CN110709090A - 用于在体内递送治疗剂的b细胞及其剂量 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于施用经遗传修饰以产生诸如治疗性蛋白的治疗剂的自体和/或同种异体B细胞的方法。特别公开了用于施用单个最大有效剂量的经遗传修饰的B细胞和用于施用多剂量的经遗传修饰的B细胞的方法。本文公开的组合物和方法可用于长期体内递送治疗剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月27日提交的美国临时申请第62/491,151号的优先权,所述申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供,并且在此通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件的名称为IMCO-006_01WO_ST25.txt。文本文件为10KB,创建于2018年4月26日,并且经由EFS-Web电子提交。
背景
技术领域
本公开内容涉及B细胞用于长期体内递送治疗剂,如抗原特异性抗体或蛋白质(如,酶),并且特别涉及施用单剂量和多剂量的B细胞。
相关技术描述
当前用于治疗慢性疾病和病症的方法包括治疗剂(如,酶替代疗法)的直接输注,经由病毒载体进行的基因疗法以及干细胞的过继转移(如,造血干细胞转移)。然而,这些方法中的每一种都有缺点。重组治疗性蛋白的注入受蛋白质有限的半寿期的困扰,并且所有这三种方法都提供了治疗剂的次优的组织穿透。诸如经由重组腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体的注入改变内源性组织以产生治疗剂通常导致从集中位置产生治疗剂。从一个位置产生治疗剂增加了产生组织中局部毒性的可能性。另外,由于重组病毒被认为是外来的,因此能够多次施用病毒载体而不会引起不良反应是不可能的,这意味着只有一次注射机会来获得正确剂量的治疗剂。考虑到程序(如使用病毒体内引入核酸至细胞中)中固有的生物变异,在单次注射的限制下获得期望的剂量将非常困难。
近来,将分化的B细胞组合物用于转基因的长期体内表达被认为是治疗各种疾病和病症的有前途的策略。然而,尚未描述为了在体内实现治疗有效水平的药剂,施用修饰的B细胞以递送治疗剂的方法。因此,在本领域中仍然需要长期治疗许多慢性疾病和病症。本公开内容提供了施用和给药经遗传修饰的B细胞组合物以治疗慢性疾病和病症的方法。本公开内容提供了这些优点和其他优点,如详述中所述。
发明概述
本发明的一方面提供了用于向对象施用经遗传修饰的B细胞以用于在体内产生治疗剂的方法,所述方法包括向对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞。
本发明的一方面提供了用于向体内多种组织递送治疗剂的方法,其包括向对象施用两个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。
本发明的一方面提供了用于治疗MPS I的方法,其包括向患有MPS I的对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞以产生IDUA。
本发明的一方面提供了用于减少患有MPS I的对象中的糖胺聚糖(GAG)的量的方法,所述方法包括向对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞以产生IDUA。
本发明的一方面提供了用于向一种或多种体内组织递送治疗剂的方法,所述方法包括向对象施用一个或多个剂量的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是迁移性的。
本发明的一方面提供了向对象施用经遗传修饰的B细胞以使得能够在体内协同产生治疗剂的方法,所述方法包括:确定用于诱导所述治疗剂的最佳体内产生的经修饰的B细胞的最优单剂量浓度;降低经修饰的B细胞的最优单剂量浓度以获得经修饰的B细胞的次优单剂量浓度;和向对象施用两个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。
本发明的一方面提供了经工程化以产生治疗剂的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中,治疗剂是IDUA。在一些实施方案中,治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
本发明的一方面提供了包含经工程化以产生治疗剂的经遗传修饰的B细胞群的组合物,其中经遗传修饰的B细胞处于最优迁移能力。在一些实施方案中,治疗剂是IDUA。在一些实施方案中,治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
本发明的一方面提供了包含经工程化以产生治疗剂的经遗传修饰的B细胞群的组合物,其中在不产生显著量的炎性细胞因子的时间点从培养物中收获组合物中的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中,治疗剂是IDUA。在一些实施方案中,治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
本发明的一方面提供了向对象施用经遗传修饰的B细胞以用于在体内产生治疗剂的方法,所述方法包括向对象施用最优的单剂量的经遗传修饰的B细胞。在一些实施方案中,治疗剂是IDUA。在一些实施方案中,治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
附图简述
图1是用于人IDUA的转座和表达的“睡美人”(SB)转座子和转座酶构建体/图谱的图解。IDUA受EEK启动子的调控(参见实施例1)。在EEK的上游掺入EF1a启动子的双向启动子沿相反方向调控耐药人L22Y-F31S二氢叶酸还原酶(DHFR)的转录。CMV-调节的SB100x提供了SB转座酶活性。由TriLink提供的体外转录产生了带帽和聚腺苷酸化的编码SB100x的mRNA。箭头:转录方向。带有深色三角形的绿色框是T2 SB反向重复/正向重复(IR/DR)序列。pA,聚腺苷酸化信号。图1A显示了构建体设计。图1B显示了图1A中所示的pKT2/EEK-IDUA-DHFR构建体的质粒图谱,所述构建体包含具有L22Y,F31S突变的人DHFR。
图2显示了在原代人B细胞中的SB-介导的人IDUA表达。将人CD19+原代B细胞培养2天,然后将pKT2/EEK-IDUA和pCMV-SB100x作为转座酶源,使用Lonza 4D系统进行电穿孔。测定电穿孔后第8天的细胞裂解物的IDUA酶活性。
图3是显示了在大规模B细胞扩增过程中对IDUA+细胞的MTX选择性富集的一系列直方图。在具有pKT2/EEK-IDUA-DHFR转座子的情况下,将来自两个不同供体(19009和2764)的B细胞进行电穿孔,在第2天至第4天,在含有(底部两个直方图)或不含MTX(顶部两个直方图)的培养基中孵育,然后进一步扩增共7天。在第7天收集来自每个群体的细胞,并通过对人IDUA进行细胞内染色,然后进行流式细胞术(细胞计数/IDUA)来测定IDUA阳性细胞%。
图4显示了输注有IDUA-DHFR转座的B细胞的NSG小鼠中的艾杜糖醛酸酶表达。在第-30天和-4天向NSG IDUA+小鼠腹膜内(i.p.)输注CD4+T细胞,然后在第0天经由i.p.或静脉内(i.v.)注射来输注已经在MTX中选择的107个pKT2/EEK-IDUA-DHFR B细胞。作为对照,一些小鼠经由i.p.注射输注有表达GFP的B细胞。在指定的时间点测定血浆样品中的IDUA。小鼠1至8接受了表达IDUA的B细胞的i.p.输注。小鼠9、10、12和42接受了表达IDUA的B细胞的i.v.输注。小鼠43和48接受了表达GFP的B细胞的i.p.输注。
图5显示了使用MPS I的小鼠模型在血浆中存在的艾杜糖醛酸酶(IDUA)的量。从图例的顶部到底部,小鼠接受了在存在CD4+记忆T细胞的情况下3x 106个转导有IDUA的B细胞(IDUA+B细胞)、在存在CD4+记忆T细胞的情况下1x 107个IDUA+B细胞、在存在CD4+记忆T细胞的情况下3x 107个IDUA+B细胞、仅CD4+记忆T细胞或在第0天没有接受细胞,并且在施用后整个38天内测量了血清中的IDUA酶活性水平。
图6显示了具有多剂量的转导有IDUA的B细胞(IDUA+B细胞)的MPS I小鼠模型的血浆中存在的IDUA的量。从正常供体的清血法(apheresis)产物中富集了CD19的人B细胞,并在扩增过程中用pKT2/EEK-IDUA转座子加上编码SB100x的mRNA进行电穿孔。将CD4+T细胞从同一供体中分离,并在输注IDUA转座的B细胞前一周腹膜内(i.p)输注至NSG MPS I动物中。对照组包括未处理的NSG MPS I小鼠(“无B细胞”)和仅i.v输注有IDUA+B细胞(即没有CD4+T细胞)的NSG MPS I小鼠。随后在第0天、第21天和第42天(箭头)将用自体CD4+T细胞预处理的NSG MPS I小鼠i.v.或i.p.输注IDUA+B细胞。在整个56天内测量血清中的IDUA酶活性水平。N=4。
图7显示了来自图6中描述的相同NSG MPS I小鼠的血浆IgG。N=4。
图8显示了来自MPS I小鼠的多种组织中的IDUA活性。在存在CD4+T细胞(或无细胞作为对照)的情况下,在第0天、第21天和第42天,向MPS I小鼠给予三个剂量的1x 107个经工程化以产生IDUA的B细胞(或无细胞作为对照),并在第一次B细胞输注后第60天在指定的器官中测量IDUA酶的活性水平。N=4。
图9显示了来自MPS I小鼠的多种组织中的糖胺聚糖(GAG)的量。在第0天,在存在CD4+T细胞(或无细胞作为对照)的情况下,在第0天、第21天和第42天,向MPS I小鼠给予三个剂量的1x 107个经工程化以产生IDUA的B细胞(或无细胞作为对照),并在第一次B细胞输注后第60天在指定的器官中测量GAG水平。另外,红色横条表示每组小鼠血浆中的平均IDUA酶活性。N=4。
图10显示了来自用两个剂量的2x 107个经工程化以产生IDUA的B细胞处理的MPSINSG小鼠的血浆中可长期检测到IDUA活性。在施用CD4+T细胞后1周给予第一剂量的B细胞,并且在第一B细胞剂量后30天施用第二剂量B细胞。(IDUA+B细胞)。右侧的彩色编码图例指示小鼠组。X轴表示以周计的时间。Y轴表示在小鼠血浆样品中检测到的IDUA酶活性的量。
图11显示了根据与图10相同的方案,用两个剂量的2x 107个经工程化以产生IDUA的B细胞处理的MPSI NSG小鼠的多个组织中存在的IDUA活性的量。右侧的彩色编码图例指示小鼠组和时间点。X轴列出了被调查的组织,并且Y轴列出了检测到的IDUA酶促活性水平。
图12显示了根据与图10和图11相同的方案,来自用两个剂量的2x 107个经工程化以产生IDUA的B细胞处理的MPS I NSG小鼠的多种组织中糖胺聚糖(GAG)的量。用B细胞产物处理导致多个组织的GAG水平长期降低。右侧的彩色编码图例表示评估GAG的器官。X轴表示小鼠组和细胞剂量。Y轴表示检测到的GAG的量。
图13显示了在两室Transwell测定中经工程化以表达IDUA的B细胞向趋化物的迁移。图13A显示了经工程化的B细胞向趋化物CXCL12的第0天迁移。图13B显示了在工程化后培养4天、5天、6天、7天、8天或9天之后,经工程化的B细胞向趋化物CXCL12的迁移。图13C显示了在工程化后培养4天、5天、6天、7天、8天或9天之后,经工程化的B细胞向趋化物CXCL13的迁移。对于图13B和13C两者,请注意,仅在第4天时间点实施了非趋化因子对照。图13D显示了用于产生图13A-13C中的数据的Transwell测定的示意图。
图14显示了经工程化以表达IDUA的B细胞的克隆性的深度测序分析的汇总数据。
图15显示了由经工程化以产生IDUA的B细胞进行的炎性细胞因子产生的Luminex分析。图15A显示了在含有和不含IL6(50ng/ml)的第2天(D2)、第7天(D7)和第0天(D0)基础培养基中IL6、IFNα和IFNγ的产生。图15B显示了在D2、D7和D0基础培养基中sFAS、TNFRp75、BAFF、HGF和IL5的产生。
图16显示了根据本发明工程化的人B细胞中人LCAT(卵磷脂-胆固醇酰基转移酶)、人LPL(脂蛋白脂肪酶)和人FIX(凝血因子IX)的表达。图16A显示了经工程化的浆母细胞/浆细胞中的LCAT活性。图16B显示了经工程化的浆母细胞/浆细胞中的LPL活性。图16C显示了通过ELISA确定的在经工程化的原代B细胞中的FIX蛋白质表达。
详述
除非另有相反的指示,否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学、重组DNA技术、蛋白质表达和蛋白质/肽/碳水化合物化学的常规方法,出于示例的目的,这些中的许多在下文被描述。此类技术在文献中有充分的解释。参见,如Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2000);DNA Cloning:A PracticalApproach,第I&II卷(D.Glover编辑);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑,1984);Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(P.Herdewijn编辑,2004);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编辑,1985);Nucleic AcidHybridization:Modern Applications(Buzdin和Lukyanov编辑,2009);Transcriptionand Translation(B.Hames&S.Higgins编辑,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney编辑,1986);Freshney,R.I.(2005)Culture of Animal Cells,a Manual of BasicTechnique,第5版Hoboken NJ,John Wiley&Sons;B.Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(第3版2010);Farrell,R.,RNA Methodologies:A Laboratory Guidefor Isolation and Characterization(第3版2005)。以上讨论的公布仅为其在本申请的申请日期之前的公开内容而提供。本文全部都不应被解释为承认本发明无权因为是在先发明而先于此类公开。定义和缩写
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在说明书和所附权利要求书中所使用的,除非相反地指明,否则以下术语具有所指示的含义。关于本说明书,只要如本文定义的术语定义与所引用的参考文献中针对相同术语给出的定义不同,本文明确定义的定义是该术语的正确定义。
除非特别指出,否则词语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”表示一个或多个/一种或多种。
“约”意指相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或长度,变化多达30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或长度。。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施方案中,特别地考虑到可以省略术语“约”。
“组合物”可包含活性剂和惰性或活性的载体,如,药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在特定的实施方案中,组合物是无菌的,基本上不含内毒素或者在使用的剂量或浓度下对接受者无毒。
除非上下文另外要求,否则在整个本说明书和权利要求书中,词语“包含(comprise)”及其变型(如“包含(comprises)””和“包含(comprising)”)应以开放和包容的意义来解释,即“包括但不限于”。
“由……组成”意指包括并且限于短语“由...组成”后所列举的内容。因此,短语“由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的,并且可以不存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括在短语之后列出的任何要素,并且限于不干扰或促进本公开中指明的所列要素的活性或作用的的其他要素。因此,词组“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的,但其他要素是可选的,并且根据它们是否影响所列要素的活性或作用,其他要素可以存在或可以不存在。
在整个说明书中,提及“生物活性(biological activity)”或“生物活性(bioactivity)”是指由于施用本文考虑的任何化合物、药剂、多肽、缀合物、药物组合物导致的在体外测定或者在细胞、组织、器官或有机体(如,动物、或哺乳动物、或人)中诱导的任何响应。生物活性可以是指激动作用或拮抗作用。生物活性可能是有益的作用;或生物活性可能不是有益的,即毒性。在一些实施方案中,生物活性将是指药物或药物组合物对活的对象(如哺乳动物,如人)的正或负作用。因此,术语“具有生物活性的”意在描述具有如本文所述的生物活性的任何化合物。可以通过技术人员当前已知的任何适当手段来评估生物活性。此类测定可以是定性的或定量的。技术人员将容易理解需要采用不同的测定方法来评估不同多肽的活性;对于普通研究人员而言,这是一项日常工作。此类测定通常在对优化基本没有要求的实验室背景中易于实施,并且通常,可获得使用大多数实验室常用的各种技术为多种多肽提供简单、可靠且可重现的生物活性读数的商业试剂盒。当不可获得此类试剂盒时,普通技术研究人员可以轻松设计和优化针对靶多肽的内部生物活性测定方法,而无需进行过多实验;因为这是科学过程的常规方面。
提及术语“如”旨在意为“如但不限于”,因此应当理解,跟随其后的仅是特定实施方案的实例,而绝不应被解释为是限制性实例。除非另外指出,否则使用“如”旨在明确表示已经考虑了其他实施方案并且其被本发明涵盖。
在整个说明书中,提及“实施方案”或“一个实施方案”或“一实施方案”或“一些实施方案”或“某些实施方案”意指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此,在整个说明书的不同地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”或“在某些实施方案中”不一定全部指相同的实施方案。此外,具体的特征、结构或特性可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。
“增加”或“提高”的量通常是“统计上显著的”量,并且可包括是本文所述的量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(如100倍、500倍、1000倍)(包括介于之间且大于1的所有整数和小数点,如2.1、2.2、2.3、2.4等)的增加。类似地,“降低”或“减少”或“更少”的量通常是“统计上显著的”量,并且可包括是本文所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(如,100倍、500倍、1000倍)(包括介于之间且大于1的所有整数和小数点,如1.5、1.6、1.7.1.8等)的减少。
术语“体外”、“离体”和“体内”在本文中旨在具有其常规的科学含义。因此,如,“体外”意指用分离的细胞组分发生的实验或反应,如例如在试管中使用适当的底物、酶、供体和任选的缓冲液/辅因子进行的酶促反应。“离体”意指使用已经从有机体中移出或独立于有机体繁殖的功能性器官或细胞进行的实验或反应。“体内”意指在正常完整状态的活有机体内发生的实验或反应。
“哺乳动物”包括人,并且包括家养动物,如实验室动物和家养宠物(如,猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马和兔)以及非家养动物如野生动物等。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生,并且该描述包括所述事件或情形发生的情况以及所述事件或情形不发生的情况。
“药物组合物”是指化合物(如治疗上有用的多肽)与本领域普遍接受的用于将所述化合物递送至动物(如,人)的介质的制剂。因此,此类介质可以包括任何药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
“药学上有效的赋形剂”和“药学上有效的载体”是本领域技术人员众所周知的,并且其制备方法对于技术人员也是显而易见的。此类组合物及其制备方法可以见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995,并入本文)。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用。它们是指任意长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意三维结构,并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸,如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话,可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以包含非核苷酸组分。聚合后,可以如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。
如本文所用的“对象”包括可用本发明的药剂治疗的表现出疾病或症状或者有表现出疾病或症状的风险的任何动物。合适的对象包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物以及家养动物或宠物(如猫或狗)。包括非人的灵长类动物,并且优选人患者。
“基本上”或“大体上”意指足够的或相当大的量、数量、大小;几乎完全或全部;例如,一些给定数量的95%或更高。
“治疗剂”是指当以治疗有效量向对象(如,优选哺乳动物,更优选人)施用时能够实现如以下定义的疾病或病况的治疗的任何化合物。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指当施用于对象(如,优选哺乳动物,更优选人)时足以在动物中实现疾病或病况的如以下定义的治疗的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将根据化合物、病况及其严重程度、施用方式以及待治疗的动物的年龄而变化,但是可以由本领域的普通技术人员考虑到他自己的知识和本公开内容来常规地确定。
如本文所用,“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对患有目标疾病或病况的对象、优选人的目标疾病或病况的治疗,并且包括:(i)预防或抑制对象出现该疾病或病况,特别地,当此类对象易患该病况但尚未被诊断为患有该病况时;(ii)抑制疾病或病况,即阻止其发展;(iii)减轻疾病或病况,即引起疾病或病况消退;或(iv)减轻由疾病或病况引起的症状。如本文所用,术语“疾病”、“病症”和“病况”可以互换使用,或可以不同,因为具体的病、损伤或状况可能不具有已知的致病物(使得尚未找出病因),因此尚未被认为是损伤或疾病,而仅仅被认为是不期望的状况或综合征,其中或多或少的具体症状集已由临床医生鉴定出。
概述
本发明利用已经通过引入核酸而改变的自体和/或同种异体B细胞来产生治疗剂并涉及施用经修饰的B细胞的方法。在一些实施方案中,术语“经工程化的B细胞”、“经遗传工程化的B细胞”、“经修饰的B细胞”和“经遗传修饰的B细胞”在本文中可互换使用以指代包含一种或多种核酸(如,转基因)以产生治疗剂(如,使得能够表达多肽如治疗性多肽的转基因)的此类改变的B细胞。具体而言,经修饰的B细胞可以以单剂量或多剂量施用。出乎意料的是,发现与其他剂量相比,某些B细胞剂量产生的治疗剂水平高于预期水平。另外,令人惊讶地发现使用经多剂量方案的过程递送的B细胞的多剂量导致的治疗剂水平比通过含相同数量的细胞的单剂量实现的治疗剂水平更高。另外,令人惊讶地发现经修饰的B细胞具有向趋化物的最优迁移能力的窗口,并且其迁移能力可在培养一定时间段后下降。另外,如果意外地发现,尽管经工程化的B细胞的初始群产生IL6,到培养结束时,产生的水平下降至接近本底水平,并且测试的大多数炎性细胞因子均未由经工程化的B细胞产生。此外,显示,最终的经工程化的B细胞群明显是多克隆的,这是因为在最终的经工程化的B细胞群中未发现特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.2%以上。最后,人们发现,经修饰的B细胞能够将药物有效地递送至使用其他形式难以靶向的多种组织,如肺、心脏和肠。
因此,用于施用本文所述的经修饰的B细胞组合物的方法可用于长期体内递送和表达治疗剂。本公开内容总体上涉及用于获得足够的富集和数量的产生治疗剂的细胞以及足够水平的体内治疗剂同时确保产物安全性的方法。
如本文所用,短语“长期体内存活”和“长期存活”是指本文所述的经修饰的B细胞在施用后在对象体内存活10天或更多天。长期存活可以以天、周或甚至年测量。在一个实施方案中,大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天或更多天。在一个实施方案中,大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周、36周、37周、38周、39周、40周、41周、42周、43周、44周、45周、46周、47周、48周、49周、50周、51周、52周或更多周。在另一个实施方案中,经修饰的B细胞在体内存活1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年、4.5年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年或更多年。另外,虽然本文所述的经修饰的B细胞可以在体内存活10天或更多天,但可以理解,大多数经修饰的B细胞在施用后在体内存活1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多天。因此,可以预期本文所述的经修饰的B细胞可用于短期治疗(如,4天)和长期治疗(如,30或更多天)的方法。
B细胞
在离开骨髓后,B细胞充当抗原呈递细胞(APC)并内化抗原。抗原通过受体介导的胞吞作用被B细胞摄取并被加工。抗原被加工成抗原肽,被装载到MHC II分子上,并在B细胞胞外表面上被呈递给CD4+T辅助细胞。这些T细胞结合MHC II/抗原分子并引起B细胞激活。受T细胞刺激后,激活的B细胞开始分化为更特化的细胞。生发中心B细胞可分化成长寿命的记忆B细胞或浆细胞。另外,二级免疫刺激可导致记忆B细胞产生另外的浆细胞。从记忆或非记忆B细胞形成浆细胞之前是形成前体浆母细胞,其最终分化成能产生大量抗体的浆细胞(参见,Trends Immunol.2009年6月;30(6):277-285;Nature Reviews,2005,5:231-242)。浆母细胞分泌的抗体多于B细胞,但少于浆细胞。它们迅速分裂,继续内化抗原并将抗原呈递给T细胞。浆母细胞具有迁移到趋化因子产生部位(如在骨髓中)的能力,由此它们可以分化成长寿命浆细胞。最终,浆母细胞可作为浆母细胞保留几天,然后死亡或不可逆地分化为成熟的完全分化的浆细胞。具体而言,能够归巢至含有浆细胞存活小生境(如,在骨髓中)的组织的浆母细胞能够取代驻留的浆细胞,从而成为长寿命浆细胞,所述长寿命浆细胞可持续多年分泌高水平的蛋白质。
本文所述的方法中使用的B细胞包括泛B细胞、记忆B细胞、浆母细胞和/或浆细胞。在一个实施方案中,经修饰的B细胞是记忆B细胞。在一个实施方案中,经修饰的B细胞是浆母细胞。在一个实施方案中,经修饰的B细胞是浆细胞。
终末分化的浆细胞通常不表达常见的泛B细胞标志物如CD19和CD20,并且表达相对较少的表面抗原。浆细胞表达CD38、CD78、CD138和白介素-6受体(IL-6R),并且缺乏CD45表达,并且这些标志物可用于如通过流式细胞术来鉴定浆细胞。CD27也是浆细胞的良好标志物,这是因为初始B细胞是CD27-,记忆B细胞是CD27+并且浆细胞是CD27++。记忆B细胞亚群也可表达表面IgG、IgM和IgD,而浆细胞不在细胞表面表达这些标志物。CD38和CD138在浆细胞上以高水平表达(参见维基百科(Wikipedia),The Free Encyclopedia.,“Plasmacell”Page Version ID:404969441;最后修订日期:2010年12月30日09:54UTC,2011年1月4日检索;还参见:Jourdan等人Blood.2009年12月10日;114(25):5173-81;TrendsImmunol.2009年6月;30(6):277-285;Nature Reviews,2005,5:231–242;NatureMed.2010,16:123-129;Neuberger,M.S.;Honjo,T.;Alt,Frederick W.(2004).Molecularbiology of B cells.Amsterdam:Elsevier,第189页-第191页;Bertil Glader;Greer,John G.;John Foerster;Rodgers,George G.;Paraskevas,Frixos(2008).Wintrobe'sClinical Hematology,2-Vol.Set.Hagerstwon,MD:Lippincott Williams&Wilkins.第347页;Walport,Mark;Murphy,Kenneth;Janeway,Charles;Travers,Paul J.(2008).Janeway's immunobiology.New York:Garland Science,第387-388页;Rawstron AC(2006年5月).“Immunophenotyping of plasma cells”.Curr Protoc Cytom)。
如本文所用,“静止的”,是指其中细胞未活跃增殖的细胞状态。
如本文所用,“激活的”,是指其中细胞响应于刺激而活跃地增殖和/或产生细胞因子的细胞状态。
如本文所用,术语“分化”和“分化的”,是指细胞表型从一种细胞类型或状态变为另一种细胞类型或状态。例如,转化成浆细胞的记忆B细胞是分化的。
术语“对象”旨在包括可以引起适应性免疫应答的活的有机体(如哺乳动物)。对象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。在一个实施方案中,对象是人。B细胞可从多种来源获得,包括外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、感染部位的组织、脾脏组织和肿瘤。在优选的实施方案中,B细胞来源是PBMC。在本公开内容的某些实施方案中,可以使用本领域中可获得的许多B细胞系。
在本文所述的方法的某些实施方案中,B细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术,如FICOLLTM(可以用于制备高密度溶液的蔗糖和表氯醇的共聚物)从收集自对象的血液单位中获得。在一个优选的实施方案中,通过清血法或白细胞分离术获得来自个体的循环血液的细胞。清血法的产物通常含有淋巴细胞,包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中,可以将通过清血法收集的细胞洗涤以去除血浆级分,并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续的处理步骤。在本文描述的方法的一个实施方案中,将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代的实施方案中,洗涤溶液缺乏钙并且可缺乏镁或可缺乏许多(即使不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易理解的那样,洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成,如通过根据制造商的说明书使用半自动“流通式”(flow-through)离心机(例如,Cobe 2991细胞处理器)。洗涤后,可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液如例如PBS中。可选地,可以去除清血法的样品中的不期望的组分,并将细胞直接重悬于培养基中。
可以使用本领域已知的技术从外周血或白细胞分离术分离B细胞。例如,可以使用FICOLLTM(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)分离PBMC和使用本领域已知的多种抗体中的任一种如Rosette四聚体复合物系统(Rosette tetrameric complex system)(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada)或MACSTM MicroBead Technology(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)通过阴性或阳性选择对CD19+B细胞进行纯化。在某些实施方案中,如Jourdan等人(Blood.2009年12月10日;114(25):5173-81)所述分离记忆B细胞。例如,在使用抗CD2磁珠去除CD2+细胞之后,可以通过FACS对CD19+CD27+记忆B细胞进行分选。骨髓浆细胞(BMPC)可以使用抗CD138磁微珠分选法或其他类似方法和试剂进行纯化。人B细胞可以如使用CD19 MicroBeads,人(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。人记忆B细胞可以如使用记忆B细胞分离试剂盒,人(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。
其他分离试剂盒可商购获得,如R&D Systems的MagCellect人B细胞分离试剂盒(Minneapolis,MN)。在某些实施方案中,如在(Defranco等人,(1982)J.Exp.Med.155:1523)中所述,可以通过在不连续的Percoll梯度上沉积来制备静息B细胞。
在一个实施方案中,使用基于梯度的纯化(如,FICOLLTM)从血液样品中获得PBMC。在另一个实施方案中,从基于清血法的收集获得PBMC。在一个实施方案中,通过分离泛B细胞从PBMC中分离B细胞。分离步骤可利用阳性和/或阴性选择。在一个实施方案中,阴性选择包括使用抗CD3缀合的微珠耗尽T细胞,从而提供T细胞耗尽的级分。在进一步的实施方案中,通过针对CD27的阳性选择从泛B细胞或T细胞耗尽的级分中分离记忆B细胞。
在一个特定的实施方案中,通过耗尽不需要的细胞并随后用CD27MicroBeads进行阳性选择,来分离记忆B细胞。可以使用针对CD2、CD14、CD16、CD36、CD43和CD235a(血型糖蛋白A)的生物素化抗体和抗生物素微珠的混合物来耗尽不需要的细胞,例如T细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞、粒细胞、血小板和红系细胞。
在一个实施方案中,获得了转换的记忆B细胞。如本文所用的“转换的记忆B细胞”或“转换的B细胞”是指已经进行同种型类别转换的B细胞。在一个实施方案中,针对IgG对转换的记忆B细胞进行阳性选择。在另一个实施方案中,通过耗尽表达IgD和IgM的细胞来获得转换的记忆B细胞。转换的记忆B细胞可以如使用转换的记忆B细胞试剂盒,人(SwitchedMemory B Cell Kit,human)(Miltenyi Biotec,San Diego,CA)分离。
例如,在一个特定的实施方案中,可以用生物素化的CD2、CD14、CD16、CD36、CD43、CD235a(血型糖蛋白A)、抗IgM和抗IgD抗体的混合物对非靶细胞进行标记。随后可以用抗生物素微珠对这些细胞进行磁性标记。可以通过耗尽磁性标记的细胞来获得高纯度的转换的记忆B细胞。
在进一步的实施方案中,来自记忆B细胞独有的基因的启动子序列,如例如CD27基因(或记忆B细胞所特有但未在初始B细胞中表达的其他基因)用于驱动可选择标志物的表达,如例如允许在甲氨蝶呤存在下对记忆B细胞进行阳性选择的突变的二氢叶酸还原酶。在另一个实施方案中,来自泛B细胞基因如例如CD19基因的启动子序列用于驱动可选择标志物的表达,如例如允许在甲氨蝶呤存在下对记忆B细胞进行阳性选择的突变的二氢叶酸还原酶。在另一个实施方案中,使用CD3或通过添加环孢菌素来耗尽T细胞。在另一个实施方案中,通过阳性选择从泛B细胞中分离CD138+细胞。在又一个实施方案中,通过阳性选择从PBMC中分离CD138+细胞。在另一个实施方案中,通过阳性选择从泛B细胞中分离CD38+细胞。在又一个实施方案中,通过阳性选择从PBMC中分离CD38+细胞。在一个实施方案中,通过阳性选择从PBMC中分离CD27+细胞。在另一个实施方案中,使用本领域可获得的体外培养方法从PBMC选择性地扩增记忆B细胞和/或浆细胞。
体外培养B细胞
B细胞,如记忆B细胞,可以使用体外方法进行培养,以将B细胞激活并分化为浆细胞或浆母细胞或两者。如本领域技术人员将认识到的,可以使用标准的流式细胞术方法通过细胞表面蛋白表达模式来鉴定浆细胞。例如,终末分化的浆细胞表达相对较少的表面抗原,并且不表达常见的泛B细胞标志物如CD19和CD20。相反,可以通过CD38、CD78、CD138和IL-6R的表达和缺乏CD45的表达来鉴定浆细胞。CD27也可用于鉴定浆细胞,这是因为初始B细胞是CD27-,记忆B细胞是CD27+,并且浆细胞是CD27++。浆细胞表达高水平的CD38和CD138。
在一个实施方案中,B细胞是CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中,B细胞是CD138+浆细胞。在一个实施方案中,B细胞是激活的并且具有CD138-、CD27+的细胞表面表型。
在一个实施方案中,B细胞是CD20、CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中,B细胞是CD20-、CD138+浆细胞。在一个实施方案中,B细胞是激活的并且具有CD20-、CD138-、CD27+的细胞表面表型。
在一个实施方案中,B细胞是CD20-、CD38-、CD138-记忆B细胞。在一个实施方案中,B细胞是CD20-、CD38+、CD138+浆细胞。在一个实施方案中,B细胞是激活的并且具有CD20-CD38-CD138-CD27+的细胞表面表型。
在一个实施方案中,使B细胞与一种或多种B细胞激活因子接触,如已知激活和/或分化B细胞的多种细胞因子、生长因子或细胞系中的任一种(参见如,Fluckiger,等人,Blood 1998 92:4509-4520;Luo,等人,Blood 2009 1 13:1422-1431)。此类因子可选自但不限于以下:IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34和IL-35、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、C型趋化因子XCL1和XCL2、C-C型趋化因子(到目前为止包括CCL1-CCL28)和CXC型趋化因子(到目前为止包括CXCL1-CXCL17)和TNF超家族成员(如TNF-α、4-1BB配体、B细胞激活因子(BLyS)、FAS配体、sCD40L(包括多聚体形式的sCD40L;如,与抗聚组氨酸mAb组合的组氨酸标记的可溶重组CD40L以将多个sCD40L分子聚集在一起)、淋巴毒素、OX40L、RANKL、TRAIL)、CpG和其他toll样受体激动剂(如,CpG)。
可以将B细胞激活因子以各种浓度添加到体外细胞培养物中,以实现期望的结果(如,扩增或分化)。在一个实施方案中,B细胞激活因子用于扩增培养的B细胞。在一个实施方案中,B细胞激活因子用于使培养的B细胞分化。在另一个实施方案中,B细胞激活因子用于扩增和分化培养的B细胞。在一个实施方案中,以相同的浓度提供B细胞激活因子以用于扩增和分化。在另一个实施方案中,B细胞激活因子以第一浓度提供以用于扩增并以第二浓度提供以用于分化。考虑B细胞激活因子可以1)用于扩增B细胞但不分化B细胞,2)用于分化B细胞但不扩增B细胞,或3)用于扩增和分化B细胞。
例如,在具有选自CD40L、IL-2、IL-4和IL-10的一种或多种B细胞激活因子的情况下,培养B细胞,以扩增B细胞。在一个实施方案中,在0.25-5.0μg/ml CD40L的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,CD40L的浓度是0.5~g/ml。在一个实施方案中,交联剂(如与HIS标记的CD40L组合的抗HIS抗体)用于产生CD40L的多聚体。在一个实施方案中,使用蛋白多聚化结构域(如,IgG的Fc区或亮氨酸拉链结构域),将CD40L的分子共价连接或保持在一起。在一个实施方案中,将CD40L与珠粒缀合。在一个实施方案中,CD40L由饲养细胞表达。在一个实施方案中,在1-10ng/ml IL-2的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-2的浓度是5ng/ml。在一个实施方案中,在1-10ng/ml IL-4的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-4的浓度是2ng/ml。在一个实施方案中,在10-100ng/ml IL-10的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-10的浓度是40ng/ml。
在一个实施方案中,在具有选自CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的一种或多种B细胞激活因子的情况下,培养B细胞以扩增B细胞。在一个实施方案中,在0.25-5.0μg/ml CD40L的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,CD40L的浓度是0.5μg/ml。在一个实施方案中,交联剂(如与HIS标记的CD40L组合的抗HIS抗体)用于产生CD40L的多聚体。在一个实施方案中,使用蛋白多聚化结构域(如,IgG的Fc区或亮氨酸拉链结构域),将CD40L的分子共价连接或保持在一起。在一个实施方案中,将CD40L与珠粒缀合。在一个实施方案中,CD40L由饲养细胞表达。在一个实施方案中,在1-10ng/ml IL-2的情况下培养B细胞。在一个实施方案中,IL-2的浓度是5ng/ml。在一个实施方案中,在1-10ng/ml IL-4的情况下培养B细胞。在一个实施方案中,IL-4的浓度是2ng/ml。在一个实施方案中,在10-100ng/ml IL-10的情况下培养B细胞。在一个实施方案中,IL-10的浓度是40ng/ml。在一个实施方案中,在50-150ng/ml IL-15的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-15的浓度是100ng/ml。在一个实施方案中,在50-150ng/ml IL-21的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-21的浓度是100ng/ml。在一个特定的实施方案中,在CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的情况下,培养B细胞以用于扩增B细胞。
例如,在一个实施方案中,在具有B细胞激活因子CD40L、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21的情况下,培养B细胞以用于扩增B细胞,其中将CD40L与交联剂交联以产生CD40L的多聚体。可以在整个培养期(如7天培养期)期间维持此类培养系统,其中将B细胞转染或以其他方式工程化以表达目标转基因(如,外源多肽如例如IDUA)。可以将转基因整合到B细胞中(如,经由病毒或非病毒载体)。可以经由使用转座子在B细胞中表达转基因。由于将转基因靶向整合至B细胞的基因组中,转基因可以在B细胞中表达。靶向整合可经由同源重组进行。同源重组可在由核酸酶诱导的双链断裂处发生。核酸酶可以是如锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)、兆核酸酶(如,归巢核酸内切酶),或经由CRISPR/CAS9核酸酶系统。
在另一个实例,在具有选自CD40L、IFN-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-15、IL-21和P类CpG寡脱氧核苷酸(p-ODN)的一种或多种B细胞激活因子的情况下,培养B细胞以使B细胞分化。在一个实施方案中,在25-75ng/ml CD40L的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,CD40L的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中,在250-750U/ml IFN-α的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IFN-α的浓度是500U/ml。在一个实施方案中,在5-50U/ml IL-2的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-2的浓度是20U/ml。在一个实施方案中,在25-75ng/ml IL-6的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-6的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中,在10-100ng/ml IL-10的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-10的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中,在1-20ng/ml IL-15的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-15的浓度是10ng/ml。在一个实施方案中,在10-100ng/ml IL-21的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,IL-21的浓度是50ng/ml。在一个实施方案中,在1-50μg/ml p-ODN的情况下,培养B细胞。在一个实施方案中,p-ODN的浓度是10μg/ml。
在一个实施方案中,使B细胞接触饲养细胞或将B细胞在饲养细胞上培养。在一个实施方案中,饲养细胞是基质细胞系,如鼠基质细胞系S17或MS5。在另一个实施方案中,在表达CD40配体(CD40L,CD154)的成纤维细胞的存在下,在一种或多种B细胞激活因子细胞因子如IL-10和IL-4的情况下,培养分离的CD19+细胞。在一个实施方案中,提供与表面如组织培养板或珠粒结合的CD40L。在另一个实施方案中,在饲养细胞的存在下或不存在下,在CD40L和一种或多种细胞因子或因子的情况下,培养纯化的B细胞,所述细胞因子或因子选自IL-10、IL-4、IL-7、p-ODN、CpG DNA、IL-2、IL-15、IL6和IFN-α。
在另一个实施方案中,B细胞激活因子是通过转染至B细胞或其他饲养细胞中提供的。在该上下文中,可以使用一种或多种促进B细胞分化为抗体分泌细胞的因子和/或一种或多种提高抗体产生细胞寿命的因子。此类因子包括例如Blimp-1、TRF4、抗凋亡因子如Bcl-xl或Bcl5,或者CD40受体的组成型活性突变体。此外,促进下游信号分子分子表达的因子如TNF受体相关因子(TRAF)也可用于B细胞的激活/分化中。在这方面,TNF受体超家族的细胞激活、细胞存活和抗凋亡功能主要由TRAF1-6介导(参见如,R.H.Arch,等人,GenesDev.12(1998),第2821页-第2830页)。TRAF信号传导的下游效应子包括NF-κB和AP-1家族中的转录因子,其可以打开参与细胞和免疫功能各个方面的基因。此外,已显示,NF-κB和AP-1的激活可经由抗凋亡基因的转录提供免于凋亡的细胞保护。
在另一个实施方案中,爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)衍生的蛋白质用于激活和/或分化B细胞或提高抗体产生细胞的寿命。EBV衍生的蛋白质包括但不限于EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2、EBER、miRNA、EBV-EA、EBV-MA、EBV-VCA和EBV-AN。
在某些实施方案中,使用本文提供的方法使B细胞与B细胞激活因子接触尤其导致细胞增殖(即扩增)、将lgM+细胞表面表型调节成与激活的成熟B细胞一致的表型、分泌Ig和同种型转换。可使用已知且可商购获得的细胞分离试剂盒如MiniMACSTM细胞分离系统(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Germany)分离CD19+B细胞。在某些实施方案中,CD40L成纤维细胞在用于本文所述的方法中之前进行辐照。在一个实施方案中,在IL-3、IL-7、Flt3配体、血小板生成素、SCF、IL-2、IL-10、G-CSF和CpG中的一种或多种的存在下培养B细胞。在某些实施方案中,该方法包括在一种或多种上述因子的存在下,与转化的基质细胞(如MS5)一起培养B细胞,从而提供低水平的与板或珠粒结合的锚定CD40L和/或CD40L。
如上所讨论的,B细胞激活因子诱导B细胞的扩增、增殖或分化。因此,使B细胞与上面列出的一种或多种B细胞激活因子接触以获得扩增的细胞群。可以在转染之前扩增细胞群。可选地或另外,可以在转染后扩增细胞群。在一个实施方案中,扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10和CD40L培养细胞(参见如,Neron等人,PLoS ONE,20127(12):e51946)。在一个实施方案中,扩增B细胞群包括用IL-2、IL-10、CpG和CD40L培养细胞。在一个实施方案中,扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-21和CD40L培养细胞。在一个实施方案中,扩增B细胞群包括用IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-21和多聚化的CD40L培养细胞。
在另一个实施方案中,B细胞群的扩增由引入B细胞的转基因诱导和/或增强。例如,含有重组受体或经工程化的受体的B细胞在结合其配体(如,可溶性配体或细胞表面表达的配体)后诱导细胞信号传导途径(如,CD40的信号传导下游)。在一个实施方案中,由于CD40转基因的表达导致B细胞过表达CD40。在另一个实施方案中,B细胞表达工程化的受体,包括如重组工程化的抗体。在一个实施方案中,工程化的受体类似于嵌合抗原受体(CAR)并且包含scFv和B细胞受体(如CD40)的细胞内信号传导部分的融合蛋白。
在一个实施方案中,由向细胞培养物中添加的小分子化合物诱导和/或增强B细胞群的扩增。例如,结合CD40并使其二聚体化的化合物可用于触发CD40信号传导途径。
如本领域技术人员所知,多种培养基中的任一种都可以用于本发明的方法中(参见如,Current Protocols in Cell Culture,2000-2009,John Wiley&Sons,Inc.)。在一个实施方案中,用于本文所述的方法中的培养基包括但不限于伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基(含有或不含胎牛或其他适当的血清)。说明性培养基还包括但不限于IMDM、RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20。在进一步的实施方案中,培养基可以包含表面活性剂、抗体、人血浆蛋白粉或还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸,2-巯基乙醇)、一种或多种抗生素和/或添加剂如胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和环孢菌素。在一些实施方案中,也可以使用IL-6、可溶性CD40L和交联的增强剂。
将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段以达到期望的分化和/或激活。在某些实施方案中,将B细胞在一定条件下培养且培养足够时间段,使得10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%的B细胞根据需要分化和/或激活。在一个实施方案中,B细胞被激活并分化成浆母细胞和浆细胞的混合群。如本领域技术人员将认识到的,可以使用如本文中其他地方所述的标准的流式细胞术方法通过细胞表面蛋白质表达模式,如CD38、CD78、IL-6R、CD27高和CD138中的一种或多种的表达和/或CD19、CD20和CD45中的一种或多种的表达的缺乏或减少来鉴定浆母细胞和浆细胞。如本领域技术人员将认识到的,记忆B细胞通常是CD20+CD19+CD27+CD38-,而早期浆母细胞是CD20-CD19+CD27++CD38++。在一个实施方案中,使用本文所述的方法培养的细胞是CD20-、CD38+、CD138-。在另一个实施方案中,细胞具有CD20-、CD38+、CD138+的表型。在某些实施方案中,将细胞培养1-7天。在进一步的实施方案中,将细胞培养7天、14天、21天或更久。因此,可以将细胞在适当的条件下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或更多天。将细胞重新涂铺,并可使用本领域已知的技术根据需要添加或更换培养基和补充物。
在某些实施方案中,将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段,使得至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的细胞分化和激活以产生Ig和/或表达转基因。
可通过诸如3H-尿苷掺入RNA(随着B细胞分化,RNA合成增加)或通过3H-胸苷掺入(其测量与细胞增殖相关的DNA合成)的技术来测量B细胞激活的诱导。在一个实施方案中,可以将白介素-4(IL-4)以适当的浓度(如,约10ng/ml)添加到培养基,以增强B细胞增殖。
可选地,B细胞激活被测量为免疫球蛋白分泌的函数。例如,将CD40L与IL-4(如10ng/ml)和IL-5(如5ng/ml)或其他激活B细胞的细胞因子一起加入静息B细胞。流式细胞术也可用于测量激活的B细胞特有的细胞表面标志物。参见如,Civin CI,Loken MR,Int'lJ.Cell Cloning 987;5:1-16;Loken,MR等人,Flow Cytometry Characterization ofErythroid,Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow,inFlow Cytometry in Hematology,Laerum OD,Bjerksnes R.编辑,Academic Press,NewYork 1992;第31页–第42页;和LeBein TW等人,Leukemia 1990;4:354-358。
在培养适当的时间段如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更多天(通常大约3天)后,可以添加另外体积的培养基。在培养期间的各个时间点收获来自各个培养物的上清液并针对IgM和IgG1对其进行定量,如Noelle等人,(1991)J.Immunol.146:1118-1124中所述。在一个实施方案中,将培养物收获并使用流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ELISPOT或本领域已知的其他测定针对目标转基因的表达进行测量。
在另一个实施方案中,ELISA用于测量抗体同种型产生,如IgM或目标转基因产物。在某些实施方案中,使用可商购获得的抗体如山羊抗人IgG作为捕获抗体进行IgG确定,然后使用多种适当的检测试剂中的任一种如生物素化的山羊抗人Ig、链霉亲和素碱性磷酸酶和底物进行检测。
在某些实施方案中,将B细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段,使得细胞数量比培养开始时的B细胞数量大1倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍或更多倍。在一个实施方案中,细胞数量比培养开始时的B细胞数量大10-1000倍(包括在其中的连续的整数)。例如,扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少10倍。在另一个实施方案中,扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少100倍。在一个实施方案中,扩增的B细胞群比最初分离的B细胞群大至少500倍。
B细胞的工程化
在一个实施方案中,将经遗传修饰的B细胞用转基因转染。用于转染B细胞的示例性方法提供于WO 2014/152832和WO 2016/100932中,这两者通过引用整体并入本文。B细胞的转染可使用本领域可获得的将DNA或RNA引入B细胞中的多种方法中任一种来实现。合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、压力介导的转染或“细胞挤压”(如,CellSqueeze微流体系统,SQZ Biotechnologies)、使用逆转录病毒或其他病毒如牛痘进行的纳米颗粒介导的或脂质体介导的转染和转导。参见,如,Graham等人,1973,Virology 52:456;Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratories;Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier;Chu等人,1981,Gene 13:197;US5,124,259;US 5,297,983;US 5,283,185;US 5,661,018;US 6,878,548;US 7,799,555;US 8,551,780;和US 8,633,029。可商购获得的适用于B细胞的电穿孔技术一个实例是NucleofectorTM转染技术。
转染可在分离的B细胞在上述一种或多种激活和/或分化因子的存在下进行体外培养之前或期间进行。例如,在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第30天、第31天、第32天、第33天、第34天、第35天、第36天、第37天、第38天或第39天转染细胞。在一个实施方案中,在体外培养的第1天、第2天或第3天转染细胞。在一个特定的实施方案中,在第2天转染细胞。例如,在体外培养的第2天对细胞进行电穿孔以用于递送如质粒、转座子、微环或自我复制RNA。在另一个实施方案中,在体外培养的第4天、5天、6天或7天转染细胞。在特定的实施方案中,在体外培养的第6天转染细胞。在另一个实施方案中,在体外培养的第5天转染细胞。
在一个实施方案中,在激活之前,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。在另一个实施方案中,在激活期间,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。在一个实施方案中,在激活之后,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。在一个实施方案中,在分化之前,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。在另一个实施方案中,在分化期间,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。在一个实施方案中,在分化之后,将细胞转染或以其他方式工程化(如,经由转基因的靶向整合)。
在一个实施方案中,非病毒载体用于将DNA或RNA递送至记忆B细胞和/或浆细胞。例如,不需要病毒整合系统即可促进记忆B细胞和/或浆细胞转染的系统包括但不限于转座子(如,睡美人转座子系统)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)、兆核酸酶、微环、复制子、人工染色体(如,细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体和酵母人工染色体)、质粒、粘粒和噬菌体。
在一些实施方案中,此类非病毒依赖性载体系统还可经由本领域已知的或下述病毒载体递送。例如,在一些实施方案中,病毒载体(如,逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)用于递送一种或多种非病毒载体(如,例如上述锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)、兆核酸酶或能够促进靶向整合的任何其他酶/互补载体、多核苷酸和/或多肽中的一种或多种。因此,在一些实施方案中,细胞(如,B细胞,如记忆B细胞和/或浆细胞)可经由靶向整合方法进行工程化以表达外源序列(如,编码治疗性多肽如IDUA的序列)。此类方法是本领域已知的,并且可包括在细胞中使用一种或多种核酸酶(如,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas、兆核酸酶)切割内源基因座和向细胞施用转基因,使得该转基因整合至内源性基因座中并在细胞中表达。可将转基因包含在供体序列中,将所述供体序列在核酸酶切割位点处或附近整合至宿主细胞的DNA中。
外源序列(如编码治疗性多肽如IDUA的序列)的整合可经由重组发生。如本领域技术人员所清楚的,“重组”是指两个多核苷酸之间遗传信息交换的过程,包括但不限于通过非同源末端连接(NHEJ)进行的供体捕获和同源重组。该重组可以是同源重组。为了本公开的目的,“同源重组(HR)”是指此类交换的特殊形式,其例如在经由同源定向修复机制修复细胞中的双链断裂期间发生。该过程利用了核苷酸序列的同源性,由此“供体”分子(如,包含此类序列的供体多核苷酸序列或供体载体)被细胞的DNA修复机制用作修复“靶”分子(即,经历双链断裂的分子)的模板,并且通过这些手段引起遗传信息从供体转移至靶标。在HR定向整合的一些实施方案中,供体分子可含有与基因组同源的至少2个区域(“同源臂”)。在一些实施方案中,同源臂的长度可以为如至少50-100个碱基对。同源臂可以与其中待发生靶向整合的切割位点侧翼的基因组DNA区域具有显著的DNA同源性。供体分子的同源臂可以位于待整合到靶基因组或靶DNA基因座中的DNA的侧翼。染色体断裂,然后使用质粒DNA的同源区域作为模板进行修复,可能导致侧接有同源臂的插入转基因转移到基因组中。参见,如,Koller等人(1989)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 86(22):8927-8931;Thomas等人(1986)Cell 44(3):419-428。可通过在靶区域附近故意产生双链断裂来将这种类型的同源定向靶向整合的频率增加高达105倍(Hockemeyer等人(2009)Nature Biotech.27(9):851-857;Lombardo等人(2007)Nature Biotech.25(11):1298-1306;Moehle等人(2007)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 104(9):3055-3060;Rouet等人(1994)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 91(13):6064-6068。
根据本公开内容,能够介导基因组基因座靶向切割使得可将转基因整合至靶细胞的基因组中(如,通过重组如HR)的任何核酸酶都可以用于工程化细胞(如,记忆B细胞或浆母细胞)。
双链断裂(DSB)或缺口可以通过位点特异性核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应因子结构域核酸酶(TALEN)、兆核酸酶,或使用CRISPR/Cas9系统用经工程化的crRNA/tractRNA(单导向RNA)指导特异性切割来产生。参见,例如,Burgess(2013)Nature ReviewsGenetics 14:80-81,Urnov等人(2010)Nature 435(7042):646-51;美国专利公开20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20090263900;20090117617;20100047805;20110207221;20110301073和国际公开WO 2007/014275,其公开内容出于所有目的通过引用整体并入。
在一些实施方案中,细胞(如记忆B细胞或浆母细胞)经由锌指核酸酶介导的供体构建体的靶向整合来工程化。锌指核酸酶(ZFN)是由于通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的“锌指DNA结合蛋白”(ZFP)(或结合结构域)与核酸酶的偶联而引起的能够特异性识别并切割靶核苷酸序列的酶。ZFN可以包含与ZFP DNA结合结构域可操作地连接的任何合适的切割结构域(如,核酸酶)以形成可促进靶DNA序列的位点特异性切割的经工程化的ZFN(参见,如,Kim等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160)。例如,ZFN可以包含与FOK1酶或FOK1酶的一部分连接的靶标特异性ZFP。在一些实施方案中,在ZFN介导的靶向整合方法中使用的ZFN利用两个独立的分子,每个分子都包含各自结合ZFP的FOK1酶的亚基,每个ZFP对靶切割位点侧翼的DNA序列具有特异性,并且当两个ZFP结合它们相应的靶DNA位点时,使FOK1酶亚基彼此接近并且结合在一起,从而激活切割靶切割位点的核酸酶活性。ZFN已经在多种有机体中用于基因组修饰(例如,美国专利公开20030232410;20050208489;20050026157;20050064474;20060188987;20060063231;以及国际公开WO07/014,275,其通过引用整体并入本文)。定制的ZFP和ZFN可以从如Sigma Aldrich(St.Louis,MO)商购获得,并且使用这种定制的ZFN可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。
在一些实施方案中,细胞(例如,记忆B细胞或浆母细胞)经由CRISPR/Cas(如,CRISPR Cas9)核酸酶介导的供体构建体的整合而工程化。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关的)核酸酶系统是可用于基因组工程的基于细菌系统的经工程化的核酸酶系统。它基于许多细菌和古细菌的适应性免疫应答的一部分。当病毒或质粒入侵细菌时,入侵者的DNA区段通过“免疫”应答转化为CRISPR RNA(crRNA)。该crRNA然后通过部分互补区域与称为tracrRNA的另一类型的RNA缔合,以将Cas9核酸酶引导至与靶DNA中crRNA同源的区域(称为“前间隔序列(protospacer)”)。Cas9切割DNA,以在crRNA转录物内包含的20个核苷酸指导序列指定的位点处的DSB处产生平末端。Cas9需要crRNA和tracrRNA两者用于位点特异性DNA识别和切割。该系统现在已经被工程化使得crRNA和tracrRNA可以组合成一个分子(“单导向RNA”),并且可以将单导向RNA的crRNA等效部分进行工程化以引导Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(参见Jinek等人(2012)Science 337,第816-821页,Jinek等人,(2013),eLife2:e00471,和David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此,CRISPR/Cas系统可经工程化以在基因组的期望靶标处产生DSB,并且可通过使用修复抑制剂引起易错修复增加来影响DSB的修复。
在一些实施方案中,CRISPR/Cas核酸酶介导的整合利用了II型CRISPR。II型CRISPR是最充分表征的系统之一,并且按四个连续步骤进行靶向DNA双链断裂。第一,从CRISPR基因座转录两种非编码RNA,即前crRNA阵列和tracrRNA。第二,tracrRNA与前crRNA的重复区域杂交,并介导前crRNA加工成含有单个间隔子序列的成熟crRNA。第三,成熟的crRNA:tracrRNA复合物经由crRNA上的间隔子和与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻的靶DNA上的前间隔序列之间的沃森-克里克碱基配对将Cas9引导至靶DNA(靶标识别的另外的要求)。第四,Cas9介导靶DNA的切割,以在前间隔序列内产生双链断裂。
Cas9相关的CRISPR/Cas系统包含两种RNA非编码组分:tracrRNA和前crRNA阵列,其含有通过相同的直接重复(DR)间隔的核酸酶引导序列(间隔子)。为了使用CRISPR/Cas系统完成基因组工程,这些RNA的两种功能都必须存在(参见Cong等人,(2013)Sciencexpress1/10.1126/science 1231143)。在一些实施方案中,tracrRNA和前crRNA是经由单独的表达构建体或作为单独的RNA提供的。在其他实施方案中,构建嵌合RNA,其中将经工程化的成熟crRNA(赋予靶标特异性)与tracrRNA(提供与Cas9的相互作用)融合以产生嵌合cr-RNA-tracrRNA杂合物(也称为单导向RNA)。(参见Jinek同上和Cong同上)。
在一些实施方案中,可以将含有crRNA和tracrRNA的单导向RNA进行工程化,以引导Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(如,Jinek等人,(2012)Science 337,第816页-第821页,Jinek等人,(2013),eLife2:e00471,David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此,可以对CRISPR/Cas系统进行工程化,以在基因组的期望靶标处产生DSB。
定制的CRISPR/Cas系统可以从如Dharmacon(Lafayette,CO)商购获得,并且可以使用此类定制的单导向RNA序列常规地靶向和切割DNA的任何位置。用于重组的单链DNA模板可以被合成(如,经由本领域已知的和可商购获得的寡核苷酸合成方法),或者被提供在载体如诸如AAV的病毒载体中。
在一些实施方案中,细胞(如,记忆B细胞或浆母细胞)经由TALE核酸酶(TALEN)介导的供体构建体的靶向整合来工程化。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也被称为“重复”)的长度通常为33-35个氨基酸,并且表现出与天然存在的TALE蛋白质内的其他TALE重复序列的至少一些序列同源性。TAL效应子可含有核定位序列、酸性转录激活结构域和串联重复的集中结构域,其中每个重复含有约34个氨基酸,这些氨基酸对于这些蛋白质的DNA结合特异性是关键的。(如,Schornack S,等人(2006)J Plant Physiol163(3):256-272)。TAL效应子取决于在串联重复中发现的包含约102bp的序列,并且所述重复通常彼此91-100%同源(如,Bonas等人,(1989)MoI Gen Genet 218:127-136)。这些DNA结合重复可以被工程化为具有新的重复组合和数量的蛋白质,以制备能够与新序列相互作用并激活非内源性报道基因表达的人工转录因子(如,Bonas等人,(1989)Mol Gen Genet218:127-136)。经工程化的TAL蛋白质可与FokI切割半结构域连接,以产生TAL效应子结构域核酸酶融合(TALEN)以切割靶标特异性DNA序列(如,Christian等人,(2010)Geneticsepub 10.1534/genetics.110.120717)。
定制的TALEN可以从如Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)商购获得,并且可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。
在一些实施方案中,细胞(如记忆B细胞或浆母细胞)经由兆核酸酶介导的供体构建体的靶向整合来工程化。兆核酸酶(或“归巢核酸内切酶”)是在大于12个碱基对的识别序列处结合并切割双链DNA的核酸内切酶。天然存在的兆核酸酶可以是单体的(如I-SceI)或二聚体的(如I-CreI)。天然存在的兆核酸酶识别15-40个碱基对切割位点,并且通常分为四个家族:LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利第5,420,032号;美国专利第6,833,252号;Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388;Dujon等人(1989)Gene 82:115-118;Perler等人(1994)Nucleic AcidsRes.22,1125-1127;Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228;Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180;Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New EnglandBiolabs目录。术语“兆核酸酶”包括单体兆核酸酶、二聚体兆核酸酶和缔合以形成二聚体兆核酸酶的单体。
在某些实施方案中,本文所述的方法和组合物利用包括经工程化的(非天然存在的)归巢核酸内切酶(兆核酸酶)的核酸酶。归巢核酸内切酶和兆核酸酶如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII的识别序列是已知的。还参见美国专利第5,420,032号;美国专利第6,833,252号;Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388;Dujon等人(1989)Gene82:115-118;Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127;Jasin(1996)TrendsGenet.12:224-228;Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180;Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。此外,归巢核酸内切酶和兆核酸酶的DNA结合特异性可经工程化以结合非天然靶位点。参见,例如,Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10:895-905;Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962;Ashworth等人(2006)Nature441:656-659;Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7:49-66;美国专利公布号20070117128。归巢核酸内切酶和兆核酸酶的DNA结合结构域可在核酸酶作为一个整体的背景下改变(即,使得核酸酶包括同源切割结构域)或可与异源切割结构域融合。定制的兆核酸酶可从如New England Biolabs(Ipswich,MA)商购获得,并且可以常规地靶向和切割DNA的任何位置。
B细胞的工程化可以包括如经由一种或多种编码核酸酶的载体将一种或多种核酸酶(如,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas、兆核酸酶)施用至B细胞,使得B细胞摄取了包含编码的核酸酶的载体。载体可以是病毒载体。
在一些实施方案中,核酸酶在细胞(如,记忆B细胞或浆细胞)中切割特定的内源基因座(如安全港基因(safe harbor gene)或目标基因座),并且施用一条或多条外源(供体)序列(如,转基因)(如包含这些外源序列的一种或多种载体)。核酸酶可在靶DNA中诱导双链(DSB)或单链断裂(缺口)。在一些实施方案中,可以在将转基因整合至细胞基因组中的位点处经由同源定向修复(HDR)、非同源修复机制(如NHEJ介导的末端捕获)或核苷酸(如内源序列)的插入和/或缺失来进行供体转基因的靶向插入。
在一个实施方案中,转染B细胞的方法包括在使B细胞与载体接触之前电穿孔B细胞。在一个实施方案中,在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天对细胞进行电穿孔。在一个实施方案中,在体外培养的第2天对细胞进行电穿孔,以递送质粒。在一个实施方案中,在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天使用转座子转染细胞。在另一个实施方案中,在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天使用微环转染细胞。在一个实施方案中,在体外培养的第2天进行睡美人转座子的电穿孔。
在一个实施方案中,在足以转染至少一部分B细胞的条件下,使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的载体接触。在一个实施方案中,在足以转染至少5%的B细胞的条件下,使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的载体接触。在进一步的实施方案中,在足以转染至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的B细胞的条件下,使B细胞与载体接触。在一个特定的实施方案中,转染如本文所述在体外培养的B细胞,在这种情况下使培养的B细胞与如本文所述的载体在足以转染至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的B细胞的条件下接触。
病毒载体可用于转导记忆B细胞和/或浆细胞。病毒载体的实例包括但不限于基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒(AAV)的载体、逆转录病毒载体、逆转录病毒-腺病毒载体和衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体,包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(参见,如,Krisky,Gene Ther.5:1517-30,1998;Pfeifer,Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177-211,2001,其各自通过引用整体并入)。
在一个实施方案中,在体外培养的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天或第9天用病毒载体(如,慢病毒载体)转导细胞。在特定的实施方案中,在体外培养的第5天用病毒载体转导细胞。在一个实施方案中,病毒载体是慢病毒。在一个实施方案中,在体外培养的第1天用麻疹病毒假型慢病毒转导细胞。
在一个实施方案中,使用本领域多种已知技术中的任一种用逆转录病毒载体转导B细胞(参见,如Science 12April 1996 272:263-267;Blood 2007,99:2342-2350;Blood2009,1 13:1422-1431;Blood 2009年10月8日;1 14(15):3173-80;Blood.2003;101(6):2167-2174;Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009))。B细胞的病毒转导的另外描述可以见于WO 2011/085247和WO 2014/152832,其各自通过引用整体并入本文。
例如,可以分离来自供体的PBMC、B或T淋巴细胞以及其他B细胞癌细胞,如B-CLL,并将它们在IMDM培养基或RPMI 1640(GibcoBRL Invitrogen,Auckland,New Zealand)或如本文所述的其他合适的培养基(无血清或补充有血清(如,5-10%FCS、人AB血清和血清替代品)和青霉素/链霉素和/或其他适合的补充剂如转铁蛋白和/或胰岛素)中培养。在一个实施方案中,将细胞以1x 105个细胞接种在48孔板中,并以本领域技术人员可以使用常规方法进行常规优化的各种剂量添加浓缩载体。在一个实施方案中,将B细胞转移至在补充有10%AB血清、5%FCS、50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhlL-15和5ng/ml rhlL-2的RPMI中的MS5细胞单层,并根据需要定期更新培养基。如本领域技术人员将认识到的,可以根据需要使用其他适合的培养基和补充剂。
某些实施方案涉及使用逆转录病毒载体或衍生自逆转录病毒的载体。“逆转录病毒”是有包膜的RNA病毒,其能够感染动物细胞,并在感染的早期利用逆转录酶以从其RNA基因组中产生DNA拷贝,然后通常将所述DNA拷贝整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体的实例莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体,在靶细胞如造血前体细胞及其分化后代中提供长期稳定表达的基于鼠干细胞病毒的逆转录病毒载体(参见,如,Hawley等人,PNAS USA93:10297-10302,1996;Keller等人,Blood 92:877-887,1998),杂合载体(参见,如,Choi,等人,Stem Cells 19:236-246,2001)和复杂的逆转录病毒来源的载体,如慢病毒载体。
在一个实施方案中,在足以转导至少一部分B细胞的条件下,使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的逆转录病毒载体接触。在一个实施方案中,在足以转导至少2%的B细胞的条件下,使B细胞与包含与启动子可操作地连接的目标核酸的逆转录病毒载体接触。在进一步的实施方案中,在足以转导至少2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%静息B细胞的条件下,使B细胞与载体接触。在一个特定的实施方案中,转导如本文所述的在体外培养的分化和激活的B细胞,在这种情况下,使培养的分化/激活的B细胞与如本文所述的载体在足以转导至少2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的分化和激活的B细胞的条件下接触。
在某些实施方案中,在转导之前,用金黄色葡萄球菌Cowan(SAC;Calbiochem,SanDiego,CA)和/或技术人员已知且常规优化的适当浓度的IL-2预刺激细胞。可以使用如技术人员已知的以及在本文中描述的其他B细胞激活因子(如,PMA)。
如上所述,某些实施方案采用慢病毒载体。术语“慢病毒”是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞的复杂逆转录病毒的一个属。慢病毒的实例包括HIV(人免疫缺陷病毒;包括1型HIV和2型HIV)、绵羊髓鞘脱落(visna-maedi)、山羊关节炎脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体可来源于这些慢病毒中的任一种或多种(参见,如Evans等人,Hum Gene Ther.10:1479-1489,1999;Case等人,PNAS USA96:2988-2993,1999;Uchida等人,PNAS USA 95:1 1939-1 1944,1998;Miyoshi等人,Science 283:682-686,1999;Sutton等人,J Virol 72:5781-5788,1998;和Frecha等人,Blood.1 12:4843-52,2008,其各自通过引用整体并入)。
有文献证明,静息T细胞和静息B细胞可以通过携带大多数HIV辅助蛋白(vif、vpr、vpu和nef)的VSVG包被的LV进行转导(参见,如Frecha等人,2010Mol.Therapy 18:1748)。在某些实施方案中,逆转录病毒载体包含来自慢病毒基因组如HIV基因组或SIV基因组的某些最小序列。慢病毒的基因组通常组织成5'长末端重复(LTR)区、gag基因、pol基因、env基因、辅助基因(如nef、vif、vpr、vpu、tat、rev)和3'LTR区。病毒LTR分为三个区域,称为U3、R(重复)和U5。U3区含有增强子和启动子元件,U5区含有聚腺苷酸化信号,并且R区将U3和U5区分开。R区的转录序列出现在病毒RNA的5'端和3'端(参见,如,“RNA Viruses:A PracticalApproach”(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,2000);O Narayan,J.Gen.Virology.70:1617-1639,1989;Fields等人,Fundamental Virology RavenPress.,1990;Miyoshi等人,J Virol.72:8150-7,1998;和美国专利第6,013,516号,其各自通过引用整体并入)。慢病毒载体可以包含慢病毒基因组的这些元件中的任一种或多种,以根据需要调控载体的活性,或者它们可以在这些元件中的一种或多种中含有缺失、插入、置换或突变,如以减少慢病毒复制的病理作用,或将慢病毒载体限于单轮感染。
通常,最小逆转录病毒载体包含某些5'LTR和3'LTR序列、一个或多个目标基因(待在靶细胞中表达)、一个或多个启动子以及用于包装RNA的顺式作用序列。如本文所述和本领域已知的,可以包括其他调控序列。通常将病毒载体克隆到可以被转染到包装细胞系如真核细胞(如293-HEK)中的质粒中,并且通常还包含可用于在细菌中复制质粒的序列。
在某些实施方案中,病毒载体包含来自逆转录病毒如慢病毒的5'和/或3'LTR的序列。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如,它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。优选地,LTR序列是HIV LTR序列。
在某些实施方案中,病毒载体包括来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的灭活或“自我灭活”的3'LTR。“自我灭活的3'LTR”是3'长末端重复(LTR),其含有防止LTR序列驱动下游基因表达的突变、置换或缺失。来自3'LTR的U3区的拷贝充当用于在整合原病毒中产生两个LTR的模板。因此,当具有失活的缺失或突变的3'LTR整合为原病毒的5'LTR时,就不可能从5'LTR转录。这消除了病毒增强子/启动子与任何内部增强子/启动子之间的竞争。自灭活3'LTR描述于例如Zufferey等人,J Virol.72:9873-9880,1998;Miyoshi等人,J Virol.72:8150-8157,1998;和Iwakuma等人,J Virology 261:120-132,1999中,其各自通过引用整体并入。自灭活3'LTR可由本领域已知的任何方法生成。在某些实施方案中,3'LTR的U3元件含有其增强子序列的缺失,优选TATA盒、Spl和/或NF-κB位点。由于自灭活的3'LTR,整合至宿主细胞基因组中的原病毒将包含灭活的5'LTR。
本文提供的载体通常包含编码期望在一种或多种靶细胞中表达的蛋白质(或其他分子,如siRNA)的基因。在病毒载体中,目标基因优选位于5'LTR序列和3'LTR序列之间。此外,目标基因优选与其他遗传元件例如转录调控序列如启动子和/或增强子处于功能关系中,一旦基因被整合至靶细胞中就以特定方式调控目标基因的表达。在某些实施方案中,有用的转录调控序列是在时间和空间上对活性都高度调控的序列。
在某些实施方案中,可以将一个或多个另外的基因作为一种安全措施并入,主要是为了允许在异源群体如人患者中选择性杀灭转染的靶细胞。在一个示例性实施方案中,所选基因是胸苷激酶基因(TK),其表达使得靶细胞易于受药物更昔洛韦的作用的影响。在进一步的实施方案中,自杀基因是被二聚化药物激活的半胱天冬酶9自杀基因(参见,如,Tey等人,Biology of Blood and Marrow Transplantation13:913-924,2007)。
在某些实施方案中,可以将编码标志物蛋白的基因置于病毒或非病毒载体中的主要基因之前或之后,以允许鉴定和/或选择表达期望蛋白的细胞。某些实施方案掺入了荧光标志物蛋白,如绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP),以及目标主要基因。如果包括一个或多个另外的报道基因,则也可以包括IRES序列或2A元件,从而将目标主要基因与报道基因和/或任何其他目标基因分开。
某些实施方案可以采用编码一种或多种可选择标志物的基因。实例包括在真核细胞或原核细胞中有效的可选择标志物,如编码在选择培养基中生长的转化宿主细胞存活或生长所必需的因子的用于抗药性的基因。示例性选择基因编码赋予对抗生素或其他毒素(如G418、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素、乌本苷、杀稻瘟菌素、氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性、补充营养缺陷型缺陷的蛋白质,,或供应可存在于单独的质粒上并通过用病毒载体共转染引入。在一个实施方案中,基因编码赋予甲氨蝶呤抗性的突变型二氢叶酸还原酶(DHFR)。某些其他实施方案可采用编码可用于标记和检测或纯化转染细胞的一种或细胞表面受体(如低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)或者用作转导标签系统的其他此类受体的基因。参见如Lauer等人,Cancer Gene Ther.2000年3月;7(3):430-7。
某些病毒载体如逆转录病毒载体使用一种或多种异源启动子、增强子或两者。在某些实施方案中,在病毒构建体中,可以用启动子或增强子序列替换来自逆转录病毒或慢病毒5'LTR的U3序列。某些实施方案采用位于病毒载体的5'LTR和3'LTR序列之间并与目标基因可操作地连接的“内部”启动子/增强子。
“功能关系”和“可操作地连接”意指但不限于该基因相对于启动子和/或增强子处于正确的位置和取向,使得当启动子和/或增强子与适当的调控分子接触时基因的表达将受到影响。可以使用调控(如增加、减少)包装细胞系中病毒RNA基因组的表达、调控感染的靶细胞中所选目标基因的表达或两者的任何增强子/启动子组合。
启动子是由允许聚合酶结合和转录发生的DNA序列形成的表达控制元件。启动子是未翻译的序列,位于所选目标基因的起始密码子上游(5')(通常在约100至1000bp内),并控制与其可操作地连接的编码多核苷酸序列的转录和翻译。启动子可以是诱导型的或组成型的。诱导型启动子响应于培养条件的一些变化(如温度变化)而在其控制下启动提高水平的从DNA的转录。启动子可以是单向的或双向的。双向启动子可用于共表达两种基因,如目标基因和选择标志物。可选地,可以使用包含在同一载体中呈相反取向的两个启动子的双向启动子构型,每个启动子控制不同基因的表达。
如用于将启动子可操作地连接至多核苷酸编码序列的方法一样,多种启动子是本领域已知的。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于指导所选目标基因的表达。某些实施方案采用异源启动子,这是因为与天然启动子相比,它们通常允许更高的转录和更高的期望蛋白质产率。
某些实施方案可以采用异源病毒启动子。此类启动子的实例包括从病毒(如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组中获得的那些。某些实施方案可以采用异源哺乳动物启动子,如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子或与目标基因的天然序列相关的启动子。通常,启动子与靶细胞如激活的B淋巴细胞、浆B细胞、记忆B细胞或其他淋巴细胞靶细胞相容。
某些实施方案可以采用RNA聚合酶II和III启动子中的一种或多种。RNA聚合酶III启动子的合适选择可见于例如Paule和White.Nucleic Acids Research.,第28卷,pp1283-1298,2000,将其通过引用整体并入。RNA聚合酶II和III启动子还包括可分别指导RNA聚合酶II或III转录其下游RNA编码序列的任何合成的或经工程化的DNA片段。此外,用作病毒载体的一部分的RNA聚合酶II或III(Pol II或III)启动子可以是诱导型的。任何合适的诱导型Pol II或III启动子可与本文所述的方法一起使用。示例性Pol II或III启动子包括Ohkawa和Taira,Human Gene Therapy,第11卷,pp577-585,2000;和Meissner等人,NucleicAcids Research,第29卷,pp1672-1682,2001中提供的四环素响应性启动子,其各自通过引用整体并入。
可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括泛素的启动子、CMV启动子(参见,如,Karasuyama等人,J.Exp.Med.169:13,1989)、β-肌动蛋白(参见,如,Gunning等人,PNASUSA 84:4831-4835,1987)、延伸因子-1α(EF-1α)启动子、CAG启动子和pgk启动子(参见,如,Adra等人,Gene 60:65-74,1987);Singer-Sam等人,Gene 32:409-417,1984;和Dobson等人,Nucleic Acids Res.10:2635-2637,1982,其各自通过引用并入)。组织特异性启动子的非限制性实例包括lck启动子(参见,如Garvin等人,Mol.Cell Biol.8:3058-3064,1988;和Takadera等人,Mol.Cell Biol.9:2173-2180,1989)、成肌素启动子(Yee等人,Genes andDevelopment 7:1277-1289.1993)和thyl启动子(参见,如,Gundersen等人,Gene1 13:207-214,1992)。
启动子的另外实例包括泛素-C启动子、人μ重链启动子或Ig重链启动子(如,MH),及人κ轻链启动子或Ig轻链启动子(如,EEK),其在B-淋巴细胞中有功能。MH启动子含有在侧接有基质结合区的iEμ增强子前的人μ重链启动子,并且EEK启动子含有在内含子增强子(iEκ)、基质结合区和3'增强子(3Eκ)之前的κ轻链启动子(参见,如,Luo等人,Blood.1 13:1422-1431,2009,和美国专利申请公布号2010/0203630)。因此,某些实施方案可以采用这些启动子或增强子元件中的一种或多种。
在一个实施方案中,一个启动子驱动可选标志物表达和第二启动子驱动目标基因的表达。例如,在一个实施方案中,EF-1α启动子驱动选择标志物(如,DHFR)的产生和微型CAG启动子(参见,如,Fan等人Human Gene Therapy 10:2273–2285,1999)驱动目标基因(如,IDUA)的表达。
如上所述,某些实施方案采用增强子元件,如内部增强子来增加目标基因的表达。增强子是DNA的顺式作用元件,通常长约10至300bp,作用于启动子以增加其转录。增强子序列可来源于哺乳动物基因(如,珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰岛素),如□□□增强子、□□□内含子增强子和3'□□增强子。还包括来自真核病毒的增强子,包括复制起点后侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗原特异性多核苷酸序列的5'位或3'位剪接到载体中,但是优选位于启动子的5'位点。本领域技术人员将基于期望的表达模式选择适当的增强子。
在某些实施方案中,选择启动子以允许基因的诱导型表达。在本领域中已知用于诱导型表达的许多系统,包括四环素响应系统和lac操纵子-阻遏子系统。还预期启动子的组合可用于获得目标基因的期望表达。技术人员将能够基于目标有机体和/或靶细胞中基因的期望表达模式来选择启动子。
某些病毒载体包含顺式作用包装序列,以促进基因组病毒RNA掺入病毒颗粒。实例包括psi序列。此类顺式作用序列是本领域中已知的。在某些实施方案中,本文所述的病毒载体可表达两种或更多种基因,这可例如通过掺入可操作地连接至除第一基因之外的每个单独基因的内部启动子、通过掺入促进共表达的元件如内部核糖体进入序列(IRES)元件(美国专利第4,937,190号,通过引入并入)或2A元件、或两者来实现。仅以举例说明的方式,当单个载体包含编码具有期望特异性的免疫球蛋白分子的每条链的序列时,可以使用IRES或2A元件。例如,第一编码区(编码重链或轻链)可位于紧接启动子下游,并且第二编码区(编码另一条链)可位于第一编码区下游,其中IRES或2A元件位于第一和第二编码区之间,优选紧接在第二编码区之前。在其他实施方案中,IRES或2A元件用于共表达不相关基因,如报告基因、可选择标志物或增强免疫功能的基因。可使用的IRES序列的实例包括但不限于脑脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、泰累尔氏鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、人鼻病毒(HRV)、柯萨基病毒(CSV)、脊髓灰质炎病毒(POLIO)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)和瘟病毒(如,猪瘟弱毒(HOCV)和牛病毒腹泻病毒(BVDV))的IRES元件(参见,如,Le等人,Virus Genes 12:135-147,1996;和Le等人,Nuc.Acids Res.25:362-369,1997,其各自通过引用整体并入)。2A元件的一个实例包括来自口蹄疫病毒的F2A序列。
在某些实施方案中,本文提供的载体还含有另外的遗传元件,以达到期望的结果。例如,某些病毒载体可以包括促进病毒基因组的核进入靶细胞的信号,如HIV-1皮瓣信号。作为进一步的实例,某些病毒载体可以包括促进原病毒整合位点在靶细胞中表征的元件,如tRNA琥珀抑制剂序列。某些病毒载体可以含有一种或多种经设计以增强目标基因表达的遗传元件。例如,可以将土拨鼠肝炎病毒响应元件(WRE)置于构建体中(参见,如,Zufferey等人,J.Virol.74:3668-3681,1999;和Deglon等人,Hum.Gene Ther.11:179-190,2000,其各自通过引用整体并入)。作为另一个实例,鸡β-珠蛋白隔离子也可以包括在构建体中。已经表明,由于甲基化和异染色质化作用,这种元件减少了使靶细胞中整合的DNA沉默的可能性。此外,隔离子可以保护内部增强子、启动子和外源基因免受染色体上整合位点处周围DNA的正或负位置效应。某些实施方案采用了这些遗传元件中的每一种。在另一个实施方案中,本文提供的病毒载体还可以含有遍在染色质开放元件(UCOE)以增加表达(参见如,Zhang F等人,Molecular Therapy:The journal of the American Society of GeneTherapy 2010年9月;18(9):1640–9.)。
在某些实施方案中,本文提供的病毒载体(如逆转录病毒,慢病毒)用主要靶向选定的细胞类型的一种或多种选定的病毒糖蛋白或包膜蛋白进行“假分型(pseudo-typed)”。假分型(pseudo-typing)通常是指将一种或多种异源病毒糖蛋白掺入至细胞表面病毒颗粒,通常允许病毒颗粒感染不同于其正常靶细胞的选定细胞。“异源”元件来源于不同于病毒载体的RNA基因组所来源的病毒的病毒。通常,病毒载体的糖蛋白编码区已如通过缺失进行了遗传改变,以防止其自身糖蛋白的表达。仅以举例说明的方式,通常在用异源病毒糖蛋白进行假分型之前,将HIV衍生的慢病毒载体的包膜糖蛋白gp41和/或gp120缺失。
在某些实施方案中,病毒载体用靶向B淋巴细胞的异源病毒糖蛋白进行假分型。在某些实施方案中,病毒糖蛋白允许选择性感染或转导静息或静止B淋巴细胞。在某些实施方案中,病毒糖蛋白允许选择性感染B淋巴细胞浆细胞、浆母细胞和激活的B细胞。在某些实施方案中,病毒糖蛋白允许感染或转导静止B淋巴细胞、浆母细胞、浆细胞和激活的B细胞。在某些实施方案中,病毒糖蛋白允许感染B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞。在一个实施方案中,病毒载体用VSV-G进行假分型。在另一个实施方案中,异源病毒糖蛋白来源于麻疹病毒(如埃德蒙顿麻疹病毒)的糖蛋白。某些实施方案假分型麻疹病毒糖蛋白血凝素(H)、融合蛋白(F)或两者(参见,如,Frecha等人,Blood.112:4843-52,2008;和Frecha等人,Blood.114:3173-80,2009,其各自通过引用整体并入)。在一个实施方案中,病毒载体用长臂猿白血病病毒(GALV)进行假分型。在一个实施方案中,病毒载体用猫内源性逆转录病毒(RD114)进行假分型。在一个实施方案中,病毒载体用狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)进行假分型。在一个实施方案中,病毒载体用鼠白血病病毒(MLV)进行假分型。在一个实施方案中,病毒载体用长臂猿白血病病毒(GALV)进行假分型。在进一步的实施方案中,病毒载体包括用于将载体靶向特定细胞类型的嵌入的抗体结合结构域,如一个或多个可变区(如,重链和轻链可变区)。
病毒载体的产生可以使用本领域已知的任何合适的遗传工程化技术来完成,包括但不限于限制核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、PCR扩增和DNA测序的标准技术,例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1989));Coffin等人(Retroviruses.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1997))和“RNA Viruses:A Practical Approach”(Alan J.Cann,编辑,Oxford University Press,(2000)所述。
可以使用本领域已知的各种方法来产生合适的逆转录病毒颗粒,其基因组包含病毒载体的RNA拷贝。作为一种方法,可以将病毒载体引入包装细胞系,所述包装细胞系将基于病毒载体的病毒基因组RNA包装至具有期望靶细胞特异性的病毒颗粒中。包装细胞系通常反式提供将病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中并感染靶细胞所需的病毒蛋白质,包括结构性gag蛋白、酶促pol蛋白和包膜糖蛋白。
在某些实施方案中,包装细胞系稳定表达某些必需的或期望的病毒蛋白质(如,gag、pol)(参见,如,美国专利第6,218,181号,其通过引用并入本文)。在某些实施方案中,用质粒瞬时转染包装细胞系,所述质粒编码某些必需的或期望的病毒蛋白质(如,gag、pol、糖蛋白),包括本文所述的麻疹病毒糖蛋白序列。在一个示例性实施方案中,包装细胞系稳定表达gag和pol序列,然后用编码病毒载体的质粒和编码糖蛋白的质粒转染细胞系。引入期望的质粒之后,将病毒颗粒如通过超速离心法收集并相应处理,以获得浓缩的病毒颗粒原液。示例性包装细胞系包括293(ATCC CCL X)细胞系、HeLa(ATCC CCL 2)细胞系、D17(ATCC CCL 183)细胞系、MDCK(ATCC CCL 34)细胞系、BHK(ATCC CCL-10)细胞系和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞系。
治疗剂
如本文所用的“目标基因”或“基因”或“目标核酸”是指待在靶标转染的细胞中表达的转基因。尽管可以使用术语“基因”,但这并不意味着这是在基因组DNA中存在的基因并且可以与术语“核酸”互换使用。通常,目标核酸提供用于编码治疗剂合适的核酸,并且可以包含cDNA或DNA,并且可以包含或不可包含内含子,但通常不包含内含子。如在别处所指出的,目标核酸可操作地连接至表达控制序列,以在靶细胞中有效地表达目标蛋白质。在某些实施方案中,本文所述的载体可以包含一种或多种目标基因,并且可以包括2种、3种、4种或5种或更多种目标基因,如例如可以使用如本文所述的内部启动子来组织的免疫球蛋白的重链和轻链。
如本文所用的叙述“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式)的聚合形式。术语包括DNA和RNA的单链和双链形式。目标核酸或基因可以是编码目标蛋白质的任何核酸。
待由如本文所述的经遗传修饰的B细胞递送的治疗剂可以是蛋白质。如本文所述使用的目标蛋白质包括提供期望活性的任何蛋白质。在这方面,目标蛋白质包括但不限于抗体或其抗原结合片段、细胞表面受体、分泌的蛋白如细胞因子(淋巴因子、白介素、干扰素或趋化因子)、其他分泌的信号传导分子如TGF-β和成纤维细胞生长因子、蛋白质的抗原片段、DNA编码的小分子(参见如,Nature Chemical Biology 5,647-654(2009))、酶、凝血因子和粘附分子。在一个实施方案中,核酸编码抗体或其抗原结合片段。示例性抗原结合片段包括结构域抗体、sFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。在一个实施方案中,核酸将目标蛋白质编码为包含可切割接头的融合蛋白。例如,抗体重链和轻链可以表达为具有可自切割接头肽如F2A。
在一个实施方案中,由核酸编码的抗体至少包含HIV中和抗体,b12的抗原结合结构域(参见,如,J Virol 2003,77:5863-5876;J Virol.1994年8月;68(8):4821-8;ProcNatl Acad Sci U S A.1992,89:9339-9343;对于b12轻链(AAB26306.1 Gl 299737)和重链(AAB26315.1 Gl 299746),示例性序列以GenBank登录号提供)。在进一步的实施方案中,由目标核酸编码的抗体包含Fuzeon(TM)(T-20/恩夫韦地/喷他夫西(pentafuside)/DP-178)。DP-178是来自HIV上的gp41的氨基酸序列并且干扰HIV与其靶细胞融合的能力。Fuzeon可使用技术人员已知的方法合成性地产生(参见如,2001J.Virol.75:3038-3042;应注意,本文所述方法极不可能导致治疗性剂量的DP-178肽的分泌)。
在一个特定的实施方案中,目标核酸编码免疫活性蛋白。在某些实施方案中,目标核酸编码蛋白质或其生物活性片段(如,抗原片段),其通过在B细胞、T细胞或其他免疫细胞的表面上呈递蛋白质来诱导免疫疫苗样反应。在某些实施方案中,目标蛋白质影响B细胞的调控,例如但不限于促进细胞分裂、促进分化为不同的B谱系、灭活或杀伤细胞,或调控其他引入的DNA元件的产生或活性。白介素是技术人员已知的,并且迄今为止包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL27的p28亚基的分泌形式、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34和IL-35。干扰素包括IFN-γ,IFN-α,IFN-β和IFN-ο。考虑在本文中使用的趋化因子包括C型趋化因子XCL1和XCL2,C-C型趋化因子(迄今为止包括CCL1-CCL28)和CXC型趋化因子(迄今为止包括CXCL1-CXCL17)。TNF超家族的成员(如,TNF-a、4-1BB配体、B细胞激活因子、FAS配体、淋巴毒素、OX40L RANKL和TRAIL)也被考虑为目标基因。
在某些实施方案中,目标蛋白质诱导免疫耐受性。在这方面,目标蛋白质可包含IgG-抗原融合蛋白(参见,如Cellular Immunology235(1),2005,12-20)。在某些实施方案中,目标蛋白质的表达可伴随着用诸如TGF-β、IL-10和LPS的因子刺激细胞。在某些实施方案中,用培养的B细胞表达诱导耐受性的因子,如IL-10或转录因子。
在进一步的实施方案中,目标基因编码促进B细胞分化为抗体分泌细胞的一种或多种因子和/或提高抗体产生细胞的寿命的一种或多种因子。此类因子包括例如Blimp-1、Xbp1、IRF4、Zbtb20、TRF4、抗凋亡因子如Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1或Bcl5及CD40受体的组成型活性突变体。目标另外基因编码促进下游信号传导分子表达的因子如TNF受体相关因子(TRAF)。在这方面,TNF受体超家族的细胞激活、细胞存活和抗凋亡功能主要由TRAF 1-6介导(参见,如,R.H.Arch,等人,Genes Dev.12(1998),pp2821-2830)。TRAF信号传导的下游效应子包括NF-KB和AP-1家族中的转录因子,其可以打开参与细胞和免疫功能各个方面的基因。此外,已显示,NF-κβ和AP-1的激活经由抗凋亡基因的转录提供免于凋亡的细胞保护。在另外的实施方案中,编码的因子如IL-10、IL-35、TGF-β或Fc-融合蛋白与诱导免疫耐受性有关。
在另外的实施方案中,目标核酸编码一种或多种爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)衍生的蛋白质。EBV衍生的蛋白质包括但不限于EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2、EBER、EBV-EA、EBV-MA、EBV-VCA和EBV-AN。在一个特定的实施方案中,目标核酸编码抗体或其抗原结合片段。在这方面,抗体可以是天然抗体或定制的重组工程化抗体。特别考虑包含抗体或其部分的融合蛋白由本文所述的载体编码。
在一个实施方案中,根据本公开内容的抗体或其片段具有抗HIV抗体(如m36抗HIV抗体)的氨基酸序列(参见如,Proc Natl Acad Sci U S A.2008年11月4日;105(44):17121-6),或与抗HIV抗体如m36的氨基酸序列具有至少60%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸分子。特别地,特别考虑了包含m36的融合蛋白或其衍生物,如m36L2CD4Fc(参见如,Antiviral Research第88卷,第1期,2010年10月,第107页-第115页)。在一个实施方案中,抗HIV抗体是广泛中和单克隆抗体VRC01(参见,如,Wu等人,Science,2010,329(5993):856861和Li等人,J Virol,2011,85(17):8954-8967)。
在进一步的实施方案中,由本公开的转基因编码的抗体结合自身抗原。在某些实施方案中,在这方面的自身抗原与多发性硬化或1型糖尿病的发展有关,包括但不限于MBP、αB-晶状体蛋白、S100β、蛋白脂质蛋白(PLP)、HSP105、大疱性类天疱疮(BP)抗原1(BPAG1-e)的上皮同种型、脂质和髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)-α和MOG-β同种型,或者多种胰岛细胞自身抗原(如唾液糖脂(sialoglycolipid)、谷氨酸脱羧酶、胰岛素、胰岛素受体,38kD、牛血清白蛋白、葡萄糖转运蛋白、hsp 65、羧肽酶H,52kD、ICA 12/ICA512,150kD和RIN极性)中的任一种。这些自身抗原的抗体是本领域已知的,并且可以使用常规技术进行测序和重组制备(参见,如,J.Clin.Invest.107(5):555-564(2001))。
在进一步的实施方案中,抗体结合癌症相关的抗原。癌症相关的抗原可来源于多种肿瘤蛋白质。用于本公开内容的示例性肿瘤蛋白质包括但不限于以下中的任一种或多种:p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1 R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu(如,抗体可来源于Her2特异性mAb、赫赛汀(Herceptin(R)))、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、□-连环蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、Myosin/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、Annexin II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARa和TEL/AML1。这些和其他肿瘤蛋白质是技术人员已知的。
在进一步的实施方案中,目标核酸编码具有特定功能属性(如但不限于抑制活性、诱导癌细胞中细胞死亡的能力或者减缓或抑制癌细胞增殖的能力)的肽或其他结合结构域。在这方面,在一个实施方案中,由目标核酸编码的肽或结合结构域可以结合本文所述的任何靶蛋白,如如上所述的癌症相关抗原、CD4、HIV gp120或其他病毒蛋白质、ICAM-3、DC-SIGN(参见,如美国专利7,301,010)。在某些实施方案中,所述肽可以来源于致病性和非致病性细菌和绿色植物。美国专利7084105、7301010、7338766、7381701、7491394、7511117、7556810中公开了示例性肽。在一个实施方案中,目标核酸编码天青蛋白-p28(NSC745104),一种p53泛素化的肽抑制剂(参见如Cancer Chemother Pharmacol 2010,DOI 10.1007/S00280-010-1518-3;美国专利7,084,105)。在进一步的实施方案中,目标核酸编码称为胃饥饿素的因子,其诱导食欲并且可用于治疗癌症患者(参见,如,Obes Facts.20103:285-92;FASEB J.18(3):439-56)。在另一个实施方案中,目标核酸编码结合并抑制血管生成素1和2的肽(参见,如,AMG386,用于治疗癌症的抗体(肽体)的Fc片段;在某些实施方案中,可以直接从患有癌症的个体中鉴定出肿瘤抗原。在这方面,可以使用多种已知技术进行筛选。例如,在一个实施方案中,从患者取出肿瘤活检材料,从肿瘤细胞中分离RNA,使用基因芯片(例如,来自Affymetrix,Santa Clara,CA)进行筛选并鉴定肿瘤抗原,一旦鉴定出肿瘤靶抗原,就可以使用本领域已知的技术对其进行克隆、表达和纯化。
在一个特定的实施方案中,目标核酸编码酶。在一个实施方案中,目标核酸编码治疗溶酶体贮积症的酶。在一个实施方案中,目标核酸编码艾杜糖醛酸酶(IDUA)以用于治疗或预防I型粘多糖贮积症(MPS I)。在一个实施方案中,目标核酸编码艾度硫酸酯酶(idursulfase)以用于治疗或预防II型粘多糖贮积症(MPS II)。在一个实施方案中,目标核酸编码加硫酶以用于治疗或预防VI型粘多糖贮积症(MPS VI)。在一个实施方案中,目标核酸编码依洛硫酸酯酶α以用于治疗或预防IVA型粘多糖贮积症(MPS IVA)。在一个实施方案中,目标核酸编码半乳糖苷酶β以用于治疗或预防法布雷病(Fabry’s disease)。在一个实施方案中,目标核酸编码半乳糖苷酶α以用于治疗或预防法布雷病。在一个实施方案中,目标核酸编码α-1-抗胰蛋白酶以用于治疗或预防α-1-抗胰蛋白酶缺乏症。在一个实施方案中,目标核酸编码α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶以用于治疗或预防IIIB型粘多糖贮积症(MPSIIIB)。在另一个实施方案中,目标核酸编码因子VII以用于治疗或预防血友病。在一个实施方案中,目标核酸编码可用于治疗或预防如LCAT缺乏症和动脉粥样硬化的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)。在另一个实施方案中,目标核酸编码载脂蛋白A-1Milano(ApoA-1Milano)以用于治疗或预防心血管疾病和病症,如例如动脉粥样硬化。在一个实施方案中,目标核酸编码脂蛋白脂肪酶(LPL)以用于治疗或预防LPL缺乏症。在另一个实施方案中,目标核酸编码广泛中和抗体(bNAb)或其融合蛋白,其结合并中和多个HIV-1毒株(如,b12)。在又一个实施方案中,目标核酸编码苯丙氨酸羟化酶以用于治疗或预防苯丙酮尿症(PKU)。
如本文所用的“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体;灵长类化(如,人源化);鼠;小鼠-人;小鼠-灵长类动物;和嵌合性;并且可以是完整分子、其片段(如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段),或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体;并且可以天然存在或如通过免疫、合成或遗传工程制备;如本文所用的“抗体片段”是指来源于抗体或与抗体相关的片段,其结合抗原并且在一些实施方案中可以被衍生以表现出促进清除和摄取的结构特征,如通过掺入半乳糖残基。这包括如F(ab)、F(ab)'2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)以及它们的组合。来源包括来自各种物种(包括人、骆驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼;Hamers-Casterman等人(1993)Nature,363:446和Nguyen等人(1998)J.Mol.Biol.,275:413)、鲨鱼(Roux等人(1998)Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)95:1 1804)、鱼(Nguyen等人(2002)Immunogenetics,54:39)、啮齿动物、禽类、绵羊)的抗体基因序列(其可诸如在噬菌体文库中格式化为抗体、sFv、scFv或Fab),编码随机肽文库的序列或编码在可选非抗体支架的环区中经工程化的多种氨基酸的序列,如纤维蛋白原结构域(参见,如Weisel等人(1985)Science230:1388)、Kunitz结构域(参见,如美国专利第6,423,498号)、脂质运载蛋白结构域(参见,如,WO 2006/095164)、V样结构域(参见,如,美国专利申请公布号2007/0065431)、C型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBS J.272:6179)等(参见,如,PCT专利申请公开号WO 2007/098934;WO 2006/072620)等。
除非本文明确定义,否则本领域技术人员理解为指代抗体技术的术语各自具有本领域所获得的含义。例如,术语“VL”和“VH”是指分别来源于抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的、定义明确的子区域组成,所述子区域称为“互补决定区”(CDR)和“框架区域”(FR)。术语“CL”和“CH”是指“免疫球蛋白恒定区”,即分别来源于抗体轻链或重链的恒定区,其中后一个区被理解为还可分为Cm、CH2、CH3和CH4恒定区结构域,这取决于所述区域所来源的抗体同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。恒定区结构域的一部分构成了Fc区(“可结晶片段”区),其含有负责以下的结构域:免疫球蛋白的效应子功能,如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体固定,与Fc受体结合,相对于缺乏Fc区的多肽的更长的体内半寿期,蛋白A结合和也许甚至胎盘转移(参见Capon等人(1989)Nature,337:525)。此外,包含Fc区的多肽允许多肽的二聚化或多聚化。
免疫球蛋白的结构域结构适合工程化,这是因为抗原结合结构域和赋予效应子功能的结构域可以在免疫球蛋白类别和亚类之间交换。例如,氨基酸变化(如,缺失、插入、置换)可以改变免疫球蛋白的翻译后过程,如改变糖基化和/或岩藻糖基化位点的数量或位置。经由糖基化增强ADCC的方法是本领域已知的,并考虑用于本文。例如,增强糖基化的酶可以与抗体共表达。在一个实施方案中,MGAT3在产生抗体的细胞中过表达,以增强抗体的糖基化及其ADCC功能。在一个实施方案中,经由如siRNA抑制Fut8增强了抗体的糖基化和ADCC。
免疫球蛋白的结构和功能例如在Harlow等人编辑,Antibodies:A LaboratoryManual,第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,1988)中进行了综述。可以在教科书重组抗体(Recombinant Antibodies)(John Wiley&Sons,NY,1999)中找到有关重组抗体技术所有方面的广泛的介绍以及详细信息。可以在R.Kontermann和S.Dubel,编辑,The Antibody Engineering Lab Manual(Springer Verlag,Heidelberg/New York,2000)中找到详细的抗体工程化实验室方案的全面收藏。另外相关方案也可在John Wiley&Sons,Inc.,Boston,MA出版的Current Protocols in Immunology(2009年8月)中获得。用于产生酶和蛋白质工程(如,IDUA)的方法在本领域中也是已知的,并且考虑在本文中使用。
因此,本公开内容提供了用于遗传修饰B细胞的编码本公开的治疗剂(如,目标蛋白质)的多核苷酸(分离的或纯化的或纯的多核苷酸),包含此类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体),以及根据本公开内容用多核苷酸或载体转化或转染的细胞(如,宿主细胞)。在某些实施方案中,考虑了编码本公开内容的目标蛋白质的多核苷酸(DNA或RNA)。在本文中还考虑了编码目标蛋白质的表达盒。
本公开内容还涉及包括本公开内容的多核苷酸的载体并且特别涉及重组表达构建体。在一个实施方案中,本公开内容考虑了包含编码本公开内容的蛋白质的多核苷酸以及引起或促进此类蛋白质编码序列的转录、翻译和加工的多核苷酸序列的载体。与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体描述于例如Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,NY,(1989)中。示例性克隆/表达载体包括克隆载体、穿梭载体和表达构建体,其可基于质粒、噬菌粒、噬粒(phasmids)、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知的适用于扩增、转移和/或表达其中所含的多核苷酸的任何核酸媒介物。
如本文所用,除非另有关于病毒载体的描述,否则“载体”意指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。示例性载体包括质粒、微环、转座子(如,睡美人转座子)、酵母人工染色体、自复制RNA和病毒基因组。某些载体可以在宿主细胞中自主复制,而其他载体可以整合到宿主细胞的基因组中并从而与宿主基因组一起复制。此外,某些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”),其含有与表达控制序列可操作地连接的核酸序列,因此能够指导那些序列的表达。在某些实施方案中,表达构建体衍生自质粒载体。说明性构建体包括修饰的pNASS载体(Clontech,Palo Alto,CA),其具有编码氨苄青霉素抗性基因的核酸序列、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点;pDEF38和pNEF38(CMC ICOS Biologies,Inc.),其具有CHEF1启动子;和pD18(Lonza),其具有CMV启动子。其他合适的哺乳动物表达载体也是众所周知的(参见,如,Ausubel等人,1995;Sambrook等人,同上;还参见,如来自Invitrogen,San Diego,CA;Novagen,Madison,Wl;Pharmacia,Piscataway,NJ的目录)。
可以制备有用的构建体,其包括在合适的调控控制下的二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列以促进增强的融合蛋白产生水平,所述水平由施加适当选择剂(如,甲氨蝶呤)后的基因扩增产生。在一个实施方案中,使用编码治疗性基因(如,IDUA)以及抗药性DHFR的双功能转座子结合在甲氨蝶呤(MTX)中的孵育来富集成功转座的B细胞,产生了更有效的产物。
通常,重组表达载体将包括复制起点和允许宿主细胞转化的可选择标志物,以及来源于高度表达的基因以指导下游结构序列转录的启动子,如上所述。与根据本公开内容的多核苷酸可操作连接的载体产生克隆或表达构建体。示例性克隆/表达重建体含有可操作地连接至本公开内容的多核苷酸的至少一种表达控制元件,如启动子。在根据本公开内容的载体和克隆/表达构建体中还考虑了另外的表达控制元件,如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。根据本公开内容的多核苷酸的异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列组装。因此,例如,本文提供的编码核酸可以包含在多种表达载体构建体(如,微环)中的任一种中,作为用于在宿主细胞中表达此类蛋白质的重组表达构建体。
适当的DNA序列可以例如通过多种程序插入载体中。通常,通过本领域已知的程序将DNA序列插入适当的限制性核酸内切酶切割位点中。考虑了用于克隆,DNA分离,扩增和纯化,用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应和各种分离技术的标准技术。多种标准技术描述于例如Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,Boston,MA,1993);Sambrook等人(Molecular Cloning,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY,1989);Maniatis等人(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY,1982);Glover(编辑)(DNA Cloning Vol.I and II,IRL Press,Oxford,UK,1985);Hames和Higgins(编辑)(Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK,1985);和其他地方。
表达载体中的DNA序列与至少一种适当的表达控制序列(如,组成型启动子或调控启动子)可操作地连接,以指导mRNA合成。此类表达控制序列的代表性实例包括如上所述的真核细胞或其病毒的启动子。启动子区可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体、卡那霉素载体或其他具有可选标志物的载体从任何期望基因中选择。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-1。适当的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员水平内,并且本文描述了包括与编码根据本公开内容的蛋白质或多肽的核酸可操作地连接的至少一个启动子或调控启动子的某些特别优选的重组表达构建体的制备。
例如,在一个实施方案中,载体可以是具有图1b所示的结构的质粒。在一个实施方案中,质粒可包含SEQ ID NO:1的序列。在一个实施方案中,质粒可由SEQ ID NO:1的序列组成。在一个实施方案中,质粒可包含与SEQ ID NO:1至少约60%相同的序列或由其组成。在一个实施方案中,质粒可包含与SEQ ID NO:1至少约85%相同或者与SEQ ID NO:1至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%相同的序列或由其组成。
还考虑了本公开内容的多核苷酸的变体。多核苷酸变体与如本文所述的限定序列的多核苷酸中的一个至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%并且优选95%、96%、97%、98%、99%或99.9%相同,或在约65-68℃0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者约42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺的严格杂交条件下与限定序列的那些多核苷酸中的一个杂交。多核苷酸变体保留了编码具有本文所述的功能性的结合结构域或其融合蛋白的能力。
术语“严格的”用于指本领域中通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂(如甲酰胺)的浓度决定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是约65-68℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、或约42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。也可以使用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂);然而,杂交速率将受到影响。在其中涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下,另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)下在6x SSC,0.05%焦磷酸钠中洗涤。
本公开内容的另一方面提供了用或以其他方式含有本公开内容的多核苷酸或载体/表达构建体中的任一种转化或转染的宿主细胞。使用本领域已知的任何方法,包括转化、转染和转导,将本公开内容的多核苷酸或克隆/表达构建体引入合适的细胞中。宿主细胞包括经历离体细胞疗法(包括离体基因疗法)的对象的细胞。当携带根据本公开内容的多核苷酸、载体或蛋白时考虑为本公开内容的一方面的真核宿主细胞除了对象自身的细胞(如,人患者自身的细胞)之外还包括VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰表达的多价结合分子的糖基化模式的修饰的CHO细胞,参见美国专利申请公布号2003/01 15614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾细胞(如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞和任何其他的本领域已知可用于表达和任选分离根据本公开内容的蛋白或肽的真核细胞。还考虑了原核细胞,包括大肠肝菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌或本领域已知的适用于表达和任选分离根据本公开内容的蛋白质或肽的任何原核细胞。在从原核细胞分离蛋白质或肽中,特别地考虑到可以使用本领域已知的用于从包涵体提取蛋白质的技术。根据本文的教导,适当的宿主的选择在本领域技术人员的范围内。考虑了糖基化本公开内容的融合蛋白的宿主细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指含有重组表达载体的细胞。应当理解,此类术语不仅旨在指特定的对象细胞,而且还指此类细胞的后代。由于突变或环境影响,某些修饰可能会在后代中发生,因此此类后代实际上可能与亲代细胞不同,但仍被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以在被修饰为适于激活启动子、选择转化子或扩增特定基因的常规营养培养基中培养。选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件如温度、pH等对本领域普通技术人员而言是显而易见的。也可以使用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman(1981)Cell 23:175描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系,以及能够表达相容载体的其他细胞系,例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子和任选的增强子,和还有任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列,以及5'侧翼非转录序列,例如如本文中关于多价结合蛋白质表达构建体制备所述。来源于SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法实现构建体引入宿主细胞中,包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染或电穿孔(Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology)。
细胞和组合物
在一个实施方案中,已经在体外激活/分化并转染本文所述的经修饰的B细胞以表达如本文所述的治疗剂。在一个实施方案中,已在体外激活/分化并工程化(如,使用靶向转基因整合方法,如锌指核酸酶、TALEN、兆核酸酶或CRISPR/CAS9介导的转基因整合)本文所述的经修饰的B细胞以表达如本文所述的治疗剂。在一个实施方案中,组合物包含已分化为血浆B细胞、已经被转染或以其他方式工程化并表达一种或多种目标蛋白质的B细胞。靶细胞群,如本公开内容的转染的或以其他方式工程化和激活的B细胞群可以单独施用,或与稀释剂和/或其他组分如细胞因子或细胞群组合作为药物组合物施用。
在一个实施方案中,在经修饰的B细胞对特定的趋化物具有最优迁移能力的时间点,体外激活/分化后,从培养物中收获已经被工程化以表达一种或多种目标蛋白质的经修饰的B细胞。在一些实施方案中,最优迁移能力可以在B细胞培养的第7天、第8天或第9天。在一些实施方案中,最优迁移能力可以在转染或工程化后B细胞培养的第5天、第6天或第7天。在一些实施方案中,最优迁移能力可以在转染或工程化后B细胞培养的第8天或者在转染或工程化后培养的第8天之后(如,第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天或晚于第20天)。在一些实施方案中,最优迁移能力可在B细胞培养的第10天之前。在一些实施方案中,最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第8天之前。在一些实施方案中,最优迁移能力可在B细胞培养的第6天或第7天。在一些实施方案中,最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第4天或第5天。在一些实施方案中,最优迁移能力可在B细胞培养的第9天之前。在一些实施方案中,最优迁移能力可在转染或工程化后B细胞培养的第7天之前。在一些实施方案中,最优迁移能力对于归巢至CXCL12的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中,最优迁移能力对于归巢至接受经修饰的B细胞的一次或多次施用的对象骨髓的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中,在培养的约第7天至约第9天,以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在转染或工程化后培养的约第5天至约第7天,以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在培养约第10天之前以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在转染或工程化后培养约第8天之前,以至CXCL12和/或对象骨髓的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,最优迁移能力对于归巢至CXCL13的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中,最优迁移能力对于归巢至接受经修饰的B细胞的一次或多次施用的对象中的炎症部位的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中,在培养的约第6天或约第7天,以至CXCL13和/或对象中的炎症部位的最优迁移能力,收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在转染或工程化后培养的约第4天或约第5天,以至CXCL13和/或对象中的炎症部位的最优迁移能力,收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在培养约第10天之前,以至CXCL13和/或炎症部位的最优迁移能力,收获B细胞以施用于对象。在一些实施方案中,在转染或工程化后培养约第8天之前,以至CXCL13和/或炎症部位的最优迁移能力收获B细胞以施用于对象。
在一些实施方案中,最优迁移能力对于归巢至CXCL12和CXCL13的经修饰的B细胞是最优的。在一些实施方案中,在B细胞培养的第7天,以对于归巢至CXCL12和CXCL13的最优迁移能力收获B细胞。在一些实施方案中,在转染或工程化后B细胞培养的第5天,以归巢至CXCL12和CXCL13的最优迁移能力收获B细胞。
在一些实施方案中,当至少约20%的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物时收获经工程化的B细胞。例如但不受实例限制,当至少约20%的B细胞在趋化性测定中迁移至CXCL12时可收获经工程化的B细胞(如,产生IDUA的B细胞)。或者,在另一个非限制性实例中,当至少约20%的B细胞在趋化性测定中迁移至CXCL13时,可收获经工程化的B细胞(如,产生IDUA的B细胞)。此外,当至少约30%的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物(如,CXCL12或CXCL13)时,或当至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%或至少约70%的B细胞在趋化性测定中迁移至特定趋化物(如,CXCL12或CXCL13)时,可收获经工程化的B细胞(如,产生IDUA的B细胞)。此外,当大于70%的B细胞在趋化性测定中迁移时,可收获经工程化的B细胞(如产生IDUA的B细胞)。此类趋化性测定是本领域中已知的并且在本文中描述(参见,如本文的实施例6)。
简而言之,本公开内容的细胞组合物可包含与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的已被转染并表达如本文所述的治疗剂的分化并激活的B细胞群。这类组合物可包含缓冲液,如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、乳酸林格氏液等;碳水化合物,如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露糖醇;蛋白质;多肽或氨基酸如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂,如EDTA或谷胱甘肽;佐剂(如氢氧化铝);和防腐剂。本公开内容的组合物优选被配制为静脉内施用或皮下施用。
在一个实施方案中,在施用之前评估细胞组合物的纯度。在另一个实施方案中,测试细胞组合物的治疗剂产生的稳健性。在一个实施方案中,测试细胞组合物的无菌性。在另一个实施方案中,筛选细胞组合物以确认其匹配接受者对象。
在一个实施方案中,在施用至对象之前,评估了经工程化的B细胞群的多克隆性。确保最终细胞产物的多克隆性是重要的安全参数。具体而言,优势克隆的出现被认为可能导致体内肿瘤发生或自身免疫性疾病。可以通过本领域已知的或本文描述的任何手段来评估多克隆性。例如,在一些实施方案中,通过对经工程化的B细胞群中表达的B细胞受体进行测序(如,通过深度测序)来评估多克隆性。由于B细胞受体在B细胞发育过程中经历了变化,从而使其在B细胞之间是独特的,因此该方法允许量化有多少细胞共有相同的B细胞受体序列(意味着它们是克隆的)。因此,在一些实施方案中,在经工程化的B细胞群中表达相同B细胞受体序列的B细胞越多,该群体的克隆就越多,因此将该群体施用于对象的安全性就越低。相反,在一些实施方案中,在经工程化的B细胞群中表达相同B细胞受体序列的B细胞越少,该群体的克隆就越少(即更多多克隆的),因此将该群体施用于对象的安全性就越高。
在一些实施方案中,在已确定经工程化的B细胞具有足够的多克隆后,将其施用于对象。例如,在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.2%以上之后,可将经工程化的B细胞施用于对象。在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.1%以上或者总B细胞群的约0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%或约0.04%以上之后,可将经工程化的B细胞施用于对象。在特定的实施方案中,在确定在最终群体中没有特定的B细胞克隆占总B细胞群的约0.03%以上之后,可将经工程化的B细胞(如,其产生IDUA)施用于对象。
在一个实施方案中,在4℃下储存和/或运输细胞组合物。在另一个实施方案中,将细胞组合物冷冻以用于储存和/或运输。可以将细胞组合物冷冻在如-20℃或-80℃。在一个实施方案中,冷冻细胞组合物的步骤包括液氮。在一个实施方案中,使用控制速率的冷冻机冷冻细胞组合物。因此,本文所述的方法还可包括解冻步骤。
使用方法
本发明的一方面涉及治疗剂的长期体内递送。在特定的实施方案中,经修饰的B细胞用于治疗和/或预防慢性疾病和病症的方法中。
本文所述的经修饰的B细胞可以以适合于待治疗或预防的疾病或病症的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量,但施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度的因素决定。
在一个实施方案中,向对象施用单个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中,向对象依序施用两个或更多个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中,向对象依序施用三个剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中,以每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次、每半年(semiannually)一次、每年一次或每两年(biannually)一次向对象施用一定剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中,当由经修饰的B细胞产生的治疗剂的量减少时,向对象施用第二剂量或随后剂量的经修饰的B细胞。
在一个实施方案中,以一定的频率(如,每周、每两周、每月、每两月或每季度)向对象施用一定剂量的经修饰的B细胞,直至在对象中检测到期望量(如有效量)的治疗剂。在一个实施方案中,在对象中监测治疗剂的量。在一个实施方案中,当由经修饰的B细胞产生的治疗剂的量减少到期望量以下时,向对象施用随后剂量的经修饰的B细胞。在一个实施方案中,期望量是产生期望效果的范围。例如,在用于减少患有MPS I的个体中的糖胺聚糖(GAG)的量的方法中,期望的IDUA的量是与在没有IDUA的情况下GAG的水平相比使某些组织中的GAG的水平降低的量。
当指示“有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抑制肿瘤的有效量”或“治疗量”时,可以由医生考虑患者(对象)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度及状况的个体差异确定待施用的本公开内容的组合物的精确量。B细胞组合物也可以以适当剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见,如,Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。也可以在测量生物样品(如,体液或组织样品)中的治疗剂(如,目标基因或蛋白质)的水平之后调整治疗,测量生物样品(如,体液或组织样品)中的治疗剂(如,目标基因或蛋白质)的水平也可以用于评估治疗功效,并且可以相应地进行调整以增加或减少治疗。通常,在相关的过继免疫疗法研究中,将抗原特异性T细胞大约以2x109至2x 1011个细胞施用于患者。(参见,如,美国专利第5,057,423号)。
在本公开内容的一些方面,用于多剂量方案的经修饰的B细胞的最优剂量可通过以下来确定:首先确定对象的B细胞的最优单剂量浓度,减少最优单剂量浓度中存在的B细胞的数量以提供经修饰的B细胞的次优单剂量浓度,以及向对象施用两个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。在一些方面,向对象施用2个、3个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。在一些方面,向对象施用2个、3个或更多个剂量的次优单剂量浓度的经修饰的B细胞导致体内协同产生经修饰的B细胞经工程化以表达的治疗性多肽。在一些方面,次优单剂量浓度为最优单剂量浓度的1/2或3、4、5、6、7、8、9、10倍,或小于最优单剂量浓度。在一些方面,治疗性多肽是IDUA。在一些方面,治疗性多肽是人凝血因子X(FIX)。在一些方面,治疗性多肽是人卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)。在一些方面,治疗性多肽是人脂蛋白脂肪酶(LPL)。
在本公开内容的一些方面,可以施用较低数量的在106/千克范围内(每位患者106-1011)的本公开的转染的B细胞。在某些实施方案中,将B细胞以1x 104、5x 104、1x 105、5x105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、5x 108、5x 109、1x 1010、5x 1010、1x 1011、5x1011或1x 1012个细胞施用于对象。B细胞组合物可以以在这些范围内的剂量多次施用。所述细胞可以是正在接受治疗的患者的自体的或异源的(如,同种异体的)。如果需要的话,治疗还可以包括施用丝裂原(如PHA)或本文所述的淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(如GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-13、IL-21、Flt3-L、RANTES、MIP1α、BAFF等)以增强免疫应答的诱导和输注的B细胞的植入。
可以以任何方便的方式(包括通过气雾剂吸入、注射、摄食、输注、植入或移植)来进行主题组合物的施用。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、鞘内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。本文所述的组合物可以直接施用于患者进入神经系统。在一个实施方案中,将本公开内容的B细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在另一个实施方案中,如本文所述的B细胞组合物优选通过i.v.注射施用。可将B细胞的组合物直接注入肿瘤、淋巴结、骨髓或感染部位。
在又一个实施方案中,可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方案中,可以使用泵(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533;Sefton 1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald等人,1980;Surgery 88:507;Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中,可以使用聚合物材料(参见MedicalApplications of Controlled Release,1974,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,BocaRaton,Fla.;Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,1984,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York;Ranger and Peppas,1983;J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;还参见Levy等人,1985,Science 228:190;During等人,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施方案中,可将控释系统置于治疗性靶标附近,因此仅需要全身剂量的一部分(参见,如,Medical Applications of Controlled Release,1984,Langer和Wise(编辑),CRCPres.,Boca Raton,Fla.,第2卷,pp.115-138)。
也可以使用任意数量的基质施用本公开内容的B细胞组合物。在组织工程的背景下,已经使用了基质许多年(参见,如,Principles of Tissue Engineering(Lanza,Langer和Chick(编辑)),1997。本公开内容在用作人造淋巴器官支持和维持B细胞的新背景下利用此类基质。因此,本公开内容可以利用已证明在组织工程中具有实用性的那些基质组合物和制剂。因此,可以用于本公开内容的组合物、装置和方法中的基质类型几乎是不受限的,并且可包括生物基质和合成基质。在一个特定的实例中,利用美国专利第5,980,889号;第5,913,998号;第5,902,745号;第5,843,069号;第5,787,900号;或第5,626,561号所示的组合物和装置。基质包含通常与当施用于哺乳动物宿主时具有生物相容性相关的特征。基质可以由天然和/或合成的材料形成。在需要将永久性结构或可移除结构留在动物体内的情况下,基质是不可生物降解的,如植入物;或可生物降解的。基质可以采取海绵、植入物、管、telfa垫、纤维、中空纤维、冻干组分、凝胶、粉末、多孔组合物或纳米颗粒的形式。此外,可以设计基质以允许接种细胞或产生的细胞因子或其他活性剂持续释放。在某些实施方案中,本公开内容的基质是柔性且有弹性的,并且可以被描述为可以渗透物质如无机盐、水性流体和包括氧气在内的溶解气态物质的半固体支架。
本文使用基质作为生物相容性物质的实例。然而,目前的公开内容不限于基质,因此,无论术语基质(matrice)或基质(matrices)出现在何处,这些术语均应被理解为包括这样的装置和其他物质,其允许细胞滞留或细胞穿越,具有生物相容性并且能够允许大分子直接穿越通过物质,使得该物质本身是半透膜,或与特定的半渗透物质结合使用。
在本公开内容的某些实施方案中,与许多相关治疗形式结合(如之前、同时或之后)来向患者施用使用本文所述的方法或本领域已知的其他方法转染和激活的B细胞,所述治疗形式包括但不限于用药剂如抗病毒剂的治疗,化疗,放射,免疫抑制剂如环孢菌素、bisulfin、硼替佐米、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506,抗体,或其他免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH,抗CD3抗体或其他抗体疗法,细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)、蛋白酶体(硼替佐米),或抑制对于生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell 66:807-815,1991;Henderson等人,Immun.73:316-321,1991;Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993;Isoniemi(同上))。在进一步的实施方案中,本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂如氟达拉滨、体外放射线疗法(XRT)、环磷酰胺或者抗体如OKT3或CAMPATH进行T细胞消融疗法(T cell ablative therapy)结合(如之前、同时或之后)施用于患者。在一个实施方案中,在B细胞消融疗法如与CD20反应的药剂如之后施用本公开内容的细胞组合物。在一个实施方案中,在使用药剂如硼替佐米进行的B细胞消融疗法之后施用本公开内容的细胞组合物。例如,在一个实施方案中,对象可经历用高剂量化疗进行的标准治疗,然后是外周血干细胞移植。在某些实施方案中,在移植后,对象接受本公开内容的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中,在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待施用于患者的上述治疗的剂量将随所治疗病况的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践来缩放供人施用的剂量。
经修饰的B细胞可用于治疗或预防各种传染病、癌症、退行性疾病和免疫学病症。
包含如本文所述的经修饰的B细胞的组合物可用于治疗由传染性有机体(如病毒、细菌、寄生虫和真菌)引起的多种传染病中的任一种。传染性有机体可包括病毒(如RNA病毒、DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、寄生虫(如原生动物和后生动物病原体如疟原虫物种、利什曼原虫物种、血吸虫物种、锥虫物种)、细菌(如分枝杆菌,特别是结核分枝杆菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌)、真菌(如念珠菌物种、曲霉物种)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)和朊病毒(已知的朊病毒感染动物会导致瘙痒病,这是绵羊和山羊神经系统的一种可传播的退行性疾病,以及牛海绵状脑病(BSE)或“疯牛病”和猫海绵状脑病。已知影响人的四种朊病毒疾病是(1)库鲁病,(2)克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD),(3)Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS),以及(4)致命性家族性失眠(FFI))。如本文所用,“朊病毒”包括导致使用的任何动物(尤其是人和家养农场动物)中这些疾病或其他疾病中的所有或任一种的所有形式的朊病毒。说明性传染病包括但不限于弓形虫病、组织胞浆菌病、CMV、EBV、球孢子菌病、结核病、HIV等。
在某些实施方案中,如本文所述的经修饰的B细胞组合物还可用于预防或治疗多种癌症。在这方面,在某些实施方案中,包含转染的B细胞的组合物可用于预防或治疗黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、胶质瘤、胸腺瘤、乳房癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、食道癌、多发性骨髓瘤、肝细胞瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或其他癌症。
在一个实施方案中,经修饰的B细胞还可用于治疗免疫病症如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、无丙种球蛋白血症、低丙球蛋白血症、其他免疫缺陷、免疫抑制和严重联合免疫缺陷病(SCID)。
在一个实施方案中,如本文所述的经修饰的B细胞也可用于治疗自身免疫性疾病,如但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病、艾迪生氏病(Addison'sdisease)、乳糜泻、慢性疲劳综合征、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、纤维肌痛、全身性红斑狼疮、银屑病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s Syndrome)、甲状腺机能亢进/格雷夫斯病(Graves disease)、甲状腺功能减退/桥本氏病(Hashimoto'sdisease)、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、重症肌无力、子宫内膜异位、硬皮病、恶性贫血、古德帕斯丘综合征(Goodpasture syndrome)、韦格纳氏病(Wegener's disease)、肾小球性肾炎、再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫溶血性贫血、埃文斯综合征(Evan's syndrome)、因子VIII抑制剂综合征、全身性血管炎、皮肌炎、多肌炎和风湿热。因此,在一个实施方案中,本文所述的方法包括用于治疗疾病的方法,其包括向有需要的对象或患者施用治疗有效量的包含如本文所述的经修饰的B细胞的组合物,从而治疗该疾病。
在一个实施方案中,如本文所述的经修饰的B细胞也可用于治疗酶缺乏性疾病和病症,如但不限于、MPS I、MPS II、MPS III、MP IV、MPS V、MPS VI、MPS VII、溶酶体贮积症、尼曼匹克病(A型、B型和C型)、高歇氏病(Guacher’s disease,I型、II型和III型)、戴-萨克斯病(Tay-Sachs disease)和庞贝病症(Pompe disorder)。
一个实施方案提供了用于治疗个体中的MPS I的方法,该方法包括向患有或怀疑患有MPS I的对象施用经遗传修饰以表达IDUA的B细胞(IDUA+B细胞)。在一个实施方案中,向对象施用单个最大有效剂量的IDUA+B细胞。在另一个实施方案中,向对象施用两个或更多个剂量的IDUA+B细胞,从而使植入的IDUA+B细胞的量最大化。在一些实施方案中,向对象施用的两个或更多个剂量的IDUA+B细胞比单个最大有效剂量的IDUA+B细胞包含更少的IDUA+B细胞。在一些实施方案中,当以低于IDUA+B细胞的最大有效单剂量的IDUA+B细胞剂量向对象施用两个或更多个剂量的IDUA+B细胞时,所得的IDUA产生的协同增加发生。在一个实施方案中,向对象施用IDUA+B细胞导致在健康对照对象中所见的正常的IDUA水平。在一个实施方案中,向对象施用IDUA+B细胞导致对象中的IDUA高于正常水平。在一个实施方案中,向对象施用IDUA+B细胞将对象中的GAG水平降低至正常水平。在一个实施方案中,向对象施用IDUA+B细胞将对象中的GAG水平降低至低于对象中正常的GAG水平。
实施例
实施例1
表达IDUA的B细胞的产生
产生用于转座和表达人IDUA的睡美人转座子和转座酶构建体。经组装以在B细胞中实现IDUA基因整合和表达的转座子显示于图1中。我们使用了由来自人免疫球蛋白基因的启动子和增强子元件组成的EEK启动子以及先前所述的其他调控元件来实现B细胞中的高水平表达。为了测试IDUA的转座和表达,从两个单独的供体中分离人B细胞,并对其进行了培养扩增,在第2天用pKT2/EEK-IDUA加pCMV-SB100x进行电穿孔。电穿孔后第8天制备的细胞裂解物含有约60nmol/hr/mg IDUA活性,为野生型细胞中存在的IDUA水平的约50倍,证明了SB转座子系统在扩增的人B细胞中实现高水平IDUA表达的有效性(图2)。
为了富集表达IDUA的细胞,我们还生成了编码人IDUA以及人二氢叶酸还原酶的双功能转座子(pKT2/EEK-IDUA-DHFR,图1),其经合成以编码对叶酸拮抗剂甲氨蝶呤(MTX:(McIvor RS.1996.Bone Marrow Transplantation 18:S50-54.))有抗性的新型变体酶(L22Y,F31S)。该构建体的质粒图谱显示于图1B中,并且其序列提供为SEQ ID NO:1。
我们还建立了一种使用可商购获得的抗人IDUA抗体以通过透化和细胞内染色,然后通过流式细胞术来鉴定表达高水平的IDUA的细胞的技术。我们使用类似于pKT2/EEK-IDUA-DHFR的GFP-DHFR转座子,通过在细胞扩增的第2天至第4天在几种不同浓度的MTX下孵育,首先建立了转座的B细胞的选择性生长的条件。我们发现200nM为表达GFP报告转基因的B细胞的选择性生长提供了最有效的条件(表1)。然后,我们将这些条件应用于pKT2/EEK-IDUA-DHFR+pCMV-SB100x电穿孔细胞的扩增,在第7天通过细胞内染色评价IDUA+细胞%。虽然在转座的细胞群中观察到IDUA+细胞的频率为10-12%,但通过应用MTX选择,该频率增加到25%或更高(图3)。
表1.甲氨蝶呤选择条件*
[MTX],nM | 对照 | 供体1 | 供体2 |
100 | 0.01 | 8.97 | 13.50 |
200 | 25.20 | 39.00 | |
300 | 13.40 | 5.49 |
*第2至4天MTX选择后第7天的GFP阳性细胞%
使用已回交至NOD-SCID的MPS I小鼠品系开始最初的体内研究,但在输注至该品系中后一周,尚无B细胞维持的证据。如下文实施例2中所述,这个问题最终通过在产生IL-2受体γ-C敲除等位基因的NSG-MPS I小鼠中杂交来解决,但与此同时,我们在IDUA+NSG小鼠中测试了MTX-选择的IDUA+B细胞的过继转移(如图3所示)。富集自体外周血细胞的CD4+,并在第-30天和第-4天腹膜内(i.p.)输注,从而为在第0天i.p.或静脉内注射的pKT2/EEK-IDUA-DHFR转座的B细胞提供支持。我们在i.p.和i.v.施用表达IDUA的B细胞的动物中观察到了从野生型水平到野生型200倍的血浆IDUA范围(图4)。我们还观察到血浆中的人免疫球蛋白水平极高(1至4mg/mL的平均值),这是成功的人B细胞过继转移的有力证据。尽管没有在IDUA缺陷动物中进行,但来自该实验的结果仍提供了将高度有效的IDUA+B细胞群引入NSG小鼠中后可达到的人IDUA水平的实例。
实施例2
在MPS I小鼠中体内产生IDUA
为了确定所施用的经修饰的B细胞的数量与所产生的治疗剂的量之间的关系是否为线性的,将I型粘多糖贮积症(MPS I)小鼠模型与经遗传修饰以表达艾杜糖醛酸酶(IDUA)的同种异体B细胞一起使用。
将NSG(NOD-SCIDγ-C缺陷型)小鼠与NOD-SCID IDUA缺陷型小鼠杂交,以收集同一品系中的γ-C和IDUA缺陷等位基因,并产生NSG MPS I小鼠,在本文中还被称为“MPS I小鼠”。当产生足够的NSG MPS I小鼠时,在第-7天向这些动物i.p.输注3x 106个CD4+T细胞,然后在第0天i.v.输注3x 106个、1x 107个或3x 107个pKT2/EEK-IDUA转座的B细胞(通过细胞内染色约10%IDUA+)。向MPS I小鼠给予单剂量的经工程化以在CD4+记忆T细胞(或无细胞作为对照)的存在下产生IDUA(或无细胞作为对照)的B细胞,和使用先前由Hopwood JJ,等人,Clin Chim Acta.1979年3月1日;92(2):257-65(其内容通过引用整体并入本文)报道的IDUA酶测定方案测量血清中的IDUA酶活性水平直到第38天(图5)。因为小鼠缺乏B细胞长期存活所需的因子,所以也向小鼠腹膜内施用CD4+T记忆细胞以促进B细胞存活。
出乎意料的是,这些结果表明,在某些细胞剂量下,细胞数量与血清IDUA水平之间的关系不是线性的。不希望受到理论的束缚,这一发现可能是由于B细胞在体内彼此相互作用而在不同细胞浓度下产生不同的存活结果。因此,这些结果表明,存在一种这样的理想剂量,在施用最少数量的必需细胞时,其实现了足够的治疗剂产生。图5中说明了这一概念,由此与1x 107个细胞剂量相比,3x 107个细胞剂量导致血浆中IDUA活性水平增加了3倍以上。
实施例3
在MPS I小鼠中多个剂量的产生IDUA的B细胞
为了确定B细胞的剂量是否影响体内产生的治疗剂的量,向MPS I小鼠给予一系列的3个剂量的产生IDUA的B细胞。
在第0天,在CD4+记忆T细胞(或无细胞作为对照)的存在下,向MPS I小鼠给予一系列的3个剂量的经工程化以产生IDUA的1x 107个B细胞(或无细胞作为对照),和测量血清中的IDUA酶活性水平直到第56天(图6)。具体而言,在第-7天向MPS I小鼠i.p.输注3x 106个CD4+T细胞,然后在第0天i.p.或i.v.输注107个pKT2/EEK-IDUA转座的B细胞(通过细胞内染色约10%IDUA+)。在第一次注射后的第21天和第42天,通过相同的施用途径,向动物给予107个pKT2/EEK-IDUA转座的B细胞的另外输注。
使用该程序,我们发现大多数B细胞处理的动物中均达到了野生型水平的血浆IDUA(约1nmol/hr/ml),并且这需要先前施用CD4+T细胞(图6)。我们发现血浆中的人IgG范围为200μg/mL至1mg/mL,作为B细胞过继转移的证据(图7)。
这些结果表明,与通过施用在单剂量中全部经修饰的B细胞获得的相比,施用在数个剂量的过程中相同数量的经修饰的B细胞导致更高的治疗剂的最终水平。如可从图6中看出的,与在第三剂量后获得的那些水平(其出乎意料地导致IDUA的血清水平远远超过了在第一剂量后观察到的IDUA的血清水平3倍)相比,第一剂量的1x 107个B细胞后IDUA的初始水平较低。通过将图5中的1x 107个细胞/小鼠数据与图6中的数据(当每个剂量为1x 107时)进行比较,也可以观察到这种现象。然而在图5中显示静脉内施用单剂量的1x 107个细胞导致D38降低IDUA的水平,图6中清楚的是,静脉内施用3个剂量的1x107个细胞产生的IDUA的水平导致表达水平持续大幅增加且也大大超过同一时间点的1x 107个单剂量水平和3x 107个单剂量水平的3倍。出乎意料的是,这种跨多种剂量的协同作用仅在静脉内递送了经工程化的B细胞的这些小鼠组中观察到了,而在经由腹膜内注射接受经工程化的B细胞的小鼠中却没有观察到。
除了显示多剂量导致的治疗剂水平高于相同数量的细胞的单剂量所预期的水平之外,多剂量导致更高水平的治疗剂这一纯粹概念是有利的,也是出乎意料的。从机制上讲,认为分化的B细胞占据有限水平的存活生态位,并且当产生新的分化细胞时,它们替换一些旧细胞。因此,可以预期随后剂量的B细胞不会导致治疗剂的血清水平同时升高。然而,我们已经证明并非如此,并且另外的B细胞输注确实会导致所制造的治疗剂的稳态血浆水平更高。这种现象可用于在体内获得适当剂量的治疗性药物,同时使所需的细胞剂量最小化。
具体而言,可以向患者施用剂量,然后测量药物的血浆水平。如果水平低于期望水平,则可以施用另外剂量的细胞。考虑到大多数注射的生物制剂的平均半寿期,这些发现当然不适用于直接输注生物制剂。此外,使用诸如基于病毒的药物递送的其他方法不太可能获得这些结果,所述方法也可引发对载体的免疫应答,从而因此降低将来尝试施用其他量的功效/阻止将来尝试施用其他剂量。
因此,本文公开的用于递送治疗剂的方法提供了优于现有技术的方法的优点,包括能够施用多于一个剂量的经修饰的B细胞以及由此产生的剂量堆积。
实施例4
向多种组织的基于B细胞的递送直接输注治疗剂、经由病毒载体递送和造血干细胞转移均无法将治疗剂成功地递送至多种组织。为了确定经修饰的B细胞是否可用于向多种组织体内递送治疗剂,向MPS I小鼠给予一系列的3个剂量的产生IDUA的B细胞(如先前实施例所述)。
按照先前实施例中所述的方案,向MPS I小鼠给予一个给药方案,该方案包含在CD4+T细胞(或无细胞作为对照)的存在下,向MPS I小鼠给予3个剂量的经工程化以产生IDUA(或无细胞作为对照)的1x107个B细胞。在首次B细胞输注后60天,使动物安乐死,收集其组织,并在肝脏、肺、脾脏、肾脏、肠、肌肉、脑、心脏、腹腔灌洗液和骨髓中测量IDUA酶活性水平(图8)。
流式细胞术显示在输注了人T和表达IDUA的B细胞的动物的脾脏和淋巴结中的20%至35%的人CD 45+和2%至10%的CD19+细胞。通过在外周组织且甚至脑中恢复的IDUA活性,观察到大量的代谢交叉校正(图8)。
IDUA降解GAG,并且在没有IDUA的情况下,存在的GAG的量如在MPS I小鼠的组织中增加。因此,在第60天也对脑、肺、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、脾脏和肠中的糖胺聚糖(GAG)进行了测量,以确定IDUA是否在那些组织中降解了GAG(图9)。由于IDUA引起的代谢交叉校正,在还输注了CD4+T细胞的B细胞处理的动物中,组织糖胺聚糖显著减少(图9)。
这些结果表明,经由经修饰的B细胞递送IDUA允许治疗剂至组织的增强递送以及治疗剂在那些组织中的增强活性。图8显示了由产生IDUA的B细胞的输注导致的组织中的IDUA酶活性水平。图9显示了这些相同小鼠中的GAG水平。GAG是在MPS I小鼠组织中积累并被IDUA的酶促活性分解的有毒细胞产物。从两个图中可以看到,在包括肺、脾脏、肝脏、心脏和肠在内的多种组织中有效地发生了IDUA产生和GAG减少。值得注意的是,IDUA的输注被认为不能充分解决组织如心脏、脾脏和肝脏中的疾病表征。这些结果首次证明了表达IDUA的人B细胞对MPS I的代谢校正的有效性。因此,该数据支持了该酶经由经遗传修饰的B细胞的体内传递假定有增强对体内各个器官的治疗的倾向。
实施例5
基于B细胞的治疗剂递送的长期功效
为了确定基于B细胞的治疗剂递送是否导致长期的蛋白产生,我们分析了接受产生IDUA的B细胞的MPSI NSG小鼠的血浆和组织中的长期IDUA活性。
如前所述制备过表达IDUA的B细胞。在B细胞输注前一周,向NSG MPS I动物腹膜内输注3e6 CD4+记忆T细胞。然后在第0天和第30天向动物输注表达2e7 IDUA的B细胞。
我们首先分析了来自已接受产生IDUA的B细胞的MPSI NSG小鼠的血浆中的IDUA酶活性(如先前的实施例所述)。在该期间还分析了未处理的MPSI NSG小鼠作为对照。大约每2周从这些动物中采血持续6.5个月,并如前所述测定IDUA的酶促活性。
如图10所示,在接受经工程化的B细胞的小鼠中,血浆IDUA活性被强烈诱导,其中在输注后大约5周发生了峰值血浆响应,并且IDUA活性在这些动物中保持较高直至输注后6.5个月处死时。
此外,用B细胞产物的长期治疗还导致在用经工程化的B细胞输注后3个月、6个月和6.5个月分析的多种组织中IDUA的水平长期升高(图11),这表明我们在以上实施例4中观察到的IDUA组织递送增强不是仅仅短暂的,而是长期存在。
此外,首次输注B细胞后3个月、6个月和6.5个月,如实施例4所述,使动物安乐死,并测定来自组织的提取物的GAG水平,并观察到在多种组织中GAG水平长期降低(图12)。作为GAG减少的阳性对照,测定了NSG-IDUA+/-小鼠(IDUA杂合且表型正常)。作为GAG减少的阴性对照,一组MPSI NSG小鼠未接受任何细胞。
因此,这些数据表明经由经修饰的B细胞递送治疗剂允许不仅在血浆中,而且在组织如心脏、脾脏和肝脏(其通常不能用输注IDUA治疗)中延长的体内酶活性水平提高。
实施例6
经工程化的B细胞的迁移能力的优化
为了使浆细胞长期存活,通常认为前体细胞(即浆母细胞)必须具有迁移到在诸如骨髓的位置中发现的长期浆细胞存活小生境的能力。相比之下,通常认为一旦浆细胞完成分化,它们就会下调其迁移能力。因此,如果打算从输注的浆母细胞群中产生浆细胞群,则认为细胞具有稳健的迁移能力是重要的。具体而言,向CXCL12的迁移对于浆细胞前体向骨髓的迁移是重要的。另外,诸如CXCL13的趋化因子可能对迁移到炎症部位和组织如脾脏是重要的。
为了确定培养条件是否产生迁移性B细胞,并且为了确定经工程化以表达治疗性蛋白的B细胞的迁移能力是否取决于经工程化的B细胞在工程化后但在收获用于施用于对象之前培养保留的时间量,我们如前所述制备了过表达IDUA的B细胞并在分析其迁移能力之前,我们将经工程化的B细胞维持培养4天至9天。
使用其中各室连接(如板)的两腔培养容器进行测定。将经工程化的B细胞接种在一个室中,并且另一个室装载有100ng/mL CXCL12(将B细胞吸到骨髓中的趋化物)或CXCL13(将B细胞吸到炎症部位以及组织如脾脏的趋化物)。允许B细胞迁移3小时后,从第二孔收集B细胞并计数。在每次测定中,使用阴性对照,其中没有向第二室添加趋化物(CXCL12或CXCL13)。图13D中呈现了有关CXCL12的测定示意图。对于CXCL13,使用相同的测定。
测试组是B细胞,其暴露于我们先前已经显示极大增强了经工程化的B细胞的迁移能力的培养系统中(参见PCT/US2015/066908,其通过引用整体并入本文)。该培养系统可用于本文所述的所有实验(除非另有说明),包括CD40L(针对多聚化标记的HIS)、CD40L交联剂(诱导CD40L多聚化的抗HIS抗体)、IL-2、IL-4、IL-10、IL-15和IL-21。在Transwell分析之前,在工程化之后,将B细胞培养相关天数。
令人惊讶的是,我们观察到在我们的培养条件下经工程化的B细胞对CXCL12具有最优的迁移潜能,在大约7-9天(在培养中或工程化后5-7天)达到峰值,并且对CXCL13具有最优的迁移潜能,在大约6-7天(在培养中或工程化后大约4-5天)达到峰值(图13A-C)。这些数据表明,在某些情况下,可能有益的是在该窗口内将经工程化的B细胞收获并将其施用于对象以确保最优的迁移潜能并诱导向靶组织的最优迁移。
实施例7
经工程化以表达IDUA的最终B细胞的克隆性评估
确保最终细胞产物的多克隆性是重要的安全参数。具体而言,优势克隆的出现被认为可能导致体内肿瘤发生或自身免疫性疾病。为了评估B细胞最终产物,将细胞如前所述(参见实施例6中呈现的培养条件)培养生长,使用实施例1中所述的方法使所述细胞工程化以表达IDUA,在培养的第7天收获并冷冻保存。提取DNA并对其进行B细胞受体的高通量深度测序。由于B细胞受体在B细胞发育过程中经历了变化,从而使其在B细胞之间具有独特性,因此该方法允许量化有多少细胞共有相同的B细胞受体序列(意味着它们是克隆的)。
深度测序的结果显示在以下图14和表2中。分析了超过248,000个模板分子,并且观察到约241,000个独特的重排,表示最大克隆性频率(即任何特定B细胞克隆的患病率)为0.03%。
表2:B细胞克隆性测序的测序概述
该实验证明最终的B细胞产物是高度多克隆的,并且没有单个克隆代表细胞群的重要部分。具体而言,来自测序的结果表明,没有单个克隆代表最终群体的0.03%以上。因此,预期最终经工程化的B细胞对于治疗性目的是足够多克隆的,并且似乎不含有任何特定的克隆。因此,预期最终的经工程化的B细胞对于治疗性目的是足够多克隆的,并且似乎不包含大量的任何特定的克隆。由于培养条件、基因组修饰和外来因素(如培养基中存在的胎牛血清)的存在可能导致克隆性的出现是合理的,因此我们认为这一结果是出乎意料的,因为没有单个克隆达到显著频率。
实施例8
经工程化的B细胞的炎性潜能
像大多数治疗剂一样,本发明具有刺激免疫系统的潜能,潜在地导致可降低或消除功效的有害副作用和/或中和抗体。关于是否可能触发这种不利的免疫反应的一个有用的预测因素是最终经工程化的B细胞产物是否产生炎性细胞因子。因此,我们测量了培养B细胞产物(根据上述实施例经工程化以产生IDUA的B细胞)的末期是否产生各种炎性细胞因子中的任一种。
如前所述(参见实施例6中呈现的培养条件),将B细胞在培养物中培养7天,使用实施例1中所述的方法工程化以表达IDUA,在培养的第7天收获并冷冻保存。在培养期间的多个时间点期间,取出培养基样品,并使用Luminex装置针对其测定一组细胞因子。具体而言,测定以下因子的存在:IL6、IFNα、IFNγ、sFAS、TNFRp75、BAFF、HGF、IL5、IL2Rα、TNFα、IL1ra、TNFRp55、VEGF、IL1α、sIL6R。由于培养基制剂含有可含这些因子的FBS,因此将不含B细胞的培养基用作阴性对照。在IL6的情况下,将重组蛋白(在一些情况下)添加到不含B细胞的培养基中,作为阳性对照。
令人惊讶的是,在大多数情况下,到B细胞培养结束时,所探询的因子要么无法检测到,要么并未高于仅培养基对照(图15A和B)。考虑到经工程化的细胞是在培养和工程化过程中经受显著刺激的免疫细胞,这一结果是出乎意料的。这一情况的例外是IL6和sFAS(图15A,左边的第一组,和图15B,左边的第一组)。发现在培养过程中增加的唯一因子是sFAS。在IL6的情况下,虽然在培养的第2天检测到升高的水平,但是到第7天,IL6的水平非常接近在仅培养基中发现的水平。
总之,这些结果说明,培养B细胞产物的末期不产生显著水平的测试的炎性细胞因子。考虑到我们为B细胞提供了许多刺激性细胞因子,因此无法预料最终产物不产生显著水平的这些细胞因子。最出乎意料的是,我们发现随着时间推移,B细胞将其IL6的产生减少到接近本底水平。这与临床实施非常相关,因为已知IL6是有效的免疫刺激信号。总之,我们认为这些结果反映出就避免大规模显著刺激免疫系统的潜力而言,预期最终的B细胞产物在体内是安全的。
实施例9
表达人LCAT或FIX的B细胞的产生
如实施例1中所述产生用于人LCAT、人LPL和人FIX的转座和表达的睡美人转座子和转座酶构建体,并且在培养的第2天通过电穿孔转染原代记忆B细胞。对于LCAT和LPL,在电穿孔后2天(培养的第4天,“D4”)和电穿孔后6天(培养的第8天,“D8”)收集培养基并进行表达分析。
使用基于荧光的LCAT酶活性测定(参见以下方法)证实了转染的B细胞中LCAT的表达。从转染的细胞中收集的培养基在D4和D8中均具有很强的LCAT活性,而在仅培养基的对照中未观察到显著的活性(图16A)。
使用基于荧光的LPL酶活性测定(参见以下方法)证实了转染的B细胞中LPL的表达。从转染的细胞中收集的培养基在D4和D8中均具有很强的LPL活性,而在仅培养基的对照中未观察到显著的活性(图16B)。
为了检测卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)和脂蛋白脂肪酶(LPL),将B细胞进行培养(参见实施例6中呈现的培养条件),并在培养的第2天(如实施例1中一样)用编码LCAT或LPL的转座子以及编码转座酶源(SB100x,参见实施例1和图1)的构建体电穿孔。在培养的第4天和第8天取培养基样品,并使用荧光酶测定法测定LCAT和LPL的存在。具体而言,使用4-甲基伞形酮棕榈酸酯底物(4-MUP),并通过测量在340、390和460nm的波长处的荧光增加来检测底物被LCAT和LPL的切割。制备含有100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)的反应缓冲液,并将其置于37℃。通过与2mg 4-MUP和16mg Triton X-100混合来稀释4-MUP。将4-MUP和反应缓冲液合并,并且将总体积150ul与2ul激活剂化合物(如丁酸对硝基苯酯)一起加入96孔板上的孔中。制备B细胞培养基的连续稀释液,然后向混合物汇总加入50ul稀释液并在37℃孵育。荧光测量在加入培养基后立即开始,并且每分钟收集一次,总持续时间为30分钟。
通过ELISA证实了转染的B细胞中FIX的表达。更具体而言,制备B细胞的细胞裂解物,并根据制造商的推荐方案,使用可商购获得的ELISA试剂盒(FIX-EIA,Enzyme ResearchLaboratories,South Bend,IN)经由ELISA对所述B细胞的细胞裂解物进行检测。电穿孔后2天收集培养基,并且培养基含有浓度为约15ng/ml的FIX蛋白,而在阴性对照细胞(转染有GPF的B细胞)中未检测到FIX蛋白(图16C)。
因此,这些数据表明,B细胞可以用于本文公开的方法中,以表达多种多肽并将其递送至对象。
可以将上述各种实施方案进行组合以提供另外的实施方案。在本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果必要,可以修改实施方案的各方面,以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。
可以根据以上详述对实施方案进行这些和其他改变。通常,在以下权利要求书中,所使用的术语不应解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求书中公开的具体实施方案,而应解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所享有的等效物的全部范围。因此,该权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110> 益缪索夫特公司(Immunosoft Corporation)
马修·瑞恩·舒尔茨(Scholz, Matthew Rein)
埃里克·J·赫比格(Herbig, Eric J.)
斯科特·R·麦基弗(McIvor, R. Scott)
里安·德拉特(De Laat, Rian)
埃里克·奥尔森(OLSON, Erik)
<120> 用于在体内递送治疗剂的B细胞及其剂量
<130> IMCO-006/01WO 312423-2025
<150> US 62/491,151
<151> 2017-04-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7322
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 实验室制备 - 质粒构建体pKT2/EEK-IDUA-DHFR
<400> 1
cctggatcca gatccctata cagttgaagt cggaagttta catacactta agttggagtc 60
attaaaactc gtttttcaac tactccacaa atttcttgtt aacaaacaat agttttggca 120
agtcagttag gacatctact ttgtgcatga cacaagtcat ttttccaaca attgtttaca 180
gacagattat ttcacttata attcactgta tcacaattcc agtgggtcag aagtttacat 240
acactaagtt gactgtgcct ttaaacagct tggaagctgc gcactaggca agttaactaa 300
ctcctctgaa tgtcagtatt tccatctgta agatgaacac agtggggctc caattccata 360
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 420
aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 480
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 540
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gccagctaga gcggccgctt 600
aatcattctt ctcatatact tcaaatttgt acttaatgcc tttctcctcc tggacatcag 660
agagaacacc tgggtattct ggcagaagtt tatatttctc caaatcaatt tctggaaaaa 720
acgtgtcact ttcaaagtct tgcatgatcc ttgtcacaaa tagtttaaga tggcctgggt 780
gattcatggc ttccttataa acagaactgc caccaactat ccagaccatg tctactttat 840
ttgctaattc tggttgttca gtaagtttta aggcatcatc tagacttctg gaaagaaaat 900
gagctccttg tggaggttcc ttgagttctc tgctgagaac taaattaatt ctacccttta 960
aaggtcgatt cttctcagga atggagaacc aggtcttctt acccataatc accagattct 1020
gtttaccttc tactgaagag gttgtggtca ttctctggaa atatctggat tcattcctga 1080
gcggtggcca gggatagtcc ccgttcttgc cgatgcccat gttctgggac acagcgacga 1140
tgcagtttag cgaaccaacc atgatggaag ctactgtaca ccaacctgtc aggagaggaa 1200
agagaagaag gttagtacaa ttgtctaggg ctgcagggtt catagtgcca cttttcctgc 1260
actgccccat ctcctgccca ccctttccca ggcatagaca gtcagtgact taccaaactc 1320
acaggaggga gaaggcagaa gcttgaatgt tcacagagac tactgcactt atatatggtt 1380
ctcccccacc ctggggaaaa aggtggagcc agtacaccac atcactttcc cagtttaccc 1440
aagccccacc ttctctaggc accagttcaa ttgcccaccc ctccccccaa cttctcaggg 1500
actgtgggcc atgtgctctc tgcccactga ggggcactca gccctcaagc atgctcttct 1560
ccactagtca cccctattga ccttatgtat gtgccaataa tgggaaaaac ccattgactc 1620
accccctatt gaccttttgt actgggcaaa acccaatgga aagtccctat tgactcagtg 1680
tacttggctc caatgggact ttcctgttga ttggcgcgcc cgggggatcc agtttggtta 1740
attaaaccgg tgagtttcat ggttacttgc ctgagaagat taaaaaaagt aatgctacct 1800
tatgagggag agtcccaggg accaagatag caactgtcat agcaaccgtc acactgcttt 1860
ggtcaaggag aagacccttt ggggaactga aaacagaacc ttgagcacat ctgttgcttt 1920
cgctcccatc ctcctccaac agggctgggt ggagcactcc acaccctttc accggtcgta 1980
cggctcagcc agagtaaaaa tcacacccat gacctggcca ctgagggctt gatcaattca 2040
ctttgaattt ggcattaaat accattaagg tatattaact gattttaaaa taagatatat 2100
tcgtgaccat gtttttaact ttcaaaaatg tagctgccag tgtgtgattt tatttcagtt 2160
gtacaaaata tctaaaccta tagcaatgtg attaataaaa acttaaacat attttccagt 2220
accttaattc tgtgatagga aaattttaat ctgagtattt taatttcata atctctaaaa 2280
tagtttaatg atttgtcatt gtgttgctgt cgtttacccc agctgatctc aaaagtgata 2340
tttaaggaga ttattttggt ctgcaacaac ttgatagggc tcagcctctc ccacccaacg 2400
ggtggaatcc cccagagggg gatttccaag aggccacctg gcagttgctg agggtcagaa 2460
gtgaagctag ccacttcctc ttaggcaggt ggccaagatt acagttgacc cgtacgtgca 2520
gctgtgccca gcctgcccca tcccctgctc atttgcatgt tcccagagca caacctcctg 2580
ccctgaagcc ttattaatag gctggtcaca ctttgtgcag gagtcagact cagtcaggac 2640
acagctctag agtcgagaat tcggccatgc gtcccctgcg cccccgcgcc gcgctgctgg 2700
cgctcctggc ctcgctcctg gccgcgcccc cggtggcccc ggccgaggcc ccgcacctgg 2760
tgcaggtgga cgcggcccgc gcgctgtggc ccctgcggcg cttctggagg agcacaggct 2820
tctgcccccc gctgccacac agccaggctg accagtacgt cctcagctgg gaccagcagc 2880
tcaacctcgc ctatgtgggc gccgtccctc accgcggcat caagcaggtc cggacccact 2940
ggctgctgga gcttgtcacc accagggggt ccactggacg gggcctgagc tacaacttca 3000
cccacctgga cgggtacctg gaccttctca gggagaacca gctcctccca gggtttgagc 3060
tgatgggcag cgcctcgggc cacttcactg actttgagga caagcagcag gtgtttgagt 3120
ggaaggactt ggtctccagc ctggccagga gatacatcgg taggtacgga ctggcgcatg 3180
tttccaagtg gaacttcgag acgtggaatg agccagacca ccacgacttt gacaacgtct 3240
ccatgaccat gcaaggcttc ctgaactact acgatgcctg ctcggagggt ctgcgcgccg 3300
ccagccccgc cctgcggctg ggaggccccg gcgactcctt ccacacccca ccgcgatccc 3360
cgctgagctg gggcctcctg cgccactgcc acgacggtac caacttcttc actggggagg 3420
cgggcgtgcg gctggactac atctccctcc acaggaaggg tgcgcgcagc tccatctcca 3480
tcctggagca ggagaaggtc gtcgcgcagc agatccggca gctcttcccc aagttcgcgg 3540
acacccccat ttacaacgac gaggcggacc cgctggtggg ctggtccctg ccacagccgt 3600
ggagggcgga cgtgacctac gcggccatgg tggtgaaggt catcgcgcag catcagaacc 3660
tgctactggc caacaccacc tccgccttcc cctacgcgct cctgagcaac gacaatgcct 3720
tcctgagcta ccacccgcac cccttcgcgc agcgcacgct caccgcgcgc ttccaggtca 3780
acaacacccg cccgccgcac gtgcagctgt tgcgcaagcc ggtgctcacg gccatggggc 3840
tgctggcgct gctggatgag gagcagctct gggccgaagt gtcgcaggcc gggaccgtcc 3900
tggacagcaa ccacacggtg ggcgtcctgg ccagcgccca ccgcccccag ggcccggccg 3960
acgcctggcg cgccgcggtg ctgatctacg cgagcgacga cacccgcgcc caccccaacc 4020
gcagcgtcgc ggtgaccctg cggctgcgcg gggtgccccc cggcccgggc ctggtctacg 4080
tcacgcgcta cctggacaac gggctctgca gccccgacgg cgagtggcgg cgcctgggcc 4140
ggcccgtctt ccccacggca gagcagttcc ggcgcatgcg cgcggctgag gacccggtgg 4200
ccgcggcgcc ccgcccctta cccgccggcg gccgcctgac cctgcgcccc gcgctgcggc 4260
tgccgtcgct tttgctggtg cacgtgtgtg cgcgccccga gaagccgccc gggcaggtca 4320
cgcggctccg cgccctgccc ctgacccaag ggcagctggt tctggtctgg tcggatgaac 4380
acgtgggctc caagtgcctg tggacatacg agatccagtt ctctcaggac ggtaaggcgt 4440
acaccccggt cagcaggaag ccatcgacct tcaacctctt tgtgttcagc ccagacacag 4500
gtgctgtctc tggctcctac cgagttcgag ccctggacta ctgggcccga ccaggcccct 4560
tctcggaccc tgtgccgtac ctggaggtcc ctgtgccaag agggccccca tccccgggca 4620
atccatgagc ctgtgctgag ccccagtggg atcctctaga gtcgagaatt cactcctcag 4680
gtgcaggctg cctatcagaa ggtggtggct ggtgtggcca atgccctggc tcacaaatac 4740
cactgagatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat 4800
ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg 4860
tgtctctcac tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt taaaacatca gaatgagtat 4920
ttggtttaga gtttggcaac atatgccata tgctggctgc catgaacaaa ggtggctata 4980
aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc 5040
cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc 5100
cctaaaattt tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc 5160
agtcatagct gtccctcttc tcttatgaag atccctcgac ctgcataccg gtcaagctag 5220
cgatatcaat taaccctcac taaagggaga ccaagttaaa caatttaaag gcaatgctac 5280
caaatactaa ttgagtgtat gtaaacttct gacccactgg gaatgtgatg aaagaaataa 5340
aagctgaaat gaatcattct ctctactatt attctgatat ttcacattct taaaataaag 5400
tggtgatcct aactgaccta agacagggaa tttttactag gattaaatgt caggaattgt 5460
gaaaaagtga gtttaaatgt atttggctaa ggtgtatgta aacttccgac ttcaactgta 5520
tagggatctg gtaccattta aatctgttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 5580
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 5640
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 5700
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 5760
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 5820
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 5880
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 5940
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 6000
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 6060
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 6120
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 6180
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 6240
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 6300
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 6360
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 6420
ctttttgcca gtgttacaac caattaacca attctgatta gaaaaactca tcgagcatca 6480
aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt 6540
tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc 6600
ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa 6660
taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa 6720
gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat 6780
cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc 6840
gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg 6900
ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg 6960
tttttccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct 7020
tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa 7080
catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc 7140
catacaagcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc 7200
catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgacgtttcc cgttgaatat 7260
ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 7320
ca 7322
Claims (150)
1.向对象施用经遗传修饰的B细胞以在体内产生治疗剂的方法,所述方法包括:
向对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰的B细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其中施用包括在次优单剂量浓度下的两个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。
3.如权利要求1所述的方法,其中施用包括三个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞是所述对象自体的。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞是所述对象同种异体的。
6.如权利要求1所述的方法,其中对象是人。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述治疗剂是蛋白质、多核苷酸或DNA编码的小分子。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述蛋白质是酶、抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞表面受体、分泌蛋白、信号传导分子、抗原片段、凝血因子或粘附分子。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38-和CD138-。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138+。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138-。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述施用包括静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射或肌内注射。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述施用包括静脉内注射。
14.如权利要求1所述的方法,其中使用睡美人转座子制备所述经遗传修饰的B细胞以在所述B细胞中表达所述治疗剂。
15.如权利要求1所述的方法,其中使用重组病毒载体制备所述经遗传修饰的B细胞以在所述B细胞中表达所述治疗剂。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述重组病毒载体编码重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒或重组腺相关病毒。
17.如权利要求1所述的方法,其中通过将编码所述治疗剂的多核苷酸序列靶向整合至所述B细胞的基因组中来制备所述经遗传修饰的B细胞。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述靶向整合包括锌指核酸酶介导的基因整合、CRISPR/CAS9介导的基因整合、TALE核酸酶介导的基因整合或兆核酸酶介导的基因整合。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述多核苷酸的靶向整合经由同源重组发生。
20.如权利要求17所述的方法,其中所述靶向整合包括病毒载体介导的核酸酶递送,所述核酸酶能够在靶DNA位点处诱导DNA切割。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述核酸酶是锌指核酸酶、CAS9核酸酶、TALE核酸酶或兆核酸酶。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞包含具有与SEQ ID NO:1相同的序列的多核苷酸。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞包含具有与SEQ ID NO:1至少约85%相同或者与SEQ ID NO:1至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%或超过99%相同的序列的多核苷酸。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞在培养后第2天或第3天进行工程化。
25.如权利要求24所述的方法,其中使用包括电穿孔的方法对所述经遗传修饰的B细胞进行工程化。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法,其中在工程化后培养的第4天、第5天、第6天或第7天收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法,其中在工程化后培养的第8天或以后收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
28.如权利要求27所述的方法,其中在工程化后培养的第10天或更早收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中收获的经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子。
30.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中在确定所述经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子的培养时间点收获所述经遗传修饰的B细胞。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法,其中在工程化前和工程化后的整个培养期内,使所述经遗传修饰的B细胞在包含IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-31和多聚化的CD40配体中的每一种的培养系统中生长。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述多聚化的CD40配体是使用抗his抗体进行多聚化的HIS标记的CD40配体。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法,其还包括在向所述对象施用之前扩增所述经遗传修饰的B细胞。
34.如权利要求33所述的方法,其中扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体显示高度的多克隆性。
35.如权利要求33所述的方法,其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.2%以下。
36.如权利要求33所述的方法,其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.05%以下。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞包含编码对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因的多核苷酸。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因含有在氨基酸22处的亮氨酸至酪氨酸和在氨基酸31处的苯丙氨酸至丝氨酸的置换突变。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法,其包括在收获用于施用之前用甲氨蝶呤处理所述经遗传修饰的B细胞。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述甲氨蝶呤处理是100nM至300nM。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述甲氨蝶呤处理是200nM。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞在施用于所述对象后迁移至多种组织。
43.如权利要求1-41中任一项所述的方法,其中向所述对象施用的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至选自以下的一种或多种组织:骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
44.如权利要求43所述的方法,其中施用于所述对象的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法,其中由所述经遗传修饰的B细胞产生的治疗剂是艾杜糖醛酸酶(IDUA)。
46.如权利要求45所述的方法,其中向所述对象施用所述经遗传修饰的B细胞导致所述对象的多种组织中的糖胺聚糖(GAG)减少。
47.如权利要求45所述的方法,其中向所述对象施用所述经遗传修饰的B细胞导致所述对象的一种或多种组织中的GAG减少,所述组织选自骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
48.如权利要求47所述的方法,其中向所述对象施用所述经遗传修饰的B细胞导致所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑中的GAG减少。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法,其中所述对象患有I型粘多糖贮积症(MPSI)。
50.如权利要求49所述的方法,其中所述经遗传修饰的B细胞的施用治疗所述对象的MPSI。
51.用于将治疗剂递送至体内多种组织的方法,其包括向对象施用两个或更多个剂量的经遗传修饰的B细胞。
52.用于治疗对象的MPS I的方法,其包括向患有MPS I的对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰以产生IDUA的B细胞。
53.用于减少患有MPSI的对象中的糖胺聚糖(GAG)的量的方法,其包括向所述对象施用两个或更多个连续剂量的经遗传修饰以产生IDUA的B细胞。
54.经修饰的B细胞,其包含pKT2/EEK-IDUA-DHFR双功能转基因。
55.用于将治疗剂递送至体内一种或多种组织的方法,其包括向对象施用一个或多个剂量的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是迁移性的。
56.如权利要求55所述的方法,其中至少约20%的所述B细胞在使用CXCL12的趋化性测定中迁移。
57.如权利要求55所述的方法,其中至少约40%、至少约45%或至少约50%的所述B细胞在使用CXCL12的趋化性测定中迁移。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法,其中至少约20%的所述B细胞在使用CXCL13的趋化性测定中迁移。
59.如权利要求55-58中任一项所述的方法,其中至少约40%、至少约45%或至少约50%的所述B细胞在使用CXCL13的趋化性测定中迁移。
60.如权利要求55所述的方法,其中至少约40%的所述B细胞在使用CXCL12的趋化性测定中迁移并且至少约40%的所述B细胞在使用CXCL13的趋化性测定中迁移。
61.如权利要求55-60中任一项所述的方法,其中所述经修饰的B细胞经遗传工程化以表达所述治疗剂。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法,其中所述经修饰的B细胞经遗传工程化以分泌所述治疗剂。
63.如权利要求55所述的方法,其中当将所述经遗传修饰的B细胞在工程化后培养小于约7天时,施用所述B细胞。
64.如权利要求55所述的方法,其中当将所述经遗传修饰的B细胞培养4-9天时,施用所述B细胞。
65.如权利要求55所述的方法,其中在将所述经遗传修饰的B细胞在工程化后培养5天、6天或7天之后施用所述B细胞。
66.如权利要求55-65中任一项所述的方法,其中所述治疗剂是IDUA。
67.如权利要求55-65中任一项所述的方法,其中所述治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
68.如权利要求55-67中任一项所述的方法,其中所述方法包括施用至少两个剂量的所述经修饰的B细胞。
69.如权利要求55-68中任一项所述的方法,其中所述施用包括静脉内注射。
70.向对象施用经遗传修饰的B细胞以使得能够在体内协同产生治疗剂的方法,其包括:确定用于诱导所述治疗剂的最佳体内产生的所述经修饰的B细胞的最优单剂量浓度;降低所述经修饰的B细胞的最优单剂量浓度以获得所述经修饰的B细胞的次优单剂量浓度;和向所述对象施用两个或更多个剂量的所述次优单剂量浓度的经修饰的B细胞。
71.如权利要求70所述的方法,其中测试所述经修饰的B细胞的多个单剂量,以便确定所述经修饰的B细胞的最优单剂量浓度。
72.如权利要求71所述的方法,其中增加单剂量浓度的经修饰的B细胞中存在的经修饰的B细胞的剂量导致所述治疗剂的产生线性增加。
73.如权利要求70所述的方法,其中测试所述经修饰的B细胞的多个次优单剂量浓度,以便找到最优剂量,其中与较低剂量相比,所得的剂量导致大于线性增加。
74.如权利要求70所述的方法,其中所述次优单剂量浓度是所述最优单剂量浓度的剂量的二分之一或三分之一。
75.如权利要求70所述的方法,其中所述次优单剂量浓度小于所述最优单剂量浓度的剂量的三分之一。
76.如权利要求70-75中任一项所述的方法,其中由向所述对象施用两个或更多个剂量的次优单剂量浓度的所述经修饰的B细胞导致的所述治疗剂的体内协同产生是由B细胞产物的静脉内注射导致的。
77.如权利要求70-76中任一项所述的方法,其中所述B细胞经工程化以表达所述治疗剂。
78.如权利要求77所述的方法,其中所述经修饰的B细胞经遗传工程化以分泌所述治疗剂。
79.如权利要求70-78中任一项所述的方法,其中所述治疗剂是IDUA。
80.如权利要求70-78中任一项所述的方法,其中所述治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
81.经遗传修饰的B细胞,其经工程化以产生治疗剂。
82.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞对于所述经遗传修饰的B细胞所施用的对象是自体的。
83.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是施用所述经遗传修饰的B细胞的对象的同种异体的。
84.如权利要求82或83所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述对象是人。
85.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述治疗剂是蛋白质、多核苷酸或DNA编码的小分子。
86.如权利要求85所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述蛋白质是酶、抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞表面受体、分泌蛋白、信号传导分子、抗原片段、凝血因子或粘附分子。
87.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述治疗剂是IDUA。
88.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
89.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38-和CD138-。
90.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138+。
91.如权利要求81所述的经遗传修饰的B细胞,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138-。
92.组合物,其包含经工程化以产生治疗剂的经遗传修饰的B细胞群,其中所述经遗传修饰的B细胞处于最优迁移能力。
93.如权利要求92所述的组合物,其中所述治疗剂是IDUA。
94.如权利要求92所述的组合物,其中所述治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
95.组合物,其包含经工程化以产生治疗剂的经遗传修饰的B细胞群,其中在不产生显著量的炎性细胞因子的时间点从培养物中收获所述组合物中的经遗传修饰的B细胞。
96.如权利要求92-95中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞对于所述经遗传修饰的B细胞所施用的对象是自体的。
97.如权利要求92-95中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞对于所述经遗传修饰的B细胞所施用的对象是同种异体的。
98.如权利要求96-97中任一项所述的组合物,其中所述对象是人。
99.如权利要求92或95所述的组合物,其中所述治疗剂是蛋白质、多核苷酸或DNA编码的小分子。
100.如权利要求99所述的组合物,其中所述蛋白质是酶、抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞表面受体、分泌蛋白、信号传导分子、抗原片段、凝血因子或粘附分子。
101.如权利要求92-100中任一项所述的组合物,其中所述治疗剂是IDUA。
102.如权利要求92-100中任一项所述的组合物,其中所述治疗剂是FIX、LPL或LCAT。
103.如权利要求92-102中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38-和CD138-。
104.如权利要求92-102中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138+。
105.如权利要求92-102中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞是CD20-、CD38+和CD138-。
106.如权利要求92-105中任一项所述的组合物,其中使用睡美人转座子来制备所述经遗传修饰的B细胞以在所述B细胞中表达所述治疗剂。
107.如权利要求92-105中任一项所述的组合物,其中使用重组病毒载体来制备所述经遗传修饰的B细胞以在所述B细胞中表达所述治疗剂。
108.如权利要求107所述的组合物,其中所述重组病毒载体编码重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒或重组腺相关病毒。
109.如权利要求92-105和106-108中任一项所述的组合物,其中通过将编码所述治疗剂的多核苷酸序列靶向整合至所述B细胞的基因组中来制备所述经遗传修饰的B细胞。
110.如权利要求109所述的组合物,其中所述靶向整合包括锌指核酸酶介导的基因整合、CRISPR/CAS9介导的基因整合、TALE核酸酶介导的基因整合或兆核酸酶介导的基因整合。
111.如权利要求110所述的组合物,其中所述多核苷酸的靶向整合经由同源重组发生。
112.如权利要求109所述的组合物,其中所述靶向整合包括病毒载体介导的核酸酶递送,所述核酸酶能够在靶DNA位点处诱导DNA切割。
113.如权利要求112所述的组合物,其中所述核酸酶是锌指核酸酶、CAS9核酸酶、TALE核酸酶或兆核酸酶。
114.如权利要求92-113中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞包含具有与SEQ ID NO:1相同的序列的多核苷酸。
115.如权利要求92-113中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞包含具有与SEQ ID NO:1至少约85%相同或者与SEQ ID NO:1至少约90%、95%、96%、97%、98%、99%或超过99%相同的序列的多核苷酸。
116.如权利要求92-115中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞在培养后第2天或第3天进行工程化。
117.如权利要求116所述的组合物,其中使用包括电穿孔的方法对所述经遗传修饰的B细胞进行工程化。
118.如权利要求92-117中任一项所述的组合物,其中在工程化后培养的第4天、第5天、第6天或第7天收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
119.如权利要求92-117中任一项所述的组合物,其中在工程化后培养的第8天或以后收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
120.如权利要求92-119中任一项所述的组合物,其中在工程化后培养的第10天或更早收获所述经遗传修饰的B细胞以施用于对象。
121.如权利要求92-120中任一项所述的组合物,其中收获的经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子。
122.如权利要求92-121中任一项所述的组合物,其中在确定所述经遗传修饰的B细胞不产生显著水平的炎性细胞因子的培养时间点收获所述经遗传修饰的B细胞。
123.如权利要求92-122中任一项所述的组合物,其中在工程化前和工程化后的整个培养期,将所述经遗传修饰的B细胞在包含IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、IL-31和多聚化的CD40配体中的每一种的培养系统中生长。
124.如权利要求123所述的组合物,其中所述多聚化的CD40配体是使用抗his抗体进行多聚化的HIS标记的CD40配体。
125.如权利要求92-124中任一项所述的组合物,其中在施用于所述对象之前扩增所述经遗传修饰的B细胞。
126.如权利要求125所述的组合物,其中扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体显示高度的多克隆性。
127.如权利要求126所述的组合物,其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.2%以下。
128.如权利要求126所述的组合物,其中所述扩增的经遗传修饰的B细胞的最终群体中的任何特定的B细胞克隆占总B细胞群的0.05%以下。
129.如权利要求92-128中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞包含编码对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因的多核苷酸。
130.如权利要求129所述的组合物,其中所述对甲氨蝶呤具有增强的抗性的人DHFR基因含有在氨基酸22处的亮氨酸至酪氨酸以及在氨基酸31处的苯丙氨酸至丝氨酸的置换突变。
131.如权利要求92-130中任一项所述的组合物,其中所述经遗传修饰的B细胞在收获以用于施用之前用甲氨蝶呤处理。
132.如权利要求131所述的组合物,其中所述甲氨蝶呤处理是100nM至300nM。
133.如权利要求132所述的组合物,其中所述甲氨蝶呤处理是200nM。
134.如权利要求92-133中任一项所述的组合物,其中所述组合物中包含的所述经遗传修饰的B细胞在施用于对象后迁移至多种组织。
135.如权利要求92-133中任一项所述的组合物,其中当将所述经遗传修饰的B细胞的组合物施用于对象时,所述组合物中包含的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至选自以下的一种或多种组织:骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
136.如权利要求135所述的组合物,其中当将所述经遗传修饰的B细胞的组合物施用于对象时,所述组合物中包含的经遗传修饰的B细胞群中的至少一种经遗传修饰的B细胞迁移至所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
137.如权利要求92-136中任一项所述的组合物,其中由所述经遗传修饰的B细胞产生的治疗剂是艾杜糖醛酸酶(IDUA)。
138.如权利要求137所述的组合物,其中将所述包含所述经遗传修饰的B细胞的组合物施用于对象导致所述对象的多种组织中的糖胺聚糖(GAG)减少。
139.如权利要求137所述的组合物,其中将所述包含所述经遗传修饰的B细胞的组合物施用于对象导致所述对象的一种或多种组织中的GAG减少,所述组织选自:骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑。
140.如权利要求137所述的方法,其中将所述包含所述经遗传修饰的B细胞的组合物施用于对象导致所述对象的骨髓、肠、肌肉、脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和脑中的GAG减少。
141.如权利要求92-140中任一项所述的组合物,其中将所述组合物施用至患有I型粘多糖贮积症(MPS I)的对象。
142.如权利要求141所述的组合物,其中所述包含所述经遗传修饰的B细胞的组合物的施用治疗所述对象的MPS I。
143.如权利要求92-136中任一项所述的组合物,其中由所述经遗传修饰的B细胞产生的所述治疗剂选自FIX、LPL和LCAT。
144.向对象施用经遗传修饰的B细胞用于在体内产生治疗剂的方法,其包括向对象施用最优的单剂量的经遗传修饰的B细胞。
145.如权利要求144所述的方法,其中所述对象是人。
146.如权利要求145所述的方法,其中所述最优的单剂量是人当量的3x 107个经修饰的B细胞/Kg。
147.如权利要求144-146中任一项所述的方法,其中所述剂量是1.5x 109个经遗传修饰的B细胞/Kg。
148.如权利要求144-147中任一项所述的方法,其中与最优剂量的三分之二或更少的剂量相比,所述最优的单剂量的经遗传修饰的B细胞导致所述治疗剂的每次输注细胞水平大于线性增加。
149.如权利要求144-148中任一项所述的方法,其中在单次B细胞输注的背景下,所述最优的单剂量的经遗传修饰的B细胞导致在每个细胞的基础上最高的体内治疗剂水平。
150.如权利要求144-149中任一项所述的方法,其中所述药剂是IDUA。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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