体外，半胱氨酸可生成谷胱甘肽，谷胱甘肽是最主要的及最高的抗氧化剂，两者处理可能对褐变的发生都有减轻作用。如表1，在接种30天统计结果看出，未处理预处理的外植体接种到有PVP的培养基中，其褐变率依然有45.0％，但是采用低温处理或0.1克/升L-半胱氨酸浸泡处理后褐变率显著下降，而两者的结合有叠加的效应。由此可知，采用权利要求书中处理(低温预处理24h，0.1克/升L-半胱氨酸浸泡时间10分钟)有着最佳的表现，褐变率仅3.7％，而丛生芽的发生率可达80.0％。
表1预处理对外植体褐变率和丛生芽诱导的影响
Figure BDA0002256963700000041
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：将上一步得到的外植体材料按生长极性接种到WPM培养基中培养，该培养基添加不超过2.0毫克/升ZT，不超过5.0毫克/升的6-BA，不超过1.0克/升的CH，不超过5.0克/升的PVP，蔗糖30克/升，琼脂9.0克/升，pH为5.8-6.0。接好外植体的培养基置先于黑暗中培养1天，培养温度为21-25℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒。如表2，培养30天后统计发现，添加ZT 0.4毫克/升，6-BA 2.0毫克/升，PVP 1.0克/升，CH 0.5克/升的WPM培养基有着最高的不定芽诱导率和不定芽数，且褐变率也最低；单独使用6-BA，不定芽诱导率和不定芽数也大大下降，故使用两种细胞分裂素有着协同作用。同时从褐变来看，有无添加PVP，对褐变率影响明显，因为PVP是多酚物质的专一吸附剂，缺少底物，酶促反应自然减少，CH被报道也可减少褐变，从数据上看确实也发挥了作用，尽管不明显。过高浓度的ZT和6-BA对于褐变有很大的促进作用，可能得到的不定芽还会发生玻璃化现象，影响后续的培养。由于褐变的原因，导致了不定芽诱导率的下降和不定芽的下降。故采用权利要求书中处理(ZT 0.5毫克/升，6-BA 2.0毫克/升，PVP 1.0克/升，CH 0.5克/升)有着最佳的表现。
表2不同处理对丛生芽诱导的影响
Figure BDA0002256963700000042
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：不定芽的增殖：将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到WPM培养基中进行培养，该培养基添加有不超过1.0毫克/升的NAA，不超过5.0毫克/升的6-BA，不超过1.0毫克/升的CH，不超过5.0克/升的PVP，蔗糖30克/升，琼脂9.0克/升，pH为5.8-6.0，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒。如表3，30天后统计发现，添加PVP后，可基本避免褐变，从而间接提高增殖倍数。6-BA浓度的增加提高了增殖倍数，但过高浓度带来的却是茎叶的玻璃化。NAA的存在有利于植物的生长，但对于茎增殖的作用不明显，同时NAA的使用有利于下一步的生根实验。CH对于增殖倍数有一定的促进作用，因为其可提供各种氨基酸。综合来看，权利要求书中处理(NAA 0.1毫克/升，6-BA 1.0毫克/升，CH 0.5克/升，PVP 1.0克/升)的WPM基本培养基最适合不定芽的增殖。
表3不同处理对不定芽增殖的影响
培养基添加物 增殖倍数 生长情况
NAA 0.1，6-BA 1.0，CH 0.5，PVP 1.0 6.4 茎粗，生长快速快
NAA 0.1，6-BA 1.0，CH 0.5 4.5 生长慢，培养基有褐变
6-BA 1.0，CH 0.5，PVP 1.0 6.2 茎粗，生长速度较快
6-BA 1.0 5.0 生长慢，茎细，培养基有褐变
NAA 0.1，6-BA 0.1，CH 0.5，PVP 1.0 4.1 茎较粗，生长较快
NAA 1.0，6-BA 5.0，CH 0.5 2.6 茎叶玻璃化，培养基褐变
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)：切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入12.5％-100％浓度的WPM培养基中生根培养，该培养基添加有不超过2.0毫克/升的NAA，不超过5.0克/升的AC，蔗糖20-30克/升，琼脂8.0克/升，pH 5.8-6.0，培养条件为：培养温度为(23±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/(米2·秒)。培养30天从表4可看出，生根率在50-97％，生根时间13.5-21.0天。不添加任何激素的50％WPM基本培养基生根率最低，但添加NAA后生根率明显升高；适当低浓度的WPM有利于组培苗的生根，因为可促进其从异养转化为自养，但过低却带来养分的不足而导致茎叶变黄；NAA浓度对生根和组培苗的生长的影响是先随着浓度升高生根率和生长变强，但随后生根率有所下降，茎和根表现变差，过高浓度的茎和叶表现出玻璃化，根变短变粗，吸水和吸肥能力变弱；AC给培养基可提供一个黑暗的环境，模拟了土中的环境，同时AC还可起到防止培养基褐变的作用，但是高浓度的AC也会带来吸附培养基营养的弊端。综合表4，最佳的组合浓度为50％的WPM添加有NAA 0.2毫克/升，AC 2.0克/升，培养得到的根5.0个，且根粗适中，茎粗壮，苗浓绿，适于炼苗移栽。
表4不同处理对丛生芽诱导的影响
Figure BDA0002256963700000051
Figure BDA0002256963700000061
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于步骤(5)：待生根的组培苗的苗高长3厘米以上，当根长超过5厘米时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40微摩尔/(米2·秒)光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的加入蛭石的菜园土中，株距2厘米以上，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在18-22℃。3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。从表5可看出，菜园土中加适量蛭石可提高移栽成活率，因为蛭石可起到保水和保肥作用，但过多的蛭石对移栽成活率并无提高，故考虑到经济性，选择蛭石：菜园土为1：20的比例。
表5不同蛭石添加量对移栽成活率的影响
蛭石：菜园土 移栽成活率(％)
1：100 92
1：20 98
1：1 97
10：1 96

Claims (6)

1.一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
（1）琴叶榕茎段的消毒
取琴叶榕的当年生茎段，放入适量的洗洁精溶液浸泡2分钟，用流水冲洗0.5小时后，沥干后放入冰箱4℃低温冷藏0-48小时，取出后在超净台浸入滴加有1滴吐温-80，质量分数为0.1%的升汞溶液内浸泡消毒10-12分钟，然后用无菌水充分浸洗3次，于无菌滤纸上切去头尾并切成带一腋芽的茎段，转入过滤灭菌的0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡0-60分钟，用无菌水充分浸洗3次后得到消毒完的外植体材料；
（2）丛生芽的诱导
将上一步得到的外植体材料按生长极性接种到WPM培养基中培养，该培养基中添加有不超过2.0毫克/升的ZT、不超过5.0毫克/升的6-BA、不超过1.0克/升的CH、不超过5.0克/升的PVP、30克/升的蔗糖、9.0克/升的琼脂，pH值为5.8-6.0；接好外植体的培养基置先于黑暗中培养1天，培养温度为21-25℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14 小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
（3）不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到WPM培养基中进行培养，该培养基添加有不超过1.0 毫克/升的NAA、不超过5.0 毫克/升的6-BA、不超过1.0克/升的CH、不超过5.0克/升的PVP、30克/升的蔗糖、9.0克/升的琼脂，pH值为5.8-6.0，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
（4）再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入12.5%-100%浓度的WPM培养基中生根培养，该培养基添加有不超过2.0 毫克/升的NAA、不超5.0克/升的AC、20-30克/升的蔗糖， 8.0克/升的琼脂，pH 值为5.8-6.0，培养条件为：培养温度为21-25℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40微摩尔/米2·秒；
（5）炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长3厘米以上，当根长超过5 厘米时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18 小时，移走瓶盖，让30-40 微摩尔/米2·秒光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次，然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的加入蛭石的菜园土中，株距2厘米以上，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在18-22℃，3 天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。
2.根据权利要求1所述的一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（1）中茎段经清洗后于冰箱4℃低温冷藏24小时，并在升汞溶液消毒并清洗后再浸于0.1克/升半胱氨酸溶液中浸泡10分钟。
3.根据权利要求1所述的一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的WPM基本培养基添加有0.4毫克/升的ZT、2.0毫克/升的6-BA、0.5克/升的CH、1.0克/升的PVP。
4.根据权利要求1所述的一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中WPM基本培养基添加有0.1毫克/升的NAA、6-BA 1.0毫克/升的6-BA、0.5克/升的CH、1.0克/升的PVP。
5.根据权利要求1所述的一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的生根培养基浓度为50%的WPM添加有0.2毫克/升的NAA、2.0克/升的AC。
6.根据权利要求1所述的一种琴叶榕组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于：所述步骤（5）中消毒菜园土中添加的蛭石体积占比为1/20。
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