CN115279751B - 一种特异性降解tau蛋白的小分子化合物及其用途 - Google Patents

一种特异性降解tau蛋白的小分子化合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双功能分子化合物技术领域，公开了一种具有特异性降解tau蛋白功能的小分子化合物及其应用。该特异性降解tau蛋白的小分子化合物的化学结构为TBM‑L‑ULM或其药学上可接受的盐、对映体、立体异构体、溶剂化物、多晶型物或N‑氧化物，其中，TBM为tau蛋白结合部分，L为连接体基团，ULM为泛素连接酶结合部分，所述tau蛋白结合部分与所述泛素连接酶结合部分通过连接体基团连接。本发明所述的特异性降解tau蛋白的小分子化合物能增强细胞中tau蛋白的降解，从而降低tau蛋白的含量。

Description

一种特异性降解tau蛋白的小分子化合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年02月13日提交的中国专利申请202010090680.6的权益，该申请的内容通过引用被合并于本文。
技术领域
本发明涉及双功能分子化合物技术领域，具体涉及一种特异性降解tau蛋白的小分子化合物及其用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的一种痴呆症，约占痴呆症的50-70％。据统计，2016年中国有约1000万，全球则有4400万AD患者。随着人口的老龄化，AD的发病率将进一步上升，预计到2050年中国将有约4000万AD患者。目前所有治疗AD的药物都是表征药物(Symptomatic drugs)，只能短暂缓解症状而不能延缓病情的进展。全球迫切期待有能真正改变AD进展的新药(Disease-modifying drugs)。
AD的两个特征性的病理变化是老年斑(Senile plaques，SPs)及神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)，分别是由β-淀粉样蛋白(Aβ)及高度磷酸化的tau蛋白形成的聚合物，其中tau病变而不是Aβ病变与AD的痴呆程度呈正相关。最新的研究显示tau介导Aβ诱导的神经毒性，为Aβ的神经毒性所必需；并且tau是朊脘病毒样蛋白(Prion-likeprotein)，能在神经元间传播从而导致tau病变的扩散，提示其可能是AD必需的药物靶点。
除了AD外，tau的聚集也见于连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(frontotemporal dementia linked to chromosome-17 parkinsonism，FTDP-17)、皮克氏病(Pick’s disease，PiD)、进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration，CBD)、原发性年龄相关性tau病(primaryage-related tauopathy，PART)、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease，AGD)、老化相关tau星形胶质细胞病(aging-related tau astrogliopathy，ARTAG)、慢性创伤性脑病(chronic traumatic encephalopathy，CTE)、球形胶质细胞tau病变(Globular glialtauopathy，GGT)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病(Huntington’sDisease，HD)等一系列神经退行性疾病。这类疾病包括AD被统称为tau疾病(tauopathies)。Tau蛋白是引起这类疾病的重要原因，故也是这类疾病的重要治疗靶点。
目前，虽然已有多种基于tau蛋白的治疗提案，但其中最有吸引力的方案之一是降低细胞内tau蛋白的含量。该方案之所以受青睐，主要基于下述原因：(1)大量的证据表明，降低细胞内tau蛋白的含量，在动物模型中甚少引起副作用；(2)降低tau蛋白的含量可抑制tau蛋白的聚集，而tau蛋白的聚集则是引起神经元退行性变的重要原因；(3)降低tau蛋白的含量可降低多种因素(比如Aβ)引起的神经元兴奋性神经毒性作用。因此，降低tau蛋白也被认为是一种新的潜在的治疗癫痫及中风的方案。
降低细胞内靶蛋白常用的技术方法有两种。(1)用siRNA、miRNA或反义寡核苷酸降低靶蛋白的表达。由于这些寡核苷酸在组织中的分布不好，药物代谢动力学较差，加之有脱靶的可能性，目前其在临床的应用受到限制，还有待进一步改进。(2)增强靶蛋白的降解。常见的方法是增强蛋白降解系统包括蛋白酶系统及自噬系统的活性。但非特异性地增强蛋白降解系统的活性易引起其它非靶蛋白的降解而严重副作用，故目前尚未有激活蛋白降解系统的药物获批在临床应用。理想的方法是只选择性增强靶蛋白的降解而避免因增强蛋白降解系统的活性而导致的非靶蛋白的降解。
发明内容
本发明的目的是构建一种特异性针对tau蛋白的小分子化合物。为了实现此目的，本发明的发明人通过深入研究发现，利用蛋白降解靶向嵌合体(PROteolysis TArgetingChimeras，PROTAC)技术可以构建一种双功能分子化合物，其一端能特异结合靶蛋白，另一端特异结合特定的泛素连接酶，两者之间经由连接体基团(linker)连接。如此构建的化合物因能同时结合靶蛋白及泛素连接酶，使靶蛋白临近泛素连接酶，故能增强靶蛋白的泛素化，最终经由蛋白酶体降解。而且，所述PROTAC技术除了对靶蛋白的选择性，还有下面的优点：(1)能作用于许多传统难以成药的靶点。许多传统的小分子药物必须作用于靶蛋白的特定的结合口袋(binding pockets)，才能发挥抑制作用。PROTAC技术则没有这种限制，其只要能与靶蛋白的任何区段相互作用，并且无需很高的亲和力，即可导致靶蛋白的快速降解从而抑制靶蛋白的功能，故能作用于许多传统难以成药的靶点。(2)PROTAC技术在细胞内能被重复使用，能起到类似催化的效应，故无需很高浓度即可达到治疗效果。
为此，本发明第一方面提供了一种具有特异性降解tau蛋白功能的小分子化合物，其中，该化合物的化学结构为TBM-L-ULM或其药学上可接受的盐、对映体、立体异构体、溶剂化物、多晶型物或N-氧化物，其中，TBM为tau蛋白结合部分，L为连接体基团，ULM为泛素连接酶结合部分，所述tau蛋白结合部分与所述泛素连接酶结合部分通过连接体基团连接。
本发明第二方面提供了降解有需要的患者体内的tau蛋白的方法，包括给予所述患者有效量的如上所述的小分子化合物。
本发明第三方面提供了上述小分子化合物在制备用于治疗或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用。
通过免疫印迹试验证实本发明所述的特异性降解tau蛋白的小分子化合物能增强小鼠大脑中tau蛋白的降解，从而降低tau蛋白的含量。由此表明，本发明所述的特异性降解tau蛋白的小分子化合物可在预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的一系列tau疾病中发挥作用。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的小分子化合物的核磁共振谱图；
图2是经侧脑室注射本发明提供的化合物对小鼠大脑皮质中tau蛋白含量的影响的免疫印迹杂交结果(a)及半定量分析(b)；
图3是本发明实施例2制备的小分子化合物的核磁共振谱图；
图4是小鼠皮下注射本发明实施例2制备的小分子化合物或溶解小分子化合物的溶剂(对照组)48小时后，海马tau蛋白及上样量对照GAPDH的免疫印迹图(a)及对该图的半定量分析(b)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，未做特殊说明的情况下，所述“键”是指原子间的连接键。所述“室温”是指～25℃，例如，25±3℃。
本发明所述的特异性降解tau蛋白的小分子化合物的化学结构为TBM-L-ULM或其药学上可接受的盐、对映体、立体异构体、溶剂化物、多晶型物或N-氧化物，其中，TBM为tau蛋白结合部分，L为连接体基团，ULM为泛素连接酶结合部分，所述tau蛋白结合部分与所述泛素连接酶结合部分通过连接体基团连接。
在优选情况下，ULM能够结合E3泛素连接酶。进步一步优选地，所述E3泛素连接酶为VHL E3泛素连接酶或CRBN E3泛素连接酶。
在较优选的实施方式中，ULM为具有式(1)或式(2)所示结构的基团，
其中，R1为羟基或者在患者或对象体内代谢成羟基的基团；
R2为羟基、取代或未取代的C6-C24的芳基、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基、取代或未取代的六元杂环基或者取代或未取代的氨基，其中，取代的氨基为一元取代或二元取代，一元取代的氨基为-NH-R4，R4为C1-C12的烷基、C6-C18的芳基、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基、取代或未取代的六元杂环基或者-R5-Ar-HET，其中，R5为O、S、C1-C6的亚烷基、至少一个氢原子被取代的亚烷基，Ar为取代或未取代的C6-C12亚芳基，HET为任选取代的噻唑、选取代的异噻唑、选取代的噻吩、选取代的吡啶、选取代的哒嗪、选取代的呋喃、选取代的吡咯、选取代的吡啶、选取代的咪唑、选取代的喹啉或选取代的吲哚；
R3为-CHR6-M-，ULM通过M与连接体基团L相连，其中，R6为C1-C6的烷基，M为键、C1-C6的亚烷基、-NH-或-NH-C(O)-R7-，其中R7为C1-C6的亚烷基；
R8为H、C1-C12的烷基、C6-C18的芳基、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基、取代或未取代的六元杂环基或者以下式(3)所示的基团，
其中，R11为H、C1-C12的烷基、C6-C18的芳基、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基或者取代或未取代的六元杂环基；
R12为键、C1-C4的亚烷基或C6-C18的亚芳基；
R9为C1-C6的亚烷基、-NH-或-NH-C(O)-R13-，其中R13为C1-C6的亚烷基；
R10为H、C1-C12的烷基、C6-C18的芳基、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基或者取代或未取代的六元杂环基。
在较优选的实施方式中，L为基团-X-Y-Z-，X与TBM相连，Z与ULM相连，
其中，X为键、C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)、-NH-或-NH-C(O)-R19-，其中R19为键或C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)；
Y为-R20-(R22-E-R23)n-R21-，其中R20和R21各自为键或C1-C8的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基或亚辛基)，R22和R23各自为C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)，n为0-10的整数(如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，E为O、S、酰胺基、哌嗪基、NR24、S(O)、S(O)2、-S(O)2O、-OS(O)2、OS(O)2O、 其中E1为O、S、CHR25或NR26，R24、R25和R26各自为H或者任选一个或两个羟基取代的C1-C3的烷基；
Z为-A-B-，其中A为键、O或S，B为键、C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)或-R27-C(O)-，其中R27为C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)。
在较优选的实施方式中，TBM为具有式(4)所示结构的基团，或者为式(4)所示结构的基团中①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨或⑩位被取代基团进一步修饰的基团，其中，TBM通过式(4)中的①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨或⑩位与所述连接体基团L相连，
其中，R14为键、C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)或C6-C18的亚芳基(如亚苯基或亚萘基)；
R15和R16各自为H、C1-C12的烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)、C6-C18的芳基(如苯基或萘基)、取代或未取代的三元脂肪环基、取代或未取代的四元脂肪环基、取代或未取代的五元脂肪环基、取代或未取代的六元脂肪环基、取代或未取代的三元杂环基、取代或未取代的四元杂环基、取代或未取代的五元杂环基或者取代或未取代的六元杂环基；
R17为键、H、C1-C4的烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)或-R18-C(O)-，其中，R18为C1-C4的亚烷基(如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)。
其中，修饰式(4)所示结构的基团中①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨或⑩位的取代基团可以为卤素(如氟或氯)、C1-C4的烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)、C1-C4的烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基)、羧基、氨基、胺基、C6-C18的芳基(如苯基)或苄基。
进一步优选地，在式(4)所示结构中，TBM通过式(4)中的⑤位与所述连接体基团L相连，R14为亚乙基，R15和R16各自为甲基，R17为键、亚甲基或-CH2-C(O)-。
在最优选的实施方式中，所述特异性降解tau蛋白的小分子化合物的结构式为：
在一个优选的实施方式中，上述特异性降解tau蛋白的小分子化合物可以按照以下工艺路线制备：
具体制备过程包括如下步骤：
(1)制备化合物2-1
室温下将2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(化合物1-1)加入二氯甲烷中，再添加三乙胺。优选地，体系中的化合物1-1的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.5mol/L，更优选为0.3-0.4mol/L)，三乙胺的浓度为0.1-1mol/L(优选0.5-0.8mol/L，更优选为0.7-0.8mol/L)，优选化合物1-1与三乙胺的浓度比为1∶1.8-2.2。然后将1-(1，4-二氮杂-1-基)乙氧基-1-酮用二氯甲烷稀释(优选使得1-(1，4-二氮杂-1-基)乙氧基-1-酮的浓度为1-5mol/L，更优选2-4mol/L，进一步优选为2-3mol/L)，并缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温搅拌(例如可以为500-1000rpm搅拌)过夜(约18h，例如18±2h)。用水淬灭反应。优选地，水的用量使得在淬灭后的体系内水含量为30-40体积％。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压下(例如-0.05MPa至-0.1MP)除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到化合物2-1。
(2)制备化合物3-1
室温下将化合物2-1加入二氯甲烷中，再加入三乙胺。优选地，体系中的化合物2-1的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.5mol/L，更优选为0.2-0.3mol/L)，三乙胺的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.8mol/L，更优选为0.4-0.6mol/L)，优选化合物2-1与三乙胺的浓度比为1∶1.8-2.2。然后将2-(噻吩-2-基)乙-1-胺用二氯甲烷稀释(优选使得2-(噻吩-2-基)乙-1-胺的浓度为1-5mol/L，更优选1-3mol/L，进一步优选为1.5-2.5mol/L)并缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温搅拌(例如可以为500-1000rpm搅拌)过夜(约18h，例如18±2h)。用水淬灭反应。优选地，水的用量使得在淬灭后的体系内水含量为30-40体积％。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压下(例如-0.05MPa至-0.1MPa)除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到化合物3-1。
(3)制备化合物4-1
将化合物3-1加入二氯甲烷中，再加入三乙胺。优选地，体系中的化合物3-1的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.5mol/L，更优选为0.2-0.3mol/L)，三乙胺浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.8mol/L，更优选为0.4-0.6mol/L)，优选化合物3-1和三乙胺的浓度比为1∶1.8-2.2。然后将(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯用二氯甲烷稀释(优选(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯浓度为0.1-1mol/L，更优选0.3-0.8mol/L，进一步优选为0.4-0.6mol/L)，并将其缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温搅拌(例如可以为500-1000rpm搅拌)过夜(约18h，例如18±2h)。用水淬灭反应。优选地，水的用量使得在淬灭后的体系内水含量为40-50体积％。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压下(例如-0.05MPa至-0.1MPa)除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到化合物4-1。
(4)制备化合物5-1
将化合物4-1加入二氯甲烷中，再缓慢滴加三氟乙酸酯。优选地，体系中化合物4-1的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.3mol/L，更优选为0.1-0.2mol/L)，三氟乙酸酯的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.5mol/L，更优选为0.2-0.3mol/L)，优选化合物4-1和三氟乙酸酯的浓度比为1∶1.8-2.2。将混合物在室温搅拌(例如可以为500-1000rpm搅拌1-5h)。在减压下(例如可以为-0.05MPa至-0.1MPa)浓缩反应混合物。向残余物中加入二氯甲烷，并减压(例如可以为-0.05MPa至-0.1MPa)浓缩。重复操作多次，得到化合物5-1。
(5)制备化合物7-1
向DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中加入2，2′-(乙烷-1，2-二烷基双(氧基))二乙酸。接着在搅拌下加入4-氨基-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3-二酮和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)。优选地，体系中2，2′-(乙烷-1，2-二烷基双(氧基))二乙酸的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.8mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)，4-氨基-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3-二酮的浓度为0.1-1mol/L(优选0.5-0.8mol/L，更优选为0.7-0.9mol/L)，DIPEA的浓度为1-5mol/L(优选1-3mol/L，更优选为2-3mol/L)，优选三者的浓度比为1∶1-2∶3-5。将混合物在室温搅拌三天(例如可以为500-1000rpm搅拌70-75h)。用HCl将残余物调节至pH值4-5，并用乙酸乙酯萃取(为了提高收率，可以重复萃取3-5次并将获得的有机相合并)。将合并的有机相干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到化合物7-1。
(6)制备目标化合物
将化合物7-1加入DMF中，再向其中加入HATU(2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基铀六氟磷酸盐)。优选地，体系中化合物7-1的浓度为0.01-0.5mol/L(优选0.01-0.2mol/L，更优选为0.01-0.1mol/L)，HATU的浓度为0.01-0.5mol/L(优选0.01-0.2mol/L，更优选为0.1-0.15mol/L)，优选化合物7-1和HATU的浓度比为1∶0.8-1.2。接着在搅拌下再加入化合物5-1和DIEAP。优选地，体系中化合物5-1的浓度为0.01-0.5mol/L(优选0.01-0.2mol/L，更优选为0.1-0.18mol/L)，DIEAP的浓度为0.01-0.5mol/L(优选0.01-0.2mol/L，更优选为0.1-0.18mol/L)。优选化合物7-1、化合物5-1和DIEAP的浓度比为1∶0.8-1.2∶2-4。将混合物在室温搅拌(例如可以500-1000rpm搅拌15-20h)。用HCl将残余物调节至pH值4-5，并用乙酸乙酯萃取(为了提高收率，可以重复萃取3-5次并将获得的有机相合并)。将合并的有机相干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到目标化合物。
在另一个优选的实施方式中，上述特异性降解tau蛋白的小分子化合物可以按照以下工艺路线制备：
具体制备过程包括如下步骤：
(1)制备化合物3-1
将化合物1-1溶于丙酮。优选地，化合物1-1的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.6mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)。在0℃，搅拌(例如可以为500-1000rpm)的条件下，将化合物0-b和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)与之混合。优选地，体系中化合物0-b的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.6mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)，DIEA的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.6mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)。优选地，其中，化合物1-1、化合物0-b和DIEA的浓度比为1∶0.8-1.2∶0.8-1.2。将该混合物在室温下搅拌(例如可以为500-1000rpm)10-60min。
液相色谱-质谱联用(LCMS，m/z＝275.4[M+H]+)监测反应完毕后，在0℃下将上述反应液与化合物0-d以及DIEA混合。优选地，体系中化合物0-d的浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.6mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)，DIEA浓度为0.1-1mol/L(优选0.3-0.6mol/L，更优选为0.5-0.6mol/L)。优选地，化合物0-d和DIEA的浓度比为1∶0.8-1.2。将该混合物在室温下搅拌(例如可以为500-1000rpm)10-60min。
LCMS(m/z＝376.1[M+H]+)监测反应完毕后，将反应后的混合物与水混合，采用乙酸乙酯萃取。优选地，乙酸乙酯萃取的操作步骤可以重复3-5次，乙酸乙酯的用量使得萃取体系中乙酸乙酯的含量达到30-40体积％。将萃取获得的有机相合并后用饱和食盐水洗涤，而后采用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。优选地，所述减压浓缩的条件包括：压力-0.05MPa至-0.1MPa，时间10min至1h。浓缩产物(粗品)经纯化后获得化合物3-1。优选地，所述纯化可以采用硅胶柱层析分离纯化等方法。
(2)制备化合物4-1
将化合物3-1溶于丙酮。优选地，化合物3-1的浓度为0.1-1.5mol/L(优选为0.5-1mol/L，更优选为0.7-0.9mol/L)。0℃下将该溶液与化合物30-a以及DIEA混合。优选地，体系中化合物30-a的浓度为0.1-1.5mol/L(优选为0.5-1mol/L，更优选为0.7-0.9mol/L)，DIEA的浓度为0.1-1.5mol/L(优选为0.5-1mol/L，更优选为0.7-0.9mol/L)。更优选地，化合物3-1、化合物30-a和DIEA的浓度比为1∶0.8-1.2∶0.8-1.2。将混合物在室温下搅拌(例如可以为500-1000rpm)10-60min。
LCMS(m/z＝418.1[M+H]+)监测反应完毕后，将反应后的混合物与水混合，采用乙酸乙酯萃取。优选地，乙酸乙酯萃取的操作步骤可以重复3-5次，乙酸乙酯的用量使得萃取体系中乙酸乙酯的含量达到30-40体积％。将萃取获得的有机相合并后用饱和食盐水洗涤，而后采用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。优选地，所述减压浓缩的条件包括：压力-0.05MPa至-0.1MPa，时间10min至1h。浓缩产物(粗品)经纯化后获得化合物4-1。所述纯化可以采用硅胶柱层析分离纯化等方法。
(3)制备化合物5-1
0℃下将化合物4-1溶于二氯甲烷。优选地，化合物4-1的浓度为0.1-0.5mol/L(优选为0.1-0.3mol/L，更优选为0.1-0.2mol/L)。将该溶液与三氟乙酸混合。优选地，三氟乙酸的用量使得所述混合体系中三氟乙酸的含量为10-50体积％，优选10-30体积％。室温下搅拌(例如可以为500-1000rpm)1-3h。将反应产物减压浓缩，即获得化合物5-1(粗品)。优选地，所述减压浓缩的条件包括：压力-0.05MPa至-0.1MPa，时间10min至1h。
(4)制备化合物31-b
室温下将化合物31-a溶于DMF。优选地，所述化合物31-a的浓度为0.1-1mol/L(优选为0.1-0.5mol/L，更优选为0.3-0.5mol/L)。将该溶液与化合物29-b、DIEA和HATU混合。优选地，体系中化合物29-b的浓度为0.1-1mol/L(优选为0.1-0.5mol/L，更优选为0.3-0.5mol/L)，DIEA的浓度为1-3mol/L(优选为1-2mol/L，更优选为1-1.5mol/L)，HATU的浓度为0.1-1mol/L(优选为0.1-0.8mol/L，更优选为0.3-0.6mol/L)。优选地，体系中化合物31-a、化合物29-b、DIEA和HATU的浓度比为1∶0.8-1.2∶2-4∶1-1.5。将混合后的物料在室温下搅拌过夜(例如可以为500-1000rpm搅拌约15-20h)。
LCMS(m/z＝478.1[M+H]+)监测反应完毕后，将反应后的混合物与水混合，调节pH至3-4。采用乙酸乙酯萃取。优选地，乙酸乙酯萃取的操作步骤可以重复3-5次，乙酸乙酯的用量使得萃取体系中乙酸乙酯的含量达到30-40体积％。将萃取获得的有机相合并后用饱和食盐水洗涤，而后采用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。优选地，所述减压浓缩的条件包括：压力-0.05MPa至-0.1MPa，时间10min至1h。浓缩产物(粗品)经纯化后获得化合物31-b。优选地，所述纯化可以采用硅胶柱层析分离纯化等方法。
(5)制备目标化合物
室温下将化合物31-b溶于DMF。优选地，化合物31-b的浓度为0.1-0.5mol/L(优选0.1-0.3mol/L，更优选0.15-0.25mol/L)。将该溶液与化合物5-1、DIEA以及HATU混合。优选地，混合体系中化合物5-1的浓度为0.1-0.5mol/L(优选0.1-0.3mol/L，更优选0.15-0.25mol/L)，DIEA的浓度为0.1-1mol/L(优选0.4-0.8mol/L，更优选0.55-0.65mol/L)，HATU的浓度为0.1-1mol/L(优选0.1-0.5mol/L，更优选0.15-0.3mol/L)。优选地，化合物31-b、化合物5-1、DIEA和HATU的浓度比为1∶0.8-1.2∶2-4∶1-1.5。将混合后的物料在室温下搅拌过夜(例如可以为500-1000rpm搅拌约15-20h)。
LCMS(m/z＝478.1[M+H]+)监测反应完毕后，将反应后的混合物与水混合，采用乙酸乙酯萃取。优选地，乙酸乙酯萃取的操作步骤可以重复3-5次，乙酸乙酯的用量使得萃取体系中乙酸乙酯的含量达到70-80体积％。将萃取获得的有机相合并后用饱和食盐水洗涤，而后采用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。优选地，所述减压浓缩的条件包括：压力-0.05MPa至-0.1MPa，时间10min至1h。浓缩产物(粗品)经纯化后获得目标化合物。优选地，所述纯化可以采用硅胶柱层析分离纯化、HPLC等方法中的至少一种。
本发明第二方面提供了降解有需要的患者体内的tau蛋白的方法，包括给予所述患者有效量的本发明提供的上述化合物。
在上述方法中，所述化合物可以通过选自以下至少一种方式被给予所述患者：鼻服、吸入、局部、口服、肌内、皮下、经皮、腹腔、硬膜外、鞘内和静脉内途径。
本发明第三方面提供了上述化合物在制备用于治疗或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用。所述疾病可以为阿尔茨海默病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、皮克氏病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、原发性年龄相关性tau病、嗜银颗粒病、老化相关tau星形胶质细胞病、慢性创伤性脑病、球形胶质细胞tau病变、帕金森病、亨廷顿病、脑卒中和癫痫中的至少一种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
(1)制备化合物2-1
室温下将2，4，6-三氯-1，3，5-三嗪(2.00g，10.93mmol)加入二氯甲烷(30mL)中，再添加2.21g(21.86mmol，2.0eq.)三乙胺。在0℃冷却后，将1.55g(10.93mmol，1.0当量)的1-(1，4-二氮杂-1-基)乙氧基-1-酮用4ml二氯甲烷稀释并缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温800rpm搅拌过夜(约18h)。用水(20mL)淬灭反应。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷(每次10mL)萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压下(约-0.09MPa)除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到2.40g(76.0％)化合物2-1，为黄色固体。
(2)制备化合物3-1
室温下将化合物2-1(2.40g，8.30mmol)加入二氯甲烷(30mL)中，再加入1.68g(16.60mmol，2.0eq.)三乙胺。在0℃冷却后，将1.05g(8.30mmol，1.0eq.)的2-(噻吩-2-基)乙-1-胺用4ml二氯甲烷稀释并缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温800rpm搅拌过夜(约18h)。用水(20mL)淬灭反应。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷(每次10mL)萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压(-0.09MPa)下除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到2.70g(85.6％)化合物3-1，为黄色固体。
(3)制备化合物4-1
将化合物3-1(1.00g，2.63mmol)加入二氯甲烷(10mL)中，再加入0.531g(5.26mmol，2.0eq.)三乙胺。在0℃冷却后，将0.915g(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯用4ml二氯甲烷稀释，并将其缓慢滴加到反应混合物中。将混合物在室温800rpm搅拌过夜(约18h)。用水(10mL)淬灭反应。保持室温直立后，分离上层有机溶液，下层水溶液用二氯甲烷(每次10mL)萃取三次。将如上所得的有机溶液合并在一起，用无水硫酸镁干燥并浓缩，在减压(-0.09MPa)下除去溶剂。残余物用甲苯固化，过滤，用正己烷洗涤，得到0.800g(58.7％)化合物4-1，为黄色固体。
(4)制备化合物5-1
将化合物4-1(248mg，0.478mmol)加入二氯甲烷(3mL)中，再缓慢滴加46.3mg(0.772mmol，2.0eq.)的三氟乙酸酯。将混合物在室温800rpm搅拌1小时。在减压(-0.09MPa)下浓缩反应混合物。向残余物中加入二氯甲烷(3mL)，并减压浓缩。重复此过程3次，得到200mg(粗品)化合物5-1，为黄色油状物。
(5)制备化合物7-1
在0℃下向DMF(3mL)中加入2，2′-(乙烷-1，2-二烷基双(氧基))二乙酸(300mg，1.69mmol)。在相同温度下静置30分钟后，在800rpm搅拌下加入4-氨基-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1，3-二酮(693mg，2.54mmol)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺，983mg，7.62mmol)。将混合物在室温800rpm搅拌三天(约72h)。用1M HCl将残余物调节至pH值4-5，并用乙酸乙酯萃取(每次20mL，共2次)，将获得的有机相合并。将合并的有机相干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到化合物7-1(100mg，48.0％产率)，为白色固体。
(6)制备目标化合物
将化合物7-1(100mg，0.231mmol)加入DMF(3毫升)中，再在0℃下向其中加入HATU(132mg，0.346mmol)。在0℃下静置30分钟后，在800rpm搅拌下再加入化合物5-1(200mg，0.478mmol)和DIEAP(59.6mg，0.462mmol)。将混合物在室温800rpm搅拌3小时。用1M HCl将残余物调节至pH值4-5，并用乙酸乙酯萃取(20mL×2次)，将获得的有机相合并。将合并的有机相干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到目标化合物(化合物C030019，17mg，8.85％收率)，为白色固体。该化合物的核磁共振谱图如图1所示，核磁共振波谱数据如下：
1H NMR(400MHz，Acetone-d6)：δ：ppm 10.32(s，1H)，9.94(br，1H)，8.70(d，J＝8.4Hz，1H)，7.70(t，J＝7.8Hz，1H)，7.45-7.44(m，2H)，7.09(d，J＝4.8Hz，1H)，6.79-6.74(m，2H)，5.93(br，1H)，5.04-5.00(m，1H)，4.03(s，2H)，3.82(s，2H)，3.63(br，7H)，3.52-3.46(m，6H)，3.30(br，4H)，2.98(t，J＝7.4Hz，3H)，2.88-2.84(m，4H)，2.62-2.63(m，2H)，2.14-2.11(m，1H)，1.94(s，2H)，1.91(s，2H)，1.16(s，1H)。
HPLC纯度：99.3％(254nm)，99.3％(214nm)；Mass：m/z 834[M+1]+。
实施例2
(1)制备化合物3-1
将化合物1-1(2g，10.85mmol)溶于丙酮(20mL)，在0℃下搅拌下将化合物0-b(1.3g，10.85mmol)和DIEA(1.4g，10.85mmol)加入反应液中，反应混合液在室温下800rpm搅拌30分钟。LCMS监测反应完毕。LCMS：m/z 275.4[M+H]+。
0℃下向上述反应液中加入化合物0-d(1.5g，10.85mmol)和DIEA(1.4g，10.85mmol)，该反应混合物在室温下搅拌30分钟。LCMS监测反应完毕。反应混合物倒入水中，乙酸乙酯萃取(3×10mL)。合并的有机相再经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压(-0.09MPa)浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)得到白色固体化合物3-1(3.28g，收率81％)。
(2)制备化合物4-1
0℃下向化合物3-1(1g，2.6mmol)的丙酮溶液(3mL)中加入化合物30-a(457mg，2.6mmol)和DIEA(335mg，2.6mmol)，该反应混合物在室温下800rpm搅拌30分钟。LCMS监测反应完毕(m/z＝376.1[M+H]+)，将反应液加入水(5mL)中，乙酸乙酯萃取(3次×10mL)后，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压(-0.09MPa)浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)得到白色固体化合物4-1(750mg，收率55.1％)。
(3)制备化合物5-1
0℃下将4-1(640mg，1.2mmol)溶于二氯甲烷(7mL)中滴加三氟乙酸(2mL)，该反应混合物在室温下800rpm搅拌2小时。LCMS(m/z＝418.1[M+H]+)监测反应完毕。反应混合物减压(-0.09MPa)浓缩。所得粗品化合物5-1(320mg，粗品)。
(4)制备化合物31-b
室温下将31-a(1g，4.5mmol)溶于DMF(10mL)，将29-b(1.2g，4.5mmol)和DIEA(1.7g，13.5mmol)，HATU(2.1g，5.4mmol)加入反应液中，反应混合液在室温下800rpm搅拌反应过夜(约18h)。LCMS(m/z 478.1[M+H]+)监测反应完毕。将反应液加入水(5mL)中，用2M盐酸水溶液调至pH＝3.5±0.5，乙酸乙酯萃取(3×10mL)后，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压(-0.09MPa)浓缩。所得粗品经硅胶柱层析分离纯化(*石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1-0∶1)得到白色固体化合物31-b(809mg，粗品)。
*纯化过程中，硅胶层析柱中的填料由石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1的混合溶液逐步过渡至填料全部为乙酸乙酯，以使纯化产物(化合物31-b)能够被收集完全。
(5)制备目标化合物
将31-b(300mg，0.63mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3mL)，将30-c(264mg，0.63mmol)和DIEA(244mg，1.89mmol)，HATU(287mg，0.77mmol)加入反应液中，反应混合液在室温下800rpm搅拌反应过夜(约18h)。LCMS(m/z＝478.1[M+H]+)监测反应完毕。反应混合物倒入水(5mL)中，乙酸乙酯萃取(3×10mL)，将获得的有机相合并。合并的有机相再经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压(-0.09MPa)浓缩。所得粗品经HPLC(0.5％甲酸水/甲醇)分离纯化得到白色固体化合物即为目标化合物(化合物31，50mg，收率9％)。
该化合物的核磁共振谱图如图3所示，核磁共振波谱数据如下：
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.76(d，J＝8.5Hz，1H)，7.76(t，J＝7.9Hz，1H)，7.57(d，J＝7.3Hz，1H)，7.16(d，J＝5.1Hz，1H)，6.89(t，J＝4.3Hz，1H)，6.82(s，1H)，5.12(dd，J＝12.5，5.5Hz，1H)，4.16(s，2H)，3.87(s，3H)，3.812-2.63(m，2H)，2.14-2.11(m，1H)，1.94(s，2H)，1.913H)，2.10.16(s，1H)(8-2.84(m，J＝43.7Hz，2H)。LCMS m/z 878.3[M+H]+。
测试例1
一、动物样品制备
1、动物的饲养
C57BL/6小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。实验动物严格按照《中国实验动物管理条例》管理，温度控制在25℃，保持12小时昼夜颠倒节律，所有动物实验均经过华中科技大学同济医学院伦理委员会批准。
2、动物的药物处理
用侧脑室注射方式给小鼠给药。在小鼠气体麻醉机上用异氟烷(购自瑞沃德生命科技有限公司)麻醉小鼠，用剃毛推子将小鼠头顶部毛发剃干净并用碘伏消毒，将小鼠固定在立体位仪上继续麻醉，眼球用红霉素眼膏涂满保护，用眼科剪将小鼠头顶部皮肤沿颅中线剪开一个切口，充分暴露前囟和后囟及颅骨中线，调节立体定位仪使前囟到后囟处于同一水平且颅骨平面水平。在前囟后0.2mm、旁开0.9mm处进行立体定位钻孔。用10微升量程的汉密尔顿针吸取5μl的C030019(即实施例1中制备获得的目标化合物，200μM)或0.04％DMSO(空白对照组)，从颅骨平面向下进针2.3mm，用微量注射泵匀速注射10分钟(0.25μl/min)，留针10分钟，取出针头，缝合皮肤。药物注射48h后取材。
3、样品的制备
首先准备好小鼠脑组织匀浆所用的仪器及耗材，配置新鲜的匀浆液(50mM Tris-HCl，pH 7.4-7.5，100mM NaCl，1％Triton，5mM EDTA，1mM PMSF(sigma，P-7626)，1×蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitors cocktail，Sigma，P8340))，并将匀浆液置于冰上预冷。用6％的水合氯醛麻醉小鼠后，将小鼠断头，取出完整的脑组织，置于放在冰上的玻璃板上，迅速切掉小脑，分开左右脑，将一半脑组织分离皮层和海马，皮层取靠近额颞叶的1/3，分别置于预冷的1.5mL的EP管中。将脑组织称重后放入匀浆管中，按1∶10(脑组织质量∶匀浆液体积＝1∶10)加入匀浆液，打开匀浆机，forward和reverse各匀浆50下，收集匀浆液至EP管中，冰上静置30分钟，每隔10分钟将管内液体吹打混匀，然后在预冷至4℃的离心机中离心12000rpm×20分钟，将上清分为两部分。第一部分取适量体积，按3∶1加入4×SDS上样缓冲液，在通风橱里按10∶1加入250mM β-巯基乙醇，混匀后在铁浴锅上加热95℃×10分钟，待冷却后震荡混匀，离心，收于-80℃冰箱保存。另一部分留约10μL，测蛋白浓度，其余置液氮迅速冷冻后，再转到-80℃冰箱保存。免疫印迹杂交上样前，将样品用适量的1×SDS上样缓冲液稀释4～5倍后，重新加热10分钟，待冷却后，短暂离心，混匀样品。
二、样品蛋白质含量的测定(BCA法)
采用的BCA试剂盒购自Thermofisher scientific公司，牌号为23224。标准蛋白购自VWR公司，牌号为0332。
1、将蛋白样品震荡后进行适当稀释(样品各取5μl与45μl双蒸水混合稀释，各设2个平行样)，离心震荡；
2、设六个标准管，分别取20mg/ml BSA(100mg BSA溶于5ml双蒸水中)0μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，分别加1000μl、990μl、980μl、970μl、960μl、950μl双蒸水配制成0μg/μl、0.2μg/μl、0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、1.0μg/μl的标准蛋白；
3、将稀释过的蛋白样品和稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内(5μl/孔，用PCR枪贴壁和底的交界处，每加一个孔换一个枪头)，各设3个平行孔。
4、工作液由试剂盒中A液和B液按50∶1比例配制而成。将工作液加入96孔板中，每孔快速悬空加入95μl，加完后盖上盖子迅速贴底沿同方向震荡，手不要触碰96孔板底，用塑料盒垫着37℃孵育30分钟；
5、用1ml注射器针头去气泡，打开BioTek开关，打开Gen5，点左箭头图标，点击OK，导出Excel；
6、复制标准蛋白OD值，框选OD值和标准蛋白浓度插入散点图。选择数据点添加趋势线，显示公式，显示R平方值(小数点后应至少有2个9)，去掉异常值。复制样品蛋白OD值，上方输入相应样品组号，去掉异常值。
三、tau蛋白含量测定(免疫印迹法)
1、搭架子(两种玻璃板，三个瓶子，五个试剂，滤纸，卫生纸，垃圾桶，枪，枪头，梳齿)
(1)擦净桌面和底架，洗净梳齿、玻璃板、蒸馏水瓶和上、下部胶瓶，并烘干上、下部胶瓶，拿出配制电泳胶的试剂恢复至室温；
(2)将较高的玻璃板朝内叠在一起，按住上部使下部紧贴桌面使其平齐，将夹子向外翻夹紧，放在底架上用夹子扣住。
(3)注入双蒸水检验是否漏液，若漏液则重装后再检漏。
2、制备电泳胶
按照表1中的配方进行电泳胶制备。
表1
(1)依次加入20％Arc/Bis，Tris缓冲液，TEMED和10％APS，用移液器吹打混匀，整个过程防止混合液中混有气泡；
(2)沿两个角分别将分离胶缓缓注入到胶膜内(吸取时深入液面下轻柔吹打混匀，每次枪头留少量液体以防产生气泡)，每块胶用量为3×900μl，观察胶不漏后沿两个角分别用双蒸水将胶膜的空隙处填满(防止氧气抑制聚合并保持下部胶水平，可多放一段时间)；
(3)等待凝胶30分钟左右待分离胶凝固后倾去双蒸水，并用滤纸将剩余水吸尽，并用记号笔标出下部胶的上沿；
(4)沿两个角分别将浓缩胶缓缓注入到胶膜内，斜着从左往右插入所需规格梳齿(上样量＜20μl用小梳齿，上样量＞20μl用大梳齿)，在泳道间补胶避免缩胶，等待凝胶(约需50分钟)。
3、上样和蛋白的电泳分离(上样针，样品，排插，Marker，电泳液，电泳槽，蒸馏水瓶)。
清洗电泳架下面的导电丝，将其转移到电泳架上，用记号笔标出泳道及编号，缓慢垂直拔出梳齿，用电泳液加满凝胶槽，用微量加样器取样品加入各个泳道(Marker加1μl于第1泳道)。上完样后将电泳架转移至电泳槽，加电泳液后盖上盖子使红色对红色，黑色对黑色，加样后先用恒流10mA/块胶电泳约30分钟(按两次启动)，待溴酚蓝指示剂电泳至浓缩胶与分离胶交界处成以线状时，改为恒压100V(若无法恒压可调高电流)电泳约60分钟至溴酚蓝到凝胶底部且Marker条带都完全分离。
4、转膜(标记NC膜，转膜液，滤纸，冰盒，盆子，盘子，转膜槽，塑料板，清洗镊子)
(1)将NC膜用记号笔标记后浸于回收的转膜液10-20分钟(有利于蛋白质的固定，能平衡凝胶且去除SDS)，按住两旁的卡口取下凝胶槽，用小板撬起玻璃板和白瓷板右侧中间部分，期间保持剩余胶的电泳。
(2)依欲显分子量范围用玻璃板垂直略倾斜并轻微地左右来回一次切胶，用镊子将浸过转膜液的三层滤纸贴在胶上，用小板小心地将胶撬起放在的海绵上(滤纸朝下)，另一面贴上倒置的NC膜，将胶和NC膜浸没至转膜液中(胶在上)用玻璃棒赶气泡，用镊子夹起小心放在手上(胶在上)，用镊子将浸过转膜液的三层滤纸贴在胶上，倒置放在海绵上，再贴上三层滤纸。由下至上放置黑塑料板→一层海绵→三层滤纸→胶→NC膜→三层滤纸→一层海绵→透明塑料板，若不紧可用橡皮筋固定。
(3)正确安置电极后，将转膜槽放入冰浴中(通电前不要将胶长时间泡在转膜液中，以免蛋白质扩散分解)，转移电流为恒流276mA，电压一般在140V(可以适当补充甲醇提高电压)，具体转移时间根据所需要转移的蛋白质的分子量的大小决定，转移的蛋白质的分子量＜100kDa时时间为1h，＞100kDa时时间为1.5h。
5、免疫印迹显色(清洗镊子，装有双蒸水的盒子，牛奶，保鲜袋，卫生纸，一抗，冰盒，平板，透明胶，TBST，黑色塑料袋，二抗)
(1)封闭：转膜结束后小心地将NC膜用含5％脱脂奶粉的TBS封闭液于室温振荡(80rpm)封闭1h，回收未与胶接触的滤纸。
(2)一抗孵育：取出NC膜，用1×TBS漂去膜表面残留的奶渍，用镊子夹着NC膜竖在卫生纸上除去多余的水，将NC膜Marker一侧朝外置于保鲜袋中用卫生纸排水排气。加入一抗(可加入0.1％的吐温20降低背景)封口贴在平板上(有Marker和蛋白的一面朝上)，透明胶带不要压在目标条带上，于4℃孵育过夜。
(3)二抗孵育：次日从孵育袋中取出NC膜并回收一抗，用TBST缓冲液漂洗3×5分钟，用1×TBS漂去膜表面残留的盐离子，用镊子夹着NC膜竖在卫生纸上除去多余的水，将NC膜置于保鲜袋中用卫生纸排水排气。避光加入辣根过氧化物标记的羊抗兔或羊抗鼠的Odyssey二抗(可加入0.1％的吐温20(Tween 20)降低背景)，封口贴在平板上(有Marker和蛋白的一面朝上)，透明胶带不要压在目标条带上，于室温慢摇孵育约1小时后，从孵育袋中取出NC膜并回收二抗，用TBST缓冲液漂洗3×5分钟。漂洗完毕后，用1×TBS漂洗去掉膜表面残留的盐离子。
(4)显色：先用蘸有无水乙醇的擦镜纸将玻璃板擦干净。将NC膜Marker侧朝上放置在玻璃板上，加入按说明书说明配置的ECL化学发光底物(BeyoECL Star，P0018AM)孵育约1分钟，然后用ECL显影仪器(上海勤翔科学仪器有限公司，ChemiScope 3300Mini)拍摄照片。
(5)半定量分析：用Image J软件对获得的图像做灰度定量。
(6)统计分析：统计分析用GraphPad Prism软件完成。
图2是经侧脑室注射本发明提供的化合物对小鼠大脑皮质中tau蛋白含量的影响的免疫印迹杂交结果(a)及半定量分析(b)结果。结果显示：该化合物能显著降低小鼠大脑皮质的tau蛋白的含量。
测试例2
一、动物样品制备
1、动物的饲养
6-7月龄雄性C57 BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件同测试例1，所有动物实验均经过华中科技大学同济医学院伦理委员会批准。
2、动物的药物处理
用异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)麻醉小鼠后，按照10ml/kg剂量皮下注射给药实施例2中制备获得的目标化合物。给药方式：将目标化合物溶于含20％SBECD(泰坦生物科技有限公司)的磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)中制成不同浓度梯度的溶液，以使最终的给药浓度为0.6mg/kg、3mg/kg、15mg/kg。
3、样品的制备
药物处理48小时后，将小鼠用异氟烷麻醉后，颈椎脱臼方式处死。迅速分离出小鼠的脑部组织，置冰上分离小鼠海马。称重后，按照200ul/10mg组织加入组织裂解液，用组织匀浆机(杭州齐威仪器有限公司，JZ-10)进行组织匀浆(约8秒钟)后，迅速转移到冰上，静置10分钟。4℃，15000g离心20分钟后，转移上清至新的管子。取部分上清用BCA法测蛋白浓度。另取部分上清，加入4×凝胶上样缓冲液(Sample loading buffer：200mmol/L Tris-Cl，PH6.8)(Merk)；400mmol/L DTT(泰坦生物科技有限公司)；8％SDS(sigma)；0.4％溴酚蓝(Sigma)；40％甘油(Sigma))，95℃加热5-10分钟，马上用于免疫印迹杂交实验或储存于-40℃冰箱备用。
4、免疫印迹杂交
将变性的蛋白样品加入预制胶每泳道孔加6微升(蛋白浓度为1ug/ul)做蛋白凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶用半干转膜仪(Bio-Rad)在恒流80mA条件下，转膜60分钟后，将转印后的PVDF膜(Sigma)用5％的脱脂奶粉(溶于三羟甲基氨基甲烷(Tris)-吐温缓冲液(TBST：20mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM氯化钠(NaCl)，0.1％吐温-20(Tween-20))室温封闭30分钟。然后将膜与tau的多克隆抗体(Proteintech，1∶5000)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(Proteintech，1∶10000)(溶于TBST)在37℃孵育1个小时或4℃孵育过夜。将膜用TBST洗三次，每次5分钟。再将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的二抗(Proteintech，1∶10000稀释)在37℃孵育1个小时。洗膜后(5分钟/次，共三次)，将膜用ECL化学发光显色液显色一分钟，后用凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)进行信号采集及条带的灰度定量。用GraphPad prism进行数据统计分析。
图4是小鼠皮下注射本发明所述的小分子化合物或溶解小分子化合物的溶剂(对照组)48小时后，海马tau蛋白及上样量对照GAPDH的免疫印迹图(a)及对该图的半定量分析(b)。小分子化合物在15mg/kg剂量下，显著降低了tau的含量。*，p＜0.05v.s对照组，one-way ANOVA。
根据测试例1-2的结果可以看出，本发明构建的针对tau蛋白的化合物可降低小鼠大脑中的tau蛋白含量。
由于tau蛋白在细胞内异常聚集参与20多种神经退行性疾病，其聚积量与这些退行性疾病的神经变性和记忆障碍正相关。因此，降解tau蛋白即可达到预防或/和治疗tau-相关的神经退行性变性病，如阿尔茨海默病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、皮克氏病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、原发性年龄相关性tau病、嗜银颗粒病、老化相关tau星形胶质细胞病、慢性创伤性脑病、球形胶质细胞tau病变、帕金森病、亨廷顿病、脑卒中和癫痫。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种具有特异性降解tau蛋白功能的小分子化合物，其特征在于，该化合物的化学结构为TBM-L-ULM或其药学上可接受的盐、对映体或立体异构体，其中，TBM为tau蛋白结合部分，L为连接体基团，ULM为泛素连接酶结合部分，所述tau蛋白结合部分与所述泛素连接酶结合部分通过连接体基团连接，
其中，ULM为具有式(2)所示结构的基团，
R8为以下式(3)所示的基团，
其中，R11为H或C1-C12的烷基；
R12为键或C1-C4的亚烷基；
R9为C1-C6的亚烷基、-NH-或-NH-C(O)-R13-，其中R13为C1-C6的亚烷基；
R10为H或C1-C12的烷基；
L为基团-X-Y-Z-，X与TBM相连，Z与ULM相连，
其中，X为键、C1-C4的亚烷基、-NH-或-NH-C(O)-R19-，其中R19为键或C1-C4的亚烷基；
Y为-R20-(R22-E-R23)n-R21-，其中R20和R21各自为键或C1-C8的亚烷基，R22和R23各自为C1-C4的亚烷基，n为0-10的整数，E为O或S；
Z为-A-B-，其中A为键、O或S，B为键、C1-C4的亚烷基或-R27-C(O)-，其中R27为C1-C4的亚烷基；
TBM为具有式(4)所示结构的基团，其中，TBM通过式(4)中的⑤位与所述连接体基团L相连，
其中，R14为C1-C4的亚烷基；
R15和R16各自为H或C1-C12的烷基；
R17为键。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，所述小分子化合物的结构式为：
3.权利要求1或2所述的小分子化合物在制备用于治疗或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疾病为阿尔茨海默病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、皮克氏病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、原发性年龄相关性tau病、嗜银颗粒病、老化相关tau星形胶质细胞病、慢性创伤性脑病、球形胶质细胞tau病变、帕金森病、亨廷顿病、脑卒中和癫痫中的至少一种。
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