CN110699328A - 一种b型猪肠道病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物病毒领域，具体的说是一种B型猪肠道病毒及其应用，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV‑B，保藏号为：CGMCC No.10405，命名为Ch‑SDbz‑W2Y以及B型猪肠道病毒在卵黄抗体中的应用，B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV‑B基因组全长序列7382bp，其中包含5'端的非编码区为812bp、3'端的非编码区为72bp；本发明提供的一种B型猪肠道病毒，经过筛选、分离的一株新猪源肠道病毒，该分离株的分离筛选为猪源肠道病毒的全基因组变异、重组监测提供生物信息，利用该毒株制备动物免疫血清，为蛋白变异提供新的生物信息，为后续猪源肠道病毒的研究提供依据，对后续的PEV‑B的遗传进化信息研究奠定基础，对掌握猪肠道病毒的重组、溯源，丰富病毒库具有重大意义。

Description

一种B型猪肠道病毒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物病毒领域，具体的说是一种B型猪肠道病毒及其应用。
背景技术
猪肠道病毒(Porcine enteroviruses,PEVs)属于小核糖核酸病毒科，它可引起猪的神经系统疾病、繁殖障碍、表皮损伤，以及哺乳仔猪腹泻、呕吐并导致死亡等病症。依据病毒致细胞病变(Cytopathic effect,CPE)和血清学试验特性，病毒被分成3个群，分别为I型细胞细胞病变群，II型细胞细胞病变群和III型细胞细胞病变群。PEV-B属于III型细胞细胞病变群，是单链RNA病毒，目前包含两个亚型，PEV-9和PEV-10。文献报道，PEV-B可引起猪表皮损伤。在英国、匈牙利、韩国和中国均有分离到该病毒的报道，并获的了病毒的全基因组序列。
2013年，从发生腹泻母猪粪便中分离到一株PEV-B，获得全基因组序列，分析表明该株病毒具有很大的变异，动物实验显示该毒株可导致哺乳仔猪发生腹泻、呕吐等症状，并导致死亡。
随着，该猪肠道病毒的不断分离鉴定，它的危害性将逐渐被认识。目前，还尚未有预防和/或治疗猪肠道病毒的相关研究报道，对于猪肠道病毒的检测方法主要用细胞病毒分离，PCR检测技术等。
自Klemperer于1893年首次报道鸡蛋中存在抗体以来，人们对蛋中抗体的研究不断深入。并已证明蛋内的抗体主要存在于蛋黄内。近二十年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发作了多方面的工作，卵黄抗体IgY抗体在被动免疫保护中表现出良好的应用前景，如在猪传染性胃肠炎病毒、预防轮状病毒感染、犬细小病毒感染、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒及传染性法氏囊病毒病等方面，但将卵黄抗体应用在诊断、检测、治疗猪肠道病毒，尚未有相关报道。
发明内容
本发明针对背景技术中提出的问题，本发明提供一种B型猪肠道病毒及其应用，首先，经过筛选提供一株新的猪源肠道病毒(PEV-B)，即B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y，为猪源肠道病毒的全基因组变异、重组监测提供生物信息，利用该毒株制备动物免疫血清，为蛋白变异提供新的生物信息，为后续猪源肠道病毒的研究提供依据；其次，以新筛选的B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y为免疫原制备卵黄抗体，用于诊断、检测、治疗猪肠道病毒疾病。
针对上述问题，一种B型猪肠道病毒，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirusB, PEV-B，保藏号为：CGMCC No.10405，保藏日期为2015年3月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮政编码：100101，命名为B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y。
进一步，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B)基因组全长序列7382bp，基因组全长序列不包含3'端的poly A，其中包含5'端的非编码区为812bp、3'端的非编码区为72bp。
进一步，所述的一种B型猪肠道病毒在卵黄抗体中的应用。
进一步，所述卵黄抗体是以B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B为免疫原获得卵黄抗体。
进一步，本发明的另一个目的是提供一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，步骤包括：
1)B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B)免疫原的制备；
2)卵黄抗体的制备。
进一步，具体步骤为：
1)B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的制备；
①采集腹泻猪病料，利用Vero细胞对腹泻猪病料中含有的病毒进行初步分离，然后将初步分离的病毒通过PCR检测方法进行病毒的再次分离，最后提取病毒RNA，进行全基因组的克隆、鉴定、测序，得到B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B；
②B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原制备
A、根据转瓶生产工艺，按体积分数比，在1份细胞培养液中加入1份Vero细胞，进行增殖，当细胞培养液中Vero细胞浓度增至5X 106个/mL时，按细胞培养液总体积百分比，再接入1％的病毒滴度为107.5TCID50/0.1mL的B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B, PEV-B，待细胞培养液中80％以上的Vero细胞出现细胞病变时收获病毒液，得到猪肠道病毒抗原；
B、按重量份数计，取96抗原、4份吐温80，混合均匀，制得乳化水相，备用；
C、按重量份数计，取94份白油、1.5份硬脂酸铝，边搅拌白油边加入硬脂酸铝，搅拌至溶剂透明，然后加入6份司本80，混合均匀、121℃，灭菌20分钟，制得油相，备用；
D、按乳化水相：油相的比列为1:1.5，在匀质机内加入油相，调节转速至3000r/min，搅拌5分钟，加入乳化水相，调节转速至10000r/min，乳化6分钟，得到B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原；
2)卵黄抗体的制备
①免疫接种
选取禽白血病、禽网状内皮组织增殖病均为阴性的高峰期产蛋蛋鸡；
取B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原对高峰期产蛋蛋鸡进行基础免疫接种；在基础免疫接种后的14日进行一次加强免疫接种；在一次加强免疫接种后的14 日进行二次加强免疫接种；
②卵黄抗体提取
A、取二次加强免疫接种后14日的高峰期产蛋蛋鸡所产高免鸡蛋，测定高免鸡蛋蛋黄中的B型猪肠道病毒抗体效价，当抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋，2～8℃贮存；
B、无菌条件下收集卵黄液，按体积份数计，在1份卵黄液加入6份浓度为0.15mol/L的醋酸盐缓冲液，混合均匀，调节pH值为5.2，2～8℃保存过夜，离心，制得上清液Ⅰ；
C、在上清液Ⅰ中加入辛酸至终浓度为2％，混合均匀，2～8℃存储过夜，离心，得到上清液Ⅱ，将上清液Ⅱ通过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，调节pH值为7.4，再通过截留分子量为50kDa的超滤膜进行浓缩过滤，制得上清液Ⅲ；
D、在上清液Ⅲ中加入浓度为0.08％的甲醛溶液，20～25℃条件下灭活24小时，过滤，制得卵黄抗体。
进一步，在制备猪肠道病毒抗原中Vero细胞病变的特征为细胞出现圆缩、颗粒变性、细胞颗粒增多。
进一步，所述基础免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为2.0mL/只；
一次加强免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为 2.0mL/只；
二次加强免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为 2.0mL/只。
进一步，所述的卵黄抗体的效价﹥1:16。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的一种B型猪肠道病毒，经过筛选、分离的一株新猪源肠道病毒(PEV- B)，分离株与GenBank中已录入的PEV-B的同源性最为接近，其同源性为83.6％，确定为B 型猪肠道病毒，命名为Ch-SDbz-W2Y，该分离株的分离筛选为猪源肠道病毒的全基因组变异、重组监测提供生物信息，利用该毒株制备动物免疫血清，为蛋白变异提供新的生物信息，为后续猪源肠道病毒的研究提供依据。
2.本发明提供的一种B型猪肠道病毒，其中B型猪肠道病毒Porcine enterovirusB,PEV- B同韩国PEV-B(毒株名称为PEV-B-KOR；GenBank登录号为JQ818253)相比，所述毒株在起始密码子(ATG)下游的3929位至3940位发生12个碱基的连续缺失，本发明中分离的毒株可使Vero细胞、ST细胞、PK-15细胞出现病变。
3.本发明提供的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，以新筛选的B型猪肠道病毒 Ch-SDbz-W2Y为免疫原制备卵黄抗体，用于诊断、检测、治疗猪肠道病毒疾病，通过试验可知，本发明制备的卵黄抗体可以有效控制猪肠道病毒疾病的发生，对已经发病的猪群也有很好的治疗效果，治疗率高达80％，同时也可以对猪肠道病毒疾病进行前期检测，检测率达到75％以上，为后期控制、治疗该病打下坚实基础，减少农户的经济损失。
4.本发明提供的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体，对开展PEV-B的快速诊断技术、预防和/或治疗技术的储备研究具有重要意义；与此同时，对后续的PEV-B的遗传进化信息研究奠定基础，对掌握猪肠道病毒的重组、溯源，丰富病毒库具有重大意义。
5.基于本发明建立的猪肠道病毒的检测方法，为猪病毒性腹泻病的快速鉴别诊断提供了技术支持和物质保障。
附图说明
图1为分离毒株(Ch-SDbz-W2Y)与韩国分离株(PEV-B-KOR，GenBank登录号为JQ818253) 基因序列缺失部位比较；
图2为分离毒株(Ch-SDbz-W2Y)多聚蛋白基因序列同源性进化分析比较结果；
图3为分离毒株(Ch-SDbz-W2Y)Vero细胞病变图，(A)Vero细胞接毒后96h细胞病变(100X 显微镜下观察)；(B)未接毒vero细胞(100X显微镜下观察)。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
一种B型猪肠道病毒，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B，保藏号为：CGMCC No.10405，保藏日期为2015年3月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码： 100101，命名为B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y。
LB液体培养基：在50mL的去离子水中加入胰蛋白胨1.0g、酵母浸出物0.5g、NaCl0.8g，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0，加入去离子水定容至100mL，分装，121℃条件下灭菌10min，4℃保存、备用；
含Ampicillin的LB液体培养基：按培养基中Ampicillin终浓度为100ug/mL的加入量在LB液体培养基中加入Ampicillin，摇匀，4℃保存、备用；
含Ampicillin的LB琼脂平板培养基：在50mL的去离子水中加入胰蛋白胨1.0g、酵母浸出物0.5g、NaCl 0.8g、1.5g琼脂粉，搅拌均匀，调节pH值至7.0，加入去离子水定容至100mL，121℃条件下灭菌10min，取出后待温度降至40℃时，按培养基中Ampicillin终浓度为100ug/mL的加入量在培养基中加入Ampicillin，摇匀后倒入无菌平皿内，凝固、4℃存储，备用；
1％的琼脂糖凝胶：在锥形瓶中加入0.5g琼脂糖、50ml的1×TAE缓冲液，加热至琼脂糖全部融化，制得1.0％琼脂糖凝胶液，备用；
DMEM细胞维持液：DMEM基础培养基95ml，小牛血清5ml、谷氨酰胺液2ml，在 DMEM基础培养基中加入小牛血清、谷氨酰胺液，混合均匀，密封4℃保存；
DMEM基础培养基：DMEM干粉13.4g、碳酸氢二钠3.7g、超纯水1000ml，在800ml 超纯水中加入DMEM干粉，搅拌均匀，加入碳酸氢二钠，搅拌均匀，用超纯水定容至 1000ml，调节pH值为7.2，搅拌均匀，通过0.22μm的滤膜除菌，4℃保存；
所述的1×TAE缓冲液购自北京百泰克生物技术有限公司；
所述的一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；
所述的猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司；
所述的猪轮状病毒检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司；
所述的猪流行性腹泻病毒检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司；
所述的猪传染性脑脊髓炎检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司；
所述的MagMAX总核酸提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司
所述的总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；
所述的柱式DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；
所述的质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；
其他所用材料均为市售产品。
实施例1
B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B的分离、鉴定，包括：
1)样本来源：采集于山东省滨州市某猪场腹泻母猪粪便；
2)毒株分离
①按体积份数计，在1份样本粪便中加入5份浓度为0.01mol/l的PBS缓冲液，混合均匀，离心，取上清液A，将上清液A通过0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到滤液Ⅰ，将滤液Ⅰ平均分为两份，即样品A、样品B，样品A用于菌种检测PCR检测，样品B用于病毒分离，-80℃冷冻保存，备用；
②通过MagMAX总核酸提取试剂盒提取样品A的总核酸，并分别利用猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒、猪轮状病毒检测试剂盒、猪流行性腹泻病毒检测试剂盒、猪传染性脑脊髓炎检测试剂盒对样品A的总核酸进行PCR检测，其检测结果为阴性；
通过自行建立的B型猪肠道病毒一步法RT-PCR检测方法对样品A的总核酸进行检测，其检测结果为阳性，初步判定该分离毒株为猪肠道病毒，具体方法如下：
依据GenBank中已录入的B型猪肠道病毒全基因组序列保守区域，设计引物(引物F:5’-ACTCCCTTCCCACAAGCAAC-3’，引物R:5’-GCGTGAAAGCCGAACAATAT-3’)，利用一步法RT-PCR试剂盒对样品A进行一步法RT-PCR扩增，得到样品A的总RNA，一步法RT-PCR扩增反应液体系见表1：
表1：一步法RT-PCR扩增反应液各成分加入量为
反应液名称 用量
2×one Step Buffer 25μL
引物F 2μL(引物浓度为25uM)
引物R 2μL(引物浓度为25uM)
RNA模板 11μL
酶混合液 2μL
ddH<sub>2</sub>O 8μL
在0.5ml离心管A内依次加入2×one Step Buffer、引物F、引物R、RNA模板、酶混合液、ddH2O，混合均匀，得到一步法RT-PCR反应液Ⅰ；
一步法RT-PCR扩增反应条件为：
cDNA合成50℃、30min；
预变性94℃、3min；
PCR扩增共30个循环，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s；
72℃充分延伸6min；
4℃5min，反应结束。
将一步法RT-PCR反应液Ⅰ放于PCR仪内，根据设计的一步法RT-PCR反应条件进行RT-PCR扩增反应，得到RT-PCR扩增产物Ⅰ；
结果判定：
取8uL的RT-PCR扩增产物Ⅰ即样品A的总RNA，将RT-PCR扩增产物Ⅰ经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约600bp处出现目的扩增条带，扩增结果表示为阳性，即初步判定检测的样品A中含有B型猪肠道病毒的核酸物质，阴性则未扩增出目的条带；
③根据转瓶生产工艺，按体积分数比，在含有1份细胞培养液的细胞培养瓶中接入1 份Vero细胞，当细胞培养瓶中的Vero细胞长满至单层时，弃掉培养液，然后加入样品 B，样品B的加入量为所弃掉培养液体积的1/10，在5％二氧化碳培养箱内37℃条件下吸附 1小时，弃上清，再加入8份DMEM细胞维持液，37℃条件下培养72小时，最后冻融5 小时，得到含有猪肠道病毒的细胞培养液，-20℃存储，备用；
④将含有猪肠道病毒的细胞培养液进行Vero单层细胞培养，当培养至第5代时，取培养至第5代时的细胞培养液，并通过噬斑扩增法进行病毒纯化，得到纯化后的猪肠道病毒液，平均分为三份，即纯化后的猪肠道病毒液A，纯化后的猪肠道病毒液B，纯化后的猪肠道病毒液C，纯化后的猪肠道病毒液A用于菌种鉴定，纯化后的猪肠道病毒液B用于全基因组克隆，纯化后的猪肠道病毒液C用于卵黄抗体制备，备用；
⑤利用总RNA提取试剂盒对步骤④中得到的纯化猪肠道病毒液A进行RNA提取，获得猪肠道病毒总RNA，提取猪肠道病毒总RNA的方法与自行建立的B型猪肠道病毒一步法RT-PCR检测方法相同；
⑥依据GenBank中已录入的B型猪肠道病毒全基因组序列保守区域，设计引物(引物 F:5’-ACTCCCTTCCCACAAGCAAC-3’，引物R:5’-GCGTGAAAGCCGAACAATAT-3’)，利用一步法RT-PCR试剂盒对纯化猪肠道病毒液A进行一步法RT-PCR扩增，得到猪肠道病毒总RNA，一步法RT-PCR扩增反应液体系见表2：
表2：一步法RT-PCR扩增反应液各成分加入量为
反应液名称 用量
2×one Step Buffer 25μL
引物F 2μL(引物浓度25uM)
引物R 2μL(引物浓度25uM)
RNA模板 11μL
酶混合液 2μL
ddH<sub>2</sub>O 8μL
在0.5ml离心管B内依次加入2×1Step Buffer、引物F、引物R、RNA模板、酶混合液、ddH2O，混合均匀，得到一步法RT-PCR反应液Ⅱ；
一步法RT-PCR扩增反应条件为：
cDNA合成50℃、30min；
预变性94℃、3min；
PCR扩增共30个循环，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s；
72℃充分延伸6min；
4℃5min，反应结束。
将一步法RT-PCR反应液Ⅱ放于PCR仪内，根据设计的一步法RT-PCR反应条件进行RT-PCR扩增反应，得到RT-PCR扩增产物Ⅱ；
结果判定：
取8uL的RT-PCR扩增产物Ⅱ即猪肠道病毒总RNA，将RT-PCR扩增产物Ⅱ经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约600bp处出现目的扩增条带，扩增结果表示为阳性，即初步判定检测的纯化猪肠道病毒液A中含有B型猪肠道病毒的核酸物质，阴性未有目的扩增条带出现；
⑦取20uL的RT-PCR扩增产物Ⅱ送至上海生工测序公司进行DNA序列测序，并将测序结果经过NCBI Blast程序进行同源性比对，该分离株扩增出594bp的片段与PEV-B的同源性为91.5％，确定该病毒分离株为B型猪肠道病毒(Porcine enterovirus B,PEV-B)，命名为B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y。
实施例2
B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y全基因组克隆及序列测定
1)B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y总RNA制备
①取含有B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y株的细胞培养液即纯化后的猪肠道病毒液B，以12000r/min、离心5min，得到滤液Ⅱ，利用总RNA提取试剂盒对滤液Ⅱ进行总 RNA提取，获得B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y总RNA，置于-70℃冻存，备用；
2)B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y的一步法RT-PCR扩增
①根据B型猪肠道病毒全基因组设计4对引物序列，见表3：
表3、扩增猪肠道病毒分离株全基因组所用引物序列
Figure RE-GDA0002290446550000091
②利用一步法RT-PCR试剂盒对B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y株进行RT-PCR扩增，以B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y总RNA为模板、根据步骤①中的4对引物分别设计一步法RT-PCR扩增反应体系，形成4组含B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y总RNA的一步法RT-PCR扩增反应液，即L1—RT-PCR扩增反应液、L2—RT-PCR扩增反应液、L3—RT- PCR扩增反应液、L4—RT-PCR扩增反应液，见表4
表4：4组扩增反应液各组成分加入量为：
反应液名称 用量
2×one Step Buffer 25μL
引物L-F 2μL(引物浓度25uM)
引物L-R 2μL(引物浓度25uM)
RNA模板 11μL
酶混合液 2μL
ddH<sub>2</sub>O 8μL
③设计一步法RT-PCR反应条件为：
cDNA合成50℃、45min；
预变性94℃、3min；
PCR扩增共30个循环，94℃变性30s、退火为50-57s、72℃延伸45s；
72℃充分延伸6min；
4℃5min，反应结束；
其中在PCR扩增30个循环中的退火温度根据各组引物的退火温度进行调整；
根据设计的一步法RT-PCR反应条件分别对4组含B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y总RNA的一步法RT-PCR扩增反应液进行一步法RT-PCR扩增反应，分别得到4组RT-PCR 扩增产物，即L1—RT-PCR扩增产物、L2—RT-PCR扩增产物、L3—RT-PCR扩增产物、 L4—RT-PCR扩增产物；
3)RT-PCR扩增产物鉴定
分别将4组RT-PCR扩增产物经过浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，每组RT-PCR扩增产物的加入量为8μL，并以DL2000 Marker为参照Marker，选取与参照Marker基因片段大小一致的RT-PCR扩增产物为目标RT-PCR扩增产物，然后用柱式DNA回收试剂盒分别回收4组目标RT-PCR扩增产物，得到L1—目标RT-PCR扩增产物、L2—目标RT-PCR 扩增产物、L3—目标RT-PCR扩增产物、L4—目标RT-PCR扩增产物，置于﹣20℃保存备用；
4)B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y全基因组克隆
分别对4组目标RT-PCR扩增产物进行全基因组克隆，得到4组克隆质粒，分别以4组克隆质粒为模板(模板的用量为11uL)，通过PCR检测方法分别对4组克隆质粒进行鉴定，4组克隆质粒的检测结果均为阳性重组质粒，将4组阳性重组质粒(送检阳性重组质粒的检测量为10uL)送至上海生工测序公司，分别进行测序，剩余的4组阳性重组质粒置于-20℃保存；
以L1—目标RT-PCR扩增产物为例制备L1克隆质粒，其步骤如下：
①基因克隆
在0.5mL离心管C中加入0.5μL的pMD18-T Vector、4.5μL L1—目标RT-PCR扩增产物、5μL的Solution I，混合均匀、16℃条件下连接过夜，制得连接反应产物；
②连接产物的转化
在200μL的E.coli DH5ɑ感受态细胞中加入连接反应产物，混合均匀，形成混合物，将混合物在0℃条件下冰浴30min，然后取出在42℃条件下水浴热激90s，再次在0℃条件下冰浴5min，形成混合物Ⅰ；
③在500μL的LB液体培养基中接种入混合物Ⅰ，37℃振荡培养1小时，形成培养物，取200μL培养物涂布在含Ampicillin的LB琼脂平板培养基(Ampicillin的终浓度 100μg/mL)上，待培养物被完全吸收后，倒置平板，37℃培养16小时，直至长出直径为 2-3mm的单菌落；
④阳性克隆质粒的鉴定及测序
在含有5mL的含AmpicillinLB液体培养基(Ampicillin的终浓度100μg/mL)中接种入3个直径为2-3mm的单菌落，置于摇床内，在温度为37℃、转速为200r/min，振荡培养 12小时，形成培养菌液；
⑤利用质粒提取试剂盒对培养菌液进行质粒提取，具体步骤如：
A、在新的无菌1.5mL离心管A内加入1.5mL培养菌液，在温度为4℃、转速为12000r/min，离心30s，弃上清液，然后加入100μL溶液Ⅰ，振荡、混合均匀，形成培养菌液Ⅰ；
B、在培养菌液Ⅰ中加入200μL溶液Ⅱ，混合均匀，在温度为0℃条件下，冰浴10 min，形成培养菌液Ⅱ；
C、在培养菌液Ⅱ中加入150μL溶液Ⅲ，混合均匀，在温度为0℃条件下，冰浴10min，在温度为4℃、转速为12000r/min条件下、离心5min，取上清液B，将上清液B移至无菌1.5mL离心管B中；
D、在含有上清液B的无菌1.5mL离心管B中加入等体积的酚氯仿混合液，混合均匀，在温度为4℃、转速为12000r/min条件下、离心10min，取上清液C，将上清液C移至无菌1.5mL离心管C中；
E、在含有上清液C的无菌1.5mL离心管C中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混合均匀，在温度为4℃、转速为12000r/min条件下、离心10min，将上清液D移至无菌1.5 mL离心管D中；
F、在含有上清液D的无菌1.5mL离心管D内加入等体积的异丙醇，混合均匀，先置于-20℃条件下静置20min，然后在温度为4℃、转速为12000r/min条件下、离心10min，干燥、沉淀5min，得到沉淀物，在沉淀物中加入50μL的ddH2O、2μL的RNase，混合均匀、37℃消化10min，制得L1克隆质粒，-20℃保存，备用；
G、以L1克隆质粒为模板，利用PCR检测方法对L1—克隆质粒进行鉴定，检测结果为L1—阳性重组质粒，将L1—阳性重组质粒送至测序公司进行测序，剩余L1—阳性重组质粒-20℃保存；
根据L1—阳性重组质粒的制备方法，依次制备L2—阳性克隆质粒、L3—阳性克隆质粒、L4—阳性克隆质粒，备用；
本步骤中所使用的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ酚氯仿混合液、氯仿异戊醇混合液均为质粒提取试剂盒中提供试剂；
5)阳性重组质粒序列拼接检测及结果分析
将测序得到的4组阳性克隆质粒基因片段的核苷酸序列进行序列拼接，获得重组全基因组序列，并去除重组全基因组序列中的5'端非编码区和3'端非编码区同时将重组全基因组序列与GenBank中已经录入的不同类型的肠道病毒(GenBank登陆号：Y14459(PEV-9，UKG)、AF363455(PEV-10，LP54)、JN807387(PEV-15，WBD)、HM131607(PEV-9， Ch-ah-f1)、JQ818253(PEV-B，KOR)、HQ702854(PEV-3H，K23)、AF363453(PEV-9， UKG)、KF985175(PEV-G1，13-03212)、JQ277724(OEV,TB4-OEV)、KM667941(BEV- E,Egypt)及HQ663846(BEV-2，BJ001))进行遗传进化分析；
分析结果表明，本发明中筛选的毒株与韩国株(PEV-B，KOR)在同一进化分支上，而与PEV-9和PEV-10在不同的进化亚群上，该分离株同GenBank中已录入的肠道病毒核苷酸PEV-B的同源性为83.6％，同PEV-9的同源性大于75％，结果见表5。
表5、分离株测序结果比对结果
登录号 毒株型 同源性
AF363453 PEV-9 76％
AF363455 PEV-10 75.6％
HM131607 PEV-9 77.4％
JQ818253 PEV-B 83.6％
Y14459 PEV-9 76.1％
JN807387 PEV-15 67.1％
HQ702854 PEV-3H 64.2％
KF985175 PEV-G1 65.2％
JQ277724 OEV 60.4％
KM667941 BEV-E 52.6％
HQ663846 BEV-2 52.3％
由表5可知，本发明中分离的菌株与PEV-B的同源性最为接近，该分离株与PEV-B的同源性为83.6％。
实施例3
B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B卵黄抗体的制备
1)B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原制备
A、根据转瓶生产工艺，按体积分数比，在1份细胞培养液中加入1份Vero细胞，进行增殖，当细胞培养液中Vero细胞浓度增至5X 106个/mL时，按细胞培养液总体积百分比，再接入1％的病毒滴度为107.5TCID50/0.1mL的猪肠道病毒病毒液即纯化后的猪肠道病毒液C，待细胞培养液中80％以上的Vero细胞出现细胞病变时收获病毒液，得到猪肠道病毒抗原；
B、按重量份数计，取96抗原、4份吐温80，混合均匀，制得乳化水相，备用；
C、按重量份数计，取94份白油、1.5份硬脂酸铝，边搅拌白油边加入硬脂酸铝，搅拌至溶剂透明，然后加入6份司本80，混合均匀、121℃，灭菌20分钟，制得油相，备用；
D、按乳化水相：油相的比列为1:1.5，在匀质机内加入油相，调节转速至3000r/min，搅拌5分钟，加入乳化水相，调节转速至10000r/min，乳化6分钟，得到B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原；
E、B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的检测
按现行的《中国兽药典》附录对B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原进行检验，B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原外观呈乳白色乳剂；取B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原滴10滴于0℃冰水混合液中，除第一滴外，其余均为油滴状不扩散；取B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原10ml 加入50ml离心管中，转速为3000r/min，离心15min，可见50ml离心管的底部析出的水相小于≤0.5mL。
2)卵黄抗体的制备
①免疫接种
选取禽白血病、禽网状内皮组织增殖病均为阴性的高峰期产蛋蛋鸡；
取B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原对高峰期产蛋蛋鸡进行基础免疫接种；在基础免疫接种后的14日进行一次加强免疫接种；在一次加强免疫接种后的14 日进行二次加强免疫接种；
基础免疫接种、一次加强免疫接种、二次加强免疫接种均按每只鸡2.0ml的接种量进行免疫接种；
②卵黄抗体提取
A、取二次加强免疫接种后14日的高峰期产蛋蛋鸡所产高免鸡蛋，测定高免鸡蛋蛋黄中的B型猪肠道病毒抗体效价，当抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋，2～8℃贮存；
B、无菌条件下收集卵黄液，按体积份数计，在1份卵黄液加入6份浓度为0.15mol/L的醋酸盐缓冲液，混合均匀，调节pH值为5.2，2～8℃保存过夜，离心，制得上清液Ⅰ；
C、在上清液Ⅰ中加入辛酸至终浓度为2％，混合均匀，2～8℃存储过夜，离心，得到上清液Ⅱ，将上清液Ⅱ通过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，调节pH值为7.4，再通过截留分子量为50kDa的超滤膜进行浓缩过滤，制得上清液Ⅲ；
D、在上清液Ⅲ中加入浓度为0.08％的甲醛溶液，20～25℃条件下灭活24小时，过滤，制得抗体效价﹥1:16的卵黄抗体。
实施例4
检测与预防试验
设计试验方案：
选择8个发生仔猪腹泻的猪场，每个猪场选取发生腹泻仔猪100头(排除猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性脑脊髓炎感染)，分别采集腹泻仔猪粪便，利用本发明上述中所描述的自行建立B型猪肠道病毒的一步法RT-PCR检测方法对所有样本的总核酸进行PCR检测，经过检测发现有3个猪场有B型猪肠道病毒感染，即猪场C的B型猪肠道病毒阳性率为75％，猪场E的B型猪肠道病毒阳性率为100％，猪场H 的B型猪肠道病毒阳性率为92％，检测结果见表6；
表6：8个样本猪场送检腹泻样品的RT-PCR检测结果
猪场编号 送检样品(份) 肠道病毒检测阳性(份) 阳性率(％)
猪场A 100 0 0
猪场B 100 0 0
猪场C 100 75 75
猪场D 100 0 0
猪场E 100 100 100
猪场F 100 0 0
猪场G 100 0 0
猪场H 100 92 92
由表6可知通过本发明建立的B型猪肠道病毒一步法RT-PCR检测方法可以有效的检测出B型猪肠道病毒，检出率大于75％。
选取3个发病猪场中的30日龄内的仔猪(包括发病仔猪、未发病仔猪)，各300头，口服卵黄抗体，用量为5mL/头，每日1次，连用5天，记录用药前的发病数、用药后的发病数、死亡率、治愈率，见表7：
用药后发病数率＝用药后的发病数/仔猪总数-用药前的发病数*100％
治愈率＝治愈数/发病数*100％
表7：3个发病猪场中样本仔猪在口服卵黄抗体后的治愈结果
猪场编号 猪场C 猪场E 猪场H
仔猪总数/头 300 300 300
用药前的发病数/头 75 100 92
用药后的发病数/头 29 36 34
用药后的发病数率％ 12.9 18 16.3
治愈数率％ 80 66.2 77
治愈数 92 90 97
由表7可知，本发明制得的卵黄抗体可以有效的控制B型猪肠道病毒的病情，治愈率高达80％。
实施例5
卵黄抗体预防试验
选取15日仔猪100头，平均分为试验组1、对照组1，每组仔猪各50头，对试验组1 的仔猪口服5mL卵黄抗体，每日1次，连用5天，对照组口服生理盐水，每次5mL，每日1 次，连用5天，在第6天分别对试验组1、对照组1中仔猪均口服2ml的猪肠道病毒，5日后记录发病率、死亡率、发病数，见表8：
表8：卵黄抗体预防猪肠道病毒试验的试验结果
组别 发病数(头) 死亡率(％) 发病率(％)
试验组1 13 0％ 13％
对照组1 67 8 67％
由表8可知，本发明中制备的卵黄抗体可以有效的预防猪肠道病毒的发生，从而降低了养殖户的损失，取得良好的经济和社会效益。
实施例6
治疗试验
分别选取15日龄的仔猪，设为试验组2和对照组2，每组均为30头，试验组2、对照组2中每头仔猪均口服2ml的猪肠道病毒，逐日观察，待仔猪出现呕吐症状时，试验组口服卵黄抗体，每日1次，每次5mL/头，对照组不进行治疗，观察5天后治愈率并记录见表 9：
表9：卵黄抗体治疗猪肠道病毒试验的试验结果
组别 死亡数(头) 死亡率(％) 治愈率(％)
试验组2 0 0％ 79％
对照组2 12 40％ 0％
由表9可知，本发明中制备的卵黄抗体可以有效的治疗猪肠道病毒，治愈率高达79％，为临床上治疗猪肠道病毒提供治疗依据和治疗方法。
所述毒株全基因组序列表
Figure RE-GDA0002290446550000161
Figure RE-GDA0002290446550000171
Figure RE-GDA0002290446550000181
Figure RE-GDA0002290446550000191
注:"__"为5'端非编码区(812bp)；
Figure RE-GDA0002290446550000192
为3'端非编码区(72bp)；其余部分为多聚蛋白基因序列区域 (6498bp)。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 一种B型猪肠道病毒及其应用
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7382
<212> DNA
<213> B型猪肠道病毒（Porcine enterovirus B, PEV-B）
<400> 1
ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccacccg cagggcccac tgggcgctag tacactggta 60
tgctagtacc ctggtatcac ggtaccattg tgcgtcagta cctttgtacg cctgttttat 120
actcccttcc cacaagcaac cttagaagtt taaataaata aagaccaata ggagtccaac 180
atccagttgg atcgcggtca agcacttctg tttccccgga cctagtagtg ataggctgtg 240
cccacggccg aagatgaacc cgtccgttat ccggccagct acttcgagaa gcctagtaac 300
atcaaagatc tgtcttggcg tttcgctcag cgcgttcccc ccgcgtagat cgggctgatg 360
ggtctccgca taccccacgg gcgaccgtgg cggaggccgc gtggcggcct gcctatggcg 420
aaagccatag gacgccattt cagtgacagg gtgtgaagag cctattgagc tagttggtag 480
tcctccggcc cctgaatgcg gctaatccta accacggagc actcgccggc gaaccagctg 540
gtagggtgtc gtaatgggta actctgtggc ggaaccgact actttgggtg tccgtgtttc 600
cttttgatcc tatattggct gcttatggtg acaacgataa gttgttatca taaagctttt 660
gggttggcca cctggaaaaa gttatcagtg tttgatattg ttcggctttc acgcctacca 720
ataaaacaag ccttatatta tataatttcc ttttacccga aggaagagat ttctgaattc 780
catcttcaat tgctcttaac attatcagca aaatgggaat gcaaatgagc aaaaatgtag 840
ccggatccca caccaccgtg acccaggcca ctaatggatc caagatccat tacactaata 900
tcaactacta caaccactct gctagtgcta gtcaaaacaa gcaagacatt gcgcaagatc 960
ctagcaaatt cacacaacca gtggttgact tgatgaagga gtccgcagtt ccactaaaat 1020
caccatcagc ggaagcatgc ggatacagtg acagggttgt gcaactcacg cttggaaaca 1080
gcacaataac tacacaggaa gctgctaaca tcgccgtcgc atatggcgag tggcccgaat 1140
acctttctga tgaagatgcc actgctgttg ataagaccac taaaccaggc gtagcatgcg 1200
accgcttcta cacacttcct ggaaagaagt ggacggcaga tgacaagggc tgggagtgga 1260
aattacctga tgcgctcacc gagcttggtg tctttgggca gaattgtcaa taccactacc 1320
tgatgaggtg tgggtggacc atccatgtgc agtgcaacgc aactaaattt catcaaggtt 1380
gcttgcttgt tgtggcagta cctgatcacc aattaggtac gacatacaac ccttcctttg 1440
accagaccat gcctggcaaa aatggtagaa acatccaata tccatttgag tttgaagatg 1500
gaactagtct agcaaatgct ctcgtttacc cgcaccagtg gataaacatt agaaccaaca 1560
actcagctac tttagttctg ccttacatta actcaatccc aatggactct gcaattcgtc 1620
acagtaattg gtcacttatg attataccaa tggttccgtt aaaggctgca accggaacca 1680
ccccttttgt aggcattact gtaactgtag cacctatgat gtcagagttc tcagggttac 1740
gcaaagccat tgttcaggga attcctacta caaacacacc aggttcctat cagtttatga 1800
caacagatga ggactccagc gcttgcatgc taccagactt cacccccaca caggaaatcc 1860
atatcccagg agaggttaag aaccttcaag ccttgtgtca agttgaatca attatggaaa 1920
tcaacaatgt tgagggaaaa tcaggtgttg agagacttag tcttgaagtt agtgcacaga 1980
cagatttaga caggcaactt tttgcattgg aggttacctt taaacaggat tccattatgt 2040
ctaaaacttt atgtggtata gtgtgcagct actttactca gtggtcaggt tcccttgaga 2100
ttacctttat gtttactgga tccttcatga gcacaggtaa gttattactt gcttacacac 2160
caccaggtgg ggcagcacca acaagtaggg aagatgccat gctcggcacg cacgttgtat 2220
gggactttgg gctgcagagc tcaatcactt tggttgtacc atggatatgt ggagggtatt 2280
atagggatgt ggctagagcc accaattact acgcatctgg ctatgtcact ggttggtatc 2340
agaccaatct ggttattcct ccaaactttc ccacaactgc taacattgtg tgccttctag 2400
cagcacaacc taatttctcc atgaggataa tgaaggacag acccgacatt actcaaactg 2460
ccagactaga agcacccatt cagactgcag ttgagaatgc cattgtctct gcaatcagta 2520
gtgctacagt agctgatact caacaaagtt ctcacaatat ctccactgca aacactccag 2580
ctttacaagc agcggagact ggggctacct ccaccgccag cgatgagggc atgcttgaaa 2640
ctaggcatgt tgtgaacacc aacacagtct cggaatcatc cgtggagagc ttttatggga 2700
gatctggtct tgtttccatc atcgaacttg gagctggtaa tgttgagaaa cactggctta 2760
ttaacttcaa tgagtttgta caactgagag caaaaatgga attgtttacc tacatgagat 2820
atgacattga attcactctg gttgccaccc ttgtgaagga tggtagtgcc tcaactccac 2880
cagtgcagtt acaagttatg tatgtgccac ctggtgccac tacacctgaa gatcaagatt 2940
cataccagtg gcagtctgca gcaaatccct ctgtcttttt ccaggcaaat ggagttgcag 3000
ctagattcag tgtgcccttt atgggaactt ccaatgctta tgctatattt tatgatggtt 3060
acaacacttt tggatctgat agggcaggtt ctgactatgg taagattaac agcagtcaca 3120
tgggccatat tgcagttcga gctgtggcac cacttaaaac tggagagact gttacatgga 3180
gagtatatgc caagccaaaa catgtcagag catgggcacc tcgctcacca agaattgccc 3240
catacgtgcg cattgcgact ccggtgttcg gagcgcgcac tcaaaatgtc ccaaatagaa 3300
ccaatgttct gaccaccact ggagctttcg gacagcaggg tggtgccatt tatgttggta 3360
actacaaaat tgtaaacaga caccttgcga cccatgagga ttgggagaat gtggaatggg 3420
aagattacaa cagagacctt cttgtcgcca gaacaacagc tcatggtgtt gacaagctcg 3480
ctagatgcca ttgcaatact ggtgtctact actgcaagtc cagaaacaag cattacccag 3540
tgactttcca gggaccaggc atagattgga ttgaggctag tgggtactat ccagctagat 3600
accaaacgca tcttctcctt gcctcaggga tctccgaacc tggagactgt ggtggaattc 3660
tcagatgtca gcatggagta atcggaattg taacagctgg tggtcaggga gtggtcggtt 3720
ttgccgatgt tagagacctc ttttggattg agcatgaggc tatggaacag ggccttactg 3780
actacatcca gcaacttgat aacagttttg gacaaggttt caccgctgag attaccaact 3840
acgccagcca gctcactgag atgctcattg gagcggatgg tatggtagaa agatgcctgc 3900
agacctttgt gaaagttatt tctgcaatag tcattgccac cagatcacag ggggatgtac 3960
caaccattct tgcctcctta gccttgattg gatgtgatgg aagcccttgg agatggctta 4020
aacgccaatt ttgcggaatc tttaaaatac cctatgtaga aaagcagaat gataattggt 4080
taaaaaagtt taccacttat atcaatgctt tcaagggcct tgactgggtt gcagagaaga 4140
tcatgaagtt tattgattgg cttaagaacc atcttgtacc ccaagccaaa gagaggatgg 4200
agtttgtcac taatctgaag tctcttccac tacttgaggc tcaaattgct acccttgagc 4260
actcatgccc tactactgaa cagcaagaaa ccttatttgg gaatgttcag taccttgcac 4320
actattgcag aagatatgct ccactgtacg cagcggaggc tagaagggta tttgccctag 4380
agaagagagt actaggatac atacagttca agaataagca acgaattgaa cctgtctgtc 4440
tcctaatcca tggcacggct ggaacgggaa aatctcttgc tacttcaata attggaagaa 4500
agcttgctga gtatgaaaac tctgaggtgt atgcgattcc cccagatagt gaccacttcg 4560
atggttacca acaacaggct gtagtagtga tggatgatct caatcagaac ccagatggaa 4620
aagacatggt tgcatactgt cagatggttt caaccgtacc ttatcatgtg cccatggctg 4680
ccatcgaaga gaaaggaatg cttttcacca gctcttatgt ccttgcttcc accaaccgtg 4740
caccaaccgt gtctaatgcc aaggctcttt ctaggagatt tgcctttgat gtggacattg 4800
aagttactga gcactacaaa aaccacaatg gcactcttaa tgtagttgaa gctacccaga 4860
aatgtgagga ttgctgccca gccaacttta aaacctgtat gcccttgatt tgtggagaag 4920
cctaccagct tgtggataga agaaatggga tgagatactc tattgacacc atgatttcag 4980
caatgagggc cgaatggaag agaagaaacc aggttggttc tgttattgaa gctttgtttc 5040
agggacctcc agtgtttaaa ccacttaaaa tctcagtgga tcctgagaca ccagcaccac 5100
cagctattgc agacctttta gctagcgttg attctgaagt agttagggaa tactgcaaga 5160
ggaagggatg gatcgtagaa gtccctgtgg atgagaggaa gttggagagg aatgtaaaca 5220
tggctgctac cattctctcc agtttggtgc ttttaacatc agtaattacc cttgtatatc 5280
tagtctacag actttttgct ggaactcagg gaccatatac tggactgccc aacgccaaac 5340
caaaggcccc agtactcaga gaagtgagag cccagggacc cttgatggat tttggcgtca 5400
gcatgatgaa aaagaatatt gtgaccgtgc gcactggata tggtgaattt actggccttg 5460
gtgtgtatga tacagtactt gtgctcccta ggcatgctaa cccaactggt caagttattg 5520
tggatggagt tgaaactcag gtagctgatg cctacaatct ggtggatgaa gaaggagttt 5580
ccctcgaact ctgtcttgtg acccttcaga gaaatgaaaa atttagggat attagagcca 5640
tgatcccaga gaacccaacg ggagcagccg aggcagtggt ttgtgtaaac acttcagcat 5700
ttccaaacgc ctttcttccg gttggaaaga ccgagtacta cggttacctc aacctcgctg 5760
gtagacccac tcaccgcact atgatgtaca acttcccaac taaagcgggg cagtgtggtg 5820
gggtagttct atccactgga aaagtattgg gtattcacat tggaggtaat ggagcccaag 5880
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Claims (8)

1.一种B型猪肠道病毒，其特征在于，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B，保藏号为：CGMCC No.10405，保藏日期为2015年3月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，命名为B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y。
2.根据权利要求1所述的一种B型猪肠道病毒，其特征在于，所述B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B)基因组全长序列7382bp，基因组全长序列不包含3'端的poly A，其中5'端的非编码区为812bp、3'端的非编码区为72bp。
3.根据权利要求1所述的一种B型猪肠道病毒在卵黄抗体中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种B型猪肠道病毒在卵黄抗体中的应用，其特征在于，所述卵黄抗体是以B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B为免疫原获得卵黄抗体。
5.根据权利要求4所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：
1)B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B)免疫原的制备；
2)卵黄抗体的制备。
6.根据权利要求5所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，其步骤为：
1)B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的制备；
①采集腹泻猪病料，利用Vero细胞对腹泻猪病料中含有的病毒进行初步分离，然后将初步分离的病毒通过PCR检测方法进行病毒的再次分离，最后提取病毒RNA，进行全基因组的克隆、鉴定、测序，得到B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B；
②B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原制备
A、根据转瓶生产工艺，按体积分数比，在1份细胞培养液中加入1份Vero细胞，进行增殖，当细胞培养液中Vero细胞浓度增至5X 106个/mL时，按细胞培养液总体积百分比，再接入1％的病毒滴度为107.5TCID50/0.1mL的B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B，待细胞培养液中80％以上的Vero细胞出现细胞病变时收获病毒液，得到猪肠道病毒抗原；
B、按重量份数计，取96抗原、4份吐温80，混合均匀，制得乳化水相，备用；
C、按重量份数计，取94份白油、1.5份硬脂酸铝，边搅拌白油边加入硬脂酸铝，搅拌至溶剂透明，然后加入6份司本80，混合均匀、121℃，灭菌20分钟，制得油相，备用；
D、按乳化水相：油相的比列为1:1.5，在匀质机内加入油相，调节转速至3000r/min，搅拌5分钟，加入乳化水相，调节转速至10000r/min，乳化6分钟，得到B型猪肠道病毒Porcineenterovirus B,PEV-B免疫原；
2)卵黄抗体的制备
①免疫接种
选取禽白血病、禽网状内皮组织增殖病均为阴性的高峰期产蛋蛋鸡；
取B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原对高峰期产蛋蛋鸡进行基础免疫接种；在基础免疫接种后的14日进行一次加强免疫接种；在一次加强免疫接种后的14日进行二次加强免疫接种；
②卵黄抗体提取
A、取二次加强免疫接种后14日的高峰期产蛋蛋鸡所产高免鸡蛋，测定高免鸡蛋蛋黄中的B型猪肠道病毒抗体效价，当抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋，2～8℃贮存；
B、无菌条件下收集卵黄液，按体积份数计，在1份卵黄液加入6份浓度为0.15mol/L的醋酸盐缓冲液，混合均匀，调节pH值为5.2，2～8℃保存过夜，离心，制得上清液Ⅰ；
C、在上清液Ⅰ中加入辛酸至终浓度为2％，混合均匀，2～8℃存储过夜，离心，得到上清液Ⅱ，将上清液Ⅱ通过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，调节pH值为7.4，再通过截留分子量为50kDa的超滤膜进行浓缩过滤，制得上清液Ⅲ；
D、在上清液Ⅲ中加入浓度为0.08％的甲醛溶液，20～25℃条件下灭活24小时，过滤，制得卵黄抗体。
7.根据权利要求6所述的一种B型猪肠道病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述基础免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为2.0mL/只；
一次加强免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为2.0mL/只；
二次加强免疫接种中B型猪肠道病毒Porcine enterovirus B,PEV-B免疫原的接种量为2.0mL/只。
8.根据权利要求6所述的一种B型猪肠道病毒的卵黄抗体，所述的卵黄抗体的效价﹥1:16。
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