BR112019022473A2 - células b para liberação in vivo de agentes terapêuticos e dosagens destas - Google Patents

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Eric J. Herbig
R. Scott McIvor
Rian De Laat
Erik Olson
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Abstract

A presente invenção está relacionada aos métodos para administração de células B autólogas e/ou alogênicas geneticamente modificadas para produzir um agente terapêutico, por exemplo, uma proteína terapêutica. São especificamente revelados métodos para administração de uma dose única, maximamente eficaz, de células B geneticamente modificadas e para administração de múltiplas doses de células B geneticamente modificadas. As composições e métodos revelados nesse relatório descritivo são úteis para a liberação in vivo de longo prazo de um agente terapêutico.

Description

CÉLULAS B PARA LIBERAÇÃO IN VIVO DE AGENTES TERAPÊUTICOS E DOSAGENS DESTAS REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. Provisório Nº 62/491.151, depositado em 27 de abril de 2017, cujo pedido é incorporado por referência nesse relatório descritivo em sua totalidade.
DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] A Listagem de sequências associada a esse pedido é fornecida em formato de texto no lugar de uma cópia em papel, e é aqui incorporada por referência nesse relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de sequências é IMCO-006_01WO_ST25.txt. O arquivo de texto tem 10 KB de tamanho, foi criado em 26 de abril de 2018, e está sendo submetido eletronicamente pela EFS-Web.
FUNDAMENTOS Campo técnico
[003] A presente revelação está relacionada ao uso de células B para liberação de longo prazo in vivo de um agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo ou proteína antígeno- específica (por exemplo, uma enzima) e, em particular, à administração de dosagens únicas e múltiplas das células B. Descrição da técnica estabelecida
[004] Os métodos atuais para o tratamento de doenças e distúrbios crônicos incluem infusão direta de um agente terapêutico (por exemplo, terapia de reposição de enzimas), terapia gênica por meio de um vetor viral, e transferência adotiva de células-tronco (por exemplo, transferência de célula-tronco hematopoiética). No entanto, cada um desses métodos possui desvantagens. A injeção de uma proteína terapêutica recombinante sofre da meia-vida finita da proteína, e todos os três métodos fornecem penetração tecidual subótima pelo agente terapêutico. A alteração de tecidos endógenos para produzir um agente terapêutico, por exemplo, por meio de injeção de vírus adeno-associado recombinante (AAV) e vetores lentivirais, geralmente faz com que o agente terapêutico seja produzido por uma localização centralizada. A produção do agente terapêutico por uma localização aumenta as probabilidades para toxicidade localizada nos tecidos produtores. Adicionalmente, como vírus recombinantes são considerados como estranhos, é improvável que vetores virais possam ser administrados várias vezes sem causar uma reação adversa, o que significa que só há uma oportunidade para que uma injeção única obtenha a dosagem correta do agente terapêutico. Considerando a variação biológica inerente em um procedimento como, por exemplo, a introdução in vivo de ácidos nucleicos em células com o uso de um vírus, seria muito difícil obter uma dosagem desejada sob as limitações de uma injeção única.
[005] Recentemente, o uso de composições de células B diferenciadas para expressão in vivo de longo prazo de um transgene foi identificado como uma estratégia promissora para o tratamento de várias doenças e distúrbios. No entanto, métodos para administração de células B modificadas para liberação de agentes terapêuticos ainda não foram descritos a fim de obter níveis terapeuticamente eficazes dos agentes in vivo.
[006] Consequentemente, permanece uma necessidade na técnica pelo tratamento de longo prazo para muitas doenças e distúrbios crônicos. A presente revelação fornece métodos para administração e dosagem de composições de células B geneticamente modificadas para o tratamento de doenças e distúrbios crônicos. A presente revelação fornece essas e outras vantagens como descritas na descrição detalhada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Um aspecto da presente invenção fornece um método para administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para produção in vivo de um agente terapêutico, que compreende a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas a um indivíduo.
[008] Um aspecto da invenção fornece um método para liberação de um agente terapêutico a múltiplos tecidos in vivo, que compreende a administração de duas ou mais doses de células B geneticamente modificadas a um indivíduo.
[009] Um aspecto da invenção fornece um método para o tratamento de MPS I, que compreende a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas para produzir IDUA a um indivíduo com MPS I.
[010] Um aspecto da invenção fornece um método para a redução de uma quantidade de glicosaminoglicano (GAG) em um indivíduo com MPS I, que compreende a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas para produzir IDUA ao indivíduo.
[011] Um aspecto da invenção fornece um método para liberação de um agente terapêutico a um ou mais tecidos in vivo, que compreende a administração de uma ou mais doses de células B geneticamente modificadas a um indivíduo, em que as células B geneticamente modificadas são migratórias.
[012] Um aspecto da invenção fornece um método de administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para permitir a produção sinérgica in vivo de um agente terapêutico, que compreende: a determinação de uma concentração de dose única ótima das células B modificadas para indução da maior produção in vivo do agente terapêutico; a diminuição da concentração de dose única ótima das células B modificadas para obter uma concentração de dose única subótima das células B modificadas; e a administração de duas ou mais doses da concentração de dose única subótima das células B modificadas ao indivíduo.
[013] Um aspecto da invenção fornece uma célula B geneticamente modificada que foi modificada geneticamente para produzir um agente terapêutico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é IDUA. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
[014] Um aspecto da invenção fornece uma composição que compreende uma população de células B geneticamente modificadas que foram modificadas geneticamente para produzir um agente terapêutico, em que as células B geneticamente modificadas estão em uma capacidade migratória ótima. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é IDUA. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
[015] Um aspecto da invenção fornece uma composição que compreende uma população de células B geneticamente modificadas que foram modificadas geneticamente para produzir um agente terapêutico, em que as células B geneticamente modificadas na composição são coletadas da cultura em um ponto do tempo quando não produzem quantidades significantes de citocinas inflamatórias. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é IDUA. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
[016] Um aspecto da invenção fornece um método de administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para produção in vivo de um agente terapêutico, que compreende a administração de uma dose única ótima de células B geneticamente modificadas a um indivíduo. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é IDUA. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[017] A Figura 1 é um diagrama de construções/mapa de transposon e transposase Sleeping Beauty (SB) para transposição e expressão de IDUA humana. IDUA é regulada pelo promotor EEK (veja o Exemplo 1). Um promotor bidirecional que incorpora um promotor EF1a a montante de EEK regula a transcrição de uma diidrofolato redutase humana (DHFR) L22Y-F31S resistente a fármacos na direção oposta. Um SB100x regulado por CMV fornece atividade de transposase SB. mRNA que codifica SB100x capeado e poliadenilado foi gerado por transcrição in vitro, fornecido por TriLink. Setas: direção de transcrição. Caixas verdes com triângulos escuros são sequências de repetição invertida/repetição direta (IR/DR) T2 SB. pA, sinal de poliadenilação. A FIG. 1A mostra os designs da construção. A FIG. 1B mostra o mapa de plasmídeo para a construção pKT2/EEK-IDUA-DHFR mostrada na FIG. 1A, que compreende DHFR humana com L22Y; mutações F31S.
[018] A Figura 2 mostra a expressão de IDUA humana mediada por SB em células B humanas primárias. Células B primárias humanas CD19+ foram cultivadas por 2 dias, e depois eletroporadas com pKT2/EEK-IDUA e pCMV-SB100x como uma fonte de transposase usando o sistema Lonza 4D. Lisado de células no dia 8 pós-eletroporação foi testado para a atividade da enzima IDUA.
[019] A Figura 3 é uma série de histogramas que mostram enriquecimento seletivo de MTX de células IDUA+ durante expansão de células B em larga escala. Células B de dois doadores separados (19009 e 2764) foram eletroporadas com transposon pKT2/EEK-IDUA-DHFR, incubadas em meio com (os dois histogramas inferiores) ou sem MTX (os histogramas superiores) dos dias 2-4, e depois adicionalmente expandidas por um total de 7 dias. Células de cada população foram coletadas no dia 7 e testadas quanto ao % de células IDUA- positivas por coloração intracelular para IDUA humana, seguida por citometria de fluxo (contagem de células/IDUA).
[020] A Figura 4 mostra a expressão de iduronidase em camundongos NSG infundidos com células B transpostas com IDUA-DHFR. Camundongos NSG IDUA+ foram infundidos i.p. com células T CD4+ nos dias -30 e -4 e depois no dia 0 infundidos por meio de injeção i.p. ou i.v. com 107 células B pKT2/EEK- IDUA-DHFR que foram selecionadas em MTX. Como um controle, alguns camundongos foram infundidos por meio de injeção i.p. com células B que expressam GFP. Amostras de plasma foram testadas para IDUA nos pontos do tempo indicados. Camundongos 1 a 8 receberam infusões i.p. de células B que expressam IDUA. Camundongos 9, 10, 12 e 42 receberam infusões i.v. de células B que expressam IDUA. Camundongos 43 e 48 receberam infusões i.p. de células B que expressam GFP.
[021] A Figura 5 mostra a quantidade de iduronidase (IDUA) presente no plasma usando um modelo em camundongo de MPS I. Camundongos receberam, de cima para baixo da legenda,
3 x 106 células B transduzidas com IDUA (células B IDUA+) na presença de células T de memória CD4+, 1 x 107 células B IDUA+ na presença de células T de memória CD4+, 3 x 107 células B IDUA+ na presença de células T de memória CD4+, células T de memória CD4+ somente, ou nenhuma célula no dia 0, e os níveis de atividade da enzima IDUA foram medidos no soro até o dia 38 pós-administração.
[022] A Figura 6 mostra a quantidade de IDUA presente no plasma em um modelo em camundongo de MPS I com múltiplas doses de células B transduzidas com IDUA (células B IDUA+). Células B humanas foram enriquecidas para CD19 do produto de aferese de um doador normal e eletroporadas com transposon pKT2/EEK-IDUA mais mRNA que codifica SB100x durante o processo de expansão. Células T CD4+ foram isoladas do mesmo doador e infundidas em animais NSG MPS I por via intraperitoneal (i.p) uma semana antes da infusão de células B transpostas com IDUA. Grupos de controle incluíram camundongos NSG MPS I não tratados (“Sem Células B”), e camundongos NSG MPS I infundidos com células B IDUA+ i.v. somente (ou seja, nenhuma célula T CD4+). Os camundongos NSG MPS I pré-tratados com células T CD4+ autólogas foram subsequentemente infundidos com células B IDUA+ i.v. ou i.p. nos Dias 0, 21 e 42 (setas). Os níveis de atividade da enzima IDUA foram medidos no soro até o dia 56. N = 4.
[023] A Figura 7 mostra IgG no plasma dos mesmos camundongos NSG MPS I que são descritos na Figura 6. N = 4.
[024] A Figura 8 mostra a atividade de IDUA em vários tecidos de camundongos MPS I. camundongos MPS I receberam três dosagens de 1 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA (ou nenhuma célula como um controle) nos dias 0, 21 e 42 na presença de células T CD4+ (ou nenhuma célula como um controle), e os níveis de atividade da enzima IDUA foram medidos nos órgãos indicados no dia 60 após a primeira infusão de célula B. N = 4.
[025] A Figura 9 mostra a quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) em vários tecidos de camundongos MPS I. Camundongos MPS I receberam três dosagens de 1 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA (ou nenhuma célula como um controle) nos dias 0, 21 e 42 na presença de células T CD4+ (ou nenhuma célula como um controle) no dia 0, e os níveis de GAG foram medidos nos órgãos indicados no dia 60 após a primeira infusão de célula B. Adicionalmente, as barras horizontais vermelhas indicam a atividade média da enzima IDUA no plasma para cada um dos grupos de camundongos. N = 4.
[026] A Figura 10 mostra que a atividade de IDUA é detectável no longo prazo plasma de camundongos NSG MPS I que foram tratados com duas doses de 2 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA. A primeira dosagem de células B foi dada uma semana após administração de células T CD4+ e a segunda dosagem de células B foi administrada 30 dias após a primeira dosagem de célula B (células B IDUA+). A legenda codificada colorida à direita indica os grupos de camundongos. O eixo-X indica o tempo em semanas. O eixo-Y indica a quantidade de atividade da enzima IDUA detectada em amostras de plasma de camundongos.
[027] A Figura 11 mostra a quantidade de atividade de IDUA presente em múltiplos tecidos em camundongos NSG MPS I tratados com duas doses de 2 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA de acordo com o mesmo protocolo que na Figura 10. A legenda codificada colorida à direita indica os grupos de camundongos e pontos do tempo. O eixo-X lista o tecido que está sendo testado e o eixo-Y lista os níveis de atividade enzimática de IDUA que foram detectados.
[028] A Figura 12 mostra a quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) em vários tecidos de camundongos MPS I NSG tratados com duas doses de 2 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA de acordo com o mesmo protocolo que nas Figuras 10 e 11. O tratamento com o produto de célula B resulta em reduções de longo prazo nos níveis de GAGs em múltiplos tecidos. A legenda codificada colorida à direita indica o órgão no qual os GAGs foram avaliados. O eixo-X indica o grupo de camundongos e a dosagem de células. O eixo-Y indica a quantidade de GAGs detectada.
[029] A Figura 13 mostra a migração de células B modificadas geneticamente para expressar IDUA em direção a um quimioatraente em um ensaio Transwell de duas câmaras. A FIG. 13A mostra a migração no dia 0 de células B modificadas geneticamente em direção ao quimioatraente CXCL12. A FIG. 13B mostra a migração de células B modificadas geneticamente em direção ao quimioatraente CXCL12 após 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dias em cultura após a modificação genética. A FIG. 13C mostra a migração de células B modificadas geneticamente em direção ao quimioatraente CXCL13 após 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dias em cultura após a modificação genética. Para a FIG. 13B e para a FIG. 13C, observe que o controle sem quimiocina só foi implementado para o ponto do tempo do dia 4. A FIG. 13D mostra um diagrama esquemático do ensaio Transwell utilizado para gerar os dados nas FIGS. 13A-13C.
[030] A Figura 14 mostra dados resumidos da análise de sequenciamento profundo da clonalidade de células B modificadas geneticamente para expressar IDUA.
[031] A Figura 15 mostra análise Luminex da produção de citocina inflamatória por células B modificadas geneticamente para produzir IDUA. A FIG. 15A mostra a produção de IL6, IFN-alfa e IFN-gama no dia 2 (D2), dia 7 (D7) e dia 0 (D0) com meio de base com e sem IL6 (50 ng/ml). A FIG. 15B mostra produção de sFAS, TNFRp75, BAFF HGF, e IL5 em D2, D7, e D0 com meio de base.
[032] A Figura 16 mostra a expressão de LCAT humana (lecitina-colesterol aciltransferase), LPL humana (Lipoproteína Lipase) e FIX humano (fator de coagulação IX) em células B humanas modificadas geneticamente de acordo com a presente invenção. A FIG. 16A mostra atividade de LCAT em plasmoblastos/células plasmáticas modificadas geneticamente. A FIG. 16B mostra atividade de LPL em plasmoblastos/células plasmáticas modificadas geneticamente. A FIG. 16C mostra expressão de proteína FIX por ELISA em células B primárias modificadas geneticamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[033] A prática da presente invenção empregará, salvo indicado especificamente em contrário, métodos convencionais de biologia molecular, técnicas de DNA recombinante, expressão de proteína, e química de proteína/ peptídeo/carboidrato dentro dos conhecimentos da técnica, muitos dos quais são descritos abaixo para fins de ilustração. Essas técnicas são explicadas totalmente na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook, e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3ª Edição, 2000); “DNA
Cloning: A Practical Approach”, vol. I & II (D. Glover, ed.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., 1984); “Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications” (P. Herdewijn, ed., 2004); “Nucleic Acid Hybridization” (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); “Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications” (Buzdin e Lukyanov, eds., 2009); “Transcription and Translation” (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); “Animal Cell Culture” (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) “Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique”, ª Edição, Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” (3ª Edição 2010); Farrell, R., “RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization” (3ª Edição 2005). As publicações discutidas acima são fornecidas exclusivamente quanto à sua revelação antes da data de depósito do presente pedido. Nada nesse relatório descritivo deve ser considerado como uma admissão de que a invenção não está intitulada a antedatar essa revelação em virtude de invenção prévia.
DEFINIÇÕES E ABREVIAÇÕES
[034] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados que comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Como usados no relatório descritivo e reivindicações em anexo, salvo especificação em contrário, os termos seguintes possuem os significados indicados. Com relação a esse relatório descritivo, em qualquer momento, quando uma definição de um termo como definido nesse relatório descritivo difere de uma definição dada para aquele mesmo termo em uma referência incorporada, a definição explicitamente definida nesse relatório descritivo é a definição correta do termo.
[035] As palavras “um” e “uma” significam um ou mais, salvo quando especificamente observado.
[036] O termo “cerca de” significa uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em até 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% para uma quantidade, nível, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência. Em qualquer modalidade discutida no contexto de um valor numérico usado em conjunto com o termo “cerca de”, é contemplado especificamente que o termo “cerca de” pode ser omitido.
[037] Uma “composição” pode compreender um agente ativo e um carreador, inerte ou ativo, por exemplo, um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em modalidades particulares, as composições são estéreis, substancialmente livres de endotoxinas ou atóxicas para os receptores na dosagem ou concentração empregada.
[038] A menos que o contexto exija de outra forma, ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações, a palavra “compreender” e variações desta, por exemplo, “compreende” e “que compreende”, devem ser consideradas em um sentido aberto e inclusivo, ou seja, como “incluindo, sem limitação”.
[039] O termo “que consiste em” significa que inclui e está limitado a qualquer coisa que se segue à frase “que consiste em”. Dessa forma, a frase “que consiste em” indica que os elementos listados são necessários ou mandatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. O termo “que consiste basicamente em” significa que inclui quaisquer elementos listados após a frase, e limitado a outros elementos que não interferem com ou contribuem para a atividade ou ação especificada na revelação para os elementos listados. Dessa forma, a frase “que consiste basicamente em” indica que os elementos listados são necessários ou mandatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes, dependendo se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.
[040] Referência ao longo desse relatório descritivo à “atividade biológica” ou “bioatividade” se refere a qualquer resposta induzida em um ensaio in vitro ou em uma célula, tecido, órgão ou organismo, (por exemplo, um animal, ou um mamífero, ou um humano) como o resultado da administração de qualquer composto, agente, polipeptídeo, conjugado, composição farmacêutica contemplada nesse relatório descritivo. “Atividade biológica” pode ser referir a ações agonistas ou ações antagonistas. A atividade biológica pode ser um efeito benéfico; ou a atividade biológica pode não ser benéfica, ou seja, uma toxicidade. Em algumas modalidades, “atividade biológica” irá se referir aos efeitos positivos ou negativos que um fármaco ou composição farmacêutica possui em um ser vivo, por exemplo, um mamífero como, por exemplo, um humano. Consequentemente, o termo “biologicamente ativo” visa descrever qualquer composto que possui atividade biológica, como descrito nesse relatório descritivo. A atividade biológica pode ser avaliada por qualquer meio apropriado atualmente conhecido por aqueles habilitados na técnica. Esses ensaios podem ser qualitativos ou quantitativos. Aqueles habilitados na técnica observarão prontamente a necessidade de empregar ensaios diferentes para avaliar a atividade de polipeptídeos diferentes; uma tarefa rotineira para um pesquisador comum. Esses ensaios frequentemente são facilmente implementados em um ambiente laboratorial com poucas exigências de otimização e, mais frequentemente do que não, estão disponíveis kits comerciais que fornecem leituras simples, confiáveis e reprodutíveis da atividade biológica para uma ampla gama de polipeptídeos com o uso de várias tecnologias comuns para a maioria dos laboratórios. Quando nenhum desses kits está disponível, pesquisadores comuns podem facilmente projetar e otimizar ensaios de bioatividade customizados para polipeptídeos-alvo sem experimentação desnecessária; na medida em que isso é um aspecto rotineiro do processo científico.
[041] Referência ao termo “por exemplo” visa significar “por exemplo, sem limitação” e, dessa forma, deve ser subentendido que qualquer coisa a seguir é meramente um exemplo de uma modalidade particular, mas não deve ser considerado de forma alguma como sendo um exemplo limitante. Salvo indicação em contrário, o uso de “por exemplo” visa indicar explicitamente que outras modalidades foram contempladas e estão englobadas pela presente invenção.
[042] Referência ao longo desse relatório descritivo a “modalidade” ou “uma modalidade” ou “algumas modalidades” ou “certas modalidades” significa que um recurso, estrutura ou característica particular descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Dessa forma, a ocorrência das frases “em uma modalidade” ou “em certas modalidades” em vários locais ao longo desse relatório descritivo nem sempre necessariamente se refere à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer forma adequada em uma ou mais modalidades.
[043] Uma quantidade “aumentada” ou “intensificada” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente significante”, e pode incluir um aumento que é 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 ou mais vezes (por exemplo, 100, 500, 1.000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e pontos decimais entre e acima de 1, por exemplo, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 etc.) uma quantidade ou nível descrito nesse relatório descritivo. Similarmente, uma quantidade “diminuída” ou “reduzida” ou “menor” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente significante”, e pode incluir uma diminuição que é cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 ou mais vezes (por exemplo, 100, 500,
1.000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e pontos decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 etc.) uma quantidade ou nível descrito nesse relatório descritivo.
[044] Os termos “in vitro”, “ex vivo” e “in vivo” visam ter nesse relatório descritivo seus significados científicos normais. Consequentemente, por exemplo, o termo “in vitro” visa se referir aos experimentos ou reações que ocorrem com componentes celulares isolados, por exemplo, uma reação enzimática realizada em um tubo de ensaio com o uso de um substrato, enzima, doador e, opcionalmente, tampões/co- fatores apropriados. O termo “ex vivo” visa se referir aos experimentos ou reações realizadas com o uso de órgãos ou células funcionais que foram removidas ou propagadas independentemente de um organismo. O termo “in vivo” visa se referir aos experimentos ou reações que ocorrem dentro de um organismo vivo em seu estado intacto normal.
[045] “Mamífero” inclui humanos e tanto animais domésticos como, por exemplo, animais de laboratório e animais de estimação (por exemplo, gatos, cães, suínos, gado, carneiros, cabras, cavalos e coelhos), quanto animais não domésticos como, por exemplo, animais selvagens e semelhantes.
[046] O termo “opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento subsequentemente descrito, ou circunstâncias, pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos nos quais o referido evento ou circunstância ocorre e casos nos quais ele não ocorre.
[047] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma formulação de um composto (por exemplo, um polipeptídeo terapeuticamente útil) e um meio geralmente aceito na técnica para a liberação do composto a um animal, por exemplo, humanos. Esse meio pode incluir quaisquer carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[048] Os termos “excipientes farmaceuticamente eficazes” e “carreadores farmaceuticamente eficazes” são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e métodos para a sua preparação também são prontamente evidentes para aqueles habilitados na técnica. Essas composições, e métodos para sua preparação, podem ser encontradas, por exemplo, em
“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 19ª Edição (Mack Publishing Company, 1995, incorporado nesse relatório descritivo).
[049] Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “sequência de nucleotídeos” e “ácido nucleico” são usados de forma intercambiável. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento gênico, loci (lócus) definidos por análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode incluir componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação.
[050] O termo “indivíduo”, como usado nesse relatório descritivo, inclui qualquer animal que exibe uma doença ou sintoma, ou está em risco para exibir uma doença ou sintoma,
que pode ser tratado com um agente da invenção. Indivíduos adequados incluem animais de laboratório (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou porquinho-da-índia), animais de criação e animais domésticos ou animais de estimação (por exemplo, um gato ou cão). Primatas não humanos e, preferivelmente, pacientes humanos, estão incluídos.
[051] O termo “substancialmente” ou “basicamente” significa de quantidade, tamanho amplo ou considerável; quase totalmente ou completamente; por exemplo, 95% ou maior do que certa quantidade.
[052] O termo “agente terapêutico” se refere a qualquer composto que, quando administrado a um indivíduo (por exemplo, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano), em uma quantidade terapeuticamente eficaz, é capaz de efetuar tratamento de uma doença ou condição, como definido abaixo.
[053] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “dose terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade de um composto da invenção que, quando administrada a um indivíduo (por exemplo, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano), é suficiente para efetuar tratamento, como definido abaixo, de uma doença ou condição no animal. A quantidade de um composto da invenção que constitui uma “quantidade terapeuticamente eficaz” irá variar dependendo do composto, da condição e sua severidade, da forma de administração, e da idade do animal a ser tratado, mas pode ser determinada rotineiramente por aqueles habilitados na técnica considerando seu próprio conhecimento e essa revelação.
[054] O termo “que trata” ou “tratamento”, como usado nesse relatório descritivo, cobre o tratamento da doença ou condição de interesse em um indivíduo, preferivelmente um humano, que possui a doença ou condição de interesse, e inclui: (i) prevenção ou inibição da ocorrência da doença ou condição em um indivíduo, em particular, quando esse indivíduo está predisposto à condição, mas ainda não foi diagnosticado com ela; (ii) inibição da doença ou condição, ou seja, interrupção de seu desenvolvimento; (iii) alívio da doença ou condição, ou seja, causar a regressão da doença ou condição; ou (iv) alívio dos sintomas resultantes da doença ou condição. Como usados nesse relatório descritivo, os termos “doença”, “distúrbio” e “condição” podem ser usados de forma intercambiável ou podem ser diferentes, na medida em que a enfermidade, lesão ou condição particular pode não ter um agente causativo conhecido (de modo que a etiologia ainda não foi elucidada), e ela, portanto, ainda não foi reconhecida como uma lesão ou doença, mas somente como uma condição ou síndrome indesejável, em que um conjunto mais ou menos específico de sintomas foi identificado por médicos.
VISÃO GERAL
[055] A presente invenção utiliza células B autólogas e/ou alogênicas que foram alteradas por meio da introdução de ácidos nucleicos para produzir um agente terapêutico, e está relacionada aos métodos de administração das células B modificadas. Em algumas modalidades, os termos “célula B modificada geneticamente”, “célula B modificada por engenharia genética”, “célula B modificada” e “célula B alterada geneticamente” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir a essas células B alteradas que compreendem um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, um transgene) para produzir um agente terapêutico (por exemplo, um transgene que habilita a expressão de um polipeptídeo como, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico). Especificamente, as células B modificadas podem ser administradas como uma dosagem única ou dosagens múltiplas.
Inesperadamente, foi constatado que certas dosagens de célula B produzem níveis maiores do que os esperados de agente terapêutico em comparação com outras dosagens.
Adicionalmente, foi constatado surpreendentemente que o uso de múltiplas dosagens de células B liberadas ao longo da evolução de um regime multidoses resulta em níveis maiores de agente terapêutico do que os que são obtidos por uma dosagem única que contém o mesmo número de células.
Adicionalmente, foi constatado surpreendentemente que células B modificadas possuem janelas de capacidade migratória ótima em direção a quimioatraentes, e sua capacidade migratória pode declinar após certos períodos de tempo em cultura.
Adicionalmente, foi constatado inesperadamente que, embora a população de células B modificadas geneticamente de partida produzissem IL6, os níveis de produção declinavam até perto dos níveis de base pelo final da cultura e a maioria das citocinas inflamatórias testadas não era produzida pelas células B modificadas geneticamente.
Além disso, foi demonstrado que a população de células B modificadas geneticamente final era significantemente policlonal, na medida em que foi verificado que nenhum clone particular de células B na população final de células B modificadas geneticamente compreende mais do que cerca de 0,2% da população total de células B.
Finalmente, foi descoberto que as células B modificadas são capazes de liberar eficazmente fármaco a uma ampla gama de tecidos como, por exemplo, pulmão, coração e intestino, que são alvos difíceis usando outras modalidades.
[056] Consequentemente, os métodos para administração de composições de células B modificadas descritas nesse relatório descritivo são úteis para liberação e expressão de longo prazo in vivo de agentes terapêuticos. A presente revelação está relacionada geralmente aos métodos para obtenção de enriquecimento e número suficientes de células produtoras de um agente terapêutico e níveis suficientes do agente terapêutico in vivo assegurando, ao mesmo tempo, a segurança do produto.
[057] Como usadas nesse relatório descritivo, as frases “sobrevida in vivo de longo prazo” e “sobrevida de longo prazo” se referem à sobrevida das células B modificadas descritas nesse relatório descritivo por 10 ou mais dias pós-administração em um indivíduo. A sobrevida de longo prazo pode ser medida em dias, semanas, ou até mesmo em anos. Em uma modalidade, uma maioria das células B modificadas sobrevive in vivo por 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais dias pós-administração. Em uma modalidade, uma maioria das células B modificadas sobrevive in vivo por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 ou mais semanas pós-administração. Em outra modalidade, as células B modificadas sobrevivem in vivo por 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou mais anos. Adicionalmente, embora as células B modificadas descritas nesse relatório descritivo possam sobreviver in vivo por 10 ou mais dias, subentende-se que uma maioria das células B modificadas sobrevive in vivo por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dias pós-administração. Consequentemente, é contemplado que as células B modificadas descritas nesse relatório descritivo são úteis para tratamento de curto prazo (por exemplo, 4 dias) e tratamento de longo prazo (por exemplo, 30 ou mais dias) métodos. Células B
[058] Após deixar a medula óssea, uma célula B atua como uma célula apresentadora de antígeno (APC) e internaliza antígenos. O antígeno é recolhido pela célula B por meio de endocitose mediada por receptor e processado. O antígeno é processado em peptídeos antigênicos, carregados em moléculas MHC II, e apresentados na superfície extracelular da célula B às células T auxiliares (helper) CD4+. Essas células T se ligam à molécula MHC II/antígeno e causam a ativação da célula B. Mediante estimulação por uma célula T, a célula B ativada começa a se diferenciar em células mais especializadas. Células B do centro germinal podem se diferenciar em células B de memória ou células plasmáticas de vida longa. Além disso, a estimulação imune secundária pode resultar em que as células B de memória dêem origem a células plasmáticas adicionais. A formação de células plasmáticas a partir de células B de memória ou que não são não de memória é precedida pela formação de plasmoblastos precursores que eventualmente se diferenciam em células plasmáticas, que produzem grandes volumes de anticorpos
(veja, por exemplo, Trends Immunol. Junho de 2009; 30 (6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5: 231-242). Plasmoblastos secretam mais anticorpos do que células B, mas menos do que células plasmáticas. Eles se dividem rapidamente, e continuam a internalizar antígenos e apresentar antígenos às células T. Plasmoblastos possuem a capacidade para migrar para locais de produção de quimiocina (por exemplo, na medula óssea), onde se diferenciam em células plasmáticas de vida longa. Por fim, um plasmoblasto pode permanecer como um plasmoblasto por vários dias e depois morrer ou irrevogavelmente se diferenciar em uma célula plasmática madura, totalmente diferenciada. Especificamente, plasmoblastos que são capazes de se abrigar em tecidos que contêm nichos de sobrevida de célula plasmática (por exemplo, na medula óssea) são capazes de deslocar células plasmáticas residentes a fim de se tornarem células plasmáticas de vida longa, que podem continuar a secretar níveis elevados de proteínas por anos.
[059] As células B usadas nos métodos descritos nesse relatório descritivo incluem células B-pan, células B de memória, plasmoblastos e/ou células plasmáticas. Em uma modalidade, as células B modificadas são células B de memória. Em uma modalidade, as células B modificadas são plasmoblastos. Em uma modalidade, as células B modificadas são células plasmáticas.
[060] Células plasmáticas terminalmente diferenciadas tipicamente não expressam marcadores de célula B-pan comuns, por exemplo, CD19 e CD20, e expressam relativamente poucos antígenos de superfície. Células plasmáticas expressam CD38, CD78, CD138 e receptor de interleucina-6 (IL-6R) e não possuem expressão de CD45, e esses marcadores podem ser usados, por exemplo, por citometria de fluxo, para identificar células plasmáticas. CD27 também é um bom marcador para células plasmáticas, já que células B naïve são CD27-, células B de memória são CD27+ e células plasmáticas são CD27++. Subconjuntos de células B de memória também podem expressar IgG, IgM e IgD de superfície, enquanto células plasmáticas não expressam esses marcadores na superfície celular. CD38 e CD138 são expressos em níveis elevados em células plasmáticas (Veja “Wikipedia, The Free Encyclopedia”, “Plasma Cell”, ID da Versão da Página: 404969441; Data da última revisão: 30 de dezembro de 2010 09: 54 UTC, resgatado em 4 de janeiro de 2011; Veja também: Jourdan e cols. Blood., 10 de dezembro de 2009; 114 (25):
5.173-81; Trends Immunol., junho de 2009; 30 (6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5: 231-242; Nature Med. 2010, 16: 123- 129; Neuberger, M.S.; Honjo, T.; Alt, Frederick W. (2004). “Molecular Biology of B Cells”. Amsterdam: Elsevier, páginas 189-191; Bertil Glader; Greer, John G.; John Foerster; Rodgers, George G.; Paraskevas, Frixos (2008). “Wintrobe’s Clinical Hematology”, 2-Vol. Set. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins, páginas 347; Walport, Mark; Murphy, Kenneth; Janeway, Charles; Travers, Paul J. (2008). “Janeway’s Immunobiology. New York: Garland Science”, páginas 387-388; Rawstron AC (May 2006). “Immunophenotyping of Plasma Cells. Curr Protoc Cytom”).
[061] O termo “quiescente”, como usado nesse relatório descritivo, se refere ao estado de uma célula em que a célula não está proliferando ativamente.
[062] O termo “ativada”, como usado nesse relatório descritivo, se refere ao estado de uma célula em que a célula está proliferando e/ou produzindo citocinas ativamente em resposta a um estímulo.
[063] Os termos “diferenciar” e “diferenciadas”, como usados nesse relatório descritivo, se referem às alterações no fenótipo de uma célula de um tipo ou estado de célula para outro tipo ou estado de célula. Por exemplo, uma célula B de memória que faz a transição para uma célula plasmática é diferenciada.
[064] O termo “indivíduo” visa incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune adaptiva pode ser provocada (por exemplo, mamíferos). Exemplos de indivíduos incluem humanos, cães, gatos, camundongos, ratos, e espécies transgênicas destes. Em uma modalidade, o indivíduo é humano. Células B podem ser obtidas de inúmeras fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), medula óssea, tecido de linfonodo, cordão umbilical, tecido de um local de infecção, tecido do baço e tumores. Em uma modalidade preferida, a fonte de células B consiste em PBMCs. Em certas modalidades da presente revelação, diversas linhagens de célula B disponíveis na técnica podem ser usadas.
[065] Em certas modalidades dos métodos descritos nesse relatório descritivo, células B podem ser obtidas de uma unidade de sangue coletada de um indivíduo com o uso de diversas técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, separação FICOLLTM (copolímeros de sacarose e epicloridrina que podem ser usados para preparar soluções de alta densidade). Em uma modalidade preferida, células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aferese ou leucoferese. O produto de aferese tipicamente contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outras células sanguíneas brancas nucleadas, células sanguíneas vermelhas e plaquetas. Em uma modalidade, as células coletadas por aferese podem ser lavadas para remover a fração de plasma e para colocar as células em um tampão ou meios apropriados para etapas de processamento subsequentes. Em uma modalidade dos métodos descritos nesse relatório descritivo, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem não possui cálcio e pode não possuir magnésio ou pode não possuir muitos, se não todos, os cátions divalentes. Como aqueles habilitados na técnica observariam prontamente, uma etapa de lavagem pode ser feita por métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, por utilização de uma centrífuga de “fluxo-passante” semi-automatizada (por exemplo, o processador de células Cobe 2991) de acordo com as instruções do fabricante. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em diversos tampões biocompatíveis, por exemplo, PBS. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aferese podem ser removidos e as células ressuspensas diretamente em meios de cultura.
[066] Células B podem ser isoladas do sangue periférico ou leucoferese com o uso de metodologias conhecidas na técnica. Por exemplo, PBMCs podem ser isoladas usando FICOLLTM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e células B CD19+ purificadas por seleção negativa ou positiva com o uso de qualquer um dos diversos anticorpos conhecidos na técnica, por exemplo, o sistema de complexo tetramérico Rosette
(StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) ou a Tecnologia MACS™ MicroBead (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). Em certas modalidades, células B de memória são isoladas como descrito por Jourdan e cols., (Blood., 10 de dezembro de 2009; 114 (25): 5.173-81). Por exemplo, após remoção de células CD2+ com o uso partículas magnéticas anti-CD2, células B de memória CD19+ CD27+ podem ser separadas por FACS. Células plasmáticas da medula óssea (BMPCs) podem ser purificadas usando separação com micropartículas magnéticas anti-CD138 ou outros métodos e reagentes similares. Células B humanas podem ser isoladas, por exemplo, usando “CD19 MicroBeads, Human” (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). Células B de memória humanas podem ser isoladas, por exemplo, usando o “Memory B Cell Isolation Kit, Human” (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).
[067] Outros kits de isolamento estão disponíveis comercialmente, por exemplo, “R&D Systems’ MagCellect Human B Cell Isolation Kit” (Minneapolis, MN). Em certas modalidades, células B em repouso podem ser preparadas por sedimentação em gradientes descontínuos Percoll, como descrito em Defranco e cols., (1982) J. Exp. Med. 155: 1.523.
[068] Em uma modalidade, PBMCs são obtidas de uma amostra de sangue usando uma purificação por gradiente (por exemplo, FICOLL™). Em outra modalidade, PBMCs são obtidas por coleta por aferese. Em uma modalidade, células B são isoladas de PBMCs por isolamento de células B-pan. A etapa de isolamento pode utilizar seleção positiva e/ou negativa. Em uma modalidade, a seleção negativa compreende a depleção de células T com o uso de micropartículas conjugadas anti-CD3 fornecendo, dessa forma, uma fração depletada de células T. Em uma modalidade adicional, células B de memória são isoladas das células B-pan ou da fração depletada de células T por seleção positiva para CD27.
[069] Em uma modalidade particular, células B de memória são isoladas por depleção de células indesejadas e subsequente seleção positiva com “CD27 MicroBeads”. Células indesejadas, por exemplo, células T, células NK, monócitos, células dendríticas, granulócitos, plaquetas e células eritróides, podem ser depletadas usando um coquetel de anticorpos biotinilados contra CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 e CD235a (glicoforina A) e “Anti-Biotin MicroBeads”.
[070] Em uma modalidade, são obtidas células B de memória switched. O termo “célula B de memória switched” ou “célula B switched”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma célula B que passou por mudança de classe de isótipo. Em uma modalidade, células B de memória switched são selecionadas positivamente para IgG. Em outra modalidade, células B de memória switched são obtidas por depleção de células que expressam IgD e IgM. Células B de memória switched podem ser isoladas, por exemplo, usando o “Switched Memory B Cell Kit, Human” (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).
[071] Por exemplo, em uma modalidade particular, células não-alvo podem ser marcadas com um coquetel de anticorpos biotinilados contra CD2, CD14, CD16, CD36, CD43, CD235a (glicoforina A), anti-IgM e anti-IgD. Essas células podem ser subsequentemente marcadas magneticamente com “Anti- Biotin MicroBeads”. Células B de memória switched altamente puras podem ser obtidas por depleção das células marcadas magneticamente.
[072] Em uma modalidade adicional, a sequência promotora de um gene único para células B de memória, por exemplo, o gene CD27 (ou outro gene específico para células B de memória e não expresso em células B naïve) é usado para dirigir a expressão de um marcador selecionável como, por exemplo, diidrofolato redutase mutada, o que permite a seleção positiva das células B de memória na presença de metotrexato. Em outra modalidade, a sequência promotora de um gene de célula B-pan como, por exemplo, o gene CD19, é usado para dirigir a expressão de um marcador selecionável como, por exemplo, diidrofolato redutase mutada, o que permite a seleção positiva das células B de memória na presença de metotrexato. Em outra modalidade, células T são depletadas usando CD3 ou por adição de ciclosporina. Em outra modalidade, células CD138+ são isoladas das células B-pan por seleção positiva. Ainda em outra modalidade, células CD138+ são isoladas de PBMCs por seleção positiva. Em outra modalidade, células CD38+ são isoladas das células B-pan por seleção positiva. Ainda em outra modalidade, células CD38+ são isoladas de PBMCs por seleção positiva. Em uma modalidade, células CD27+ são isoladas de PBMCs por seleção positiva. Em outra modalidade, células B de memória e/ou células plasmáticas são expandidas seletivamente a partir de PBMCs usando métodos de cultura in vitro disponíveis na técnica. Cultivo de células B in vitro
[073] Células B, por exemplo, células B de memória, podem ser cultivadas usando métodos in vitro para ativar e diferenciar as células B em células plasmáticas ou plasmoblastos ou ambos. Como seria reconhecido por aqueles habilitados na técnica, células plasmáticas podem ser identificadas por padrões de expressão de proteína na superfície celular usando métodos padronizados de citometria de fluxo. Por exemplo, células plasmáticas terminalmente diferenciadas expressam relativamente poucos antígenos de superfície, e não expressam marcadores de célula B-pan comuns, por exemplo, CD19 e CD20. Ao invés disso, células plasmáticas podem ser identificadas por expressão de CD38, CD78, CD138 e IL-6R e ausência de expressão de CD45. CD27 também pode ser usado para identificar células plasmáticas, já que células B naïve são CD27-, células B de memória são CD27+ e células plasmáticas são CD27++. Células plasmáticas expressam níveis elevados de CD38 e CD138.
[074] Em uma modalidade, as células B são células B de memória CD138-. Em uma modalidade, as células B são células plasmáticas CD138+. Em uma modalidade, as células B são ativadas e possuem um fenótipo na superfície celular de CD138-, CD27+.
[075] Em uma modalidade, as células B são células B de memória CD20-, CD138-. Em uma modalidade, as células B são células plasmáticas CD20-, CD138+. Em uma modalidade, as células B são ativadas e possuem um fenótipo na superfície celular de CD20-, CD138-, CD27+.
[076] Em uma modalidade, as células B são células B de memória CD20-, CD38-, CD138-. Em uma modalidade, as células B são células plasmáticas CD20-, CD38+, CD138+. Em uma modalidade, as células B são ativadas e possuem um fenótipo na superfície celular de CD20- CD38- CD138- CD27+.
[077] Em uma modalidade, as células B são colocadas em contato com um ou mais fatores de ativação de célula B, por exemplo, qualquer um de diversas citocinas, fatores de crescimento ou linhagens de células que sabidamente ativam e/ou diferenciam células B (veja, por exemplo, Fluckiger, e cols. Blood 1998 92: 4.509-4.520; Luo, e cols., Blood 2009 1 13: 1.422-1.431). Esses fatores podem ser selecionados do grupo que consiste, sem limitação, em IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1 1, IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL- 30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, e IL-35, IFN-γ, IFN-α, IFN- β, IFN-δ, quimiocinas tipo C XCL1 e XCL2, quimiocinas tipo C-C (incluindo até hoje CCL1 -CCL28) e quimiocinas tipo CXC (incluindo até hoje CXCL1 -CXCL17), e membros da superfamília TNF (por exemplo, TNF-α, ligante 4-1 BB, fator de ativação de célula B (BLyS), ligante FAS, sCD40L (incluindo versões multiméricas de sCD40L; por exemplo, CD40L recombinante solúvel com etiqueta de histidina em combinação com mAb anti- poli-histidina para agrupar múltiplas moléculas de sCD40L juntas), Linfotoxina, OX40L, RANKL, TRAIL), CpG, e outros agonistas do receptor toll like (por exemplo, CpG).
[078] Fatores de ativação de célula B podem ser adicionados às culturas de células in vitro em várias concentrações para obter o resultado final desejado (por exemplo, expansão ou diferenciação). Em uma modalidade, um fator de ativação de célula B é utilizado na expansão das células B em cultura. Em uma modalidade, um fator de ativação de célula B é utilizado na diferenciação das células B em cultura. Em outra modalidade, o fator de ativação de célula B é utilizado tanto na expansão quanto na diferenciação das células B em cultura. Em uma modalidade, o fator de ativação de célula B é fornecido na mesma concentração para expansão e diferenciação. Em outra modalidade, o fator de ativação de célula B é fornecido em uma primeira concentração para expansão e em uma segunda concentração para diferenciação. É contemplado que um fator de ativação de célula B pode ser 1) utilizado na expansão das células B e não na diferenciação das células B, 2) utilizado na diferenciação das células B e não na expansão das células B, ou 3) utilizado na expansão e diferenciação das células B.
[079] Por exemplo, células B são cultivadas com um ou mais fatores de ativação de célula B selecionados de CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10 para expansão das células B. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 0,25-5,0 µg/ml de CD40L. Em uma modalidade, a concentração de CD40L é de 0,5 µg/ml. Em uma modalidade, um agente de reticulação (por exemplo, um anticorpo anti-HIS em combinação com CD40L com etiqueta de HIS) é usado para criar multímeros de CD40L. Em uma modalidade, moléculas de CD40L são ligadas covalentemente ou são mantidas juntas com o uso de domínios de multimerização de proteína (por exemplo, a região Fc de uma IgG ou um domínio de zíper de leucina). Em uma modalidade, CD40L é conjugado a partículas. Em uma modalidade CD40L é expresso por células alimentadoras. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1-10 ng/ml de IL-2. Em uma modalidade, a concentração de IL-2 é de 5 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1-10 ng/ml de IL-4. Em uma modalidade, a concentração de IL-4 é de 2 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 10-100 ng/ml de IL-10. Em uma modalidade, a concentração de IL-10 é de 40 ng/ml.
[080] Em uma modalidade, células B são cultivadas com um ou mais fatores de ativação de célula B selecionados de
CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 para expansão das células B. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 0,25-5,0 µg/ml de CD40L. Em uma modalidade, a concentração de CD40L é de 0,5 µg/ml. Em uma modalidade, um agente de reticulação (por exemplo, um anticorpo anti-HIS em combinação com CD40L com etiqueta de HIS) é usado para criar multímeros de CD40L. Em uma modalidade, moléculas de CD40L são ligadas covalentemente ou são mantidas juntas com o uso de domínios de multimerização de proteína (por exemplo, a região Fc de uma IgG ou um domínio de zíper de leucina). Em uma modalidade, CD40L é conjugado a partículas. Em uma modalidade CD40L é expresso por células alimentadoras. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1-10 ng/ml de IL-2. Em uma modalidade, a concentração de IL-2 é de 5 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1- 10 ng/ml de IL-4. Em uma modalidade, a concentração de IL-4 é de 2 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 10-100 ng/ml de IL-10. Em uma modalidade, a concentração de IL-10 é de 40 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 50-150 ng/ml de IL-15. Em uma modalidade, a concentração de IL-15 é de 100 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 50-150 ng/ml de IL-21. Em uma modalidade, a concentração de IL-21 é de 100 ng/ml. Em uma modalidade particular, as células B são cultivadas com CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 para expansão das células B.
[081] Por exemplo, em uma modalidade, células B são cultivadas com os fatores de ativação de célula B CD40L, IL- 2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 para expansão das células B, em que o CD40L está reticulado com um agente de reticulação para criar multímeros de CD40L. Um sistema de cultura desse tipo pode ser mantido ao longo de todo o período de cultura (por exemplo, um período de cultura de 7 dias), em que as células B são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente para expressar um transgene de interesse (por exemplo, um polipeptídeo exógeno como, por exemplo, IDUA). O transgene pode ser integrado na célula B (por exemplo, por meio de um vetor viral ou não viral). O transgene pode ser expresso na célula B por meio do uso de um transposon. O transgene pode ser expresso na célula B em função da integração direcionada do transgene no genoma da célula B. A integração direcionada pode ser por meio de recombinação homóloga. A recombinação homóloga pode ocorrer em uma quebra de fita dupla induzida por uma nuclease. A nuclease pode ser, por exemplo, uma dedo de zinco-nuclease, uma TALE-nuclease (TALEN), uma meganuclease (por exemplo, uma Homing Endonuclease), ou por meio de um sistema CRISPR/CAS9-nuclease.
[082] Em outro exemplo, células B são cultivadas com um ou mais fatores de ativação de célula B selecionados de CD40L, IFN-α, IL-2, IL-6, IL-10, IL-15, IL-21 e oligodesoxinucleotídeos CpG classe-P (p-ODN) para diferenciação das células B. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 25-75 ng/ml de CD40L. Em uma modalidade, a concentração de CD40L é de 50 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 250-750 U/ml de IFN-α. Em uma modalidade a concentração do IFN-α é de 500 U/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 5-50 U/ml de IL-
2. Em uma modalidade a concentração de IL-2 é de 20 U/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 25-75 ng/ml de IL-6. Em uma modalidade, a concentração de IL-6 é de 50 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 10-100 ng/ml de IL-10. Em uma modalidade, a concentração de IL-10 é de 50 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1-20 ng/ml de IL-15. Em uma modalidade, a concentração de IL-15 é de 10 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 10-100 ng/ml de IL-21. Em uma modalidade, a concentração de IL-21 é de 50 ng/ml. Em uma modalidade, as células B são cultivadas com 1-50 µg/ml de p- ODN. Em uma modalidade, a concentração de p-ODN é de 10 µg/ml.
[083] Em uma modalidade, células B são colocadas em contato ou cultivadas em células alimentadoras. Em uma modalidade, as células alimentadoras são uma linhagem de célula estromal, por exemplo, linhagem de célula estromal murídea S17 ou MS5. Em outra modalidade, células CD19+ isoladas são cultivadas com uma ou mais citocinas de fator de ativação de célula B, por exemplo, IL-10 e IL-4, na presença de fibroblastos que expressam ligante de CD40 (CD40L, CD154). Em uma modalidade, CD40L é fornecido ligado a uma superfície como, por exemplo, placa de cultura de tecido ou uma partícula. Em outra modalidade, células B purificadas são cultivadas, na presença ou ausência de células alimentadoras, com CD40L e uma ou mais citocinas ou fatores selecionados de IL-10, IL-4, IL-7, p-ODN, CpG DNA, IL-2, IL-15, IL6 e IFN-α.
[084] Em outra modalidade, fatores de ativação de célula B são fornecidos por transfecção na célula B ou outra célula alimentadora. Nesse contexto, um ou mais fatores que promovem diferenciação da célula B em uma célula secretora de anticorpo e/ou um ou mais fatores que promovem a longevidade da célula produtora de anticorpo podem ser usados. Esses fatores incluem, por exemplo, Blimp-1, TRF4, fatores antiapoptóticos como Bcl-xl ou Bcl5, ou mutantes constitutivamente ativos do receptor de CD40. Além disso, fatores que promovem a expressão de moléculas de sinalização a jusante como, por exemplo, fatores associados ao receptor de TNF (TRAFs), também podem ser usados na ativação/diferenciação das células B. A esse respeito, ativação celular, sobrevida celular e funções antiapoptóticas da superfamília do receptor de TNF são mediadas principalmente por TRAF1-6 (veja, por exemplo, R.H. Arch, e cols., Genes Dev. 12 (1998), páginas 2.821-2.830). Efetores a jusante da sinalização de TRAF incluem fatores de transcrição na família de NF-κB e AP-1 que podem ligar genes envolvidos em vários aspectos de funções celulares e imunes. Além disso, foi demonstrado que a ativação de NF-κB e AP-1 fornece proteção das células contra apoptose por meio da transcrição de genes antiapoptóticos.
[085] Em outra modalidade, proteínas derivadas do vírus de Epstein Barr (EBV) são usadas para a ativação e/ou diferenciação de células B ou para promover a longevidade da célula produtora de anticorpo. Proteínas derivadas de EBV incluem, sem limitação, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP- 2, EBER, miRNAs, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA e EBV-AN.
[086] Em certas modalidades, o contato das células B com fatores de ativação de célula B com o uso dos métodos fornecidos nesse relatório descritivo leva, entre outras coisas, à proliferação celular (ou seja, expansão), modulação do fenótipo IgM+ na superfície celular para um consistente com uma célula B madura ativada, secreção de Ig, e mudança de isótipo. Células B CD19+ podem ser isoladas com o uso de kits de separação de células conhecidos e disponíveis comercialmente, por exemplo, o sistema de separação de células MiniMACS™ (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha). Em certas modalidades, fibroblastos CD40L são irradiados antes do uso nos métodos descritos nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, células B são cultivadas na presença de um ou mais de IL-3, IL-7, Flt3 ligante, trombopoietina, SCF, IL-2, IL-10, G-CSF e CpG. Em certas modalidades, os métodos incluem o cultivo das células B na presença de um ou mais dos fatores mencionados anteriormente em conjunto com células estromais transformadas (por exemplo, MS5), fornecendo um nível baixo de CD40L e/ou CD40L ancorado ligado a uma placa ou uma partícula.
[087] Como discutido acima, fatores de ativação de célula B induzem expansão, proliferação ou diferenciação de células B. Consequentemente, células B são colocadas em contato com um ou mais fatores de ativação de célula B listados acima para obter uma população de células expandidas. Uma população de células pode ser expandida antes da transfecção. Alternativamente, ou adicionalmente, uma população de células pode ser expandida após transfecção. Em uma modalidade, a expansão de uma população de células B compreende o cultivo das células com IL-2, IL-4, IL-10 e CD40L (veja, por exemplo, Neron e cols. PLoS ONE, 2012 7(12): e51946). Em uma modalidade, a expansão de uma população de células B compreende o cultivo das células com IL-2, IL-10, CpG e CD40L. Em uma modalidade, a expansão de uma população de células B compreende o cultivo das células com IL-2, IL- 4, IL-10, IL-15, IL-21 e CD40L. Em uma modalidade, a expansão de uma população de células B compreende o cultivo das células com IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 e CD40L multimerizado.
[088] Em outra modalidade, a expansão de uma população de células B é induzida e/ou aumentada por um transgene introduzido nas células B. Por exemplo, uma célula B que contém um receptor recombinante ou um receptor modificado geneticamente que induz uma via da sinalização celular (por exemplo, sinalização de CD40 a jusante) mediante ligação a seu ligante (por exemplo, um ligante solúvel ou um ligante expresso na superfície celular). Em uma modalidade, uma célula B superexpressa CD40 em função da expressão de um transgene de CD40. Em outra modalidade, uma célula B expressa um receptor modificado geneticamente incluindo, por exemplo, um anticorpo modificado por engenharia genética recombinantemente. Em uma modalidade, um receptor modificado geneticamente é similar a um receptor de antígeno quimérico (CAR) e compreende uma proteína de fusão de um scFv e uma porção de sinalização intracelular de um receptor de célula B (por exemplo, CD40).
[089] Em uma modalidade, a expansão de uma população de células B é induzida e/ou aumentada por um composto de pequena molécula adicionado à cultura de células. Por exemplo, um composto que se liga e dimeriza CD40 pode ser usado para disparar a via de sinalização de CD40.
[090] Qualquer um de diversos meios de cultura pode ser usado nos presentes métodos, como seria do conhecimento daqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, “Current
Protocols in Cell Culture”, 2000-2009 por John Wiley & Sons, Inc.). Em uma modalidade, meios para uso nos métodos descritos nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, meio de Dulbecco modificado por Iscove (com ou sem soro bovino fetal ou outro soro apropriado). Meios ilustrativos também incluem, sem limitação, IMDM, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20. Em modalidades adicionais, o meio pode compreender um tensoativo, um anticorpo, plasmanato ou um agente redutor (por exemplo, N- acetil-cisteína, 2-mercaptoetanol), um ou mais antibióticos, e/ou aditivos como, por exemplo, insulina, transferrina, selenita de sódio e ciclosporina. Em algumas modalidades, IL-6, CD40L solúvel e um intensificador de reticulação também podem ser usados.
[091] Células B são cultivadas sob condições e por períodos de tempo suficientes para obter a diferenciação e/ou ativação desejada. Em certas modalidades, as células B são cultivadas sob condições e por períodos de tempo suficientes de modo que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou até mesmo 100% das células B sejam diferenciadas e/ou ativadas como desejado. Em uma modalidade, as células B são ativadas e diferenciadas em uma população mista de plasmoblastos e células plasmáticas. Como seria reconhecido por aqueles habilitados na técnica, plasmoblastos e células plasmáticas podem ser identificadas por padrões de expressão de proteína na superfície celular com o uso de métodos padronizados de citometria de fluxo, como descrito em outra parte nesse relatório descritivo, por exemplo, expressão de um ou mais de CD38, CD78, IL-6R, CD27high e CD138, e/ou ausência ou redução da expressão de um ou mais de CD19, CD20 e CD45. Como seria subentendido por aqueles habilitados na técnica, células B de memória são geralmente CD20+ CD19+ CD27+ CD38−, enquanto plasmoblastos iniciais são CD20− CD19+ CD27++ CD38++. Em uma modalidade, as células cultivadas usando os métodos descritos nesse relatório descritivo são CD20-, CD38+, CD138-. Em outra modalidade, as células possuem um fenótipo de CD20-, CD38+, CD138+. Em certas modalidades, a células são cultivadas por 1-7 dias. Em modalidades adicionais, as células são cultivadas 7, 14, 21 dias ou mais tempo. Dessa forma, as células podem ser cultivadas sob condições apropriadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou mais dias. As células são plaqueadas novamente, e meios e suplementos podem ser adicionados ou trocados, como necessário, com o uso de metodologias conhecidas na técnica.
[092] Em certas modalidades, as células B são cultivadas sob condições e por períodos de tempo suficientes de modo que pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das células sejam diferenciadas e ativadas para produzir Ig e/ou para expressar o transgene.
[093] A indução de ativação de célula B pode ser medida por técnicas como, por exemplo, incorporação de 3H-uridina em RNA (à medida que as células B se diferenciam, a síntese de RNA aumenta), ou por incorporação de 3H-timidina, que mede a síntese de DNA associada à proliferação celular. Em uma modalidade, interleucina-4 (IL-4) pode ser adicionada ao meio de cultura em uma concentração apropriada (por exemplo,
cerca de 10 ng/ml) para aumento da proliferação de células B.
[094] Alternativamente, a ativação de célula B é medida em função da secreção de imunoglobulina. Por exemplo, CD40L é adicionado às células B em repouso junto com IL-4 (por exemplo, 10 ng/ml) e IL-5 (por exemplo, 5 ng/ml) ou outras citocinas que ativam células B. Citometria de fluxo também pode ser usada para medição de marcadores da superfície celular típicos de células B ativadas. Veja, por exemplo, Civin C.I., Loken M.R., Int’l J. Cell Cloning 987; 5: 1-16; Loken, M.R., e cols., “Flow Cytometry Characterization of Erythroid, Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow”, em “Flow Cytometry in Hematology”, Laerum O.D., Bjerksnes R. eds., Academic Press, Nova York 1992; páginas 31 -42; e LeBein TW, e cols., Leukemia 1990; 4: 354-358.
[095] Após cultura por um período de tempo apropriado, por exemplo, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dias, geralmente em torno de 3 dias, um volume adicional de meio de cultura pode ser acrescentado. O sobrenadante de culturas individuais pode ser colhido várias vezes durante a cultura e quantificado para IgM e IgG1, como descrito em Noelle e cols., (1991) J. Immunol. 146: 1.118-1.124. Em uma modalidade, a cultura é colhida e medida para expressão do transgene de interesse usando citometria de fluxo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ELISPOT ou outro ensaio conhecido na técnica.
[096] Em outra modalidade, ELISA é usado para medir a produção de isótipo de anticorpo, por exemplo, IgM, ou um produto do transgene de interesse. Em certas modalidades, são feitas determinações de IgG usando anticorpos disponíveis comercialmente, por exemplo, anti-IgG humana de cabra, como anticorpo de captura, seguido por detecção usando qualquer um de diversos reagentes de detecção apropriados como, por exemplo, anti-Ig humana de cabra biotinilado, estreptavidina - fosfatase alcalina e substrato.
[097] Em certas modalidades, as células B são cultivadas sob condições e por períodos de tempo suficientes de modo que o número de células seja 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000 vezes ou mais, maior do que o número de células B no início da cultura. Em uma modalidade, o número de células é 10-1.000 vezes maior, incluindo números inteiros consecutivos, do que o número de células B no início da cultura. Por exemplo, uma população de células B expandidas é pelo menos 10 vezes maior do que a população inicial de células B isoladas. Em outra modalidade, a população de células B expandidas é pelo menos 100 vezes maior do que a população inicial de células B isoladas. Em uma modalidade, a população de células B expandidas é pelo menos 500 vezes maior do que a população inicial de células B isoladas. Modificação por engenharia genética de células B
[098] Em uma modalidade, as células B geneticamente modificadas são transfectadas com um transgene. Métodos exemplares para transfecção de células B são fornecidos em WO 2014/152832 e WO 2016/100932, ambos incorporados nesse relatório descritivo por referência em suas totalidades. A transfecção de células B pode ser obtida com o uso de qualquer um de diversas métodos disponíveis na técnica para introduzir DNA ou RNA em uma célula B. Técnicas adequadas podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE- Dextrana, eletroporação, transfecção ou “espremedura de células” mediada por pressão (por exemplo, sistema microfluídico CellSqueeze, SQZ Biotechnologies), transfecção mediada por nanopartícula ou mediada por lipossomo e transdução com o uso de retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccínia. Veja, por exemplo, Graham e cols., 1973, Virology 52: 456; Sambrook e cols., 2001, “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis e cols., 1986, “Basic Methods in Molecular Biology”, Elsevier; Chu e cols., 1981, Gene 13: 197; US 5.124.259; US
5.297.983; US 5.283.185; US 5.661.018; US 6.878.548; US
7.799.555; US 8.551.780; e US 8.633.029. Um exemplo de uma técnica de eletroporação disponível comercialmente adequada para células B é a tecnologia de transfecção Nucleofector™.
[099] A transfecção pode ocorrer antes ou durante cultura in vitro das células B isoladas na presença de um ou mais fatores de ativação e/ou de diferenciação descritos acima. Por exemplo, as células são transfectadas no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 de cultura in vitro. Em uma modalidade, as células são transfectadas no dia 1, 2 ou 3 de cultura in vitro. Em uma modalidade particular, as células são transfectadas no dia 2. Por exemplo, as células são eletroporadas no dia 2 de cultura in vitro para liberação de, por exemplo, um plasmídeo, um transposon, um minicírculo, ou um RNA auto-replicante. Em outra modalidade, as células são transfectadas no dia 4, 5, 6 ou 7 de cultura in vitro. Em uma modalidade particular, as células são transfectadas no dia 6 de cultura in vitro. Em outra modalidade, as células são transfectadas no dia 5 de cultura in vitro.
[100] Em uma modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) antes da ativação. Em outra modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) durante ativação. Em uma modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) após ativação. Em uma modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) antes da diferenciação. Em outra modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) durante diferenciação. Em uma modalidade, as células são transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente (por exemplo, por meio da integração direcionada de um transgene) após diferenciação.
[101] Em uma modalidade, um vetor não viral é usado para liberar DNA ou RNA às células B de memória e/ou células plasmáticas. Por exemplo, sistemas que podem facilitar a transfecção de células B de memória e/ou células plasmáticas sem a necessidade de um sistema de integração viral incluem, sem limitação, transposons (por exemplo, sistema transposon Sleeping Beauty), dedo de zinco-nucleases (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes ao ativador da transcrição (TALENs),
repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas (CRISPRs), meganucleases, minicírculos, replicons, cromossomos artificiais (por exemplo, cromossomos artificiais bacterianos, cromossomos artificiais de mamíferos e cromossomos artificiais de levedura), plasmídeos, cosmídeos e bacteriófago.
[102] Em algumas modalidades, esses sistemas de vetor não-viral-dependentes também podem ser liberados por meio de um vetor viral conhecido na técnica ou descrito abaixo. Por exemplo, em algumas modalidades, um vetor viral (por exemplo, um retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adeno- associado), é utilizado para liberar um ou mais vetores não virais (como, por exemplo, um ou mais das dedo de zinco- nucleases (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes ao ativador da transcrição (TALENs), repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente espaçadas (CRISPRs) meganucleases mencionadas acima, ou qualquer outra enzima/vetores, polinucleotídeos e/ou polipeptídeos complementares capazes de facilitar a integração direcionada. Consequentemente, em algumas modalidades, uma célula (por exemplo, células B como, por exemplo, células B de memória e/ou células plasmáticas) pode ser modificada geneticamente para expressar uma sequência exógena (por exemplo, uma sequência que codifica um polipeptídeo terapêutico como, por exemplo, IDUA) por meio do método de integração direcionada. Esses métodos são conhecidos na técnica e podem compreender a clivagem de um lócus endógeno na célula com o uso de uma ou mais nucleases (por exemplo, ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas, meganuclease) e administração do transgene à célula, de forma que ele seja integrado no lócus endógeno e expresso na célula. O transgene pode estar contido em uma sequência doadora que é integrada no DNA da célula hospedeira no ponto de uma clivagem, ou perto dele, pela nuclease.
[103] A integração da sequência exógena (por exemplo, uma sequência que codifica um polipeptídeo terapêutico como, por exemplo, IDUA) pode ocorrer por meio de recombinação. Como seria evidente para aqueles habilitados na técnica, o termo “recombinação” se refere a um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos incluindo, sem limitação, captura do doador por junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga. A recombinação pode ser recombinação homóloga. Para os objetivos dessa revelação, “recombinação homóloga (HR)” se refere à forma especializada dessa troca que ocorre, por exemplo, durante reparo de quebras de fita dupla em células por meio de mecanismos de reparo dirigido por homologia. Esse processo utiliza homologia de sequência de nucleotídeos, pela qual uma molécula “doadora” (por exemplo, sequência doadora de polinucleotídeos ou vetor doador que compreende essa sequência) é utilizada pelo maquinário de reparo de DNA de uma célula como um modelo para o reparo de uma molécula “alvo” (ou seja, aquela que apresentou a quebra de fita dupla) e, por esses meios, causa a transferência de informação genética do doador para o alvo. Em algumas modalidades de integração dirigida por HR, a molécula doadora pode conter pelo menos 2 regiões de homologia para o genoma (“braços de homologia”). Em algumas modalidades, os braços de homologia podem ter, por exemplo, pelo menos 50-100 pares de bases de comprimento. Os braços de homologia podem ter homologia de DNA substancial para uma região de DNA genômico que flanqueia o sítio de clivagem no qual a integração direcionada deve ocorrer. Os braços de homologia da molécula doadora podem flanquear o DNA que deve ser integrado no genoma-alvo ou lócus de DNA-alvo. A quebra do cromossomo seguida por reparo usando a região homóloga do DNA de plasmídeo como um modelo pode resultar na transferência do transgene interveniente flanqueado pelos braços de homologia no genoma. Veja, por exemplo, Koller e cols. (1989) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86(22): 8.927-8.931; Thomas e cols. (1986) Cell 44 (3): 419-428. A frequência desse tipo de integração direcionada dirigida por homologia pode ser aumentada por um fator de até 105 por criação deliberada de uma quebra de fita dupla nas vizinhanças da região-alvo (Hockemeyer e cols. (2009) Nature Biotech. 27 (9): 851-857; Lombardo e cols. (2007) Nature Biotech. 25 (11): 1.298-
1.306; Moehle e cols. (2007) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 104 (9): 3.055-3.060; Rouet e cols. (1994) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91(13): 6.064-6.068.
[104] Qualquer nuclease capaz de mediar a clivagem direcionada de um lócus genômico de modo que um transgene possa ser integrado no genoma de uma célula-alvo (por exemplo, por recombinação como, por exemplo, HR) pode ser utilizada na modificação por engenharia genética de uma célula (por exemplo, uma célula B de memória ou plasmoblasto) de acordo com a presente revelação.
[105] Uma quebra de fita dupla (DSB) ou corte pode ser criado por uma nuclease sítio-específica como, por exemplo, uma dedo de zinco-nuclease (ZFN), uma nuclease de domínio efetor TAL (TALEN), uma meganuclease, ou o uso de um sistema CRISPR/Cas9 com um crRNA/RNA-trato modificado geneticamente
(RNA-guia único) para guiar a clivagem específica. Veja, por exemplo, Burgess (2013) Nature Reviews Genetics 14: 80-81, Urnov e cols. (2010) Nature 435 (7042): 646-51; Publicações de Patente U.S. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073 e Publicação International WO 2007/014275, cujas revelações são incorporadas por referência em suas totalidades para todas as finalidades.
[106] Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, a célula B de memória ou um plasmoblasto) é modificada geneticamente por meio de integração direcionada mediada por dedo de zinco-nuclease de uma construção doadora. Uma dedo de zinco-nuclease (ZFN) é uma enzima que é capaz de reconhecer e clivar uma sequência de nucleotídeos-alvo com especificidade em função do acoplamento de uma “proteína de ligação ao DNA de dedo de zinco” (ZFP) (ou domínio de ligação), que liga o DNA de uma forma sequência-específica por meio de um ou mais dedos de zinco, e uma enzima nuclease. ZFNs podem compreender quaisquer domínios de clivagem adequados (por exemplo, uma enzima nuclease) ligados operativamente a um domínio de ligação de DNA de ZFP para formar a ZFN modificada geneticamente que pode facilitar a clivagem sítio-específica de uma sequência de DNA-alvo (veja, por exemplo, Kim e cols. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (3): 1.156-1.160). Por exemplo, ZFNs podem compreender a ZFP alvo-específica ligada a uma enzima FOK1 ou a uma porção de uma enzima FOK1. Em algumas modalidades, a ZFN usada em uma abordagem de integração direcionada mediada por ZFN utiliza duas moléculas separadas, cada uma compreendendo uma subunidade de uma enzima FOK1, cada uma ligada a uma ZFP, cada ZFP com especificidade para uma sequência de DNA que flanqueia um sítio de clivagem-alvo e, quando as duas ZFPs se ligam aos seus respectivos sítios de DNA-alvo, as subunidades da enzima FOK1 se aproximam umas das outras e se ligam juntas ativando a atividade de nuclease que cliva o sítio de clivagem-alvo. ZFNs têm sido usadas para modificação do genoma em diversos organismos (por exemplo, Publicações de Patente U.S. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação International WO 07/014.275, incorporadas nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). ZFPs customizadas e ZFNs estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Sigma Aldrich (St. Louis, MO), e qualquer localização de DNA pode ser rotineiramente visada e clivada com o uso dessas ZFNs customizadas.
[107] Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, a célula B de memória ou um plasmoblasto) é modificada geneticamente por meio de integração mediada por nuclease CRISPR/Cas (por exemplo, CRISPR Cas9) de uma construção doadora. Um sistema de nuclease CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Espaçadas)/Cas (CRISPR Associado) é um sistema de nuclease modificado geneticamente com base em um sistema bacteriano que pode ser usado para modificação por engenharia genética do genoma. Ele se baseia, em parte, na resposta imune adaptiva de muitas bactérias e arquéias. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bactéria, segmentos do DNA do invasor são convertidos em RNAs de CRISPR (crRNA) pela resposta ‘imune’. Esse crRNA então se associa, por meio de uma região de complementaridade parcial, com outro tipo de RNA denominado tracrRNA para guiar a Cas9 nuclease para uma região homóloga ao crRNA no DNA- alvo denominada um “protoespaçador”. Cas9 cliva o DNA para gerar extremidades cegas na DSB em sítios especificados por uma sequência-guia de 20 nucleotídeos contida dentro do transcrito de crRNA. Cas9 exige tanto o crRNA quanto o tracrRNA para reconhecimento e clivagem de DNA sítio- específicos. Esse sistema foi agora modificado geneticamente de modo que o crRNA e tracrRNA possam ser combinados em uma molécula (o “RNA-guia único”), e a porção equivalente de crRNA do RNA-guia único pode ser modificada geneticamente para guiar a Cas9 nuclease para visar qualquer sequência desejada (veja Jinek e cols. (2012) Science 337, páginas 816-821, Jinek e cols., (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Dessa forma, o sistema CRISPR/Cas pode ser modificado geneticamente para criar uma DSB em um alvo desejado em um genoma, e o reparo da DSB pode ser influenciado pelo uso de inibidores de reparo para causar um aumento no reparo com tendência a erro.
[108] Em algumas modalidades, a integração mediada por CRISPR/Cas nuclease utiliza um CRISPR Tipo II. O CRISPR Tipo II é um dos sistemas mais bem caracterizado e realiza quebra de fita dupla de DNA direcionada em quatro etapas sequenciais. Primeiro, dois RNAs não-codificadores, o arranjo de pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos pelo lócus CRISPR. Segundo, tracrRNA hibridiza para as regiões de repetição do pré-crRNA e medeia o processamento de pré-crRNA em crRNAs maduros que contêm sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o complexo crRNA:tracrRNA maduro direciona Cas9 ao DNA-alvo por meio de pareamento de bases de Wastson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA-alvo perto de um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM), um requisito adicional para reconhecimento do alvo. Quarto, Cas9 medeia a clivagem de DNA-alvo para criar uma quebra de fita dupla dentro do protoespaçador.
[109] O sistema CRISPR/Cas relacionado a Cas9 compreende dois componentes não codificadores de RNA: tracrRNA e um arranjo de pré-crRNA que contém sequências-guia de nuclease (espaçadores) espaçados por repetições diretas (DRs) idênticas. O uso de um sistema CRISPR/Cas para obter modificação por engenharia genética do genoma, ambas as funções desses RNAs devem estar presentes (veja Cong e cols., (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). Em algumas modalidades, o tracrRNA e pré-crRNAs são fornecidos por meio de construções de expressão separadas ou como RNAs separados. Em outras modalidades, é construído um RNA quimérico no qual crRNA maduro modificado geneticamente (que confere especificidade de alvo) é fundido a um tracrRNA (que fornece interação com a Cas9) para criar um híbrido cr-RNA-tracrRNA quimérico (também denominado um RNA-guia único) (veja Jinek ibid e Cong, ibid).
[110] Em algumas modalidades, um RNA-guia único contendo tanto o crRNA quanto o tracrRNA pode ser modificado geneticamente para guiar a Cas9 nuclease para visar qualquer sequência desejada (por exemplo, Jinek e cols. (2012) Science 337, páginas 816-821, Jinek e cols., (2013), eLife 2:e00471, David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Dessa forma, o sistema CRISPR/Cas pode ser modificado geneticamente para criar uma DSB em um alvo desejado em um genoma.
[111] Sistemas CRISPR/Cas customizados estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Dharmacon (Lafayette, CO), e qualquer localização de DNA pode ser rotineiramente visada e clivada com o uso dessas sequências de RNA-guia único customizadas. Modelos de DNA de fita simples para recombinação podem ser sintetizados (por exemplo, por meio de métodos de síntese de oligonucleotídeo conhecidos na técnica e disponíveis comercialmente) ou fornecidos em um vetor, por exemplo, um vetor viral como, por exemplo, um AAV.
[112] Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, a célula B de memória ou um plasmoblasto) é modificada geneticamente por meio de integração direcionada mediada por TALE-Nuclease (TALEN) de uma construção doadora. Um “domínio de ligação ao DNA de TALE” ou “TALE” é um polipeptídeo que compreende um ou mais domínios/unidades de repetição TALE. Os domínios de repetição estão envolvidos na ligação da TALE à sua sequência de DNA-alvo cognata. Uma “unidade de repetição” única (também denominada uma “repetição”) tem tipicamente 33-35 aminoácidos de comprimento e exibe pelo menos alguma homologia de sequência com outras sequências de repetição TALE dentro de uma proteína TALE de ocorrência natural. Efetores TAL podem conter uma sequência de localização nuclear, um domínio de ativação transcricional ácido e um domínio centralizado de repetições em tandem em que cada repetição contém aproximadamente 34 aminoácidos que são cruciais para a especificidade de ligação ao DNA dessas proteínas (por exemplo, Schornack S, e cols. (2006) J. Plant. Physiol. 163 (3): 256-272). Os efetores TAL dependem das sequências encontradas nas repetições em tandem que compreendem aproximadamente 102 bp e as repetições são tipicamente 91-100% homólogas entre elas (por exemplo, Bonas e cols. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 127-136). Essas repetições de ligação ao DNA podem ser modificadas geneticamente em proteínas com novas combinações e números de repetições, para produzir fatores de transcrição artificiais que são capazes de interagir com novas sequências e ativar a expressão de um gene-repórter não endógeno (por exemplo, Bonas e cols. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 127- 136). Proteínas TAL modificadas geneticamente podem estar ligadas a um domínio de meia-clivagem FokI para gerar uma fusão nuclease de domínio efetor TAL (TALEN) para clivar sequência de DNA alvo-específica (por exemplo, Christian e cols. (2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717).
[113] TALENs customizadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), e qualquer localização de DNA pode ser rotineiramente visada e clivada.
[114] Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, uma célula B de memória ou um plasmoblasto) é modificada geneticamente por meio de integração direcionada mediada por Meganuclease de uma construção doadora. Uma Meganuclease (ou “Homing Endonuclease”) é uma endonuclease que se liga e cliva DNA de fita dupla em uma sequência de reconhecimento que tem mais do que 12 pares de bases. Meganucleases de ocorrência natural podem ser monoméricas (por exemplo, I-SceI) ou diméricas (por exemplo, I-CreI). Meganucleases de ocorrência natural reconhecem sítios de clivagem de 15-40 pares de bases e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY-YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. Homing Endonucleases exemplares incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. Suas sequências de reconhecimento são conhecidas. Veja também Pat. U.S. Nº 5.420.032; Pat. U.S. Nº 6.833.252; Belfort e cols. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3.379-3.388; Dujon e cols. (1989) Gene 82: 115-118; Perler e cols. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1.125-1.127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble e cols. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast e cols. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353 e o catálogo do “New England Biolabs”. O termo “Meganuclease” inclui meganucleases monoméricas, meganucleases diméricas e monômeros que se associam para formar meganucleases diméricas.
[115] Em certas modalidades, os métodos e composições descritas nesse relatório descritivo se utilizam de uma nuclease que compreende uma Homing Endonuclease (meganuclease) modificada geneticamente (de ocorrência não natural). As sequências de reconhecimento de Homing Endonucleases e meganucleases como, por exemplo, I-SceI, I- CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I- PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII, são conhecidas. Veja também a Pat. U.S. Nº 5.420.032; Pat. U.S. Nº 6.833.252; Belfort e cols. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
3.379-3.388; Dujon e cols. (1989) Gene 82: 115-118; Perler e cols. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1.125-1.127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble e cols. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast e cols. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353 e o catálogo do “New England Biolabs”. Além disso, a especificidade de ligação ao DNA de Homing
Endonucleases e meganucleases pode ser modificada geneticamente para se ligar a sítios-alvo não naturais. Veja, por exemplo, Chevalier e cols. (2002) Molec. Cell 10: 895- 905; Epinat e cols. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2.952-
2.962; Ashworth e cols. (2006) Nature 441: 656-659; Paques e cols. (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66; Publicação de Patente U.S. Nº 20070117128. Os domínios de ligação ao DNA das Homing Endonucleases e meganucleases podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (ou seja, de modo que a nuclease inclua o domínio de clivagem cognato) ou podem ser fundidos a um domínio de clivagem heterólogo. Meganuclease customizadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, por New England Biolabs (Ipswich, MA), e qualquer localização de DNA pode ser rotineiramente visada e clivada.
[116] A modificação por engenharia genética da célula B pode compreender a administração de uma ou mais nucleases (por exemplo, ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas, meganuclease) a uma célula B, por exemplo, por meio de um ou mais vetores que codificam as nucleases, de modo que os vetores que compreendem as nucleases codificadas sejam recolhidos pela célula B. Os vetores podem ser vetores virais.
[117] Em algumas modalidades, as nucleases clivam um lócus endógeno específicos (por exemplo, gene ou lócus de abrigo seguro de interesse) na célula (por exemplo, célula B de memória ou célula plasmática) e uma ou mais sequências exógenas (doadoras) (por exemplo, transgenes) são administradas (por exemplo, um ou mais vetores que compreendem essas sequências exógenas). A nuclease pode induzir uma quebra (corte) de fita dupla (DSB) ou de fita simples no DNA-alvo. Em algumas modalidades, a inserção direcionada de um transgene doador pode ser realizada por meio de reparo dirigido por homologia (HDR), mecanismos de reparo não-homologia (por exemplo, captura de extremidade mediada por NHEJ) ou inserções e/ou deleção de nucleotídeos (por exemplo, sequência endógena) no sítio de integração de um transgene no genoma da célula.
[118] Em uma modalidade, um método de transfecção de uma célula B compreende a eletroporação da célula B antes do contato da célula B com um vetor. Em uma modalidade, as células são eletroporadas no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de cultura in vitro. Em uma modalidade, as células são eletroporadas no dia 2 de cultura in vitro para liberação de um plasmídeo. Em uma modalidade, as células são transfectadas com o uso de um transposon no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de cultura in vitro. Em outra modalidade, as células são transfectadas usando um minicírculo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de cultura in vitro. Em uma modalidade, a eletroporação de um transposon Sleeping Beauty ocorre no dia 2 de cultura in vitro.
[119] Em uma modalidade, as células B são colocadas em contato com um vetor que compreende um ácido nucleico de interesse ligado operativamente a um promotor, sob condições suficientes para transfectar pelo menos uma porção das células B. Em uma modalidade as células B são colocadas em contato com um vetor que compreende um ácido nucleico de interesse ligado operativamente a um promotor, sob condições suficientes para transfectar pelo menos 5% das células B. Em uma modalidade adicional, as células B são colocadas em contato com um vetor sob condições suficientes para transfectar pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% das células B. Em uma modalidade particular, as células B, cultivadas in vitro como descrito nesse relatório descritivo, são transfectadas, quando então as células B cultivadas são colocadas em contato com um vetor como descrito nesse relatório descritivo sob condições suficientes para transfectar pelo menos 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% das células B.
[120] Vetores virais podem ser empregados para transduzir células B de memória e/ou células plasmáticas. Exemplos de vetores virais incluem, sem limitação, vetores à base de adenovírus, vetores à base de vírus adeno-associado (AAV), vetores retrovirais, vetores retrovirais-adenovirais, e vetores derivados de vírus do herpes simples (HSVs), incluindo vetores de amplicon, HSV replicação-defeituoso e HSV atenuado (veja, por exemplo, Krisky, Gene Ther. 5: 1.517- 30, 1998; Pfeifer, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177- 211, 2001, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade).
[121] Em uma modalidade, as células são transduzidas com um vetor viral (por exemplo, um vetor lentiviral) no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de cultura in vitro. Em uma modalidade particular, as células são transduzidas com um vetor viral no dia 5 de cultura in vitro. Em uma modalidade, o vetor viral é um lentivírus. Em uma modalidade, as células são transduzidas com um lentivírus pseudotipado vírus do sarampo no dia 1 de cultura in vitro.
[122] Em uma modalidade, células B são transduzidas com vetores retrovirais com o uso de qualquer uma de diversas metodologias conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Science 12 de abril de 1996 272: 263-267; Blood 2007, 99:
2.342-2.350; Blood 2009, 113: 1.422-1.431; Blood, 8 de outubro de 2009; 114 (15): 3.173-80; Blood. 2003; 101 (6):
2.167-2.174; “Current Protocols in Molecular Biology ou Current Protocols in Immunology”, John Wiley & Sons, Nova York, N.Y. (2009)). Descrição adicional de transdução viral de células B pode ser encontrada em WO 2011/085247 e WO 2014/152832, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
[123] Por exemplo, PBMCs, linfócitos B ou T de doadores, e outras células de câncer de célula B como, por exemplo, B- CLLs, podem ser isoladas e cultivadas em meio IMDM ou RPMI 1640 (GibcoBRL Invitrogen, Auckland, Nova Zelândia) ou outro meio adequado, como descrito nesse relatório descritivo, seja ele livre de soro ou suplementado com soro (por exemplo, FCS 5-10%, soro AB humano e substitutos de soro) e penicilina/estreptomicina e/ou outros suplementos adequados como, por exemplo, transferrina e/ou insulina. Em uma modalidade, as células são semeadas a 1 x 105 células em placas de 48 poços e vetor concentrado adicionado em várias doses que podem ser otimizadas rotineiramente por aqueles habilitados na técnica com o uso de metodologias de rotina. Em uma modalidade, as células B são transferidas para uma monocamada de células MS5 em RPMI suplementado com soro AB 10%, FCS 5%, 50 ng/ml rhSCF, 10 ng/ml rhlL-15 e 5 ng/ml rhlL- 2 e meio refrescado periodicamente como necessário. Como seria reconhecido por aqueles habilitados na técnica, outros meios e suplementos adequados podem ser usados como desejado.
[124] Certas modalidades estão relacionadas ao uso de vetores retrovirais, ou vetores derivados de retrovírus. “Retrovírus” são vírus de RNA envelopados que são capazes de infectar células animais, e que utilizam a enzima transcriptase reversa nos estágios iniciais de infecção para gerar uma cópia de DNA a partir de seu genoma de RNA, que é então tipicamente integrado no genoma do hospedeiro. Exemplos de vetores retrovirais são vetores derivado do vírus da leucemia murídea de Moloney (MLV), vetores retrovirais baseados em um Vírus de Célula-Tronco Murídea, que fornece expressão estável de longo prazo em células-alvo como, por exemplo, células precursoras hematopoiéticas e sua prole diferenciada (veja, por exemplo, Hawley e cols., PNAS USA 93: 10.297-10.302, 1996; Keller e cols., Blood 92: 877-887, 1998), vetores híbridos (veja, por exemplo, Choi, e cols., Stem Cells 19: 236-246, 2001), e vetores derivado de retrovírus complexos, por exemplo, vetores lentivirais.
[125] Em uma modalidade, as células B são colocadas em contato com um vetor retroviral que compreende um ácido nucleico de interesse ligado operativamente a um promotor, sob condições suficientes para transduzir pelo menos uma porção das células B. Em uma modalidade as células B são colocadas em contato com um vetor retroviral que compreende um ácido nucleico de interesse ligado operativamente a um promotor, sob condições suficientes para transduzir pelo menos 2% das células B. Em uma modalidade adicional, as células B são colocadas em contato com um vetor sob condições suficientes para transduzir pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% das células B em repouso. Em uma modalidade particular, as células B diferenciadas e ativadas, cultivadas in vitro como descrito nesse relatório descritivo, são transduzidas, quando então as células B diferenciadas/ativadas cultivadas são colocadas em contato com um vetor como descrito nesse relatório descritivo sob condições suficientes para transduzir pelo menos 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% das células B diferenciadas e ativadas.
[126] Em certas modalidades, antes da transdução, as células são pré-estimuladas com Staphylococcus Aureus Cowan (SAC; Calbiochem, San Diego, CA) e/ou IL-2 em concentrações apropriadas conhecidas por aqueles habilitados na técnica e rotineiramente otimizadas. Outros fatores de ativação de célula B (por exemplo, PMA), como são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e descritos nesse relatório descritivo, podem ser usados.
[127] Como observado acima, certas modalidades empregam vetores lentivirais. O termo “lentivírus” se refere a um gênero de retrovírus complexos que são capazes de infectar células tanto em divisão quanto células que não estão em divisão. Exemplos de lentivírus incluem HIV (vírus da imunodeficiência humana; incluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2), visna-maedi, o vírus da artrite-encefalite caprina, vírus da anemia infecciosa equina, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da imunodeficiência bovina (BIV) e vírus da imunodeficiência símia (SIV). Vetores lentivirais podem ser derivados de qualquer um ou mais desse lentivírus (veja, por exemplo, Evans e cols., Hum Gene Ther. 10: 1.479-1.489, 1999; Case e cols., PNAS USA 96: 2.988-2.993, 1999; Uchida e cols., PNAS USA 95: 1.1939-1.1944, 1998; Miyoshi e cols., Science 283: 682-686, 1999; Sutton e cols., J. Virol. 72: 5.781-
1.788, 1998; e Frecha e cols., Blood. 112: 4.843-52, 2008, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade).
[128] Foi documentado que células T e B em repouso podem ser transduzidas por LV revestido com VSVG que carrega a maioria das proteínas acessórias do HIV (vif, vpr, vpu e nef) (veja, por exemplo, Frecha e cols., 2010 Mol. Therapy 18: 1.748). Em certas modalidades, o vetor retroviral compreende certas sequências mínimas do genoma de um lentivírus, por exemplo, o genoma de HIV ou o genoma de SIV. O genoma de um lentivírus é tipicamente organizado em uma região de repetição terminal longa (LTR) 5’, o gene gag, o gene pol, o gene env, os genes acessórios (por exemplo, nef, vif, vpr, vpu, tat, rev) e uma região LTR 3’. A LTR viral é dividida em três regiões denominadas U3, R (repetição) e U5. A região U3 contém os elementos intensificadores e promotores, a região U5 contém os sinais de poliadenilação, e a região R separa as regiões U3 e U5. As sequências transcritas da região R aparecem tanto na extremidade 5’ quanto na extremidade 3’ do RNA viral (veja, por exemplo, “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70: 1.617-1.639, 1989; Fields e cols., “Fundamental Virology”, Raven Press, 1990; Miyoshi e cols., J. Virol. 72:
8.150-7.1998; e Pat. U.S. Nº 6.013.516, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade). Vetores lentivirais podem compreender qualquer um ou mais desses elementos do genoma lentiviral, para regular a atividade do vetor como desejado, ou eles podem conter deleções, inserções, substituições ou mutações em um ou mais desses elementos, de modo a reduzir os efeitos patológicos da replicação lentiviral, ou para limitar o vetor lentiviral a uma única rodada de infecção.
[129] Tipicamente, um vetor retroviral mínimo compreende certas sequências LTR 5’ e LTR 3’, um ou mais genes de interesse (a serem expressos na célula-alvo), um ou mais promotores, e uma sequência cis-atuante para empacotamento do RNA. Outras sequências regulatórias podem ser incluídas, como descrito nesse relatório descritivo e conhecido na técnica. O vetor viral é tipicamente clonado em um plasmídeo que pode ser transfectado em uma linhagem de célula de empacotamento, por exemplo, uma célula eucariótica (por exemplo, 293-HEK), e também tipicamente compreende sequências úteis para replicação do plasmídeo em bactérias.
[130] Em certas modalidades, o vetor viral compreende sequências das LTRs 5’ e/ou 3’ de um retrovírus como, por exemplo, um lentivírus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer lentivírus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências LTR de HIV, SIV, FIV ou BIV. De preferência, as sequências LTR são sequências LTR de HIV.
[131] Em certas modalidades, o vetor viral compreende as sequências R e U5 da LTR 5’ de um lentivírus e uma LTR 3’ inativada ou “de auto-inativação” de um lentivírus. Uma “LTR 3’ de auto-inativação” é uma repetição terminal longa (LTR) 3’ que contém uma mutação, substituição ou deleção que evita que as sequências LTR dirijam a expressão de um gene a jusante. Uma cópia da região U3 da LTR 3’ atua como um modelo para a geração de ambas as LTRs no pró-vírus integrado. Dessa forma, quando a LTR 3’ com uma deleção ou mutação inativante se integra como a LTR 5’ do pró-vírus, não é possível nenhuma transcrição da LTR 5’. Isso elimina a competição entre o intensificador/promotor viral e qualquer intensificador/ promotor interno. LTRs 3 de auto-inativação são descritas, por exemplo, em Zufferey e cols., J. Virol. 72: 9.873-9.880, 1998; Miyoshi e cols., J. Virol. 72: 8.150-8.157, 1998; e Iwakuma e cols., J. Virology 261: 120-132, 1999, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade. LTRs 3 de auto-inativação podem ser geradas por qualquer método conhecido na técnica. Em certas modalidades, o elemento U3 da LTR 3’ contém uma deleção de sua sequência intensificadora, preferivelmente os sítios TATA box, Spl e/ou NF-kappa B. Como resultado da LTR 3’ de auto-inativação, o pró-vírus que é integrado na célula hospedeira genoma compreenderá uma LTR 5’ inativada.
[132] Os vetores fornecidos nesse relatório descritivo tipicamente compreendem um gene que codifica uma proteína (ou outra molécula, por exemplo, siRNA) que é desejavelmente expressa em uma ou mais células-alvo. Em um vetor viral, o gene de interesse está localizado preferivelmente entre as sequências LTR 5’ e LTR 3’. Além disso, o gene de interesse está preferivelmente em um relacionamento funcional com outros elementos genéticos, por exemplo, sequências regulatórias da transcrição como, por exemplo, promotores e/ou intensificadores, para regular a expressão do gene de interesse de uma forma particular após o gene ser incorporado na célula-alvo. Em certas modalidades, as sequências regulatórias da transcrição úteis são aquelas que estão altamente reguladas com relação à atividade, tanto temporalmente quanto espacialmente.
[133] Em certas modalidades, um ou mais genes adicionais podem ser incorporados como uma medida de segurança, principalmente para permitir a morte seletiva de células- alvo transfectadas dentro de uma população heterogênea, por exemplo, dentro de um paciente humano. Em uma modalidade exemplar, o gene selecionado é um gene de timidina quinase (TK), cuja expressão torna uma célula-alvo suscetível à ação do fármaco ganciclovir. Em uma modalidade adicional, o gene suicida é um gene suicida de caspase 9 ativado por um fármaco de dimerização (veja, por exemplo, Tey e cols., Biology of Blood and Marrow Transplantation 13: 913-924, 2007).
[134] Em certas modalidades, um gene que codifica uma proteína marcadora pode ser colocado antes ou depois do gene primário em um vetor viral ou não viral para permitir a identificação e/ou seleção de células que estão expressando a proteína desejada. Certas modalidades incorporam uma proteína marcadora fluorescente, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) ou proteína fluorescente vermelha (RFP), juntamente com o gene primário de interesse. Se um ou mais genes-repórteres adicionais estão incluídos, sequências IRES ou elementos 2A também podem ser incluídos, separando o gene primário de interesse de um gene-repórter e/ou qualquer outro gene de interesse.
[135] Certas modalidades podem empregar genes que codificam um ou mais marcadores selecionáveis. Exemplos incluem marcadores selecionáveis que são eficazes em uma célula eucariótica ou uma célula procariótica, por exemplo,
um gene para resistência a um fármaco que codifica um fator necessário à sobrevida ou crescimento de células hospedeiras transformadas desenvolvidas em um meio de cultura seletivo. Genes de seleção exemplares codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou a outras toxinas, por exemplo, G418, higromicina B, puromicina, zeocina, ouabaína, blasticidina, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, complementam ou fornecem deficiências auxotróficas, podem estar presentes em um plasmídeo separado e introduzidos por cotransfecção com o vetor viral. Em uma modalidade, o gene codifica uma diidrofolato redutase mutante (DHFR) que confere resistência ao metotrexato. Algumas outras modalidades podem empregar genes que codificam um ou receptores da superfície celular que podem ser usados para marcação e detecção ou purificação de células transfectadas (por exemplo, receptor do fator de crescimento nervoso (LNGFR) de baixa afinidade ou outros receptores desse tipo úteis como sistemas de marcação da transdução. Veja, por exemplo, Lauer e cols., Cancer Gene Ther., março de 2000; 7 (3): 430-7.
[136] Certos vetores virais como, por exemplo, vetores retrovirais, empregam um ou mais promotores heterólogos, intensificadores, ou ambos. Em certas modalidades, a sequência U3 de uma LTR 5’ retroviral ou lentiviral pode ser substituída com uma sequência promotora ou intensificadora na construção viral. Certas modalidades empregam um promotor/intensificador “interno” que está localizado entre as sequências LTR 5’ e LTR 3’ do vetor viral, e está ligado operativamente ao gene de interesse.
[137] Os termos “relacionamento funcional” e “ligado operativamente” significam, sem limitação, que o gene está na localização e orientação corretas com relação ao promotor e/ou intensificador, de modo que a expressão do gene será afetada quando o promotor e/ou intensificador é colocado em contato com as moléculas regulatórias apropriadas. Pode ser usada qualquer combinação de intensificador/promotor que regule (por exemplo, aumente, diminua) a expressão do genoma do RNA viral na linhagem de célula de empacotamento, regule a expressão do gene selecionado de interesse em uma célula- alvo infectada, ou ambos.
[138] Um promotor é um elemento de controle da expressão formado por uma sequência de DNA que permite que ocorram a ligação à polimerase e a transcrição. Promotores são sequências não traduzidas que estão localizadas a montante (5’) do códon de partida de um gene selecionado de interesse (tipicamente dentro de cerca de 100 a 1.000 bp) e controlam a transcrição e tradução da sequência de polinucleotídeos codificadora à qual estão ligados operativamente. Promotores podem ser induzíveis ou constitutivos. Promotores induzíveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de DNA sob seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, por exemplo, uma alteração na temperatura. Promotores podem ser unidirecionais ou bidirecionais. Promotores bidirecionais podem ser usados para co-expressar dois genes, por exemplo, um gene de interesse e um marcador de seleção. Alternativamente, uma configuração de promotor bidirecional que compreende dois promotores, cada um controlando a expressão de um gene diferente, em orientação oposta no mesmo vetor, pode ser utilizada.
[139] Diversos promotores são conhecidos na técnica, bem como métodos para ligar operativamente o promotor à sequência codificadora de polinucleotídeo. Tanto sequências promotoras nativas quanto muitos promotores heterólogos podem ser usados para dirigir a expressão do gene selecionado de interesse. Certas modalidades empregam promotores heterólogos, pois eles geralmente permitem maior transcrição e rendimentos maiores da proteína desejada, quando comparados com o promotor nativo.
[140] Certas modalidades podem empregar promotores virais heterólogos. Exemplos desses promotores incluem aqueles obtidos dos genomas de vírus como, por exemplo, o vírus do polioma, vírus da varicela, adenovírus, vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Símio 40 (SV40). Certas modalidades podem empregar um promotor de mamífero heterólogo, por exemplo, o promotor de actina, um promotor de imunoglobulina, um promotor de choque térmico ou um promotor que está associado com a sequência nativa do gene de interesse. Tipicamente, o promotor é compatível com a célula-alvo, por exemplo, um, linfócito B ativado, uma célula plasmática B, uma célula B de memória ou outra célula-alvo de linfócito.
[141] Certas modalidades podem empregar um ou mais dos promotores de RNA polimerase II e III. Uma seleção adequada de promotores de RNA polimerase III pode ser encontrada, por exemplo, em Paule e White. Nucleic Acids Research, Vol. 28, páginas 1.283-1.298, 2000, que é incorporado por referência em sua totalidade. Promotores de RNA polimerase II e III também incluem quaisquer fragmentos de DNA sintéticos ou modificados geneticamente que possam dirigir RNA polimerase
II ou III, respectivamente, para transcrever suas sequências codificadoras de RNA a jusante. Além disso, o promotor ou promotores de RNA polimerase II ou III (Pol II ou III) usados como parte do vetor viral pode ser induzível. Qualquer promotor de Pol II ou III induzível adequado pode ser usado com os métodos descritos nesse relatório descritivo. Promotores de Pol II ou III exemplares incluem os promotores responsivos à tetraciclina fornecidos em Ohkawa e Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, páginas 577-585, 2000; e Meissner e cols., Nucleic Acids Research, Vol. 29, páginas
1.672-1.682, 2001, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade.
[142] Exemplos não limitantes de promotores constitutivos que podem ser usados incluem o promotor para ubiquitina, o promotor de CMV (veja, por exemplo, Karasuyama e cols., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), o promotor de β-actina (veja, por exemplo, Gunning e cols., PNAS USA 84: 4.831-
4.835, 1987), o promotor do fator de alongamento-1 alfa (EF- 1 alfa), o promotor de CAG e o promotor de pgk (veja, por exemplo, Adra e cols., Gene 60: 65-74, 1987); Singer-Sam e cols., Gene 32: 409-417, 1984; e Dobson e cols., Nucleic Acids Res. 10: 2.635-2.637, 1982, cada um deles incorporado por referência). Exemplos não limitantes de promotores tecido-específicos incluem o promotor de lck (veja, por exemplo, Garvin e cols., Mol. Cell Biol. 8: 3.058-3.064, 1988; e Takadera e cols., Mol. Cell Biol. 9: 2.173-2.180, 1989), o promotor de miogenina (Yee e cols., Genes and Development 7: 1.277-1.289, 1993) e o promotor de thyl (veja, por exemplo, Gundersen e cols., Gene 113: 207-214, 1992).
[143] Exemplos adicionais de promotores incluem o promotor de ubiquitina-C, o promotor de cadeia pesada µ humana ou o promotor de cadeia pesada de Ig (por exemplo, MH), e o promotor de cadeia leve κ humana ou o promotor de cadeia leve de Ig (por exemplo, EEK), que são funcionais em linfócitos B. O promotor de MH contém o promotor da cadeia pesada µ humana precedido pelo intensificador iEµ flanqueado por regiões de associação à matriz, e o promotor EEK contém o promotor da cadeia leve κ precedido por um intensificador intrônico (iEκ), uma região associada à matriz, e um intensificador 3’ (3Eκ) (veja, por exemplo, Luo e cols., Blood. 113: 1.422-1.431, 2009, e Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2010/0203630). Consequentemente, certas modalidades podem empregar um ou mais desses elementos promotores ou intensificadores.
[144] Em uma modalidade, um promotor dirige a expressão de um marcador selecionável e um segundo promotor dirige a expressão do gene de interesse. Por exemplo, em uma modalidade, o promotor de EF-1 alfa dirige a produção de um marcador de seleção (por exemplo, DHFR) e um promotor de CAG em miniatura (veja, por exemplo, Fan e cols. Human Gene Therapy 10: 2.273–2.285, 1999) dirige a expressão do gene de interesse (por exemplo, IDUA).
[145] Como observado acima, certas modalidades empregam elementos intensificadores, por exemplo, um intensificador interno, para aumentar a expressão do gene de interesse. Intensificadores são elementos de DNA cis-atuantes, normalmente com cerca de 10 a 300 bp de comprimento, que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Sequências intensificadoras podem ser derivadas de genes de mamíferos (por exemplo, globina, elastase, albumina, α-
fetoproteína, insulina), por exemplo, o intensificador , o intensificador intrônico  e o intensificador 3’ . Também estão incluídos intensificadores de um vírus eucariótico, incluindo o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus. Intensificadores podem ser emendados no vetor em uma posição 5’ ou 3’ para a sequência de polinucleotídeos antígeno-específica, mas estão preferivelmente localizados em um sítio 5’ do promotor. Aqueles habilitados na técnica selecionarão o intensificador apropriado com base no padrão de expressão desejado.
[146] Em certas modalidades, promotores são selecionados para permitir a expressão induzível do gene. Diversos sistemas para expressão induzível são conhecidos na técnica, incluindo o sistema responsivo à tetraciclina e o sistema operador-repressor de lac. Também é contemplado que uma combinação de promotores pode ser usada para obter a expressão desejada do gene de interesse. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de selecionar um promotor com base no padrão de expressão desejado do gene no organismo e/ou na célula-alvo de interesse.
[147] Certos vetores virais contêm sequências de empacotamento cis-atuantes para promover incorporação do RNA genômico viral na partícula viral. Exemplos incluem sequências-psi. Essas sequências cis-atuantes são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, os vetores virais descritos nesse relatório descritivo podem expressar dois ou mais genes, o que pode ser obtido, por exemplo, por incorporação de um promotor interno que está ligado operativamente a cada gene separado além do primeiro gene, por incorporação de um elemento que facilita a co-expressão como, por exemplo, um elemento de sequência interna de entrada ribossomal (IRES) (Pat.
U.S.
Nº 4.937.190, incorporada por referência) ou um elemento 2A, ou ambos.
Meramente como ilustração, elementos IRES ou 2A podem ser usados quando um único vetor compreende sequências que codificam cada cadeia de uma molécula de imunoglobulina com uma especificidade desejada.
Por exemplo, a primeira região codificadora (que codifica a cadeia pesada ou leve) pode estar localizada imediatamente a jusante do promotor, e a segunda região codificadora (que codifica a outra cadeia) pode estar localizada a jusante da primeira região codificadora, com um elemento IRES ou 2A localizado entre a primeira e segunda regiões codificadoras, preferivelmente precedendo imediatamente a segunda região codificadora.
Em outras modalidades, um elemento IRES ou 2A é usado para co- expressar um gene não relacionado, por exemplo, um gene- repórter, um marcador selecionável, ou um gene que intensifica a função imune.
Exemplos de sequências IRES que podem ser usadas incluem, sem limitação, os elementos IRES do vírus da encefalomielite (EMCV), o vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da encefalomielite murídea de Theiler (TMEV), rinovírus humano (HRV), coxsackie vírus (CSV), poliovírus (POLIO), vírus da Hepatite A (HAV), vírus da Hepatite C (HCV) e Pestivírus (por exemplo, vírus da cólera do porco (HOCV) e vírus da diarreia viral bovina (BVDV)) (veja, por exemplo, Le e cols., Virus Genes 12: 135-147, 1996; e Le e cols., Nuc.
Acids Res. 25: 362-369, 1997, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade). Um exemplo de um elemento 2A inclui a sequência F2A do vírus da febre aftosa.
[148] Em certas modalidades, os vetores fornecidos nesse relatório descritivo também contêm elementos genéticos adicionais para obter um resultado desejado. Por exemplo, certos vetores virais podem incluir um sinal que facilita a entrada nuclear do genoma viral na célula-alvo, por exemplo, um sinal de flap de HIV-1. Como um exemplo adicional, certos vetores virais podem incluir elementos que facilitam a caracterização do sítio de integração do pró-vírus na célula- alvo, por exemplo, uma sequência supressora de tRNA âmbar. Certos vetores virais podem conter um ou mais elementos genéticos projetados para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, um elemento responsivo ao vírus da hepatite da marmota (WRE) pode ser colocado na construção (veja, por exemplo, Zufferey e cols., J. Virol. 74: 3.668-
3.681, 1999; e Deglon e cols., Hum. Gene Ther. 11: 179-190, 2000, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade). Como outro exemplo, um isolador de β-globina de galinha também pode ser incluído na construção. Foi demonstrado que esse elemento reduz a chance de silenciamento do DNA integrado na célula-alvo em função de efeitos de metilação e heterocromatinização. Além disso, o isolador pode proteger o intensificador interno, promotor e gene exógeno de efeitos posicionais positivos ou negativos de DNA circundante no sítio de integração no cromossomo. Certas modalidades empregam cada um desses elementos genéticos. Em outra modalidade, os vetores virais fornecidos nesse relatório descritivo também podem conter um Elemento de Abertura de Cromatina Ubíquo (UCOE) para aumentar a expressão
(veja, por exemplo, Zhang F, e cols., Molecular Therapy: The journal of the American Society of Gene Therapy, setembro de 2010; 18 (9): 1.640–9).
[149] Em certas modalidades, os vetores virais (por exemplo, retrovirais, lentivirais) fornecidos nesse relatório descritivo são “pseudotipados” com uma ou mais glicoproteínas ou proteínas do envelope virais selecionadas, principalmente para visar tipos de células selecionados. O termo “pseudotipagem” se refere geralmente à incorporação de uma ou mais glicoproteínas virais heterólogas na partícula de vírus na superfície da célula, frequentemente permitindo que a partícula viral infecte uma célula selecionada que difere de sua células-alvo normal. Um elemento “heterólogo” é derivado de um vírus diferente do vírus no qual o genoma de RNA do vetor viral é derivado. Tipicamente, as regiões codificadoras de glicoproteína do vetor viral foram geneticamente alteradas, por exemplo, por deleção, para evitar a expressão de sua própria glicoproteína. Meramente como ilustração, as glicoproteínas do envelope gp41 e/ou gp120 de um vetor lentiviral derivado do HIV são tipicamente deletadas antes da pseudotipagem com uma glicoproteína viral heteróloga.
[150] Em certas modalidades, o vetor viral é pseudotipado com uma glicoproteína viral heteróloga que visa linfócitos B. Em certas modalidades, a glicoproteína viral permite a infecção ou transdução seletiva de linfócitos B em repouso ou quiescentes. Em certas modalidades, a glicoproteína viral permite a infecção seletiva de células plasmáticas de linfócito B, plasmoblastos e células B ativadas. Em certas modalidades, a glicoproteína viral permite a infecção ou transdução de linfócitos B, plasmoblastos, células plasmáticas quiescentes e células B ativadas. Em certas modalidades, a glicoproteína viral permite a infecção de células de leucemia linfocítica crônica de célula B. Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com VSV-G. Em outra modalidade, a glicoproteína viral heteróloga é derivada da glicoproteína do vírus do sarampo, por exemplo, o vírus do sarampo de Edmonton. Certas modalidades pseudotipam as glicoproteínas do vírus do sarampo hemaglutinina (H), proteína de fusão (F), ou ambas (veja, por exemplo, Frecha e cols., Blood. 112: 4.843-52, 2008; e Frecha e cols., Blood. 114: 3.173-80, 2009, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade). Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com o vírus da leucemia símia do gibão (GALV). Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com retrovírus endógeno do gato (RD114). Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com retrovírus endógeno do babuíno (BaEV). Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com o vírus da leucemia murídea (MLV). Em uma modalidade, o vetor viral é pseudotipado com vírus da leucemia símia do gibão (GALV). Em modalidades adicionais, o vetor viral compreende um domínio de ligação ao anticorpo embutido, por exemplo, uma ou mais regiões variáveis (por exemplo, regiões variáveis da cadeia pesada e leve), que serve para direcionar o vetor e um tipo de célula particular.
[151] A geração de vetores virais pode ser obtida usando quaisquer metodologias de engenharia genética adequadas conhecidas na técnica incluindo, sem limitação, as técnicas padronizadas de digestão com endonuclease de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo,
amplificação por PCR e sequenciamento de DNA, por exemplo, como descrito em Sambrook e cols. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin e cols. (“Retroviruses”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) e “RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).
[152] Diversos métodos conhecidos na técnica podem ser usados para produzir partículas retrovirais adequadas cujo genoma compreende uma cópia de RNA do vetor viral. Como um método, o vetor viral pode ser introduzido em uma linhagem de célula de empacotamento que empacota o RNA genômico viral com base no vetor viral em partículas virais com uma especificidade de célula-alvo desejada. A linhagem de célula de empacotamento tipicamente fornece em trans as proteínas virais que são necessárias para empacotamento do RNA genômico viral em partículas virais e infecção da célula-alvo, incluindo as proteínas estruturais gag, as proteínas enzimáticas pol e as glicoproteínas do envelope.
[153] Em certas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento expressa estavelmente certas proteínas virais necessárias ou desejadas (por exemplo, gag, pol) (veja, por exemplo, a Pat. U.S. Nº 6.218.181, incorporada nesse relatório descritivo por referência). Em certas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento é transfectada transitoriamente com plasmídeos que codificam algumas das proteínas virais necessárias ou desejadas (por exemplo, gag, pol, glicoproteína), incluindo as sequências da glicoproteína do vírus do sarampo descritas nesse relatório descritivo. Em uma modalidade exemplar, a linhagem de célula de empacotamento expressa estavelmente as sequências de gag e pol, e a linhagem de célula é então transfectada com um plasmídeo que codifica o vetor viral e um plasmídeo que codifica a glicoproteína. Após introdução dos plasmídeos desejados, as partículas virais são coletadas e processadas de acordo, por exemplo, por ultracentrifugação, para obter um estoque concentrado de partículas virais. Linhagens de células de empacotamento exemplares incluem linhagens de células 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430). Agente terapêutico
[154] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “gene de interesse” ou “gene” ou “ácido nucleico de interesse” se refere a um transgene a ser expresso na célula transfectada-alvo. Embora o termo “gene” possa ser usado, isso não significa um gene como encontrado no DNA genômico e é usado de forma intercambiável com o termo “ácido nucleico”. Geralmente, o ácido nucleico de interesse fornece ácido nucleico adequado para codificação de um agente terapêutico e pode compreender cDNA ou DNA e pode ou não incluir íntrons, mas geralmente não inclui íntrons. Como observado em outra local, o ácido nucleico de interesse está ligado operativamente a sequências de controle da expressão para expressar eficazmente a proteína de interesse na célula- alvo. Em certas modalidades, os vetores descritos nesse relatório descritivo podem compreender um ou mais genes de interesse, e podem incluir 2, 3, 4 ou 5 ou mais genes de interesse como, por exemplo, as cadeias pesadas e leves de uma imunoglobulina que podem ser organizadas usando um promotor interno como descrito nesse relatório descritivo.
[155] A citação “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, como usada nesse relatório descritivo, designa mRNA, RNA, cRNA, cDNA ou DNA. O termo tipicamente se refere à forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA e RNA. O ácido nucleico ou gene de interesse pode ser qualquer ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse.
[156] Um agente terapêutico a ser liberado por uma célula B geneticamente modificada como descrita nesse relatório descritivo pode ser uma proteína. Uma proteína de interesse para uso como descrito nesse relatório descritivo compreende qualquer proteína que forneça uma atividade desejada. A esse respeito, uma proteína de interesse inclui, sem limitação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, um receptor da superfície celular, uma proteína secretada como, por exemplo, uma citocina (linfocinas, interleucinas, interferons ou quimiocinas), outras moléculas de sinalização secretadas como, por exemplo, TGF-beta e fator de crescimento de fibroblasto, um fragmento antigênico de uma proteína, uma pequena molécula codificada por DNA (veja, por exemplo, Nature Chemical Biology 5, 647-654 (2009)), uma enzima, um fator de coagulação e uma molécula de adesão. Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste. Fragmentos de ligação ao antígeno exemplares incluem anticorpos de domínio, sFv, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv. Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica a proteína de interesse como uma proteína de fusão que compreende um vinculador clivável. Por exemplo, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de anticorpo podem ser expressas com um peptídeo vinculador autoclivável, por exemplo, F2A.
[157] Em uma modalidade, o anticorpo codificado pelo ácido nucleico compreende pelo menos o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo neutralizante de HIV, b12 (veja, por exemplo, J. Virol. 2003, 77: 5.863-5.876; J. Virol., agosto de 1994; 68 (8): 4.821-8; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89: 9.339-9.343; sequências exemplares são fornecidas nos Nos de Acesso no GenBank para a cadeia leve (AAB26306.1 Gl 299737) e cadeia pesada (AAB26315.1 Gl 299746)) de b12. Em uma modalidade adicional, o anticorpo codificado pelo ácido nucleico de interesse compreende Fuzeon(TM) (T- 20/enfuvirtida/pentafusida/DP-178). DP-178 é uma sequência de aminoácidos de gp41 em HIV e interfere com a habilidade do HIV para se fundir com sua célula-alvo. Fuzeon pode ser produzido sinteticamente com o uso de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, 2001 J. Virol. 75: 3.038-3.042. Deve ser observado que é altamente improvável que os métodos descritos nesse artigo resultassem na secreção de uma dose terapêutica do peptídeo DP-178).
[158] Em uma modalidade particular, o ácido nucleico de interesse codifica uma proteína imunologicamente ativa. Em certas modalidades, um ácido nucleico de interesse codifica uma proteína, ou um fragmento biologicamente ativo desta (por exemplo, um fragmento antigênico), que induz uma reação imune do tipo vacina por meio da apresentação da proteína na superfície de uma célula B, célula T ou outra célula imune. Em certas modalidades, a proteína de interesse influencia a regulação de células B, por exemplo, sem limitação, promoção da divisão celular, promoção da diferenciação em linhagens B diferentes, inativação ou morte de células, ou regula a produção ou atividade de outros elementos de DNA introduzidos. Interleucinas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e até hoje incluem IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL- 13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL- 25, IL-26, IL-27, forma secretada da subunidade p28 de IL27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL- 32, IL-33, IL-34 e IL-35. Interferons incluem IFN-γ, IFN-α, IFN-β e IFN-ο. As quimiocinas contempladas para uso nesse relatório descritivo incluem as quimiocinas tipo C XCL1 e XCL2, quimiocinas tipo C-C (incluindo até hoje CCL1 - CCL28) e quimiocinas tipo CXC (incluindo até hoje CXCL1 -CXCL17). Também são contemplados como um gene de interesse membros da superfamília TNF (por exemplo, TNF-α, ligante 4-1 BB, fator de ativação de célula B, ligante FAS, Linfotoxina, OX40L RANKL e TRAIL).
[159] Em certas modalidades, a proteína de interesse induz tolerância imunológica. A esse respeito, a proteína de interesse pode compreender uma proteína de fusão IgG- antígeno (veja, por exemplo, Cellular Immunology 235 (1), 2005, 12-20). Em certas modalidades, a expressão de uma proteína de interesse pode ser obtida por estimulação das células com fatores como, por exemplo, TGF-β, IL-10 e LPS. Em certas modalidades, fatores como, por exemplo, IL-10 ou fatores de transcrição que induzem tolerância são expressos com as células B cultivadas.
[160] Em uma modalidade adicional, o(s) gene(s) de interesse codifica um ou mais fatores que promovem diferenciação da célula B em uma célula secretora de anticorpo e/ou um ou mais fatores que promovem a longevidade da célula produtora de anticorpo. Esses fatores incluem, por exemplo, Blimp-1, Xbp1, IRF4, Zbtb20, TRF4, fatores antiapoptóticos como Bcl-xl, Bcl-2, Mcl-1 ou Bcl5, e mutantes constitutivamente ativos do receptor de CD40. Genes de interesse adicionais codificam fatores que promovem a expressão de moléculas de sinalização a jusante como, por exemplo, fatores associados ao receptor de TNF (TRAFs). A esse respeito, ativação celular, sobrevida celular e funções antiapoptóticas da superfamília do receptor de TNF são mediadas principalmente por TRAF 1-6 (veja, por exemplo, R.H. Arch, e cols., Genes Dev. 12 (1998), páginas 2.821-
2.830). Efetores a jusante da sinalização de TRAF incluem fatores de transcrição na família NF-KB e AP-1 que podem ligar genes envolvidos em vários aspectos de funções celulares e imunes. Além disso, foi demonstrado que a ativação de NF-κβ e AP-1 fornece proteção das células contra apoptose por meio da transcrição de genes antiapoptóticos. Em uma modalidade adicional, o fator codificado, por exemplo, IL-10, IL-35, TGF-beta ou uma proteína de fusão-Fc, está associado com indução de tolerância imune.
[161] Em uma modalidade adicional, o(s) ácido(s) nucleico(s) de interesse codifica uma ou mais proteínas derivadas do vírus de Epstein Barr (EBV). Proteínas derivadas de EBV incluem, sem limitação, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP- 1, LMP-2, EBER, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA e EBV-AN. Em uma modalidade particular, o ácido nucleico de interesse codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. A esse respeito, o anticorpo pode ser um anticorpo natural ou um anticorpo customizado, modificado por engenharia genética recombinantemente. Proteínas de fusão que compreendem um anticorpo ou porção deste são especificamente contempladas para serem codificadas pelos vetores descritos nesse relatório descritivo.
[162] Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente revelação possui uma sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-HIV, por exemplo, o anticorpo anti-HIV m36 (veja, por exemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 4 de novembro de 2008; 105 (44): 17.121-6), ou uma molécula de aminoácido que possui pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-HIV, por exemplo, m36. Em particular, proteínas de fusão que compreendem m36, ou derivados destas, são especificamente contempladas, por exemplo, m36L2CD4Fc (veja, por exemplo, Antiviral Research volume 88, Número 1, outubro de 2010, páginas 107-115). Em uma modalidade, o anticorpo anti-HIV é o anticorpo monoclonal amplamente neutralizante VRC01 (veja, por exemplo, Wu e cols., Science, 2010, 329 (5993): 856861 e Li e cols., J. Virol., 2011, 85(17): 8.954-
8.967).
[163] Em uma modalidade adicional, o anticorpo codificado pelo transgene da revelação se liga a um autoantígeno. Em certas modalidades, o autoantígeno a esse respeito está associado ao desenvolvimento de esclerose múltipla ou diabetes Tipo 1 incluindo, sem limitação, MBP, alfa-B- cristalina, S100-beta, proteína proteolipídeo (PLP), HSP105, antígeno 1 da isoforma epitelial de penfigóide bolhoso (BP)
(BPAG1-e), lipídeos, e isoformas de glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG)-alfa e MOG-beta ou qualquer um de diversas autoantígenos de célula da ilhota (por exemplo, sialoglicolipídeo, glutamato descarboxilase, insulina, receptor de insulina, 38 kD, albumina sérica bovina, transportador de glicose, hsp 65, carboxipeptidase H, 52 kD, ICA 12/ICA512, 150 kD, e RIN polar). Anticorpos para esses autoantígenos são conhecidos na técnica e podem ser sequenciados e produzidos recombinantemente com o uso de técnicas de rotina (veja, por exemplo, J. Clin. Invest. 107 (5): 555-564 (2001)).
[164] Em uma modalidade adicional, o anticorpo se liga a um antígeno associado ao câncer. Antígenos associados ao câncer podem ser derivados de diversas proteínas tumorais. Proteínas tumorais ilustrativas úteis na presente revelação incluem, sem limitação, uma ou mais de, p53, MAGE-A1, MAGE- A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88- A, NY-ESO-1, MART-1, MC1 R, Gp100, PSA, PSM, Tirosinase, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her2/neu (por exemplo, o anticorpo pode ser derivado do mAb Her2- específico, Herceptin(R)), hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, -catenina/m, Caspase-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART- 2, TRP-2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARa, e TEL/AML1 . Essas e outras proteínas tumorais são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[165] Em modalidades adicionais, o ácido nucleico de interesse codifica um peptídeo ou outro domínio de ligação com um atributo funcional particular, por exemplo, sem limitação, uma atividade inibidora, habilidade para induzir morte celular em células de câncer, ou habilidade para tornar mais lenta ou inibir a proliferação de células de câncer. A esse respeito, em uma modalidade, um peptídeo ou domínio de ligação codificado pelo ácido nucleico de interesse pode se ligar a qualquer uma das proteínas-alvo descritas nesse relatório descritivo, por exemplo, um antígeno associado ao câncer como descrito acima, CD4, HIV gp120 ou outra proteína viral, ICAM-3, DC-SIGN (veja, por exemplo, Patente U.S.
7.301.010). Em certas modalidades, os peptídeos podem ser derivados de bactérias patogênicas e não patogênicas e plantas verdes. Peptídeos ilustrativos são revelados nas Patentes U.S. 7084105, 7301010, 7338766, 7381701, 7491394, 7511117, 7556810. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica azurina-p28 (NSC745104) um peptídeo inibidor da ubiquitinação de p53 (veja, por exemplo, Cancer Chemother. Pharmacol. 2010, DOI 10.1007/S00280-010-1518-3; Patente U.S. 7.084.105). Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico de interesse codifica um fator conhecido como Grelina, que induz o apetite e pode ser usado para tratar pacientes com câncer (veja, por exemplo, Obes. Facts. 2010 3: 285-92; FASEB J. 18 (3): 439-56). Em outra modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica um peptídeo de ligação que se liga e inibe angiopoietina 1 e 2 (veja, por exemplo, AMG386, um fragmento Fc de um anticorpo (peptibody) usado para tratar câncer. Em certas modalidades, antígenos tumorais podem ser identificados diretamente de um indivíduo com câncer. A esse respeito, podem ser feitas triagens usando diversas tecnologias conhecidas. Por exemplo, em uma modalidade, uma biópsia do tumor é retirada de um paciente, RNA é isolado das células tumorais e avaliada usando um chip de gene (por exemplo, de Affymetrix, Santa Clara, CA) e um antígeno do tumor é identificado. Após o antígeno-alvo do tumor ser identificado, ele pode então ser clonado, expresso e purificado usando metodologias conhecidas na técnica.
[166] Em uma modalidade particular, o ácido nucleico de interesse codifica uma enzima. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica uma enzima para tratar a distúrbio do armazenamento lisossomal. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica iduronidase (IDUA) para o tratamento ou prevenção de mucopolissacaridose tipo I (MPS I). Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica idursulfase para o tratamento ou prevenção de mucopolissacaridose tipo II (MPS II). Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica galsulfase para o tratamento ou prevenção de mucopolissacaridose tipo VI (MPS VI). Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica elosulfase alfa para o tratamento ou prevenção de mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA). Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica agalsidase beta para o tratamento ou prevenção de doença de Fabry. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica agalsidase alfa para o tratamento ou prevenção de doença de Fabry. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica alfa-1-anti-tripsina para o tratamento ou prevenção de deficiência de Alfa-1-anti-tripsina. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica alfa-N- acetilglucosaminidase para o tratamento ou prevenção de mucopolissacaridose tipo IIIB (MPS IIIB). Em outra modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica fator VII para o tratamento ou prevenção de hemofilia. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica lecitina- colesterol aciltransferase (LCAT) útil para o tratamento ou prevenção de, por exemplo, deficiência de LCAT e aterosclerose. Em outra modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica Apolipoproteína A-1 Milano (ApoA-1 Milano) para o tratamento ou prevenção de doenças e distúrbios cardiovasculares, por exemplo, aterosclerose. Em uma modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica lipoproteína-lipase (LPL) para o tratamento ou prevenção de deficiência de LPL. Em outra modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica um anticorpo amplamente neutralizante (bNAb), ou uma proteína de fusão deste, que se liga e neutraliza múltiplas cepas de HIV-1 (por exemplo, b12). Ainda em outra modalidade, o ácido nucleico de interesse codifica fenilalanina hidroxilase para o tratamento ou prevenção de fenilcetonúria (PKU).
[167] O termo “anticorpo”, como usado nesse relatório descritivo, inclui tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais; primatizados (por exemplo, humanizados); murídeos; de camundongo-humano; de camundongo- primata; e quiméricos; e pode ser uma molécula intacta, um fragmento desta (por exemplo, fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab’ e F(ab)’2), ou multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos; e pode ocorrer na natureza ou ser produzido, por exemplo, por imunização, síntese ou engenharia genética; um “fragmento de anticorpo”, como usado nesse relatório descritivo, se refere aos fragmentos,
derivados ou relacionados a um anticorpo, que se ligam ao antígeno e que, em algumas modalidades, podem ser derivatizados para exibir características estruturais que facilitam a depuração e captação, por exemplo, pela incorporação de resíduos de galactose. Isso inclui, por exemplo, F(ab), F(ab)’2, scFv, região variável da cadeia leve (VL), região variável da cadeia pesada (VH), e combinações destes. Fontes incluem sequências de gene de anticorpo de várias espécies (que podem ser formatadas como anticorpos, sFvs, scFvs ou Fabs, por exemplo, em uma biblioteca de fago), incluindo sequências humanas, de camelídeos (de camelos, dromedários ou lhamas; Hamers-Casterman e cols. (1993) Nature, 363: 446 e Nguyen e cols. (1998) J. Mol. Biol., 275: 413), de tubarão (Roux e cols. (1998) Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 95: 11.804), de peixes (Nguyen e cols. (2002) Immunogenetics, 54: 39), roedores, aviárias, ovinas, que codificam bibliotecas de peptídeos aleatórios ou sequências que codificam uma diversidade modificada geneticamente de aminoácidos em regiões de alça de arcabouços não-anticorpo alternativos, por exemplo, domínios de fibrinogênio (veja, por exemplo, Weisel e cols. (1985) Science 230: 1.388), domínios de Kunitz (veja, por exemplo, Patente U.S. Nº
6.423.498), domínios de lipocalina (veja, por exemplo, WO 2006/095164), domínios V-like (veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2007/0065431), domínios de lectina tipo-C (Zelensky e Gready (2005) FEBS J. 272: 6.179) etc. (veja, por exemplo, Publicações de Pedidos de Patente PCT Nos WO 2007/098934; WO 2006/072620), ou semelhantes.
[168] Termos subentendidos por aqueles habilitados na técnica como se referindo à tecnologia de anticorpo recebem,
cada um, o significado adquirido na técnica, salvo quando expressamente definido nesse relatório descritivo. Por exemplo, os termos “VL” e “VH” se referem à região de ligação variável derivada da cadeia leve e pesada de um anticorpo, respectivamente. As regiões de ligação variáveis são constituídas por subregiões distintas, bem definidas, conhecidas como “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs) e “regiões framework” (FRs). Os termos “CL” e “CH” se referem a uma “região constante de imunoglobulina”, ou seja, uma região constante derivada de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo, respectivamente, com a última região subentendida por ser ainda divisível em domínios da região constante Cm, CH2, CH3 e CH4, dependendo do isótipo de anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) do qual a região foi derivada. Uma porção dos domínios da região constante constitui a região Fc (a região do “fragmento cristalizável”), que contém domínios responsáveis pelas funções efetoras de uma imunoglobulina, por exemplo, ADCC (citotoxicidade mediada por células anticorpo-dependente), CDC (citotoxicidade dependente de complemento) e fixação de complemento, ligação aos receptores Fc, maior meia-vida in vivo em relação a um polipeptídeo desprovido de uma região Fc, ligação à proteína A e, talvez, até mesmo transferência placentária (veja Capon e cols. (1989) Nature, 337: 525). Além disso, um polipeptídeo que contém uma região Fc permite a dimerização ou multimerização do polipeptídeo.
[169] A estrutura de domínio de imunoglobulinas é passível de modificação por engenharia genética, na medida em que os domínios de ligação ao antígeno e os domínios que conferem funções efetoras podem ser trocados entre classes e subclasses de imunoglobulina. Por exemplo, alterações de aminoácidos (por exemplo, deleções, inserções, substituições) podem alterar processos pós-tradução da imunoglobulina, por exemplo, alteração do número ou posição de sítios de glicosilação e/ou fucosilação. Métodos para aumento da ADCC por meio de glicosilação são conhecidos na técnica e contemplados para uso nesse relatório descritivo. Por exemplo, enzimas que aumentam a glicosilação podem ser co-expressas com o anticorpo. Em uma modalidade, MGAT3 é superexpressa em células produtoras do anticorpo para aumentar a glicosilação do anticorpo e sua função ADCC. Em uma modalidade, a inibição de Fut8 por meio, por exemplo, de siRNA, aumenta a glicosilação do anticorpo e ADCC.
[170] A estrutura e função de imunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow e cols., Eds., “Antibodies: A Laboratory Manual”, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Uma introdução extensa, além de informação detalhada sobre todos os aspectos da tecnologia de anticorpo recombinante, pode ser encontrada no livro-texto “Recombinant Antibodies” (John Wiley & Sons, NY, 1999). Uma coleção abrangente de protocolos laboratoriais detalhados de modificação por engenharia genética de anticorpos pode ser encontrada em R. Kontermann e S. Dubel, Eds., “The Antibody Engineering Lab Manual” (Springer Verlag, Heidelberg/Nova York, 2000). Protocolos relacionados adicionais também estão disponíveis em “Current Protocols in Immunology” (agosto de 2009,) publicado por John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA. Métodos para a produção de enzimas e modificação por engenharia genética de proteínas (por exemplo, IDUA) também são conhecidos na técnica e contemplados para uso nesse relatório descritivo.
[171] Dessa forma, essa revelação fornece polinucleotídeos (isolados ou purificados ou polinucleotídeos puros) que codificam agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas de interesse) dessa revelação para modificar geneticamente células B, vetores (incluindo vetores de clonagem e vetores de expressão) que compreendem esses polinucleotídeos, e células (por exemplo, células hospedeiras) transformadas ou transfectadas com um polinucleotídeo ou vetor de acordo com essa revelação. Em certas modalidades, um polinucleotídeo (DNA ou RNA) que codifica uma proteína de interesse dessa revelação é contemplado. Cassetes de expressão que codificam proteínas de interesse também são contemplados nesse relatório descritivo.
[172] A presente revelação também está relacionada aos vetores que incluem um polinucleotídeo dessa revelação e, em particular, às construções de expressão recombinante. Em uma modalidade, essa revelação contempla um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína dessa revelação, juntamente com outras sequências de polinucleotídeos que causam ou facilitam a transcrição, tradução e processamento de sequências que codificam uma proteína desse tipo. Vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são descritos, por exemplo, em Sambrook e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Vetores de clonagem/expressão exemplares incluem vetores de clonagem, vetores shuttle e construções de expressão, que podem ser baseados em plasmídeos, fagomídeos, fasmídeos, cosmídeos, vírus, cromossomos artificiais, ou qualquer veículo de ácido nucleico conhecido na técnica adequado para amplificação, transferência e/ou expressão de um polinucleotídeo nele contido.
[173] Como usado nesse relatório descritivo, salvo quando descrito de outro modo com relação aos vetores virais, o termo “vetor” significa uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Vetores exemplares incluem plasmídeos, minicírculos, transposons (por exemplo, transposon Sleeping Beauty), cromossomos artificiais de levedura, RNAs auto-replicantes, e genomas virais. Certos vetores podem replicar autonomamente em uma célula hospedeira, enquanto outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira e, dessa forma, são replicados com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são referidos nesse relatório descritivo como “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”), que contêm sequências de ácidos nucleicos que estão ligadas operativamente a uma sequência de controle da expressão e, portanto, são capazes de dirigir a expressão daquelas sequências. Em certas modalidades, as construções de expressão são derivadas de vetores de plasmídeo. Construções ilustrativas incluem vetor pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que possui sequências de ácidos nucleicos que codificam um gene de resistência à ampicilina, um sinal de poliadenilação e um sítio do promotor T7; pDEF38 e pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), que possuem um promotor de CHEF1; e pD18 (Lonza), que possui um promotor de CMV. Outros vetores de expressão mamíferos adequados são bem conhecidos (veja, por exemplo, Ausubel e cols., 1995; Sambrook e cols., supra; veja também, por exemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, Wl; Pharmacia, Piscataway, NJ).
[174] Podem ser preparadas construções úteis que incluem uma sequência que codifica diidrofolato redutase (DHFR) sob controle regulatório adequado, para promoção de níveis de produção aumentados das proteínas de fusão, cujos níveis resultam de amplificação gênica após aplicação de um agente de seleção apropriado (por exemplo, metotrexato). Em uma modalidade, o uso de um transposon bifuncional que codifica um gene terapêutico (por exemplo, IDUA) juntamente com DHFR resistente a fármacos em combinação com incubação em metotrexato (MTX) para enriquecer células B transpostas com sucesso, gera um produto mais potente.
[175] Geralmente, vetores de expressão recombinante incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação da célula hospedeira, e um promotor derivado de um gene altamente expresso para dirigir a transcrição de uma sequência estrutural a jusante, como descrito acima. Um vetor em ligação operável com um polinucleotídeo de acordo com essa revelação gera uma construção de clonagem ou de expressão. Construções de clonagem/de expressão exemplares contêm pelo menos um elemento de controle da expressão, por exemplo, um promotor, ligado operativamente a um polinucleotídeo dessa revelação. Elementos de controle da expressão adicionais, por exemplo, intensificadores, sítios de ligação fator-específicos, terminadores e sítios de ligação ao ribossomo também estão contemplados nos vetores e construções de clonagem/de expressão de acordo com essa revelação. A sequência estrutural heteróloga do polinucleotídeo de acordo com essa revelação é montada em fase apropriada com sequências de iniciação e terminação da tradução. Dessa forma, por exemplo, ácidos nucleicos codificadores como fornecidos nesse relatório descritivo podem ser incluídos em qualquer uma de diversas construções de vetor de expressão (por exemplo, minicírculos) como uma construção de expressão recombinante para expressão de uma proteína desse tipo em uma célula hospedeira.
[176] A(s) sequência(s) de DNA apropriada(s) pode ser inserida em um vetor, por exemplo, por diversos procedimentos. Em geral, uma sequência de DNA é inserida em um sítio(s) de clivagem de endonuclease de restrição apropriado por procedimentos conhecidos na técnica. Técnicas padronizadas para clonagem, isolamento, amplificação e purificação de DNA, para reações enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e semelhantes, e várias técnicas de separação, são contempladas. Diversas técnicas padronizadas são descritas, por exemplo, em Ausubel e cols. (“Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook e cols. (“Molecular Cloning”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis e cols. (“Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (“DNA Cloning”, Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames e Higgins (Eds.) (“Nucleic Acid Hybridization”, IRL Press, Oxford, UK, 1985); e em outros locais.
[177] A sequência de DNA no vetor de expressão está ligada operativamente a pelo menos uma sequência de controle da expressão apropriada (por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor regulado) para dirigir a síntese de mRNA. Exemplos representativos dessas sequências de controle da expressão incluem promotores de células eucarióticas ou seus vírus, como descrito acima. Regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado usando vetores de CAT (cloranfenicol transferase), vetores de canamicina, ou outros vetores com marcadores selecionáveis. Promotores eucarióticos incluem promotor precoce imediato de CMV, de timidina quinase de HSV, precoce e tardio de SV40, LTRs de retrovírus e metalotioneína-1 de camundongo. A seleção do vetor e promotor apropriados faz parte dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica, e a preparação de certas construções de expressão recombinante particularmente preferidas que compreendem pelo menos um promotor ou promotor regulado ligado operativamente a um ácido nucleico que codifica uma proteína ou polipeptídeo de acordo com essa revelação é descrita nesse relatório descritivo.
[178] Por exemplo, em uma modalidade, o vetor pode ser um plasmídeo que possui a estrutura mostrada na FIG. 1b. Em uma modalidade, o plasmídeo pode compreender uma sequência do ID. DE SEQ. Nº: 1. Em uma modalidade, o plasmídeo pode consistir em uma sequência do ID. DE SEQ. Nº: 1. Em uma modalidade, o plasmídeo pode compreender ou consistir em uma sequência que é pelo menos cerca de 60% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1. Em uma modalidade, o plasmídeo pode compreender ou consistir em uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1, ou pelo menos cerca de 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1.
[179] Variantes dos polinucleotídeos dessa revelação também estão contempladas. Polinucleotídeos variantes são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e, preferivelmente, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticos a um dos polinucleotídeos de sequência definida como descrito nesse relatório descritivo, ou que hibridiza para um daqueles polinucleotídeos de sequência definida sob condições de hibridização rigorosas de 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio em torno de 65-68°C ou 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio e formamida 50% em torno de 42°C. As variantes de polinucleotídeo retêm a capacidade para codificar um domínio de ligação ou proteína de fusão destes que possui a funcionalidade descrita nesse relatório descritivo.
[180] O termo “rigorosas” é usado para se referir às condições que são comumente subentendidas na técnica como rigorosas. O rigor da hibridização é determinado principalmente pela temperatura, força iônica, e pela concentração de agentes desnaturantes como, por exemplo, formamida. Exemplos de condições rigorosas para hibridização e lavagem são 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio em torno de 65-68°C ou 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio, e formamida 50% em torno de 42°C (veja Sambrook e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Condições mais rigorosas (por exemplo, temperatura maior, força iônica menor, formamida maior, ou outro agente desnaturante) também podem ser usadas; no entanto, a taxa de hibridização será afetada. Quando é necessária a hibridização de desoxioligonucleotídeos, condições de hibridização rigorosas exemplares adicionais incluem lavagem em 6x SSC, pirofosfato de sódio 0,05% a 37°C (para oligonucleotídeos de 14 bases), 48°C (para oligonucleotídeos de 17 bases), 55°C (para oligonucleotídeos de 20 bases), e 60°C (para oligonucleotídeos de 23 bases).
[181] Um aspecto adicional dessa revelação fornece uma célula hospedeira transformada ou transfectada com, ou que de algum outro modo contém, qualquer um dos polinucleotídeos ou construções de vetor/expressão dessa revelação. Os polinucleotídeos ou construções de clonagem/de expressão dessa revelação são introduzidos em células adequadas com o uso de qualquer método conhecido na técnica, incluindo transformação, transfecção e transdução. Células hospedeiras incluem as células de um indivíduo submetido à terapia de células ex vivo incluindo, por exemplo, terapia gênica ex vivo. Células hospedeiras eucarióticas contempladas como um aspecto dessa revelação quando abrigam um polinucleotídeo, vetor ou proteína de acordo com essa revelação incluem, além das células do próprio indivíduo (por exemplo, as próprias células de um paciente humano), células VERO, células HeLa, linhagens de células de ovário de hamster chinês (CHO) (incluindo células CHO modificadas capazes de modificar o padrão de glicosilação de moléculas de ligação multivalentes expressas; veja a Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº 2003/01 15614), células COS (por exemplo, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células HEK293, células HepG2, células N, células 3T3, células de Spodoptera frugiperdas (por exemplo, células Sf9), células de Saccharomyces cerevisiae, e qualquer outra célula eucariótica conhecida na técnica como sendo útil na expressão e, opcionalmente, isolamento, de uma proteína ou peptídeo de acordo com essa revelação. Também são contempladas células procarióticas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, um estreptomiceto, ou qualquer célula procariótica conhecida na técnica como sendo adequada para expressão e, opcionalmente, isolamento, de uma proteína ou peptídeo de acordo com essa revelação. No isolamento de proteína ou peptídeo de células procarióticas, em particular, é contemplado que metodologias conhecidas na técnica para extração de proteína de corpos de inclusão podem ser usadas. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro do escopo daqueles habilitados na técnica a partir dos ensinamentos apresentados nesse relatório descritivo. Células hospedeiras que glicosilam a proteínas de fusão dessa revelação são contempladas.
[182] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”) se refere a uma célula que contém um vetor de expressão recombinante. Deve ser subentendido que esses termos visam se referir não apenas à célula em questão particular, mas à prole dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações que se sucedem em função de mutação ou influências ambientais, essa prole pode, na verdade, não ser idêntica à célula parental, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo “célula hospedeira”, como usado nesse relatório descritivo. Células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em um meio nutriente convencional modificado como apropriado para ativação de promotores, seleção de transformantes ou amplificação de genes particulares.
As condições de cultura para células hospedeiras particulares selecionadas para expressão, por exemplo, temperatura, pH e semelhantes, serão prontamente evidentes para aqueles habilitados na técnica.
Vários sistemas de cultura de células de mamíferos também podem ser empregados para expressar proteína recombinante.
Exemplos de sistemas de expressão de mamíferos incluem as linhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritas por Gluzman (1981) Cell 23: 175, e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.
Vetores de expressão de mamíferos compreenderão uma origem de replicação, um promotor adequado e, opcionalmente, intensificador, e também quaisquer sítios de ligação ao ribossomo, sítios de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de emenda, sequências de terminação da transcrição e sequências não transcritas de flanqueamento 5’ necessárias, por exemplo, como descrito nesse relatório descritivo em relação à preparação de construções de expressão de proteínas de ligação multivalentes.
Sequências de DNA derivadas da emenda de SV40, e sítios de poliadenilação podem ser usados para fornecer os elementos genéticos não transcritos necessários.
A introdução da construção na célula hospedeira pode ser efetuada por diversos métodos com os quais aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados, incluindo transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana ou eletroporação (Davis e cols. (1986) “Basic Methods in Molecular Biology”).
Células e composições
[183] Em uma modalidade, as células B modificadas descritas nesse relatório descritivo foram ativadas/ diferenciadas in vitro e transfectadas para expressar um agente terapêutico como descrito nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, as células B modificadas descritas nesse relatório descritivo foram ativadas/diferenciadas in vitro e modificadas geneticamente (por exemplo, usando uma abordagem de integração direcionada de transgene como, por exemplo, uma integração de transgene mediada por dedo de zinco-nuclease, TALEN, meganuclease ou CRISPR/CAS9) para expressar um agente terapêutico como descrito nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, as composições compreendem células B que foram diferenciadas em células plasmáticas B, foram transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente e expressam uma ou mais proteínas de interesse. Populações de célula-alvo, por exemplo, as populações de células B transfectadas ou de algum outro modo modificadas geneticamente e ativadas da presente revelação podem ser administradas isoladamente, ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes como, por exemplo, citocinas ou populações de células.
[184] Em uma modalidade, as células B modificadas que foram modificadas geneticamente para expressar uma ou mais proteínas de interesse são coletadas da cultura após ativação/diferenciação in vitro em um ponto do tempo no qual as células B modificadas possuem capacidade migratória ótima para um quimioatraente em particular. Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser no dia
7, dia 8, ou dia 9 da cultura de células B.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser no dia 5, dia 6, ou dia 7 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser no dia 8 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética ou mais tarde em cultura do que o dia 8 após transfecção ou modificação por engenharia genética (por exemplo, dia 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais tarde do que o dia 20). Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser antes do dia 10 da cultura de células B.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser antes do dia 8 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser no dia 6 ou dia 7 da cultura de células B.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser no dia 4 ou dia 5 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser antes do dia 9 da cultura de células B.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima pode ser antes do dia 7 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima é ótima para célula B modificada que migra para CXCL12. Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima é ótima para célula B modificada que migra para a medula óssea de um indivíduo que recebe uma ou mais administrações das células B modificadas.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL12 e/ou para a medula óssea de um indivíduo aproximadamente desde o dia 7 até aproximadamente o dia 9 em cultura.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL12 e/ou para a medula óssea de um indivíduo aproximadamente desde o dia 5 até aproximadamente o dia 7 em cultura após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL12 e/ou para a medula óssea de um indivíduo aproximadamente antes do dia 10 em cultura.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL12 e/ou para a medula óssea de um indivíduo aproximadamente antes do dia 8 em cultura após transfecção ou modificação por engenharia genética.
Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima é ótima para célula B modificada que migra para CXCL13. Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima é ótima para célula B modificada que migra para um local de inflamação em um indivíduo que recebe uma ou mais administrações das células B modificadas.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL13 e/ou para um local de inflamação no indivíduo em torno do dia 6 ou em torno do dia 7 em cultura.
Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL13 e/ou para um local de inflamação no indivíduo em torno do dia 4 ou em torno do dia 5 em cultura após transfecção ou modificação por engenharia genética. Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL13 e/ou para um local de inflamação aproximadamente antes do dia 10 em cultura. Em algumas modalidades, as células B são coletadas para administração a um indivíduo na capacidade migratória ótima para CXCL13 e/ou para um local de inflamação aproximadamente antes do dia 8 em cultura após transfecção ou modificação por engenharia genética.
[185] Em algumas modalidades, a capacidade migratória ótima é ótima para célula B modificada que migra tanto para CXCL12 quanto para CXCL13. Em algumas modalidades, as células B são coletadas na capacidade migratória ótima para migração tanto para CXCL12 quanto para CXCL13 no dia 7 da cultura de células B. Em algumas modalidades, as células B são coletadas na capacidade migratória ótima para migração tanto para CXCL12 quanto para CXCL13 no dia 5 da cultura de células B após transfecção ou modificação por engenharia genética.
[186] Em algumas modalidades, as células B modificadas geneticamente são coletadas quando pelo menos cerca de 20%, das células B migram em um ensaio de quimiotaxia para um quimioatraente particular. Por exemplo, mas não limitado ao exemplo, as células B modificadas geneticamente (por exemplo, que produzem IDUA) podem ser coletadas quando pelo menos cerca de 20% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia para CXCL12. Ou, em outro exemplo não limitante, as células B modificadas geneticamente (por exemplo, que produzem IDUA) podem ser coletadas quando pelo menos cerca de 20% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia para CXCL13. Além disso, as células B modificadas geneticamente
(por exemplo, que produzem IDUA) podem ser coletadas quando pelo menos cerca de 30% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia para um quimioatraente particular (por exemplo, CXCL12 ou CXCL13), ou quando pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, ou pelo menos cerca de 70% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia para um quimioatraente particular (por exemplo, CXCL12 ou CXCL13). Além disso, as células B modificadas geneticamente (por exemplo, que produzem IDUA) podem ser coletadas quando mais do que 70% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia. Esses ensaios de quimiotaxia são conhecidos na técnica e são descritos nesse relatório descritivo (veja, por exemplo, Exemplo 6 nesse relatório descritivo).
[187] Resumidamente, as composições de células da presente revelação podem compreender uma população de células B diferenciadas e ativadas que foi transfectada e expressa um agente terapêutico como descrito nesse relatório descritivo, em combinação com um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Essas composições podem compreender tampões como, por exemplo, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer-lactato e semelhantes; carboidratos como, por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranas, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos como, por exemplo, glicina; antioxidantes; agentes quelantes como, por exemplo, EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente revelação são preferivelmente formuladas para administração intravenosa ou subcutânea.
[188] Em uma modalidade, uma composição de células é avaliada quanto à pureza antes da administração. Em outra modalidade, uma composição de células é testada quanto à robustez da produção de agente terapêutico. Em uma modalidade, uma composição de células é testada quanto à esterilidade. Em outra modalidade, uma composição de células é avaliada para confirmar que ela combina com o indivíduo receptor.
[189] Em uma modalidade, uma população de células B modificadas geneticamente é avaliada quanto à policlonalidade antes da administração a um indivíduo. A confirmação da policlonalidade do produto de células final é um parâmetro de segurança importante. Especificamente, a emergência de um clone dominante é considerada potencialmente como um fator contribuinte para tumorigênese ou doença autoimune in vivo. A policlonalidade pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na técnica ou descrito nesse relatório descritivo. Por exemplo, em algumas modalidades, a policlonalidade é avaliada por sequenciamento (por exemplo, por sequenciamento profundo) dos receptores de célula B expressos em uma população de células B modificadas geneticamente. Como o receptor de célula B passa por alterações durante o desenvolvimento de célula B que o tornam único entre células B, esse método permite a quantificação de quantas células compartilham a mesma sequência de receptor de célula B (o que significa que são clonais). Dessa forma, em algumas modalidades, quanto mais células B em uma população de células B modificadas geneticamente que expressam a mesma sequência de receptor de célula B, mais clonal a população e, portanto, menos segura é a população para administração a um indivíduo. Inversamente, em algumas modalidades, quanto menos células B em uma população de células B modificadas geneticamente que expressam a mesma sequência de receptor de célula B, menos clonal é a população (ou seja, mais policlonal) e, dessa forma, mais segura é a população para administração a um indivíduo.
[190] Em algumas modalidades, as células B modificadas geneticamente são administradas a um indivíduo após ter sido determinado que elas são suficientemente policlonais. Por exemplo, as células B modificadas geneticamente podem ser administradas a um indivíduo após ter sido determinado que nenhum clone de célula B particular na população final compreende mais do que cerca de 0,2% da população total de células B. As células B modificadas geneticamente podem ser administradas a um indivíduo após ter sido determinado que nenhum clone de célula B particular na população final compreende mais do que cerca de 0,1% da população total de células B, ou mais do que cerca de 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05% ou cerca de 0,04%, da população total de células B. Em modalidades particulares, as células B modificadas geneticamente (por exemplo, que produzem IDUA) são administradas a um indivíduo após ter sido determinado que nenhum clone de célula B particular na população final compreende mais do que cerca de 0,03% da população total de células B.
[191] Em uma modalidade, uma composição de células é armazenada e/ou enviada a 4°C. Em outra modalidade, uma composição de células é congelada para armazenamento e/ou envio. Uma composição de células pode ser congelada, por exemplo, a -20°C ou -80°C. Em uma modalidade, uma etapa de congelamento de uma composição de células compreende nitrogênio líquido. Em uma modalidade, uma composição de células é congelada usando um congelador com taxa controlada. Consequentemente, os métodos descritos nesse relatório descritivo podem ainda incluir uma etapa de descongelamento. Métodos de uso
[192] Um aspecto da presente invenção é dirigido à liberação de longo prazo in vivo de um agente terapêutico. Em modalidades particulares, as células B modificadas são usadas em métodos de tratamento e/ou prevenção de doenças e distúrbios crônicos.
[193] As células B modificadas descritas nesse relatório descritivo podem ser administradas de uma forma apropriada para a doença ou distúrbio a ser tratado ou evitado. A quantidade e frequência de administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente, e o tipo e severidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por experimentos clínicos.
[194] Em uma modalidade, uma dose única de células B modificadas é administrada a um indivíduo. Em uma modalidade, duas ou mais doses de células B modificadas são administradas sequencialmente a um indivíduo. Em uma modalidade, três doses de células B modificadas são administradas sequencialmente a um indivíduo. Em uma modalidade, uma dose de células B modificadas é administrada semanalmente, bissemanalmente, mensalmente, bimensalmente, trimestralmente, semi- anualmente, anualmente ou bianualmente a um indivíduo. Em uma modalidade, uma segunda dose ou dose subsequente de células B modificadas é administrada a um indivíduo quando uma quantidade de um agente terapêutico produzido pelas células B modificadas diminui.
[195] Em uma modalidade, uma dose de células B modificadas é administrada a um indivíduo em certa frequência (por exemplo, semanalmente, bissemanalmente, mensalmente, bimensalmente ou trimestralmente) até que uma quantidade desejada (por exemplo, uma quantidade eficaz) de um agente terapêutico seja detectada no indivíduo. Em uma modalidade, uma quantidade do agente terapêutico é monitorada no indivíduo. Em uma modalidade, uma dose subsequente de células B modificadas é administrada ao indivíduo quando a quantidade do agente terapêutico produzido pelas células B modificadas diminui abaixo da quantidade desejada. Em uma modalidade, a quantidade desejada é uma faixa que produz o efeito desejado. Por exemplo, em um método para a redução da quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) em um indivíduo com MPS I, uma quantidade desejada de IDUA é uma quantidade que diminui o nível de GAGs em certo tecido em comparação com o nível de GAGs na ausência de IDUA.
[196] Quando “uma quantidade eficaz”, “uma quantidade antitumoral eficaz”, “uma quantidade de inibição tumoral eficaz” ou “quantidade terapêutica” é indicada, a quantidade precisa das composições da presente revelação a ser administrada pode ser determinada por um médico considerando as diferenças individuais em termos de idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase, e condição do paciente (indivíduo). Composições de células B também podem ser administradas várias vezes em uma dosagem (ou dosagens) apropriada(s). As células podem ser administradas por utilização de técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (veja, por exemplo, Rosenberg e cols., New Eng. J. of Med. 319: 1.676, 1988).
[197] A dosagem e regime de tratamento ótimos para um paciente particular podem ser determinados por aqueles habilitados na técnica de medicina por monitoramento do paciente quanto aos sinais de doença e ajuste do tratamento de acordo. O tratamento também pode ser ajustado após medição dos níveis de um agente terapêutico (por exemplo, um gene ou proteína de interesse) em uma amostra biológica (por exemplo, fluido corporal ou amostra de tecido), o que também pode ser usado para avaliar a eficácia do tratamento, e o tratamento pode ser ajustado de acordo para aumentar ou diminuir. Tipicamente, em estudos de imunoterapia adotiva relacionados, células T antígeno-específicas são administradas aproximadamente a 2 x 109 até 2 x 1011 células ao paciente (veja, por exemplo, a Pat. U.S. Nº 5.057.423).
[198] Em alguns aspectos da presente revelação, uma dosagem ótima das células B modificadas para um regime multidoses pode ser determinada determinando-se primeiro uma concentração de dose única ótima das células B para um indivíduo, diminuindo-se o número de células B presentes na concentração de dose única ótima para fornecer uma concentração de dose única subótima das células B modificadas, e administrando-se duas ou mais dosagens da concentração de dose única subótima de células B modificadas ao indivíduo. Em alguns aspectos, 2, 3 ou mais dosagens de uma concentração de dose única subótima de células B modificadas são administradas ao indivíduo. Em alguns aspectos, a administração de 2, 3 ou mais dosagens de uma concentração de dose única subótima de células B modificadas a um indivíduo resulta na produção sinérgica in vivo de um polipeptídeo terapêutico que as células B modificadas são modificadas geneticamente para expressar. Em alguns aspectos, a concentração de dose única subótima compreende 1/2 ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes, ou menos do que a concentração de dose única ótima. Em alguns aspectos, o polipeptídeo terapêutico é IDUA. Em alguns aspectos, o polipeptídeo terapêutico é fator de coagulação humano X (FIX). Em alguns aspectos, o polipeptídeo terapêutico é Lecitina–colesterol aciltransferase humana (LCAT). Em alguns aspectos, o polipeptídeo terapêutico é lipoproteína-lipase humana (LPL).
[199] Em alguns aspectos da presente revelação, números menores das células B transfectadas da presente revelação, na faixa de 106/quilograma (106-1011 por paciente) podem ser administrados. Em certas modalidades, as células B são administradas a 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 ou 1 x 1012 células ao indivíduo. As composições de células B podem ser administradas várias vezes em dosagens dentro dessas faixas. As células podem ser autólogas ou heterólogas (por exemplo, alogênicas) para o paciente submetido à terapia. Se desejado, o tratamento também pode incluir a administração de mitógenos (por exemplo, PHA) ou linfocinas, citocinas e/ou quimiocinas (por exemplo, GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-13, IL-21, Flt3-L, RANTES, MIP1α BAFF etc.) como descrito nesse relatório descritivo para aumentar a indução de uma resposta imune e enxerto das células B infundidas.
[200] A administração das composições individuais pode ser realizada em qualquer forma conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições descritas nesse relatório descritivo podem ser administradas a um paciente por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intratecal, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.) ou por via intraperitoneal. As composições descritas nesse relatório descritivo podem ser administradas a um paciente diretamente no sistema nervoso. Em uma modalidade, as composições de células B da presente revelação são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em outra modalidade, as composições de células B como descritas nesse relatório descritivo são preferivelmente administradas por injeção i.v. As composições de células B podem ser injetadas diretamente em um tumor, linfonodo, medula óssea ou local de infecção.
[201] Ainda em outra modalidade, a composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (veja Langer, 1990, Science 249: 1.527-1.533; Sefton 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald e cols., 1980; Surgery 88: 507; Saudek e cols., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (veja “Medical Applications of Controlled Release”, 1974, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla.; “Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance”, 1984, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova York; Ranger e Peppas, 1983; J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; veja também Levy e cols., 1985, Science 228: 190;
During e cols., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard e cols., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado nas proximidades do alvo terapêutico sendo necessária, dessa forma, somente uma pequena fração da dose sistêmica (veja, por exemplo, “Medical Applications of Controlled Release”, 1984, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., vol. 2, páginas 115-138).
[202] As composições de células B da presente revelação também podem ser administradas com o uso de diversas matrizes. Matrizes têm sido utilizadas há vários anos dentro do contexto de engenharia genética de tecidos (veja, por exemplo, “Principles of Tissue Engineering” (Lanza, Langer, e Chick (eds.)), 1997. A presente revelação utiliza essas matrizes dentro do novo contexto de ação como um órgão linfóide artificial para dar suporte e manter as células B. Consequentemente, a presente revelação pode utilizar aquelas composições e formulações de matriz que demonstraram utilidade na engenharia genética de tecidos. Consequentemente, o tipo de matriz que pode ser usada nas composições, dispositivos e métodos da revelação é praticamente ilimitado e pode incluir tanto matrizes biológicas quanto matrizes sintéticas. Em um exemplo particular, as composições e dispositivos apresentados pelas Patentes U.S. Nos: 5.980.889; 5.913.998; 5.902.745;
5.843.069; 5.787.900; ou 5.626.561 são utilizados. Matrizes compreendem características comumente associadas ao fato de serem biocompatíveis quando administradas a um hospedeiro mamífero. Matrizes podem ser formadas por materiais naturais e/ou sintéticos. As matrizes podem ser não biodegradáveis quando for desejável deixar estruturas permanentes ou estruturas removíveis no corpo de um animal, por exemplo, um implante; ou biodegradáveis. As matrizes podem assumir a forma de esponjas, implantes, tubos, Telfa Pads, fibras, fibras ocas, componentes liofilizados, géis, pós, composições porosas ou nanopartículas. Além disso, matrizes podem ser projetadas para permitir a liberação sustentada de células semeadas ou citocina ou outro agente ativo produzido. Em certas modalidades, a matriz da presente revelação é flexível e elástica, e pode ser descrita como um arcabouço semi-sólido que é permeável a substâncias como, por exemplo, sais inorgânicos, fluidos aquosos e agentes gasosos dissolvidos, incluindo oxigênio.
[203] Uma matriz é usada nesse relatório descritivo como um exemplo de uma substância biocompatível. No entanto, a presente revelação não está limitada às matrizes e, dessa forma, sempre que os termos matriz ou matrizes aparecem, esses termos devem ser subentendidos como incluindo dispositivos e outras substâncias que permitem a retenção celular ou a passagem celular, são biocompatíveis, e são capazes de permitir a passagem de macromoléculas diretamente através da substância, de modo que a própria substância seja uma membrana semipermeável ou usada em conjunto com uma substância semipermeável particular.
[204] Em certas modalidades da presente revelação, células B transfectadas e ativadas usando os métodos descritos nesse relatório descritivo, ou outros métodos conhecidos na técnica, são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) qualquer uma de diversas modalidades de tratamento relevantes incluindo, sem limitação, tratamento com agentes como, por exemplo, agentes antivirais, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores como, por exemplo, ciclosporina, bisulfin, bortezomib, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos como, por exemplo, CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias com anticorpo, citotoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteróides, FR901228, citocinas e irradiação.
Esses fármacos inibem a fosfatase calcineurina cálcio-dependente (ciclosporina e FK506), o proteassoma (bortezomib), ou inibem a p70S6 quinase, que é importante para a sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina). (Liu e cols., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson e cols., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer e cols., Curr.
Opin.
Immun. 5: 763-773, 1993; Isoniemi (supra)). Em uma modalidade adicional, as composições de células da presente revelação são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) transplante da medula óssea, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos como, por exemplo, fludarabina, radioterapia com feixe externo (XRT), ciclofosfamida, ou anticorpos como, por exemplo, OKT3 ou CAMPATH.
Em uma modalidade, as composições de células da presente revelação são administradas após terapia ablativa de célula B como, por exemplo, agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan®. Em uma modalidade, as composições de células da presente revelação são administradas após terapia ablativa de célula B usando um agente como, por exemplo, bortezomib.
Por exemplo, em uma modalidade, indivíduos podem receber tratamento-padrão com quimioterapia em dose alta, seguida por transplante de célula-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplante, os indivíduos recebem uma infusão das células imunes expandidas da presente revelação. Em uma modalidade adicional, as células expandidas são administradas antes ou depois de cirurgia.
[205] A dosagem dos tratamentos acima a ser administrada a um paciente irá variar com a natureza precisa da condição que está sendo tratada e do receptor do tratamento. O escalonamento de dosagens para administração humana pode ser realizado de acordo com práticas aceitas na técnica.
[206] As células B modificadas podem ser usadas no tratamento ou prevenção de várias doenças infecciosas, cânceres, doenças degenerativas e distúrbios imunológicos.
[207] Composições que compreendem as células B modificadas como descritas nesse relatório descritivo podem ser usadas no tratamento de qualquer uma de diversas doenças infecciosas causadas por organismos infecciosos, por exemplo, vírus, bactérias, parasitas e fungos. Organismos infeciosos podem compreender vírus (por exemplo, vírus de RNA, vírus de DNA, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite A, B e C, vírus do herpes simples (HSV), citomegalovírus (CMV) vírus de Epstein-Barr (EBV), vírus do papiloma humano (HPV)), parasitas (por exemplo, patógenos protozoários e metazoários como, por exemplo, espécies de Plasmodia, espécies de Leishmania, espécies de Schistosoma, espécies de Trypanosoma), bactérias (por exemplo, micobactérias, em particular, M. tuberculosis, Salmonella, Streptococci, E. coli, Staphylococci), fungos (por exemplo, espécies de Candida, espécies de Aspergillus), Pneumocystis carinii, e príons (príons conhecidos infectam animais para causar scrapie, uma doença degenerativa transmissível do sistema nervoso de carneiros e cabras, bem como encefalopatia espongiforme bovina (BSE), ou “doença da vaca louca”, e encefalopatia espongiforme felina de gatos. Quatro doenças de príon que sabidamente afetam humanos são: (1) Kuru, (2) doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) doença de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS), e (4) insônia familiar fatal (FFI)). Como usado nesse relatório descritivo, o termo “príon” inclui todas as formas de príons que causam todas ou qualquer uma dessas doenças ou outras em quaisquer animais e, em particular, em humanos e animais de criação domesticados. Doenças infecciosas ilustrativas incluem, sem limitação, toxoplasmose, histoplasmose, CMV, EBV, coccidiomicose, tuberculosis, HIV e semelhantes.
[208] Em certas modalidades, as composições de células B modificadas como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas para a prevenção ou tratamento de vários cânceres. A esse respeito, em certas modalidades, as composições que compreendem células B transfectadas são úteis para a prevenção ou tratamento de melanoma, linfoma não-Hodgkin, doença de Hodgkin, leucemia, plasmocitoma, sarcoma, glioma, timoma, câncer de mama, câncer da próstata, câncer cólon-retal, câncer do rim, carcinoma de célula renal, câncer uterino, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer do cérebro, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer cervical, câncer testicular, câncer gástrico, câncer esofágico, mieloma múltiplo, hepatoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crônica (CML) e leucemia linfocítica crônica (CLL), ou outros cânceres.
[209] Em uma modalidade, as células B modificadas também podem ser usadas no tratamento de distúrbios imunológicos como, por exemplo, síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), agamaglobulinemia, hipogamaglobulinemia, outras imunodeficiências, imunossupressão e doença de imunodeficiência combinada severa (SCID).
[210] Em uma modalidade, as células B modificadas como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas no tratamento de doenças autoimunes como, por exemplo, sem limitação, artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes insulino-dependente, doença de Addison, doença celíaca, síndrome de fadiga crônica, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, Fibromialgia, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, síndrome de Sjögren, hipertireoidismo/doença de Graves, hipotireoidismo/doença de Hashimoto, diabetes insulino-dependente (tipo 1), miastenia grave, endometriose, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, doença de Wegener, glomerulonefrite, anemia aplásica, hemoglobinúria paroxística noturna, síndrome mielodisplásica, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica autoimune, síndrome de Evan, síndrome de inibidor do Fator VIII, vasculite sistêmica, dermatomiosite, polimiosite e febre reumática. Dessa forma, em uma modalidade, os métodos nesse relatório descritivo incluem métodos para o tratamento de uma doença, que compreende a administração a um indivíduo ou paciente necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições que compreendem as células B modificadas como descritas nesse relatório descritivo tratando, dessa forma, a doença.
[211] Em uma modalidade, as células B modificadas como descritas nesse relatório descritivo também podem ser usadas no tratamento de doenças e distúrbios por deficiência de enzimas como, por exemplo, sem limitação, MPS I, MPS II, MPS III, MP IV, MPS V, MPS VI, MPS VII, distúrbios do armazenamento lisossomal, doença de Niemann-Pick (tipos A, B e C), doença de Guacher (tipos I, II e III), doença de Tay-Sachs e distúrbio de Pompe.
[212] Uma modalidade fornece um método para o tratamento de MPS I em um indivíduo, que compreende a administração de uma célula B geneticamente modificada para expressar IDUA (células B IDUA+) a um indivíduo que possui, ou suspeito de ter, MPS I. Em uma modalidade, uma dose única, maximamente eficaz, de células B IDUA+ é administrada ao indivíduo. Em outra modalidade, duas ou mais doses de células B IDUA+ são administradas ao indivíduo maximizando, dessa forma, a quantidade de células B IDUA+ enxertadas. Em algumas modalidades, as duas ou mais doses de células B IDUA+ que são administradas ao indivíduo compreendem menos células B IDUA+ do que a dose única, maximamente eficaz, de células B IDUA+. Em algumas modalidades, quando duas ou mais doses de células B IDUA+ são administradas a um indivíduo em uma dosagem de células B IDUA+ que está abaixo da dose única maximamente eficaz de células B IDUA+, ocorre um aumento sinérgico resultante na produção de IDUA. Em uma modalidade, a administração de células B IDUA+ a um indivíduo resulta em níveis normais de IDUA observados em um indivíduo de controle, saudável. Em uma modalidade, a administração de células B IDUA+ a um indivíduo resulta em níveis maiores do que os normais de IDUA no indivíduo. Em uma modalidade, a administração de células B IDUA+ a um indivíduo reduz os níveis de GAGs no indivíduo para um nível normal. Em uma modalidade, a administração de células B IDUA+ a um indivíduo reduz os níveis de GAGs no indivíduo a um nível menor do que o nível de GAGs no indivíduo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
PRODUÇÃO DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM IDUA
[213] Foram geradas construções de transposon Sleeping Beauty e transposase para transposição e expressão de IDUA humana. Transposons montados para obter integração e expressão do gene de IDUA em células B são mostrados na Figura 1. Usamos o promotor EEK, que consiste no promotor e elementos intensificadores do gene de imunoglobulina humana, bem como outros elementos regulatórios previamente descritos, para obter expressão em nível elevado em células B. Para testar a transposição e expressão de IDUA, células B humanas foram isoladas de dois doadores separados e expandidas em cultura, com eletroporação no dia 2 com pKT2/EEK-IDUA mais pCMV-SB100x. Lisados de células preparados 8 dias pós-eletroporação continham cerca de 60 nmol/h/mg de atividade de IDUA, cerca de 50 vezes o nível de IDUA encontrado em células do tipo selvagem, demonstrando a eficácia do sistema transposon SB para obter expressão em nível elevado de IDUA em células B humanas expandidas (Figura 2).
[214] A fim de enriquecer para células que expressam IDUA, também geramos um transposon bifuncional (pKT2/EEK- IDUA-DHFR, Figura 1) que codifica IDUA humana, juntamente com uma diidrofolato-redutase humana sintetizada para codificar uma nova enzima variante (L22Y, F31S) que é resistente ao antagonista de folato metotrexato (MTX: (McIvor RS. 1996. Bone Marrow Transplantation 18: S50-54)). O mapa de plasmídeo para essa construção é mostrado na FIG. 1B e sua sequência é fornecida como ID. DE SEQ. Nº: 1.
[215] Também estabelecemos uma técnica usando um anticorpo anti-IDUA humana disponível comercialmente para identificar células que expressam níveis elevados de IDUA por permeabilização e coloração intracelular, seguidas por citometria de fluxo. Usando um transposon de GFP-DHFR similar ao pKT2/EEK-IDUA-DHFR, primeiro estabelecemos condições para crescimento excessivo seletivo de células B transpostas por incubação em várias concentrações diferentes de MTX entre os dias 2 e 4 da expansão de células. Verificamos que 200 nM forneciam as condições mais eficazes para o crescimento excessivo seletivo de células B que expressam o transgene repórter de GFP (Tabela 1). A seguir aplicamos essas condições à expansão de células eletroporadas pKT2/EEK-IDUA- DHFR + pCMV-SB100x, avaliando o % de células IDUA+ por coloração intracelular no dia 7. Embora fosse observada uma frequência de 10-12% de células IDUA+ na população de células transpostas, essa frequência foi aumentada para 25% ou mais por aplicação de seleção com MTX (Figura 3). Tabela 1. Condições de seleção com metotrexato* [MTX], nM Controle Doador 1 Doador 2 100 0,01 8,97 13,50 200 25,20 39,00 300 13,40 5,49 * % de células GFP-positivas no dia 7 após seleção com MTX nos dias 2 a 4
[216] Estudos iniciais in vivo começaram usando uma cepa de camundongo MPS I que havia sido retrocruzada em NOD-SCID, mas não havia evidência para manutenção de célula B uma semana após infusão nessa cepa. Esse problema foi eventualmente solucionado por cruzamento nos camundongos NSG-MPS I que geram alelo com knockout do receptor de IL-2 gama-C, como descrito abaixo no Exemplo 2, mas até lá testamos a transferência adotiva de células B IDUA+ selecionadas com MTX (como mostrado na Figura 3) em camundongos IDUA+ NSG. Células autólogas do sangue periférico foram enriquecidas para CD4+ e infundidas por via intraperitoneal (i.p.) nos dias -30 e -4 para dar suporte as células B-pKT2/EEK transpostas com IDUA-DHFR injetadas i.p. ou por via intravenosa no dia 0. Observamos uma faixa de IDUA no plasma, desde o nível do tipo selvagem até 200 vezes o tipo selvagem, em animais administrados com células B que expressam IDUA tanto i.p. quanto i.v. (Figura 4). Também observamos níveis extremamente elevados de imunoglobulina humana (média de 1 até 4 mg/ml) no plasma – forte evidência para transferência adotiva bem-sucedida de células B humanas. Embora não realizado em animais deficientes em IDUA, os resultados desse experimento, no entanto, fornecem um exemplo dos níveis de IDUA humana que podem ser obtidos após introdução de uma população de células B IDUA+ altamente potentes em camundongos NSG. EXEMPLO 2
PRODUÇÃO IN VIVO DE IDUA EM CAMUNDONGOS MPS I
[217] A fim de determinar se o relacionamento entre o número de células B modificadas administradas e a quantidade do agente terapêutico produzido é linear, um modelo em camundongo de mucopolissacaridose tipo I (MPS I) foi usado com células B alogênicas geneticamente modificadas para expressar iduronidase (IDUA).
[218] Camundongos NSG (NOD-SCID deficientes em gama-C) foram cruzados com camundongos NOD-SCID deficientes em IDUA para coletar os alelos de deficiência em gama-C e IDUA na mesma cepa e gerar camundongos NSG MPS I, também denominados nesse relatório descritivo “camundongos MPS I”. Quando camundongos NSG MPS I suficientes foram gerados, esses animais foram infundidos i.p. com 3 x 106 células T CD4+ no dia -7 e depois 3 x 106, 1 x 107, ou 3 x 107 pKT2/EEK-células B transpostas com IDUA (aproximadamente 10% de IDUA+ por coloração intracelular) i.v. no dia 0. Camundongos MPS I receberam uma dose única de células B modificadas geneticamente para produzir IDUA (ou nenhuma célula como um controle) na presença de células T de memória CD4+ (ou nenhuma célula como um controle) e níveis de atividade da enzima IDUA medidos no soro até o dia 38 (Figura 5) usando o protocolo de ensaio de enzima previamente relatado por Hopwood J.J., e cols., Clin. Chim. Acta., 1º de março de 1979; 92 (2): 257-65, cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Como os camundongos não possuem os fatores necessários para sobrevida de longo prazo das células B, células T de memória CD4+ foram administradas por via intraperitoneal aos camundongos também a fim de promover a sobrevida de células B.
[219] Inesperadamente, esses resultados demonstraram que o relacionamento entre o número de células e os níveis de
IDUA no soro não era linear em certas doses de células. Sem se limitar à teoria, esse achado pode ser causado pela interação das células B entre elas in vivo que produzem resultados finais de sobrevida diferentes em concentrações de células diferentes. Dessa forma, esses resultados indicam que há uma dose ideal que obtém produção suficiente do agente terapêutico administrando-se, ao mesmo tempo, o menor número de células necessários. Esse conceito está ilustrado na Figura 5, em que a dose de 3 x 107 células resultou em um aumento maior do que 3 vezes nos níveis de atividade de IDUA no plasma, comparada com a dose de 1 x 107 células. EXEMPLO 3
DOSES MÚLTIPLAS DE CÉLULAS B PRODUTORAS DE IDUA EM CAMUNDONGOS MPS I
[220] A fim de determinar se a dosagem das células B afeta a quantidade de agente terapêutico produzida in vivo, camundongos MPS I receberam uma série de 3 doses de células B produtoras de IDUA.
[221] Camundongos MPS I receberam uma série de 3 doses de 1 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA (ou nenhuma célula como um controle) na presença de células T de memória CD4+ (ou nenhuma célula como um controle) no dia 0 e os níveis de atividade da enzima IDUA medidos no soro até o dia 56 (Figura 6). Especificamente, camundongos MPS I foram infundidos i.p. com 3 x 106 células T CD4+ no dia -7 e depois 107 pKT2/EEK-células B transpostas com IDUA (aproximadamente 10% IDUA+ por coloração intracelular) i.p. ou i.v. no dia 0. Os animais receberam infusões adicionais de 107 pKT2/EEK-células B transpostas com IDUA pela mesma via de administração nos dias 21 e 42 após a primeira injeção.
[222] Com o uso desse procedimento, verificamos que níveis de IDUA no plasma do tipo selvagem (cerca de 1 nmol/h/ml) foram obtidos na maioria dos animais tratados com células B, e que isso exigia a administração prévia de células T CD4+ (Figura 6). Verificamos que IgG humana no plasma variou de 200 µg/ml até 1 mg/ml, como evidência para transferência adotiva de células B (Figura 7).
[223] Esses resultados demonstram que a administração do mesmo número de células B modificadas ao longo de várias doses resulta em níveis finais maiores de um agente terapêutico do que os que são obtidos por administração de todas ou das células B modificadas em uma dose única. Como pode ser observado na Figura 6, os níveis iniciais de IDUA após a primeira dose de 1 x 107 células B eram baixos, comparados com aqueles obtidos após a terceira dose, o que inesperadamente resultou em níveis séricos de IDUA em um excesso de 3 vezes dos níveis séricos de IDUA observados após a primeira dose. Esse fenômeno também pode ser observado por comparação dos dados de 1 x 107 células/camundongo na Figura 5 com os dados na Figura 6, na medida em que cada dose é de 1 x 107. Enquanto na Figura 5, é mostrado que uma dosagem única de 1 x 107 células administrada por via intravenosa resultou em níveis declinantes de IDUA por volta de D38, e fica claro na Figura 6 que os níveis de IDUA que resultam de 3 doses de 1 x 107 células administradas por via intravenosa resultaram em níveis de expressão que continuaram tanto a crescer acentuadamente quanto também excederam 3 vezes o nível da dosagem única de 1 x 107 e o nível da dosagem única de 3 x 107 no mesmo ponto do tempo.
Inesperadamente, essa sinergia através de múltiplas dosagens só foi observada nesses grupos de camundongos que receberam as células B modificadas geneticamente libveradas por via intravenosa, mas não nos camundongos que receberam as células B modificadas geneticamente por meio de injeção intraperitoneal.
[224] Além de mostrar que múltiplas doses resultaram em níveis de agente terapêutico maiores do que o esperado por uma dosagem única do mesmo número de células, o mero conceito de que múltiplas dosagens resultaram em níveis maiores de agente terapêutico é vantajoso e inesperado. Mecanisticamente, acredita-se que células B diferenciadas ocupem um nível finito de nichos de sobrevida, e quando novas células diferenciadas são criadas, elas deslocam algumas das células antigas. Portanto, pode ser esperado que doses subsequentes de células B não levariam a aumentos concomitantes nos níveis séricos do agente terapêutico. No entanto, demonstramos que isso não é o caso e que infusões adicionais de células B na verdade resultam em níveis plasmáticos maiores no estado de equilíbrio do agente terapêutico que estão produzindo. Esse fenômeno é útil na obtenção da dosagem adequada do fármaco terapêutico in vivo minimizando, ao mesmo tempo, a dosagem de células que é necessária.
[225] Especificamente, pacientes podem receber a administração de uma dosagem, e depois os níveis plasmáticos do fármaco medidos. Caso os níveis estejam menores do que o desejado, uma dosagem adicional de células pode ser administrada. Considerando a meia-vida média da maioria dos produtos biológicos injetada, esses achados certamente não são aplicáveis para dirigir a infusão de um produto biológico. Além disso, esses resultados provavelmente não são obtidos com o uso de outros métodos como, por exemplo, liberação de fármacos por meio viral, que também podem provocar uma resposta imune ao vetor reduzindo, dessa forma, a eficácia e impedindo tentativas futuras para administrar uma dose adicional.
[226] Consequentemente, os métodos para liberação de um agente terapêutico revelado nesse relatório descritivo fornecem vantagens em relação aos métodos da técnica estabelecida, incluindo a habilidade para administrar mais de uma dose de células B modificadas e a coleção de dosagens que dela resulta. EXEMPLO 4
LIBERAÇÃO POR CÉLULA B PARA MÚLTIPLOS TECIDOS
[227] A infusão direta de um agente terapêutico, liberação por meio de vetores virais e a transferência de célula-tronco hematopoiética não conseguiram liberar com sucesso um agente terapêutico a múltiplos tecidos. A fim de determinar se células B modificadas podem ser usadas para liberar um agente terapêutico in vivo a diversos tecidos, camundongos MPS I receberam uma série de 3 doses de células B produtoras de IDUA como descrito no exemplo prévio.
[228] Seguindo o protocolo descrito no Exemplo prévio, camundongos MPS I receberam um regime de dosagem que compreende 3 doses de 1 x 107 células B modificadas geneticamente para produzir IDUA (ou nenhuma célula como um controle) na presença de células T CD4+ (ou nenhuma célula como um controle). Os animais foram sacrificados e os tecidos coletados em 60 dias após a primeira infusão de célula B, e os níveis de atividade da enzima IDUA medidos no fígado, pulmão, baço, rim, intestino, musculo, cérebro, coração, lavagem peritoneal e medula óssea (Figura 8).
[229] A citometria de fluxo mostrou 20% a 35% de células humanas CD45+ e 2% a 10% de células CD19+ no baço e linfonodos de animais infundidos com células T e B humanas que expressam IDUA. Houve uma correção metabólica cruzada substancial observada pelas atividades de IDUA restauradas em tecidos periféricos e até mesmo no cérebro (Figura 8).
[230] IDUA degrada GAGs, e a quantidade de GAGs presente aumenta na ausência de IDUA, por exemplo, nos tecidos de camundongos MPS I. Consequentemente, glicosaminoglicanos (GAGs) também foram medidos no cérebro, pulmão, fígado, coração, rim, músculo, baço e intestino no dia 60 a fim de determinar se a IDUA está degradando GAGs naqueles tecidos (Figura 9). Como resultado da correção metabólica cruzada em função de IDUA, glicosaminoglicanos teciduais estavam significantemente reduzidos em animais tratados com células B também infundidos com células T CD4+ (Figura 9).
[231] Esses resultados demonstraram que a liberação de IDUA por meio de células B modificadas permite tanto a liberação aumentada de agentes terapêuticos aos tecidos, quanto a atividade de agentes terapêuticos naqueles tecidos. A Figura 8 mostra os níveis de atividade da enzima IDUA em tecidos resultantes da infusão de células B produtoras de IDUA. A Figura 9 mostra os níveis de GAG nesses mesmos camundongos. GAGs são produtos celulares tóxicos que se acumulam em tecidos de camundongos MPS I e que são degradados pela atividade enzimática de IDUA. Como pode ser observado em ambas as figuras, a produção de IDUA e a redução de GAG ocorreram eficazmente em múltiplos tecidos, incluindo pulmão, baço, fígado, coração e intestino. Vale ressaltar que se acredita que a infusão de IDUA não solucione adequadamente manifestações da doença em tecidos como, por exemplo, coração, baço e fígado. Esses resultados demonstraram a eficácia de células B que expressam IDUA humanas para a correção metabólica de MPS I pela primeira vez. Portanto, esses dados dão suporte de que a liberação in vivo da enzima por meio de células B geneticamente modificadas apresenta uma propensão para aprimorar o tratamento de vários órgãos no corpo. EXEMPLO 5
EFICÁCIA DE LONGO PRAZO DE LIBERAÇÃO DE PRODUTOS TERAPÊUTICOS POR CÉLULAS B
[232] Para determinar se a liberação de produtos terapêuticos por meio de células B resulta em produção de proteína de longo prazo, analisamos as atividades de IDUA de longo prazo no plasma e tecidos de camundongos NSG MPS I que receberam células B produtoras de IDUA.
[233] Células B que superexpressam IDUA foram preparadas como descrito previamente. Animais NSG MPS I foram infundidos por via intraperitoneal com 3e6 células T de memória CD4+ uma semana antes das infusões de células B. Os animais foram então infundidos com 2e7 células B que expressam IDUA nos dias 0 e 30.
[234] Primeiramente analisamos a atividade da enzima IDUA no plasma de camundongos NSG MPS I que receberam células B produtoras de IDUA como descrito nos exemplos prévios. Camundongos NSG MPS I não tratados também foram analisados ao longo desse período como um controle. Sangue foi coletado desses animais aproximadamente a cada 2 semanas por 6,5 meses e testado para atividade enzimática de IDUA como descrito previamente.
[235] Como mostrado na Figura 10, a atividade de IDUA no plasma foi fortemente induzida em camundongos que recebem as células B modificadas geneticamente, com respostas plasmáticas de pico ocorrendo em torno de 5 semanas pós- infusão, e a atividade de IDUA permaneceu maior nesses animais até o momento do sacrifício 6,5 meses pós-infusão.
[236] Além disso, o tratamento de longo prazo com o produto de célula B também resultou em níveis aumentados prolongados de IDUA em múltiplos tecidos analisados em 3, 6 e 6,5 meses pós-infusão com células B modificadas geneticamente (Figura 11), mostrando que a liberação tecidual aumentada de IDUA que observamos no Exemplo 4 acima não é meramente transitória, mas persiste por longo prazo.
[237] Além disso, 3 meses, 6 meses e 6,5 meses após a primeira infusão de células B, os animais foram sacrificados e extratos de tecidos foram testados quanto aos níveis de GAG, como descrito no Exemplo 4, e foram observadas reduções de longo prazo nos níveis de GAGs em múltiplos tecidos (FIG. 12). Como um controle positivo para redução em GAGs, camundongos NSG-IDUA+/- (que são heterozigotos para IDUA e são fenotipicamente normais) foram testados. Como um controle negativo para redução em GAGs, um grupo de camundongos NSG MPS I não recebeu nenhuma célula.
[238] Dessa forma, esses dados mostram que a liberação de agentes terapêuticos por meio de células B modificadas permite o aumento prolongado dos níveis de atividade da enzima in vivo, não apenas no plasma, mas também em tecidos como, por exemplo, o coração, baço e fígado, que tipicamente não são tratáveis com infusão de IDUA. EXEMPLO 6
OTIMIZAÇÃO DA CAPACIDADE MIGRATÓRIA DE CÉLULAS B MODIFICADAS GENETICAMENTE
[239] Para que células plasmáticas sobrevivam por longo prazo, é geralmente aceito que as células precursoras (ou seja, plasmoblastos) têm que ter a habilidade para migrar para nichos de sobrevida de longo prazo de células plasmáticas encontrados em localizações como, por exemplo, a medula óssea. Em contraste, é geralmente aceito que, após as células plasmáticas completarem a diferenciação, elas infra-regulam sua habilidade para migrar. Portanto, caso se deseje gerar uma população de células plasmáticas a partir de uma população infundida de plasmoblastos, é considerado importante que as células possuam capacidade migratória robusta. Especificamente, a migração em direção a CXCL12 é importante para a migração de precursores de células plasmáticas até a medula óssea. Adicionalmente, quimiocinas como, por exemplo, CXCL13, podem ser importantes para migração aos locais de inflamação e tecidos como, por exemplo, o baço.
[240] Para determinar se as condições de cultura geram células B migratórias e para determinar se a capacidade migratória de células B modificadas geneticamente para expressar uma proteína terapêutica é dependente da quantidade de tempo que as células B modificadas geneticamente permanecem em cultura após a modificação genética, mas antes da coleta para administração a um indivíduo, preparamos células B que superexpressam IDUA como descrito previamente e mantivemos as células B modificadas geneticamente em cultura por quatro a nove dias antes da análise de sua capacidade migratória.
[241] O ensaio foi realizado usando vasos de cultura de duas câmaras, nas quais as câmaras estão conectadas (por exemplo, uma placa Transwell®). Células B modificadas geneticamente foram semeadas em uma câmara e a outra câmara foi carregada com 100 ng/ml de CXCL12, que é um quimioatraente que atrai células B à medula óssea, ou CXCL13, que é um quimioatraente que atrai células B aos locais de inflamação, bem como tecidos como, por exemplo, baço. Após permitir que as células B migrem por 3 horas, células B foram coletadas do segundo poço e contadas. Em cada ensaio, foi usado um controle negativo no qual nenhum quimioatraente (CXCL12 ou CXCL13) foi adicionado à segunda câmara. Uma representação esquemática do ensaio é apresentada na Figura 13D com relação a CXCL12. O mesmo ensaio foi usado para CXCL13.
[242] Os grupos de teste eram células B que foram expostas a um sistema de cultura que demonstramos previamente que aumenta acentuadamente a capacidade migratória de células B modificadas geneticamente (veja PCT/US2015/066908, incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Esse sistema de cultura, que foi utilizado para todos os experimentos descritos nesse relatório descritivo (salvo indicação em contrário) compreende CD40L (com etiqueta de HIS para multimerização), um agente de reticulação de CD40L (anticorpo anti-HIS que induz multimerização do CD40L), IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21. Células B foram cultivadas pelo número de dias relevante após a modificação genética antes da análise Transwell.
[243] Surpreendentemente, observamos que células B modificadas geneticamente sob nossas condições de cultura possuem potencial migratório ótimo para CXCL12 que atinge o pico em torno de 7-9 dias (em cultura, ou 5-7 dias após a modificação genética) e potencial migratório ótimo para CXCL13 que atinge o pico em torno de 6-7 dias (em cultura, ou em torno de 4-5 dias após a modificação genética) (Figuras 13A-C). Esses dados sugerem que, em alguns casos, pode ser benéfico coletar e administrar as células B modificadas geneticamente a um indivíduo dentro dessa janela para assegurar potencial migratório ótimo e para induzir migração ótima para tecidos-alvo. EXEMPLO 7
AVALIAÇÃO DE CLONALIDADE DE CÉLULAS B MODIFICADAS GENETICAMENTE FINAIS PARA EXPRESSAR IDUA
[244] A confirmação da policlonalidade do produto de células final é um parâmetro de segurança importante. Especificamente, a emergência de um clone dominante é considerada potencialmente como um fator contribuinte para tumorigênese ou doença autoimune in vivo. Para avaliar no produto de células B final, as células foram desenvolvidas em cultura como descrito previamente (veja condições de cultura apresentadas no Exemplo 6), modificadas geneticamente para expressar IDUA usando o método descrito no Exemplo 1, coletadas no dia 7 de cultura e criopreservadas. DNA foi extraído e submetido ao sequenciamento profundo de alto rendimento do receptor de célula B. Como o receptor de célula B passa por alterações durante o desenvolvimento da célula B que o torna único entre células B, esse método permite a quantificação de quantas células compartilham a mesma sequência de receptor de célula B (o que significa que são clonais).
[245] Resultados do sequenciamento profundo são mostrados na Figura 14 e na Tabela 2 abaixo. Mais do que
248.000 moléculas-modelo foram analisadas e em torno de
241.000 rearranjos únicos foram observados, representando uma frequência Max de clonalidade (ou seja, a prevalência de qualquer clone específico de célula B) de 0,03%. Tabela 2: Resumo do sequenciamento de sequenciamento de clonalidade de célula B.
RESUMO DO SEQUENCIAMENTO Clonalidade Moléculas- Rearranjos Frequência produtiva modelo únicos máxima máxima Células
248.503 241.586 0,03% 0,03 criopreservadas
[246] Esse experimento demonstra que o produto de célula B final é altamente-policlonal e que nenhum clone único representa uma porção significante da população de células. Especificamente, resultados do sequenciamento demonstram que nenhum clone único representa mais do que 0,03% da população final. Dessa forma, espera-se que as células B modificadas geneticamente finais sejam suficientemente policlonais para fins terapêuticos e não parecem conter nenhum clone particular em abundância. Como é plausível que as condições de cultura, modificação do genoma e a presença de fatores estranhos (por exemplo, soro bovino fetal presente nos meios de cultura) possam produzir a emergência de clonalidade, consideramos esse resultado como inesperado, na medida em que nenhum clone único atingiu uma frequência significante.
EXEMPLO 8
POTENCIAL INFLAMATÓRIO DE CÉLULAS B MODIFICADAS GENETICAMENTE.
[247] Como a maioria dos produtos terapêuticos, a presente invenção possui o potencial para estimular o sistema imune, levando potencialmente a efeitos colaterais deletérios e/ou anticorpos neutralizantes que possam reduzir ou eliminar a eficácia. Um previsor útil de se uma reação imune adversa desse tipo pode ser desencadeada é se os produtos finais de células B modificadas geneticamente produzem ou não citocinas inflamatórias. Dessa forma, medimos se o final do produto de célula B da cultura (células B modificadas geneticamente para produzir IDUA de acordo com os exemplos acima) produz qualquer uma das várias citocinas inflamatórias.
[248] Células B foram cultivadas por 7 dias em cultura como descrito previamente (veja as condições de cultura apresentadas no Exemplo 6), modificadas geneticamente para expressar IDUA usando o método descrito no Exemplo 1, coletadas no dia 7 de cultura e criopreservadas. Durante vários pontos do tempo durante a cultura, foram coletadas amostras dos meios e testadas para um painel de citocinas usando um dispositivo Luminex. Especificamente, a presença dos seguintes fatores foi testada para: IL6, IFN-alfa, IFN- gama, sFAS, TNFRp75, BAFF, HGF, IL5, IL2R alfa, TNF alfa, IL1ra, TNFRp55, VEGF, IL1 alfa, sIL6R. Como a formulação dos meios contém FBS, que pode conter esses fatores, meio sem células B foi usado como um controle negativo. No caso de IL6, proteína recombinante (em alguns casos) foi adicionada aos meios sem células B para servir como controles positivos.
[249] Surpreendentemente, na maioria dos casos, pelo final da cultura de células B, o fator interrogado ou era indetectável ou não estava elevado acima dos controles somente com meio (Figuras 15A e B). Esse resultado foi inesperado, considerando que as células modificadas geneticamente são células imunes que passam por estimulação significante durante o processo de cultivo e de modificação por engenharia genética. As exceções a isso foram IL6 e sFAS (Figura 15A, primeiro grupo da esquerda, e Figura 15B, primeiro grupo da esquerda). O único fator constatado como aumentando durante a cultura foi sFAS. No caso de IL6, embora fossem detectados níveis elevados no dia 2 da cultura, por volta do dia 7 os níveis de IL6 estavam muito próximos daquele encontrado nos meios isoladamente.
[250] No geral, esses resultados ilustram que, pelo final da cultura, o produto de célula B não está produzindo níveis significantes das citocinas inflamatórias testadas. Considerando que estávamos fornecendo diversas citocinas estimulatórias às células B, não era previsto que o produto final não produzisse níveis significantes dessas citocinas. Mais inesperadamente ainda, verificamos que, ao longo do tempo, as células B reduziram sua produção de IL6 até perto dos níveis de base. Isso é muito relevante para a implementação clínica, na medida em que IL6 é sabidamente um sinal imunoestimulatório potente. No geral, acreditamos que esses resultados refletem que se espera que o produto de célula B final seja seguro in vivo em termos de potencial para evitar estimulação significante do sistema imune como um todo. EXEMPLO 9
PRODUÇÃO DE CÉLULAS B QUE EXPRESSAM LCAT OU FIX HUMANAS
[251] Foram geradas construções de transposon Sleeping Beauty e transposase para transposição e expressão de LCAT humana, LPL humana e FIX humano como descrito no Exemplo 1 e células B primárias de memória foram transfectadas por eletroporação no dia 2 em cultura. Meio foi coletado 2 dias pós-eletroporação (dia 4 em cultura, “D4”) e também 6 dias pós-eletroporação para LCAT e LPL (dia 8 em cultura, “D8”) e analisado quanto à expressão.
[252] A expressão de LCAT nas células B transfectadas foi confirmada usando um ensaio de atividade da enzima LCAT baseado em fluorescência (veja o método abaixo). Meios coletados de células transfectadas tinham forte atividade de LCAT tanto em D4 quanto em D8, enquanto atividade significante não foi observada no controle somente com meio (Figura 16A).
[253] A expressão de LPL nas células B transfectadas foi confirmada usando um ensaio de atividade da enzima LPL baseado em fluorescência (veja o método abaixo). Meios coletados de células transfectadas tinham forte atividade de LPL tanto em D4 quanto em D8, enquanto atividade significante não foi observada no controle somente com meio (Figura 16B).
[254] Para detecção de Lecitina–Colesterol- Acetiltransferase (LCAT) e Lipoproteína-Lipase (LPL), células B foram cultivadas (veja condições de cultura apresentadas no Exemplo 6) e eletroporadas no dia 2 de cultura (como no Exemplo 1) com um transposon que codifica LCAT ou LPL, bem como uma construção que codifica uma fonte de transposase (SB100x, veja o Exemplo 1 e Figura 1). Amostras dos meios foram coletadas no dia 4 e dia 8 de cultura e testadas quanto à presença de LCAT e LPL usando um ensaio fluorimétrico de enzima. Especificamente, substrato de 4-metilumbeliferil palmitato (4-MUP) foi usado e a clivagem do substrato por LCAT e LPL detectada por medição do aumento na fluorescência em comprimentos de onda de 340, 390 e 460 nm. Tampão de reação contendo 100 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4) foi preparado e colocado a 37°C. O 4-MUP foi diluído por misturação com 2 mg de 4-MUP com 16 mg de Triton X-100. 4-MUP e tampão de reação foram combinados e um volume total de 150 μl foi adicionado a um poço em uma placa de 96 poços, juntamente com 2 μl de composto ativador (por exemplo, p-Nitrofenil butirato). Diluições seriais de meios de cultura de células B foram preparadas e 50 μl das diluições foram então adicionados à mistura e incubados a 37°C. As medições de fluorescência começam imediatamente após a adição dos meios de cultura e foram coletadas a cada minuto por uma duração total de 30 minutos.
[255] A expressão de FIX nas células B transfectadas foi confirmada por ELISA. Mais especificamente, lisados de células das células B foram preparados e detectados por meio de ELISA usando um kit ELISA disponível comercialmente (FIX- EIA, Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Meios foram coletados 2 dias pós-eletroporação e os meios continham proteína FIX em uma concentração de aproximadamente 15 ng/ml, enquanto nenhuma proteína FIX foi detectada as células do controle negativo (células B transfectadas com GPF) (Figura 16C).
[256] Dessa forma, esses dados demonstram que células B podem ser usadas nos métodos revelados nesse relatório descritivo para expressar e liberar uma ampla gama de polipeptídeos a um indivíduo.
[257] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer modalidades adicionais. Todas as Patentes U.S., Publicações de Pedido de Patente U.S., Pedidos de Patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações não patentes referidas nesse relatório descritivo e/ou listadas na Folha de Dados do Pedido são incorporados nesse relatório descritivo por referência, em sua totalidade. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras modalidades adicionais.
[258] Essas e outras alterações podem ser feitas às modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações seguintes, os termos usados não devem ser considerados como limitantes das reivindicações às modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser consideradas como incluindo todas as modalidades possíveis, juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais as reivindicações estão intituladas. Consequentemente, as reivindicações não estão limitadas pela revelação.

Claims (150)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para produção in vivo de um agente terapêutico, caracterizado por compreender: a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas a um indivíduo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração compreende duas ou mais doses das células B geneticamente modificadas em concentrações de dose única subótimas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração compreende três ou mais doses de células B geneticamente modificadas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são autólogas para o indivíduo.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são alogênicas para o indivíduo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma proteína, um polinucleotídeo ou uma pequena molécula codificada por DNA.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma enzima, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, uma proteína de fusão, um receptor da superfície celular, uma proteína secretada, uma molécula de sinalização, um fragmento antigênico, um fator de coagulação ou uma molécula de adesão.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38- e CD138-.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138+.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138-.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração compreende injeção intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a administração compreende injeção intravenosa.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas usando um transposon Sleeping Beauty para expressar o agente terapêutico nas células B.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas usando um vetor viral recombinante para expressar o agente terapêutico nas células B.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o vetor viral recombinante codifica um retrovírus recombinante, lentivírus recombinante, adenovírus recombinante ou vírus adeno- associado recombinante.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas pela integração direcionada no genoma da célula B de uma sequência de polinucleotídeos que codifica o agente terapêutico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a integração direcionada compreende uma integração gênica mediada por dedo de zinco- nuclease, integração gênica mediada por CRISPR/CAS9, integração gênica mediada por TALE-nuclease ou integração gênica mediada por meganuclease.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a integração direcionada do polinucleotídeo ocorreu por meio de recombinação homóloga.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a integração direcionada compreende uma liberação mediada por vetor viral de uma nuclease capaz de induzir uma clivagem de DNA em um sítio de DNA-alvo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma dedo de zinco-nuclease, uma CAS9-nuclease, uma TALE-nuclease ou uma Meganuclease.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que possui uma sequência que é idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que possui uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1, ou pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são modificadas geneticamente no Dia 2 ou Dia 3 após o cultivo.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são modificadas geneticamente usando um método que compreende eletroporação.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 4, Dia 5, Dia 6 ou Dia 7 em cultura após a modificação genética.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 8 ou mais tarde em cultura após a modificação genética.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 10 ou mais cedo em cultura após a modificação genética.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas coletadas não produzem níveis significantes de citocinas inflamatórias.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas em um ponto do tempo em cultura no qual é determinado que elas não produzem níveis significantes de citocinas inflamatórias.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-30, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são desenvolvidas em um sistema de cultura que compreende cada um de IL-2, IL-4, IL- 10, IL-15, IL-31, e um ligante de CD40 multimerizado ao longo de todo o período de cultura pré- e pós-modificação genética.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o ligante de CD40 multimerizado é um ligante de CD40 marcado com HIS que é multimerizado usando um anticorpo anti-HIS.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado ainda por compreender a expansão das células B geneticamente modificadas antes da administração ao indivíduo.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a população final de células B geneticamente modificadas expandidas demonstra um alto grau de policlonalidade.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que qualquer clone de célula B particular na população final de células B geneticamente modificadas expandidas compreende menos do que 0,2% da população de células B total.
36. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que qualquer clone de célula B particular na população final de células B geneticamente modificadas expandidas compreende menos do que 0,05% da população de células B total.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que codifica um gene de DHFR humana com resistência aumentada ao metotrexato.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o gene de DHFR humana com resistência aumentada ao metotrexato contém mutações por substituição de leucina para tirosina no aminoácido 22 e fenilalanina para serina no aminoácido 31.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-38, caracterizado por compreender o tratamento das células B geneticamente modificadas com metotrexato antes da coleta para administração.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o tratamento com metotrexato é entre 100 nM e 300 nM.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o tratamento com metotrexato é 200 nM.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-41, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas migram para diversos tecidos mediante administração ao indivíduo.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-41, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula B geneticamente modificada da população de células B geneticamente modificadas que são administradas ao indivíduo migra para um ou mais tecidos selecionados do grupo que consiste em medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula B geneticamente modificada da população de células B geneticamente modificadas que são administradas ao indivíduo migra para a medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro do indivíduo.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-44, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico produzido pelas células B geneticamente modificadas é iduronidase (IDUA).
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a administração das células B geneticamente modificadas ao indivíduo resulta na redução de glicosaminoglicanos (GAGs) em diversos tecidos do indivíduo.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a administração das células B geneticamente modificadas ao indivíduo resulta na redução de GAGs em um ou mais tecidos do indivíduo selecionados do grupo que consiste em medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47,
caracterizado pelo fato de que a administração das células B geneticamente modificadas ao indivíduo resulta na redução de GAGs na medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro do indivíduo.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48, caracterizado pelo fato de que o indivíduo possui mucopolissacaridose tipo I (MPS I).
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a administração das células B geneticamente modificadas trata a MPS I do indivíduo.
51, Método para liberação de um agente terapêutico a múltiplos tecidos in vivo, caracterizado por compreender a administração de duas ou mais doses de células B geneticamente modificadas a um indivíduo.
52. Método para o tratamento de MPS I em um indivíduo, caracterizado por compreender a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas para produzir IDUA ao indivíduo com MPS I.
53. Método para a redução de uma quantidade de glicosaminoglicano (GAG) em um indivíduo com MPS I, caracterizado por compreender a administração de duas ou mais doses sequenciais de células B geneticamente modificadas para produzir IDUA ao indivíduo.
54. Célula B modificada, caracterizada por compreender um transgene bifuncional pKT2/EEK-IDUA-DHFR.
55. Método para liberação de um agente terapêutico a um ou mais tecidos in vivo, caracterizado por compreender a administração de uma ou mais doses de células B geneticamente modificadas a um indivíduo, em que as células B geneticamente modificadas são migratórias.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 20% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL12.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, ou pelo menos cerca de 50% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL12.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-57, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 20% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL13.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-58, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, ou pelo menos cerca de 50% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL13.
60. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 40% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL12 e pelo menos cerca de 40% das células B migram em um ensaio de quimiotaxia usando CXCL13.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-60, caracterizado pelo fato de que as células B modificadas são geneticamente modificadas para expressar o agente terapêutico.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-61, caracterizado pelo fato de que as células B modificadas são geneticamente modificadas para secretar o agente terapêutico.
63. Método, de acordo com a reivindicação 55,
caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são administradas quando as células B foram cultivadas por menos do que cerca de 7 dias após a modificação genética.
64. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são administradas quando as células B foram cultivadas por 4-9 dias.
65. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são administradas após as células B terem sido cultivadas por 5, 6 ou 7 dias após a modificação genética.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-65, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é IDUA.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-65, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-67, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de pelo menos duas doses das células B modificadas.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-68, caracterizado pelo fato de que a administração compreende injeção intravenosa.
70. Método de administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para permitir a produção sinérgica in vivo de um agente terapêutico, caracterizado por compreender: a determinação de uma concentração de dose única ótima das células B modificadas para indução da maior produção in vivo do agente terapêutico; a diminuição da concentração de dose única ótima das células B modificadas para obter uma concentração de dose única subótima das células B modificadas; e a administração de duas ou mais doses da concentração de dose única subótima das células B modificadas ao indivíduo.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que múltiplas dosagens únicas das células B modificadas são testadas, de modo que uma concentração de dose única ótima das células B modificadas seja determinada.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o aumento da dosagem de células B modificadas presentes em uma concentração de dose única de células B modificadas resulta em um aumento linear na produção do agente terapêutico.
73. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que múltiplas concentrações de dose única subótima das células B modificadas são testadas, de modo que uma dosagem ótima seja encontrada, em que a dosagem resultante resulta em um aumento mais do que linear em relação a dosagens menores.
74. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a concentração de dose única subótima é metade ou um terço da dose da concentração de dose única ótima.
75. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a concentração de dose única subótima é menor do que um terço da dose da concentração de dose única ótima.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-75, caracterizado pelo fato de que a produção sinérgica in vivo do agente terapêutico que resulta da administração de duas ou mais doses da concentração de dose única subótima das células B modificadas ao indivíduo resulta de injeção intravenosa do produto de célula B.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-76, caracterizado pelo fato de que as células B são modificadas geneticamente para expressar o agente terapêutico.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que as células B modificadas são geneticamente modificadas para secretar o agente terapêutico.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-78, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é IDUA.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-78, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
81. Célula B geneticamente modificada, caracterizada por ter sido geneticamente modificada para produzir um agente terapêutico.
82. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são autólogas para um indivíduo ao qual as células B geneticamente modificadas são administradas.
83. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que as células
B geneticamente modificadas são alogênicas para um indivíduo ao qual as células B geneticamente modificadas são administradas.
84. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
85. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é uma proteína, um polinucleotídeo ou uma pequena molécula codificada por DNA.
86. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que a proteína é uma enzima, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, uma proteína de fusão, um receptor da superfície celular, uma proteína secretada, uma molécula de sinalização, um fragmento antigênico, um fator de coagulação ou uma molécula de adesão.
87. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é IDUA.
88. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
89. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38- e CD138-.
90. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138+.
91. Célula B geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138-.
92. Composição caracterizada por compreender uma população de células B geneticamente modificadas que foram modificadas geneticamente para produzir um agente terapêutico, em que as células B geneticamente modificadas estão em uma capacidade migratória ótima.
93. Composição, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é IDUA.
94. Composição, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
95. Composição caracterizada por compreender uma população de células B geneticamente modificadas que foram modificadas geneticamente para produzir um agente terapêutico, em que as células B geneticamente modificadas na composição são coletadas da cultura em um ponto do tempo quando não produzem quantidades significantes de citocinas inflamatórias.
96. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-95, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são autólogas para um indivíduo ao qual as células B geneticamente modificadas são administradas.
97. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-95, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são alogênicas para um indivíduo ao qual as células B geneticamente modificadas são administradas.
98. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96-97, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é humano.
99. Composição, de acordo com a reivindicação 92 ou 95, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é uma proteína, um polinucleotídeo ou uma pequena molécula codificada por DNA.
100. Composição, de acordo com a reivindicação 99, caracterizada pelo fato de que a proteína é uma enzima, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, uma proteína de fusão, um receptor da superfície celular, uma proteína secretada, uma molécula de sinalização, um fragmento antigênico, um fator de coagulação ou uma molécula de adesão.
101. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-100, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é IDUA.
102. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-100, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é FIX, LPL ou LCAT.
103. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-102, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38- e CD138- .
104. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-102, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138+.
105. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-102, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são CD20-, CD38+ e CD138-
.
106. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-105, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas usando um transposon Sleeping Beauty para expressar o agente terapêutico nas células B.
107. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-105, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas usando um vetor viral recombinante para expressar o agente terapêutico nas células B.
108. Composição, de acordo com a reivindicação 107, caracterizada pelo fato de que o vetor viral recombinante codifica um retrovírus recombinante, lentivírus recombinante, adenovírus recombinante ou vírus adeno- associado recombinante.
109. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-105 e 106-108, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram preparadas pela integração direcionada no genoma da célula B de uma sequência de polinucleotídeos que codifica o agente terapêutico.
110. Composição, de acordo com a reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que a integração direcionada compreende uma integração gênica mediada por dedo de zinco- nuclease, integração gênica mediada por CRISPR/CAS9, integração gênica mediada por TALE-nuclease ou integração gênica mediada por meganuclease.
111. Composição, de acordo com a reivindicação 110, caracterizada pelo fato de que a integração direcionada do polinucleotídeo ocorreu por meio de recombinação homóloga.
112. Composição, de acordo com a reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que a integração direcionada compreende uma liberação mediada por vetor viral de uma nuclease capaz de induzir uma clivagem de DNA em um sítio de DNA-alvo.
113. Composição, de acordo com a reivindicação 112, caracterizada pelo fato de que a nuclease é uma dedo de zinco-nuclease, uma CAS9-nuclease, uma TALE-nuclease ou uma Meganuclease.
114. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-113, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que possui uma sequência que é idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1.
115. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-113, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que possui uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1, ou pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais do que 99% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1.
116. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-115, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são modificadas geneticamente no Dia 2 ou Dia 3 após o cultivo.
117. Composição, de acordo com a reivindicação 116, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são modificadas geneticamente usando um método que compreende eletroporação.
118. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-117, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 4, Dia 5, Dia 6 ou Dia 7 em cultura após a modificação genética.
119. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-117, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 8 ou mais tarde em cultura após a modificação genética.
120. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-119, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas para administração a um indivíduo no Dia 10 ou mais cedo em cultura após a modificação genética.
121. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-120, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas coletadas não produzem níveis significantes de citocinas inflamatórias.
122. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-121, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são coletadas em um ponto do tempo em cultura no qual é determinado que elas não produzem níveis significantes de citocinas inflamatórias.
123. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-122, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são desenvolvidas em um sistema de cultura que compreende cada um de IL-2, IL-4, IL- 10, IL-15, IL-31, e um ligante de CD40 multimerizado ao longo de todo o período de cultura pré- e pós-modificação genética.
124. Composição, de acordo com a reivindicação 123, caracterizada pelo fato de que o ligante de CD40 multimerizado é um ligante de CD40 marcado com HIS que é multimerizado usando um anticorpo anti-HIS.
125. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-124, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas são expandidas antes da administração ao indivíduo.
126. Composição, de acordo com a reivindicação 125, caracterizada pelo fato de que a população final de células B geneticamente modificadas expandidas demonstra um alto grau de policlonalidade.
127. Composição, de acordo com a reivindicação 126, caracterizada pelo fato de que qualquer clone de célula B particular na população final de células B geneticamente modificadas expandidas compreende menos do que 0,2% da população de células B total.
128. Composição, de acordo com a reivindicação 126, caracterizada pelo fato de que qualquer clone de célula B particular na população final de células B geneticamente modificadas expandidas compreende menos do que 0,05% da população de células B total.
129. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-128, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo que codifica um gene de DHFR humana com resistência aumentada ao metotrexato.
130. Composição, de acordo com a reivindicação 129, caracterizada pelo fato de que o gene de DHFR humana com resistência aumentada ao metotrexato contém mutações por substituição de leucina para tirosina no aminoácido 22 e fenilalanina para serina no aminoácido 31.
131. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-130, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas foram tratadas com metotrexato antes da coleta para administração.
132. Composição, de acordo com a reivindicação 131, caracterizada pelo fato de que o tratamento com metotrexato é entre 100 nM e 300 nM.
133. Composição, de acordo com a reivindicação 132, caracterizada pelo fato de que o tratamento com metotrexato é 200 nM.
134. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-133, caracterizada pelo fato de que as células B geneticamente modificadas compreendidas na composição migram para diversos tecidos mediante administração a um indivíduo.
135. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-133, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma célula B geneticamente modificada da população de células B geneticamente modificadas compreendidas na composição migra para um ou mais tecidos selecionados do grupo que consiste em medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro quando a composição de células B geneticamente modificadas é administrada a um indivíduo.
136. Composição, de acordo com a reivindicação 135, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma célula B geneticamente modificada da população de células B geneticamente modificadas compreendidas na composição migra para a medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro do indivíduo quando a composição de células B geneticamente modificadas é administrada a um indivíduo.
137. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-136, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico produzido pelas células B geneticamente modificadas é iduronidase (IDUA).
138. Composição, de acordo com a reivindicação 137, caracterizada pelo fato de que a administração da composição que compreende as células B geneticamente modificadas a um indivíduo resulta na redução de glicosaminoglicanos (GAGs) em diversos tecidos do indivíduo.
139. Composição, de acordo com a reivindicação 137, caracterizada pelo fato de que a administração da composição que compreende as células B geneticamente modificadas a um indivíduo resulta na redução de GAGs em um ou mais tecidos do indivíduo selecionados do grupo que consiste em medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro.
140. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a administração da composição que compreende as células B geneticamente modificadas a um indivíduo resulta na redução de GAGs na medula óssea, intestino, músculo, baço, rim, coração, fígado, pulmão e cérebro do indivíduo.
141. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-140, caracterizada pelo fato de que a composição é administrada a um indivíduo que possui mucopolissacaridose tipo I (MPS I).
142. Composição, de acordo com a reivindicação 141, caracterizada pelo fato de que a administração da composição que compreende as células B geneticamente modificadas trata a MPS I do indivíduo.
143. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 92-136, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico produzido pelas células B geneticamente modificadas é selecionado de FIX, LPL e LCAT.
144. Método de administração de células B geneticamente modificadas a um indivíduo para produção in vivo de um agente terapêutico, caracterizado por compreender a administração de uma dose única ótima de células B geneticamente modificadas a um indivíduo.
145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
146. Método, de acordo com a reivindicação 145, caracterizado pelo fato de que a dose única ótima é um equivalente humano de 3 x 107 células B modificadas/kg.
147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 144-146, caracterizado pelo fato de que a dose é 1,5 x 109 células B geneticamente modificadas/kg.
148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 144-147, caracterizado pelo fato de que a dose única ótima de células B geneticamente modificadas resulta em um aumento mais do que linear nos níveis perfundidos de células do terapêutico, quando comparada com uma dosagem que é dois terços ou menos da dosagem ótima.
149. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 144-148, caracterizado pelo fato de que a dose única ótima de células B geneticamente modificadas resulta nos maiores níveis in vivo de um terapêutico por célula no contexto de uma infusão única de células B.
150. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 144-149, caracterizado pelo fato de que o agente é IDUA.
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