CN110713480A

CN110713480A - AChE蛋白降解物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110713480A
Application number: CN201911030234.XA
Authority: CN
Inventors: 章迟啸; 沈正荣; 黄文海; 王尊元; 王贝贝; 梁美好; 曾申昕; 张智敏; 马臻; 郑晓亮
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110713480B

Abstract

本发明公开了一种AChE蛋白降解物及其制备方法和应用，为通式III或IV所示的结构。本发明将AChE配体与CRBN配体采用合适的手段连接，设计得到新的化合物，使其可以特异性地增强AChE的降解，从而达到治疗相关疾病的目的。该化合物及其药学上可接受的盐可用于制备乙酰胆碱酯酶降解中获益的疾病、障碍或病症药物。AChE降解增强化合物以其独有的诱导蛋白降解机制，而只需要少量的药物就可以，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，使用双功能小分子可以降低药物使用剂量，减轻毒副作用。

Description

AChE蛋白降解物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及AChE蛋白降解物领域，具体涉及一种AChE蛋白降解物及其制备方法和应用。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神经传导中的一种关键性酶，其经典功能为降解乙酰胆碱，终止神经递质的突触后膜兴奋，保证神经信号的正常传递。这是神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的治疗应用中起到了重要作用的基本机理。目前批准用于阿尔茨海默症治疗的6个药物中，5个是AChE抑制剂，其结构如下：

可见该靶点在该类疾病治疗中的重要地位。尤其是他可林(Tarcrine)，为第一代可逆性抗AChE抑制药，通过抑制AChE而增加乙酰胆碱(ACh)的含量，既可抑制血浆中的AChE，又可抑制组织中的AChE；还可激动M受体和N受体，促进ACh释放；还可促进脑组织对葡萄糖的利用。因此，他克林对阿尔茨海默病的治疗作用是多方面共同作用的结果，也是目前较有效的治疗药物。研究人员也对上述化合物进行了广泛的结构修饰或改造，试图发现效果更好的AChE抑制剂。

相比较经典功能，AChE的非经典功能目前也被人们广泛研究，如AChE在神经发育中的作用，在造血细胞的增殖、分化中的作用，在细胞凋亡中的作用。特别是在细胞凋亡中，各种诱导的细胞凋亡，包括肿瘤细胞的凋亡中，都发现了大量AChE的高表达。比如视网膜上皮细胞的诱导凋亡中发现AChE的大量表达，并且使用AChE抑制剂可以减少视网膜上皮细胞的诱导凋亡，在AChE敲除的动物模型中，同样发现了AChE水平的降低可以减少网膜上皮细胞的诱导凋亡。这一系列的研究都显示AChE可以作为老年黄斑变性疾病治疗的潜在靶点。

但目前的AChE抑制剂仍然存在很多缺点，比如：他克林(tacrine)虽然可以显著改善老年性痴呆症的症状，但是对肝脏的损伤较大；多奈哌齐(Donepezil)适用于阿尔兹海默症，具有高疗效、易吸收、毒性低的优势，但给药后，其血药浓度快速升高，可能引发例如呕吐、腹泻或失眠等不良反应。所以发展新的毒性小、可利用度高的抑制或降解AChE的药物至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了AChE蛋白降解物及其制备方法和应用，AChE蛋白降解物为一些新的双功能小分子及其药学上可接受的盐、水合物或前药。这些化合物有诱导AChE蛋白降解的功能，从而在制备治疗从AChE降解中获益的疾病、障碍或病症药物中的有所应用，尤其是在神经变性疾病中。所述神经变性疾病包括阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病及其与“疯牛”相关的新变种、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血，以及老年黄斑变性疾病。

本发明提供基于泛素－蛋白酶体(UPS)途径构建起来的双功能嵌合分子。E3泛素连接酶可以特异性地水解某些蛋白质底物，目前已有超过600多种被人类所知。目前E3泛素连接酶的配体已有报道，如nutlins-第一种小分子E3连接酶抑制剂，但是该领域仍在发展中。Cereblon(CRBN)作为E3泛素连接酶的一种，近来已有报道度胺类化合物如沙利度胺、泊马度胺、来那度胺及其类似物可以作为其配体。

本发明将AChE配体与CRBN配体采用合适的手段连接，设计得到新的化合物，使其可以特异性地增强AChE的降解，从而达到治疗相关疾病的目的。

本发明可以靶向并增强乙酰胆碱酯酶(AChE)水解水平的化合物，其一端包含结合E3泛素连接酶CRBN的配体，通过连接链，与另一端靶向结合AChE蛋白的配体通过共价键连接，从而使AChE蛋白靠拢E3泛素化连接酶，继而被泛素化降解，实现降低AChE蛋白水平的目的。

本发明的目的还在于提供一种合成新的双功能小分子的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种含有新的双功能小分子的药物制剂。

详细发明内容如下:

为了实现上述目的，本发明提供了如下通式所示的双功能小分子，其异构体或其药学上可接受的盐、水合物或前药:

ligandA-L-ligandB

其中:

ligandA是E3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白的小分子配体，包含酞胺类化合物，邻苯二酞亚胺类化合物，沙利度胺或其衍生物，来那度胺或其衍生物，泊马度胺或其衍生物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物，部分配体结构通式如下所示:

其中:

W选自CH2，C＝O，SO2，NH，N烷基；

X选自O，S；

Y选自NH，N-烷基、N-芳基、N-杂环、N-环烷基、O，S；

Z选自烷基、环烷基、Cl，F；

G选自H、烷基、-OH，-CH2-杂环；

Q1，Q2，Q3，Q4选自C，N；

ligandB为AChE抑制剂，其选自但不限于如下结构，其结构改造物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物：

作为优选，本发明中ligandB为他克林(Tarcrine)或其衍生物；

L是连接链，包含非线性链、脂肪族链、芳香链、杂芳环结构链或通过click反应生成，通过共价键将ligandA与ligandB相连，部分连接链结构如下通式所示:

其中:

n选自0-15之间的整数。

进一步的，本发明提供AChE蛋白降解物为通式III或IV所示的结构，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：

其中：

W选自-CH₂-或C＝O；

m、n独立地选自0-10的整数；

R1、R2独立地选自-H、-D、-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-NH₂、-OH、-CH₃、-CH₂F,CHF₂、-CF₃、-CH₂D、-CHD₂、-CD₃或-CH₂CH₃。

更进一步的，

W选自-CH₂-或C＝O；

m、n独立地选自0-5的整数；

R1、R2独立地选自-H、-F、-Cl、-CN、-OH、-CH₃或-CF₃。

更进一步的，本发明所述化合物为下列化合物，其可能的光学异构体，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：

本发明还提供所述的化合物的制备方法，根据连接链的不同，可以由以下方法制备得到:

方法A：

方法B：

其中，各结构式中W、R₁、R₂和m、n的定义如上所述，具有相同含义。

通式III或IV所示的化合物可以含有不对称或手性中心，因此可以以不同立体异构形式存在。本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物(如外消旋物)，均包括在本发明的范围内。

通式III或IV所示的化合物还可以以不同互变异构形式存在，所有这些形式均包括在本发明范围内。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。

根据本发明，药学上可接受的盐包括与下列酸形成的加成盐:盐酸、氢嗅酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢嗅酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、琉拍酸以及类似的已知可以接受的酸成盐。

此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是通式的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种活性组分以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述活性组分是所述的AChE降解增强化合物、所述化合物的药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物中的任意一种或任意多种。

所述的AChE降解增强化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物在制备治疗从AChE降解中获益的疾病、障碍或病症药物中的应用。

所述的AChE降解增强化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物在制备单独或和其他药物联合使用治疗神经变性疾病药物中的应用。

其中神经变性疾病是阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病及其与“疯牛”相关的新变种、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血。

所述的AChE降解增强化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、溶剂化物或多晶型物，在制备单独或和其他药物联合使用治疗老年黄斑变性疾病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明中设计的双功能小分子可以对AChE进行泛素化标记，诱导蛋白降解，效果优于AChE抑制剂。由于AChE在全身多有分布，抑制AChE往往需要将药物长期维持在较高的浓度，大剂量的使用AChE抑制剂会造成不必要的副作用；而AChE降解增强化合物以其独有的诱导蛋白降解机制，而只需要少量的药物就可以，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，所以使用双功能小分子可以降低药物使用剂量，减轻毒副作用。

附图说明

图1为应用例2中化合物IIIa和参比药物GAPDH给药8h后AChE蛋白降解比较图；

图2为应用例2中化合物R6N8T和参比药物GAPDH给药24h后AChE蛋白降解比较图；

图3为应用例2中化合物R6N8T给药24h后AChE蛋白降解情况图。

具体实施方式

不需进一步详细说明，认为本领域熟练技术人员借助前面的描述，可以最大程度的利用本发明。因此，下面提供的实施例仅仅是进一步阐明本发明而已，并不意味着以任何方式限制本发明范围。

原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。

化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)来确定。NMR测定是用ACF-400BRUK型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDC1₃)或氘代二甲亚飒(DMSO-D₆)，TMS为内标。柱层析采用200-300目硅胶。

实施例1、2-氯-N-[2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-4-1H-异吲哚基]乙酰胺(Ia)

将2.73g(10mmol)泊马度胺溶于45mlDMF中，加入3.03g(30mmol)三乙胺，氮气保护，于冰浴中滴加入3.38g(30mmol)氯乙酰氯(溶于15mlDMF)，滴加完毕后冰浴搅拌1h，升至室温，继续搅拌1h，TLC监测反应进程。反应结束后，将反应液缓慢加入150ml水中，析出灰褐色固体，过滤，滤饼即为化合物Ⅰa粗产物。粗产物以10ml甲醇打浆，得灰白色固体化合物Ia3.15g，收率90.3％。¹H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.15(s,1H,-CONHCO-),10.30(s,1H,-CONHAr),8.54(d,1H,J＝8.0Hz,ArH),7.89(t,1H,J＝8.0Hz,ArH),7.68(d,1H,J＝8.0Hz,ArH),5.17(dd,1H,J₁＝12.0Hz,J₂＝4.0Hz,-NCHCO-),3.35(s,2H,-COCH₂Cl),2.49(m,4H,-CH₂CH₂-).[M+H]⁺＝350.1。

实施例2、N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-(1,2,3,4-四氢-9-吖啶基)胺(IIa)

将2.18g(10mmol)市售9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶、3.7g(25mmol)2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙胺溶于10ml苯酚中，氮气保护，加热至90℃搅拌3h，TLC监测反应进程。反应结束后，冷却至室温，加入80ml甲苯溶解，并先后以100ml氢氧化钠水溶液(3N)、50ml水洗涤，有机层以无水硫酸钠干燥后脱溶得化合物IIa粗产物，粗产物通过硅胶柱层析提纯，得黄色油状的化合物IIa 1.65g，收率50.1％。¹H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ8.09(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.72(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.53(t,1H,J＝7.6Hz,ArH),7.35(t,1H,J＝7.6Hz,ArH),5.23(s,1H,-NHAr),3.44(m,8H,-OCH₂-),3.34(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂NHAr),2.91(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂Ar),2.73(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.64(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂ArNH),2.51(m,2H,-NH₂),1.82(m,4H,-CH₂CH₂-).[M+H]⁺＝330.2。

实施例3、N-[2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-4-1H-异吲哚基]-2-2-{2-[2-(1,2,3,4-四氢吖啶-9-氨基)乙氧基]乙氧基}乙氨基乙酰胺(IIIa)

将0.875g(2.65mmol)化合物IIa、0.345g(2.5mmol)碳酸钾加入10mlDMF中，于冰浴中加入0.875g(2.5mmol)化合物Ia以及0.019g(0.125mmol)碘化钠，搅拌1h后，升温至60℃搅拌3h，TLC监测反应进程。反应结束后，冷却至室温，将反应液倾倒入50ml水中，析出黄褐色固体，过滤，滤饼即为化合物Ⅲa粗产物，粗产物通过硅胶柱层析提纯，得黄色固体化合物IIIa0.328g，收率30.7％。¹H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.13(s,1H,-CONHCO-),10.01(s,1H,-CONHAr),8.73(d,1H,J＝6.8Hz,ArH),8.22(d,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.78(m,2H,ArH),7.59(m,1H,ArH),7.54(m,1H,ArH),7.40(m,1H,ArH),5.11(m,1H,-NCHCO-),4.59(s,1H,-NHAr),3.74(m,2H,-COCH₂NH-),3.58(m,2H,-CH₂NHAr),3.43(m,8H,-OCH₂-),2.92(m,2H,-CH₂Ar),2.80(m,2H,-CH₂NH₂),2.66(m,6H,-CH₂ArNH,-CH₂CH₂-),2.01(m,1H,-NH),1.79(m,4H,-CH₂CH₂-).[M+H]⁺＝643.3。

实施例4、N-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}乙基)-(1,2,3,4-四氢-9-吖啶基)胺(IIb)

操作过程参见实施例2，用2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙胺代替2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙胺。黄色油状的化合物IIb，收率48.2％。[M+H]⁺＝374.2。

实施例5、N-[2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-4-1H-异吲哚基]-2-2-(2-{2-[2-(1,2,3,4-四氢吖啶-9-氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氨基乙酰胺(IIIb)

操作过程参见实施例3，用IIb代替IIa。得黄色固体化合物IIIb，收率29.7％。¹H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.15(s,1H,-CONHCO-),10.04(s,1H,-CONHAr),8.74(d,1H,J＝6.8Hz,ArH),8.21(d,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.75(m,2H,ArH),7.54(m,1H,ArH),7.52(m,1H,ArH),7.40(m,1H,ArH),5.12(m,1H,-NCHCO-),4.57(s,1H,-NHAr),3.73(m,2H,-COCH₂NH-),3.55(m,2H,-CH₂NHAr),3.43(m,8H,-OCH₂-),2.92(m,2H,-CH₂Ar),2.79(m,2H,-CH₂NH₂),2.65(m,8H,-CH₂ArNH,-CH₂CH₂-),2.01(m,1H,-NH),1.80(m,4H,-CH₂CH₂-).[M+H]⁺＝687.3。

实施例6、R6NBoc合成：

将0.277g(1.2mmol)Boc氨基己酸加入三口烧瓶，N₂置换三次，用针筒注射器注入7.5mL无水DMF，25℃搅拌溶清，注入0.8mL DIPEA，加入0.57g(1.5mmol)HATU，25℃反应约45min后，加入0.26g(1.0mmol)来那度胺，60℃反应过夜。

后处理：将反应液倒入水中，过滤析出的固体即为产物，无需提纯直接用于下一步。

实施例7、R6N合成：

将R6NBoc加入烧瓶，加入TFA:DCM＝1:2，搅拌1h后，脱溶，加入MTBE，过滤析出的白色固体即为产物。

实施例8、T6合成：

将0.44g(2.0mmol)市售9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶，0.3g(2.3mmol)氨基己酸，1.0g苯酚加入烧瓶，N₂置换三次，120℃反应过夜。

后处理：加入甲醇溶清后，拌硅胶过柱，以MeOH/DCM洗脱，得白色固体，MS(ESI)：m/z＝311[M-H]^-。

实施例9、R6N6T合成：

将78mg(0.25mmol)T6加入三口烧瓶，N₂置换三次，用针筒注射器注入2.4mL无水DMF，25℃搅拌溶清，注入0.2mL DIPEA，加入143mg(1.5eq)HATU，25℃反应约45min后，加入122mg(0.25mmol)R6N，25℃反应过夜。

后处理：将反应液倒入水中，过滤析出的固体，过柱MeOH/DCM，得到R6N6T化合物，分子式为C₃₈H₄₆N₆O₅，分子量为666.81，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.032(s,1H,(-CO)₂NH),9.744(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.208(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.822(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.738(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.644(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.495(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.445(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.263(s,1H,-CONHAr),5.153(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.786(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.510(m,12H,-CH₂-),3.481(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.935(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.756(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.650(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.116(m,2H,-CH₂CH₂-),2.096(m,4H,-CH₂CH₂-),1.829(m,4H,-CH₂CH₂-).R6N6T化合物结构式如下：

实施例10、其它化合物的合成

具体操作方式见实施例6-9，先以不同链长的Boc氨基酸为原料与来那度胺反应，再以不同链长的氨基酸与市售9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶反应，然后进行缩合，得到目标产物。

R6N8T化合物分子式为C₄₀H₅₀N₆O₅，分子量为694.86，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.005(s,1H,(-CO)₂NH),9.814(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.258(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.903(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.733(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.544(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.499(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.440(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.053(s,1H,-CONHAr),5.053(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.791(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.518(m,16H,-CH₂-),3.489(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.931(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.743(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.620(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.195(m,2H,-CH₂CH₂-),2.076(m,4H,-CH₂CH₂-),1.820(m,4H,-CH₂CH₂-).R6N8T化合物结构式如下：

R6N11T化合物分子式为C₄₃H₅₆N₆O₅，分子量为736.94，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ10.978(s,1H,(-CO)₂NH),9.990(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.858(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.928(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.712(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.523(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.481(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.423(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.124(s,1H,-CONHAr),5.673(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.739(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.578(m,22H,-CH₂-),3.481(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.891(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.756(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.675(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.458(m,2H,-CH₂CH₂-),2.116(m,4H,-CH₂CH₂-),1.890(m,4H,-CH₂CH₂-).R6N11T化合物结构式如下：

R6N12T化合物分子式为C₄₄H₅₈N₆O₅，分子量为750.97，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.315(s,1H,(-CO)₂NH),10.016(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),9.259(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),8.303(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.963(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.783(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.562(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.452(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.753(s,1H,-CONHAr),5.753(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.861(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.718(m,24H,-CH₂-),3.689(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.923(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.767(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.618(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.223(m,2H,-CH₂CH₂-),2.126(m,4H,-CH₂CH₂-),1.920(m,4H,-CH₂CH₂-).R6N12T化合物结构式如下：

R8N12T化合物分子式为C₄₆H₆₂N₆O₅，分子量为779.02，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.021(s,1H,(-CO)₂NH),9.913(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.354(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.963(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.833(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.594(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.669(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.580(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.723(s,1H,-CONHAr),5.243(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.881(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.978(m,28H,-CH₂-),3.679(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.981(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.783(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.700(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.457(m,2H,-CH₂CH₂-),2.156(m,4H,-CH₂CH₂-),1.990(m,4H,-CH₂CH₂-).R8N12T化合物结构式如下：

R11N12T化合物分子式为C₄₉H₆₈N₆O₅，分子量为821.10，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.053(s,1H,(-CO)₂NH),9.964(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.778(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),7.969(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.873(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.671(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.453(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.400(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.083(s,1H,-CONHAr),5.032(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.767(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.768(m,34H,-CH₂-),3.488(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.971(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.872(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.720(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.781(m,2H,-CH₂CH₂-),2.546(m,4H,-CH₂CH₂-),1.978(m,4H,-CH₂CH₂-).R11N12T化合物结构式如下：

R12N12T化合物分子式为C₅₀H₇₀N₆O，分子量为835.13，表征数据如下：1H-NMR(400MHz,CD₃SOCD₃):δ11.675(s,1H,(-CO)₂NH),10.432(d,1H,J＝27.6Hz,ArH),8.898(d,1H,J＝8.4Hz,ArH),8.405(d,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.993(t,1H,J＝6.8Hz,ArH),7.871(t,1H,J＝7.2Hz,ArH),7.589(t,1H,J＝6.4Hz,ArH),7.473(t,1H,J＝6.0Hz,ArH),6.655(s,1H,-CONHAr),5.653(dd,1H,J₁＝4.8Hz,J₂＝13.6Hz,-NHCHCO-),4.896(dd,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝10.4Hz,ArCH₂CO-),3.719(m,36H,-CH₂-),3.586(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CH₂CO-),2.998(t,4H,J＝6.0Hz,-CH₂CO),2.813(t,2H,J＝6.0Hz,-CH₂NH₂),2.660(t,2H,J＝5.6Hz,-CH₂CONH),2.590(m,2H,-CH₂CH₂-),2.376(m,4H,-CH₂CH₂-),1.988(m,4H,-CH₂CH₂-).R12N12T化合物结构式如下：

实施例11、R6N6T盐酸盐的制备

如实施例9制得的化合物R6N6T溶于乙酸乙酯中，通入氯化氢气体，至不再有固体析出。静置，抽滤，得化合物R6N6T的盐酸盐。

应用例1：AChE酶活性实验

实验方法：

I.准备1x缓冲液:

100mM磷酸钾，pH7.5

0.05％Brij-35

II.准备用于AchE活性测试的化合物

1，化合物连续稀释

1)对于化合物，通过ECHO 550将250nl的200X化合物储备溶液转移到384孔板中；

2)对于最大和最小控制的孔，通过ECHO 550转移250nl DMSO。

Ⅲ.制备2x酶溶液

1)在1x缓冲液中制备2倍AChE酶溶液。最终浓度：AChE 1U/L.

2)最小对照孔除外，向测定板的每个孔中加入25μl酶溶液；最小对照孔加入25μl的1x缓冲液代替。

3)摇动平板并在室温下孵育60分钟。

Ⅳ.准备2x底物溶液

1)在测定缓冲液中制备DTNB和乙酰硫代胆碱氯化物的2倍底物溶液。最终底物浓度：DTNB 50μM，乙酰硫代胆碱氯化物200μM。

V.酶反应

向测定板的每个孔中加入25μl底物溶液以开始反应。摇晃。在吸光度为405nm的动力学模式下读数。

VI.收集数据

收集数据，在Enspire软件上拟合计算。

Ⅶ.曲线拟合

1)从软件程序中复制mOD/min的斜率值。

2)将斜率值转换为抑制百分比值。

抑制百分比＝(样品斜率-最小值)/(最大-最小值)*100。“min”表示无酶对照的斜率，“max”表示DMSO对照的斜率。结果如表1所示：

表1

数据以MS Excel呈现，曲线由GraphPad Prism 5拟合。使用的公式是：Y＝底部+(顶-底)/(1+10^((LogIC50-X)^HillSlope))，则部分化合物的AChE酶抑制活性结果如表2所示：

表2

Compd No.	bottom	top	LOGIC50	HILLSLOPE	IC50
						RIVASTIGMINE	5.1	104.0	0.3	0.9	2.1
Donepezil	6.3	99.7	-1.8	1.0	0.016
						R6N12T	2.8	100.0	-1.9	0.9	0.013
R6N11T	3.7	100.2	-1.9	0.9	0.013
						R6N8T	7.7	101.2	-1.6	0.9	0.024
R6N6T	10.1	100.6	-0.4	0.9	0.36

从测得的IC50可知，该类化合物IC50具有较强的AChE酶抑制活性，与阳性对照Donepezil(多奈哌齐)基本相当，较另一阳性对照物RIVASTIGMINE(卡巴拉汀)强100倍。

应用例2：AChE蛋白降解实验

实验方法：

1细胞复苏:

1)预热37℃水浴箱，培养瓶里加入4mL培养基，培养基内含L15培养基、10％FBS、1％青霉素和庆大霉素。

2)从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入水浴箱中直至溶解。

3)移液枪将冻存管中细胞吸入培养基中，按“米”字法摇匀后放入37℃，5％CO₂饱和湿度孵箱中培育，6小时后取出换液。

2细胞传代:

1)提前将PBS、培养基、0.25％蛋白胰酶等放至室温；

2)吸掉培养基，加入PBS冲洗一遍后，加入1ml胰酶，随即放入孵箱消化1分钟；

3)取出后，用移液枪吹打细胞直至细胞脱落皿底后加入9ml培养基终止消化，继续吹打；

4)取出3ml培养液至另一培养皿，并把另一培养皿培养基加至10ml后，按“米”字法摇匀放入孵箱内培育。

3细胞冻存:

1)提前开启水浴箱，培养基、胰酶、PBS放至室温，拿出冻存盒，细胞冻存管等；

2)细胞用PBS冲洗一遍，加入1ml胰酶，放入孵箱消化1分钟，取出吹打直至细胞脱落皿底，加入4ml培养基终止消化；

3)15ml离心管中将细胞吸入，1000rpm，离心5分钟；

4)配制冻存液，培养基：FBS：DMSO＝7：2:1；

5)吸掉离心管上清液，加入冻存液，吹打均匀，后加入1ml液体至冻存管中；

6)将冻存管放入冻存盒中，-80℃过夜，第二日即可放入液氮中保存。

4 Western bloting实验：

制胶：夹紧电泳玻板，按次序灌胶，分离胶在下层，浓缩胶在上层；分离胶灌完后，用乙醇液封，使其表层平整；浓缩胶灌完后，立即插上梳子。

样品处理：按蛋白定量的样品与上样缓冲液混合，沸水浴3min并离心。

上样：待胶凝固以后，放入电泳槽中固定，加入电泳缓冲液，将已处理好的样品上样，接通电源，电泳时浓缩胶的电压为80V，分离胶电压为120V。

转膜：按海绵-双层滤纸-胶-PVDF膜-单层滤纸-海棉的顺序组装滤纸凝胶纤维素夹层，200mA恒流条件下，0℃转移2h。

膜的封闭和抗体孵育：膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育2h以封闭膜上的非特异结合。封闭过的膜用TBST洗涤三次，每次5min。将膜放入杂交袋中，加入一抗4℃孵育过夜，使抗原抗体充分结合。隔天，将膜从杂交袋中取出，用TBST洗涤三次，每次10min；再放入新杂交袋中，使二抗结合一抗，室温孵育膜2h，然后用TBST洗膜4-5次，每次30min。

Western blot结果检测：ECL化学发光法检测，将膜放入混合好的显影液中，并在暗室放约1min，用凝胶成像系统拍照成像。

Western blot数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

结果如下：

化合物IIIa给药8h后AChE蛋白的降解情况如图1所示。化合物R6N8T给药24h后AChE蛋白的降解情况如图2和图3所示。

可见：给药后，相对于参比，本发明发现的化合物能够明显引起AChE的蛋白降解，证明本发明所发现的化合物具有诱导AChE蛋白降解的功能。相较于蛋白抑制化合物来说，抑制蛋白往往需要将药物长期维持在较高的浓度，大剂量的使用抑制剂会造成不必要的副作用如获得性耐药；由于蛋白降解化合物特有的性质，可以大大避免耐药性的产生；另外，降解蛋白只需要少量的药物就可以，类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，所以使用双功能小分子可以降低药物使用剂量，减轻毒副作用。

从而，本发明所述这些化合物和其药用组合物可以在治疗从AChE蛋白降解或抑制中获益的疾病、障碍或病症药物中有广泛的应用。

Claims

1.一种AChE蛋白降解物，其特征在于，为通式III或IV所示的结构：

其中：

W选自-CH₂-或C＝O；

m、n独立地选自0-10的整数；

2.根据权利要求1所述的AChE蛋白降解物，其特征在于，W选自-CH₂-或C＝O；

m、n独立地选自0-5的整数；

R1、R2独立地选自-H、-F、-Cl、-CN、-OH、-CH₃或-CF₃。

3.根据权利要求1所述的AChE蛋白降解物，其特征在于，为下列化合物：

4.根据权利要求1所述的AChE蛋白降解物的制备方法，其特征在于，采用以下反应式得到式III结构的AChE蛋白降解物：

其中，各结构式中W、R₁、R₂和m、n具有相同含义。

5.根据权利要求1所述的AChE蛋白降解物的制备方法，其特征在于，采用以下反应式得到式IV结构的AChE蛋白降解物：

其中，各结构式中W、R₁、R₂和m、n具有相同含义。

6.根据权利要求1～3任一项所述的AChE蛋白降解物及其药学上可接受的盐在制备治疗从AChE降解中获益的疾病、障碍或病症药物中的应用。

7.根据权利要求1～3任一项所述的AChE蛋白降解物及其药学上可接受的盐在制备治疗神经变性疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的神经变性疾病是阿尔茨海默症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、白内障、帕金森氏病、克-雅二氏病、亨廷顿氏病、伴有Lewy体形成的痴呆、多系统萎缩症、哈-斯病、弥散性Lewy体疾病、致命性家族失眠症、格斯特曼-斯特劳斯勒-杉克病或者伴有淀粉样变性病-荷兰型的遗传性脑溢血。

9.根据权利要求1～3任一项所述的AChE蛋白降解物及其药学上可接受的盐在制备治疗老年黄斑变性疾病药物中的应用。

10.根据权利要求7～9任一项所述的应用，其特征在于，所述的AChE蛋白降解物药学上可接受的盐，包括AChE蛋白降解物与下列酸形成的加成盐：盐酸、氢嗅酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、丙酮酸、苯磺酸或琉拍酸。