CN110702489A - 一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法及装置，该装置包括由上而下依次连接的带定时器的电动马达，金属螺纹套杆，聚四氟乙烯板，若干个并列放置的带有活塞的注射器针筒、转接头、固相萃取柱和废液或洗脱液槽；沾污较小、并且可控制所有萃取柱在同一流速、匀速下进行，萃取后的自然溶解有机物样品可进行FT‑ICR‑MS分析，解决了现有技术的问题。

Description

一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法及装置
技术领域：
本发明涉及固相萃取技术领域，具体涉及一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法及装置。
背景技术：
自然溶解有机物(DOM)是广泛存在于河水、海水、湖水等自然水体中溶解态的有机物质，是微生物碳泵的重要组成部分和全球碳循环的重要组成，对水体的碳、生源要素等的生物地化循环具有重要意义。其不仅作为营养盐前体，其本身可能是缺氧区耗氧有机物的来源，甚至通过有机氮、磷的生物降解影响水华、赤潮等灾害的发生和持续时间。DOM的分子组成信息可用于推测其进入碳、生源要素循环的周转周期和对富营养化、缺氧等生态风险的影响。然而，自然水体中的溶解态的有机物(DOM)可能多达十万种，色谱法无法从整体上反演实际环境中DOM组分并评估其对生源要素的贡献以及对生态系统的影响。FT-ICR-MS是一种适用于测试DOM分子组成信息的超高分辨质谱。在进入FT-ICR-MS测试前，需要通过固相萃取富集溶解有机物以获得足够信号，并在萃取过程中除去非挥发性无机盐以减少对FT-ICR-MS质谱分析器的损害。目前，固相萃取装置有两种方式，包括负压萃取和正压萃取。其中，负压萃取除需要配备耐负压的密封主体，还需连接真空泵、缓冲瓶，辅助部件繁杂。正压萃取采取气泵加压或重力萃取，前者对管路耐压系统、管路连接气密性要求高，采用萃取液重力萃取则速度无法控制，流速极慢，需用长管悬于高处，容易在长时间萃取等待时样品变质或沾污。此外，目前无论是正压还是负压固相萃取系统，两种方式均存在缺陷：(1)压力难以控制，尽管不同的萃取柱采用相同的压力，但填料存在的差异使得萃取过程中不同萃取柱的速度差异较大，可达数倍。可通过加装阀门独立调节每个萃取柱的流速差异，但只能通过肉眼判断，过低的流速无法通过阀门增速，实际难以控制各萃取通道在同一速度下流经液体，从而增大不同样品的回收率差异、降低数据的重现性，无法控制实验进度。为避免此问题，有部分正压萃取采用多通道蠕动泵挤压萃取液进行正压固相萃取，但蠕动泵只能采用具有弹性的塑料管道，环境样品的溶解有机物萃取前需添加盐酸，萃取后需用有机溶剂洗脱，往往需要抗酸与有机溶剂腐蚀、低流量的多通道蠕动泵，该系统造价较高，附件繁杂体积相对较大，目前已开发的蠕动泵系统一般针对大体积萃取，且商业化正压自动萃取仪费用高昂，一般在数十万元，而萃取通量一般较低，单通道到四通道不等。(2)对自然溶解有机物样品，无论是负压萃取或以采用空气加压的正压萃取，在萃取过程中样品原液置于大气压下，液面暴露在空气中从而引入大气中的颗粒物，质谱结果显示含有大量的高表面活性的脂肪酸，容易造成样品沾污并掩盖自然溶解有机物的信号。对于极灵敏的FT-ICR-MS，样品的沾污信号十分明显，具有表面活性的沾污源可产生远高于原有自然溶解有机物的信号，同时产生较高的总离子流，由于FT-ICR-MS在不同的总离子流时峰的偏差较大，总离子过高时可引起质谱峰的质荷比偏离甚至峰的裂分，导致数据误差增大，无法进行有效解谱，获得溶解有机物的分子信息。为减少沾污，需在外接氮气瓶的真空手套箱中操作进行负压萃取，真空手套箱成本远高于固相萃取装置本身，且在手套箱中操作难度较大。即使如此，暴露在气体状态下仍然会出现较高的沾污。正压萃取则可采用高纯氮气下压溶液进行萃取，但只能在保证同一压强下萃取，实际萃取流速和耗时均无法保证统一。(3)为控制流速，正压萃取可采用蠕动泵控制流速，但需使用塑料管道或其他长距离运输管道，其中，除普通塑料管道本身因为酸或者有机溶剂溶出的杂质外，由于重复使用塑料连接管道，可能产生交叉污染，影响数据准确度，而蠕动泵所采用长距离运输管道一般重复使用，难以清洗，样品交叉污染，对于高灵敏的FT-ICR-MS分析，可能出现非样品本身的信号，严重干扰测试。
发明内容：
本发明的目的是提供一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法及装置，沾污较小、并且可控制所有萃取柱在同一流速、匀速下进行，萃取后的自然溶解有机物样品可进行FT-ICR-MS分析，解决了现有技术的问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，该装置包括由上而下依次连接的带定时器的电动马达、金属螺纹套杆、聚四氟乙烯板、若干个并列放置的带有活塞的注射器针筒、转接头、固相萃取柱和废液或洗脱液槽；注射器针筒和固相萃取柱固定在萃取柱固定架上，萃取柱固定架设有用于承接固相萃取柱的开孔，还设有螺纹套杆底部承接口；所述的电动马达下方与螺纹套杆相连；螺纹套杆一端与电动马达相连，另一端经由聚四氟乙烯板中间设有的匹配螺纹套杆的螺纹的通孔穿过聚四氟乙烯板连接萃取柱固定架的螺纹套杆底部承接口；每个注射器针筒对应经由一个转接头连接一个固相萃取柱；在萃取过程中，电动马达转动，通过聚四氟乙烯板中间设有的匹配螺纹套杆的螺纹的通孔传动聚四氟乙烯板，旋转的螺纹套杆带动聚四氟乙烯板匀速下压推进，以相同的速度带动所有并列放置的装有液体的注射器针筒的活塞下压，注射器针筒内液体经转接头流入固相萃取柱；萃取柱下接废液或洗脱液槽；当马达不运转时，螺纹可阻止聚四氟乙烯板下压活塞。
特别地，带定时器的电动马达固定在固定容器顶端。
萃取柱固定架设有的用于承接固相萃取柱的开孔为不同型号，适用于不同型号的萃取柱，从而适用于不同体积的萃取液。
特别地，废液或洗脱液槽为可移动的废液或及洗脱液收集架，并列设有若干接收瓶。
特别地，转接头和萃取柱固定架采用耐酸腐蚀、耐甲醇等有机溶剂的聚四氟乙烯材料制备，装载萃取原液的活塞及注射器针筒为可重复灼烧去除任何有机物沾污、能重复使用、耐酸腐蚀、耐有机溶剂的玻璃材质。样品原液以及用于清洗和洗脱的溶剂均不接触普通塑料。
电动马达带定时器，针对特定型号的注射器针筒可准确定时定量进行萃取，以及不同型号的注射器针筒用于适应不同实验所需的流速和萃取速度。
一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法，该方法利用上述装置，包括以下步骤：先使用注射器针筒吸取甲醇进入固相萃取装置，打开电动马达及定时器开关，进行清洗，结束后将聚四氟乙烯板复位，螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板；吸取酸化高纯水进入固相萃取装置活化固相萃取柱；吸取样品溶液进行萃取、淋洗，以上每个步骤均通过上述适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置定量定时进行萃取，只需设定马达定时器，即可进行自动萃取；最后用甲醇洗脱，获得样品的甲醇溶液，无需进行浓缩，可直接进样进行FT-ICR-MS测试。
本发明的有益效果如下：
1)萃取过程为匀速且不同萃取柱可控制在同一速度，精确控制萃取时间，避免填料不均导致流速不同，在保证同一萃取条件的基础上提高数据重现性；
2)系统采用密闭注射器针筒装载样品避免与空气接触，萃取原液无需暴露于空气中。由于避免了萃取液以及萃取柱直接接触空气，并采用聚四氟乙烯及可重复灼烧的玻璃装载样品，使得萃取过程空白降低，尤其适用于FT-ICR-MS测试；
3)此外，电动马达与重力板共同作用产生下压力，驱动力能耗极低，可在12V蓄电池下到野外工作，或连接普通电源工作。利用了聚四氟乙烯板的重力，减少马达消耗的电力，免除气泵，是一种低能耗、同时可多通道萃取的装置，可一次用于36个样品同时萃取同时完成；适用环境溶解有机物样品，同样包括其他类型有机物样品，无需无氧手套箱，尤其适用于对空气氧化敏感的样品和室外采样；
4)此外由于空白背景降低，可大大减小萃取所需的体积；该固相系统体积小，重量轻，所有配件收纳至作为固定架的盒子中，可便携在野外或实验室外采集环境水样时使用，避免水样长距离运输；控制萃取时间，从而保证了不同样品和批次的重现性，提高了工作效率。
附图说明：
图1是马达电机和聚四氟乙烯板固定在固定容器部分的图；
图2是固相萃取柱连接注射器针筒的图；
图3是放置萃取柱的萃取柱固定架图；
图4是承接萃取废液和洗脱液的废液或及洗脱液收集架图；
图5是含外部固定容器的整体效果图；
图中，1为固定架容器，2为带定时器的电动马达，3为螺纹套杆，4为聚四氟乙烯板，5为匹配螺纹套杆螺纹的通孔，6为电源，7为萃取柱固定架，8为用于承接固相萃取柱的开孔，9为带有活塞的注射器针筒，10为转接头，11为固相萃取柱，12为螺纹套杆底部承接口，13为废液及洗脱液收集架。
图6是固相萃取传统方法空白(blank-1)和自然溶解有机物样品(NOM-1)在FT-ICR-MS上的测得分子式，以及本发明所采用的方法空白(blank-2)和自然溶解有机物样品(NOM-2)在FT-ICR-MS上测得的分子式，其中(a)图为聚类分析结果，(b)图为溶解有机物样品分子离子峰强度的分布比较，(c)图是测得分子离子峰的数量比较；
图7是为固相萃取传统方法(NOM-1)和本发明(NOM-2)所采用固相萃取方法萃取自然溶解有机物样品的质谱图解谱结果，其中(a)为固相萃取传统方法(NOM-1)，(b)图为本发明(NOM-2)；
图8是特征DOM峰三次平行萃取实验的结果比较。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
如图1-5所示的一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，该装置包括由上而下依次连接的带定时器的电动马达2、金属螺纹套杆2、聚四氟乙烯板4、若干个并列放置的带有活塞的注射器针筒9、转接头10、固相萃取柱11和废液或洗脱液收集架13；注射器针筒9和固相萃取柱11固定在萃取柱固定架7上，萃取柱固定架7设有用于承接固相萃取柱的开孔8，还设有螺纹套杆底部承接口12。所述的电动马达2固定于固定容器1顶端，下方与螺纹套杆3相连；螺纹套杆3一端与电动马达2相连，另一端经由聚四氟乙烯板4中间设有的匹配螺纹套杆3的螺纹的通孔5穿过聚四氟乙烯板4连接萃取柱固定架7的螺纹套杆底部承接口12；每个注射器针筒9对应经由一个转接头10连接一个固相萃取柱11；在萃取过程中，启动电源6时，电动马达2转动通过通孔5传动聚四氟乙烯板，旋转的螺纹套杆2带动聚四氟乙烯板4匀速下压推进，以相同的速度带动所有并列放置的装有液体的注射器针筒9的活塞下压，注射器针筒9内液体经转接头10流入固相萃取柱11萃取，废液流入废液或及洗脱液收集架13并列设有的若干接收瓶。当萃取完成后，将聚四氟乙烯板4复位，并旋转通孔5螺帽，使螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板，实现灵活控制启动与暂停。
均速固相萃取方法，利用上述装置，包括以下步骤：
1)先使用注射器针筒吸取5mL甲醇进入固相萃取装置，打开电源，启动电动马达及定时器开关，定时器时间调节至6分钟，进行清洗，结束后将聚四氟乙烯板复位，并旋转通孔，使螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板；
2)吸取5mL高纯水(用盐酸调节至pH＝2)进入固相萃取装置活化固相萃取柱，定时器时间调节至6分钟，结束后将聚四氟乙烯板复位，并旋转通孔，使螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板；
3)吸取10mL经0.2μm滤膜过滤后的样品原液进行萃取，定时器时间调节至12分钟，结束后将聚四氟乙烯板复位，并旋转通孔，使螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板；
4)用1mL酸化后高纯水淋洗固相萃取柱，随后用注射器针筒吸取10mL的高纯氮气，按如上萃取方法挤出剩余液体并吹干萃取柱；
5)吸取1mL甲醇溶液洗脱溶解有机物萃取柱，将废液或及洗脱液收集架设有的接收瓶中废液移出，放置2mL玻璃样品瓶承接洗脱液，不使用活塞，待甲醇洗脱液自然流出，即得到富集并去盐后的待测样品，可直接进样进行FT-ICR-MS测试。
利用本发明进行固相萃取，比较传统的DOM固相萃取法(参见Dittmar T.,KochB.,Hertkorn N.and Kattner G.(2008)A simple and efficient method for thesolid-phase extraction of dissolved organic matter(SPE-DOM)from seawater.Limnol.Oceanogr.Methods 6,230–235.)，本发明具有明显较低的沾污峰(图6(b))所示，由于减小了沾污峰带来的抑制效应，检出峰是传统方法的两倍以上，背景沾污信号的降低且大大减少了水样的需求量：传统的DOM固相萃取方法一般采集1L至10L水样才能获得足够样品量，以避免背景沾污信号的干扰；本装置仅采用10mL至30mL水样萃取即可用于测试，且背景沾污信号较低。如采用相同水样进行萃取，传统方法聚类分析结果显示样品NOM-1(来自国际腐殖酸协会IHSS)中自然溶解有机物的信号本身已经被大量掩盖(图6(a))，导致其和空白的相似度较高，图7(a)显示，多出的沾污信号集中在高H/C和低O/C比值的区间，经解谱显示是高表面活性的脂肪酸分子，信号高于DOM信号十倍以上(图6(b))，对DOM出峰具有显著的抑制(图6(c))；且由于流速差异较大(样品溶液萃取时间分别为16分钟，40分钟，96分钟)，传统萃取法的萃取效率、平行性明显差于本发明所采用的萃取方法和装置(图8)，不采用真空泵的情况下，样品溶液萃取总耗时显著高于本发明所需的12分钟。
综上，通过本发明所采用的萃取方法以及相匹配的萃取装置进行的溶解有机物萃取，能获得更好的平行性、重现性，明显较低的背景沾污信号以及更高的电喷雾离子化效率，使得样品溶液的需求量大大降低，实现复杂溶解有机物信号的高通量检出。承接样品的注射器针筒、活塞可重复高温灼烧，避免了塑料管路本身的沾污以及无法有效清洗带来的交叉污染。

Claims (6)

1.一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，其特征在于，该装置包括由上而下依次连接的带定时器的电动马达、金属螺纹套杆、聚四氟乙烯板、若干个并列放置的带有活塞的注射器针筒、转接头、固相萃取柱和废液或洗脱液槽；注射器针筒和固相萃取柱固定在萃取柱固定架上，萃取柱固定架设有用于承接固相萃取柱的开孔，还设有螺纹套杆底部承接口；所述的电动马达下方与螺纹套杆相连；螺纹套杆一端与电动马达相连，另一端经由聚四氟乙烯板中间设有的匹配螺纹套杆的螺纹的通孔穿过聚四氟乙烯板连接萃取柱固定架的螺纹套杆底部承接口；每个注射器针筒对应经由一个转接头连接一个固相萃取柱；在萃取过程中，电动马达转动，通过聚四氟乙烯板中间设有的匹配螺纹套杆的螺纹的通孔传动聚四氟乙烯板，旋转的螺纹套杆带动聚四氟乙烯板匀速下压推进，以相同的速度带动所有并列放置的装有液体的注射器针筒的活塞下压，注射器针筒内液体经转接头流入固相萃取柱；萃取柱下接废液或洗脱液槽；当马达不运转时，螺纹可阻止聚四氟乙烯板下压活塞。
2.根据权利要求1所述的适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，其特征在于，带定时器的电动马达固定在固定容器顶端。
3.根据权利要求1或2所述的适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，其特征在于，萃取柱固定架设有的用于承接固相萃取柱的开孔为不同型号。
4.根据权利要求1或2所述的适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，其特征在于，废液或洗脱液槽为可移动的废液或及洗脱液收集架，并列设有若干接收瓶。
5.根据权利要求1或2所述的适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取装置，其特征在于，转接头和萃取柱固定架采用聚四氟乙烯材料制备，装载萃取原液的活塞及注射器针筒为玻璃材质。
6.一种适用于富集自然溶解有机物的均速固相萃取方法，其特征在于，该方法利用权利要求1-5中任意一项权利要求所述装置，包括以下步骤：先使用注射器针筒吸取甲醇进入固相萃取装置，打开电动马达及定时器开关，进行清洗，结束后将聚四氟乙烯板复位，螺纹套杆复位，卡住聚四氟乙烯板；吸取酸化高纯水进入固相萃取装置活化固相萃取柱；吸取样品溶液进行萃取、淋洗，以上每个步骤，只需设定马达定时器，即可进行自动萃取；最后用甲醇洗脱，获得样品的甲醇溶液，无需进行浓缩，可直接进样进行FT-ICR-MS测试。
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