CN110698567A - 阿魏菇中抗氧化多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿魏菇中抗氧化多糖提取物及其制备方法和应用，本发明所述的抗氧化多糖提取自阿魏菇，分别命名为G‑1、AG‑1和AG‑2。该抗氧化多糖是将阿魏菇子实体磨成粉后，经热水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冻干、离子交换和分子筛而获得。该多糖提取物为白色及淡黄色絮状粉末，分子量为168kDa、204kDa和132kDa的纯多糖。该多糖具有较强的抗小鼠红细胞溶血和一定的清除DPPH及羟基自由基的作用。本发明的阿魏菇抗氧化多糖提取物为天然提取物，对人类和环境均无害；制备方法简单，成本较低，适于工业化生产。

Description

阿魏菇中抗氧化多糖提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然产物活性成分技术领域，具体涉及新疆青河县阿魏菇(PleurotusFerulaeLenzi)抗氧化多糖及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，自从世界卫生组织提倡将传统药物与现代药物相结合应用于疾病治疗与保健之后，大型真菌作为中药或功能性食品，在食品和医药行业引起了广泛关注。从大型真菌中分离获得的许多活性成分，包括多糖、多糖-蛋白复合物、小分子等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物和免疫调节的作用。其中，有关多糖的研究最为广泛，然而，大型真菌中含量丰富的生物活性多糖，包括凝集素，真菌免疫调节多糖，核糖体失活多糖，抗微生物多糖，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和医药领域的应用上展现出巨大的潜能。阿魏菇以其具有独特的食用和药用价值受到人们的喜爱和关注。
阿魏菇(Pleurotus Ferulae Lenzi)又名阿魏侧耳，阿魏蘑，属真菌门，担子菌亚门，担子菌纲，伞菌目，口蘑科，侧耳属，野生的阿魏菇寄生在荒漠地区的一种药用植物阿魏上，野生资源的分布与其寄生药用植物阿魏在自然界地域分布是一致的，因野生阿魏菇仅产于特定季节、产量少、采摘困难。现在市面上的阿魏菇以人工培育为主。阿魏菇营养成分全面、丰富，被许多学者认为是当今食用菌中的“皇后”。据报道阿魏菇中含有硒、锗、铬等微量元素，各种不饱和脂肪酸，蛋白质，及人体所需的17种氨基酸。含钾、钠、钙、镁等多种有益健康的矿物质，特别是其中的真菌多糖，含量在10％以上。
在历代典籍、民间偏方以及传说当中，认为阿魏菇能够消积、杀虫。对于痞块、久疟、疳劳也具有一定的药效。现代药理学研究发现，作为一种药食两用宝贵真菌，阿魏菇多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效。阿魏菇多糖抗氧化活性国内研究较多，主要集中在粗多糖及纯化组分通过在体外清除自由基，阻断自由基链式反应、在体内通过调节抗氧化酶或内源性抗氧化物的表达量的方式提高机体抗氧化能力的研究方面。盛伟等(食品工业科技，2008(05):103-105)采用DNS法检测阿魏菇子实体粗多糖提取物体外抗氧化活性，结果表明阿魏菇子实体粗多糖提取物对OH-，O2-，以及在模拟胃液条件下对NO2-均具有较好的清除能力，且与浓度呈正比。田金强等(食品科学，2006(04):223-226)通过对老龄小鼠进行灌胃阿魏菇粗多糖的方法，证实了阿魏菇多糖可提高体内谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，有效抑制脂过氧化反应和蛋白质氧化反应，并且对H2O2诱导的红细胞氧化溶血具有显著的抑制作用。杜彤等(沈阳药科大学学报，2017,34(03):249-253)考察阿魏菇多糖对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用，结果发现阿魏菇多糖能够降低模型小鼠血清AST和ALT含量，增强肝组织SOD和GSH活力，降低肝组织MDA水平，显著改善肝组织结构，减少肝细胞坏死。呈现出对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用。而本发明首次从阿魏菇(Pleurotus FerulaeLenzi)中分离纯化得到具有抗氧化活性的一种中性多糖G-1、两种酸性多糖AG-1和AG-2。
发明内容
本发明目的在于提供阿魏菇(PleurotusFerulaeLenzi)中三种抗氧化多糖提取物及其制备方法，该多糖提取物具有较强的抗小鼠红细胞溶血和一定的清除DPPH及羟基自由基的作用。
本发明提供的从阿魏菇(PleurotusFerulaeLenzi)中提取的三种抗氧化多糖为白色或淡黄色絮状粉末，分子量为168kDa、204kDa和132kDa。其中G-1为中性多糖，AG-1和AG-2为酸性多糖。
本发明涉及的阿魏菇(Pleurotus FerulaeLenzi)抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2是按照如下方法制备的：
1)将阿魏菇子实体50℃烘干并研磨成粉，加入8倍体积蒸馏水，80℃水浴震荡浸提6h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液，即得阿魏菇子实体多糖粗提液；
2)将阿魏菇子实体多糖粗提液用旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩，加入4倍体积无水乙醇，2～6℃放置8～16小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即得阿魏菇多糖粗提物；
3)将阿魏菇多糖粗提物用蒸馏水进行复溶，得到多糖溶液，置于分液漏斗中,用Sevage法除蛋白，剧烈震荡，静置，等到水相和有机相之间的界面出现白色时，将分液漏斗打开，将下层有机相和中间白色絮状物去除，重复上述操作3-5次；取上层水相，装入分子截留量为3500Da的透析袋中，在4℃、足量蒸馏水中透析8～20小时，反复3～5次，再经旋转蒸发除去残留的有机溶剂，冷冻干燥,即得阿魏菇多糖粗粉；
4)将阿魏菇多糖粗粉溶解于10mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-Sepharose F.F阴离子色谱层析柱，用0-2mol/LTris-HCl-NaCl溶液连续梯度洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线，收集洗脱峰，透析后冻干；
5)将每一个洗脱峰的多糖样品，分别上样于Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱层析柱进一步纯化，用蒸馏水洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线，收集洗脱峰，透析后冻干；获得阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2。
本发明中阿魏菇(Pleurotus Ferulae Lenzi)抗氧化多糖提取物采用HPLC-ELSD进行纯度和分子量的检测，证明其是分子量分别为168kDa、204kDa和132kDa的纯品。
本发明中阿魏菇(Pleurotus FerulaeLenzi)抗氧化多糖提取物对小鼠红细胞溶血有较好的抑制作用，羟基自由基及DPPH清除活性证明该多糖提取物能够能够对自由基引起的氧化损伤具有一定的保护作用。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明中阿魏菇(Pleurotus Ferulae Lenzi)抗氧化多糖提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中阿魏菇(PleurotusFerulae Lenzi)抗氧化多糖提取物为单一纯多糖，为获得该多糖的结构组成提供了基础；(3)本发明中阿魏菇(Pleurotus Ferulae Lenzi)抗氧化多糖提取物具有良好的抗氧化效果；(4)本发明中阿魏菇(Pleurotus Ferulae Lenzi)抗氧化多糖提取物制备简单，成本低，适于大规模生产。
附图说明
图1本发明Pleurotus FerulaeLenzi抗氧化多糖提取物的离子交换层析图。
图2本发明Pleurotus FerulaeLenzi抗氧化多糖提取物的凝胶色谱层析图。
图3是标准葡聚糖的分子量标准曲线图。
图4本发明Pleurotus FerulaeLenzi抗氧化多糖提取物的HPLC-ELSD图。
图5本发明Pleurotus FerulaeLenzi抗氧化多糖提取物的红外光谱图。
图6是标准葡萄糖标准曲线。
图7是标准糖醛酸标准曲线。
图8本发明Pleurotus Ferulae Lenzi抗氧化多糖提取物对小鼠红细胞溶血的抑制作用图。
图9本发明Pleurotus Ferulae Lenzi抗氧化多糖提取物对DPPH清除作用图。
图10本发明Pleurotus FerulaeLenzi抗氧化多糖提取物羟基自由基清除作用图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。所述的阿魏菇PleurotusFerulaeLenzi可从市场获得。
实施例1本发明阿魏菇Pleurotus Ferulae Lenzi抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2的制备
(1)将阿魏菇子实体50℃烘干并研磨成粉，加入8倍体积蒸馏水，80℃水浴震荡浸提6h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液，即得阿魏菇子实体多糖粗提液；
(2)将阿魏菇子实体多糖粗提液用旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4℃放置16小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即得阿魏菇多糖粗提物；
(3)将阿魏菇多糖粗提物用蒸馏水进行复溶，得到多糖溶液，置于分液漏斗中,用Sevage法除蛋白，剧烈震荡，静置，等到水相和有机相之间的界面出现白色时，将分液漏斗打开，将下层有机相和中间白色絮状物去除，重复上述操作3-5次。取上层水相，装入分子截留量为3500Da的透析袋中，在4℃、足量蒸馏水中透析8～20小时，反复3～5次，再经旋转蒸发除去残留的有机溶剂，冷冻干燥,即得阿魏菇多糖粗粉；
(4)将阿魏菇多糖粗粉溶解于10mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-Sepharose F.F阴离子色谱层析柱，用0-2mol/L Tris-HCl-NaCl溶液连续梯度洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线(图1)，收集洗脱峰，透析后冻干；
(5)将每一个洗脱峰的多糖样品，分别上样于Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱层析柱进一步纯化，用蒸馏水洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线(图2)，收集洗脱峰，透析后冻干；获得阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2。
实施例2本发明抗氧化多糖提取物的纯度和分子量测定
(1)将标准葡聚糖t系列(T-10、T-50、T-70、T-100、T-200)分别用双蒸水制成浓度为1mg/ml的标准液，0.45um滤膜过滤，本发明抗氧化多糖做同样处理；
(2)色谱条件：色谱柱为Shodex SUGER KS-804糖柱；蒸发光散射检测器；柱温：室温；流动相：双蒸水；进样量20ul；空压3*105Pa；
(3)标准曲线绘制：将标准葡聚糖分别进样20ul，采集图谱，以分子量Mw为纵坐标，保留时间t为横坐标，绘制标准曲线图(图3)。
(4)将抗氧化多糖进样20ul，采集图谱，根据出峰情况判定纯度，图4显示单一狭窄对称峰，可以判定该多糖均为纯品，将保留时间6.612min、5.987min和7.250min代入标准曲线图，计算得到该多糖分子量为168kDa、204kDa和132kDa。经傅里叶红外光谱仪测得其具有典型的多糖吸收谱，见附图5。
实施例3本发明抗氧化多糖提取物成分分析
3.1采用蒽酮-硫酸法进行糖含量测定
(1)标准曲线的绘制：标准曲线根据表1中所列出的加样体系制作，每个浓度平行做三份。
表1反应体系
Figure BDA0002272397400000061
Figure BDA0002272397400000071
冷却后，沸水浴10min，置冰浴中冷却，测定OD620，以糖浓度为横坐标，OD620为纵坐标，制作标准曲线。(图6)
(2)样品含糖量测定：取样品溶液(20mg/mL)10μL，加蒸馏水0.29mL，加入硫酸-蒽酮溶液，迅速浸于冰水中冷却，冷却后置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却后，测定OD620。根据标准曲线，计算样品的含糖量。
3.2硫酸-咔唑比色法测定糖醛酸含量
(1)标准曲线的绘制：分别精密吸取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL具塞试管中，各管加水至1mL，分别在冰水浴中加入四硼酸钠-硫酸溶液5mL，用漩涡混合器混匀，于沸水浴中加热20min，取出后立即冷却至室温，加0.15％咔唑溶液0.2mL，摇匀，在室温下保持2h，在523nm波长下测定其吸光度。(图7)
(2)样品糖醛酸含量测定：取样品溶液各0.1mL,同时做3个重复,以蒸馏水同法操作为参比,按上述标准曲线的测定法，分别测定其吸光度值,计算样品中糖醛酸的含量。
3.3、成分分析结果
采用上述分析方法对制备得到的本发明抗氧化多糖提取物进行分析，经过中性糖含量分析和糖醛酸含量分析，结果如下表所示。
表2三种抗氧化多糖的成分分析
Figure BDA0002272397400000072
实施例4本发明抗氧化多糖提取物的抗氧化活性测定
4.1本发明抗氧化多糖提取物对小鼠红细胞溶血的抑制作用
(1)正常昆明种雄性小鼠摘眼球取血，收集于冰浴的0.15M NaCl的离心管中，于2500rpm离心10min，将红细胞与血浆和破碎细胞膜分离。并用10倍体积pH7.4的PBS溶液(10mM pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，125mM NaCl)洗涤2次，最后得到完整的红细胞。
(2)此分析体系采用过氧自由基造成红细胞溶血，以pH7.4的PBS制备20％的红细胞悬液，加入到等体积的200mM AAPH中(溶于PBS)，其中含有待测样品。反应混合物置于37℃温浴振荡1h。温浴结束后将此体系以8倍体积的PBS稀释，2500rpm离心10min，于540nm测定上清液的吸光值A。
(3)同时，将此体系以8倍体积的蒸馏水稀释，以达到红细胞完全溶血，并于540nm测定上清的吸光值B。L-抗坏血酸作为正对照。
(4)抑制溶血百分率按下式计算：抑制率(％)＝(1-A/B)×100％
4.2本发明抗氧化多糖提取物对DPPH的清除作用
(1)反应体系为1ml，终浓度为50μM的DPPH乙醇溶液，加入待测样品后，于25℃保温反应90min后立即冰浴，测定517nm处的吸光度。
(2)不加样品为空白对照吸光值为A0，含待测样品的反应体系的吸光度为A1，以丁化羟基苯甲醚(BHA)为正对照。
(3)清除率的计算公式为：抑制率(％)＝(A0-A1)/A0×100％
4.3本发明抗氧化多糖提取物对羟基自由基清除作用
(1)反应体系为1ml，其中含有0.15mM，pH 7.4的PBS缓冲液，包含终浓度为100μM的Vc，12μM细胞色素C，100μM的CuSO4和不同浓度的待测样品。反应体系于25℃下温育反应90min，分光光度计检测550nm处光吸收值的变化。
(2)T为体系中加入CuSO产生·OH的透光率，T1为不加CuSO不产生·OH体系的透光率，T2为待测样品体系的透光率，以硫脲作为正对照
(3)清除率的计算公式为：抑制率(％)＝(T-T2)/(T-T1)×100％
4.4抗氧化活性测定结果
本发明PleurotusFerulaeLenzi抗氧化多糖提取物抗氧化活性测定结果见图8、图9、图10。
由附图8可知：阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2对小鼠红细胞氧化溶血的抑制能力均在50％以上，最高抑制率达到67.9％，说明三种阿魏菇多糖均对AAPH诱导的小鼠红细胞氧化溶血具有显著的抑制作用。
由附图9可知：阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2在200～1000ug/ml范围内，均具有一定的清除DPPH自由基的能力，且具有浓度依赖性。
由附图10可知：在100-800ug/ml范围内，阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2的活性随着浓度的升高而呈上升的趋势，且具有显著羟基自由基清除活性。

Claims (3)

1.阿魏菇中抗氧化多糖提取物，其特征在于：所述的抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2来自阿魏菇，是分子量为168kDa、204kDa和132kDa的纯多糖，具有一定的抗氧化活性。
2.根据权利要求1所述的阿魏菇中抗氧化多糖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将阿魏菇子实体50℃烘干并研磨成粉，加入8倍体积蒸馏水，80℃水浴震荡浸提6h，过滤所得滤渣再次浸提，合并滤液，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液，即得阿魏菇子实体多糖粗提液；
2)将阿魏菇子实体多糖粗提液用旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩，加入4倍体积无水乙醇，2～6℃放置8～16小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即得阿魏菇多糖粗提物；
3)将阿魏菇多糖粗提物用蒸馏水进行复溶，得到多糖溶液，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，剧烈震荡，静置，等到水相和有机相之间的界面出现白色时，将分液漏斗打开，将下层有机相和中间白色絮状物去除，重复上述操作3-5次；取上层水相，装入分子截留量为3500Da的透析袋中，在4℃、足量蒸馏水中透析8～20小时，反复3～5次，再经旋转蒸发除去残留的有机溶剂，冷冻干燥,即得阿魏菇多糖粗粉；
4)将阿魏菇多糖粗粉溶解于10mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-Sepharose F.F阴离子色谱层析柱，用0-2mol/LTris-HCl-NaCl溶液连续梯度洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线，收集洗脱峰，透析后冻干；
5)将每一个洗脱峰的多糖样品，分别上样于Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱层析柱进一步纯化，用蒸馏水洗脱，用分布收集器收集洗脱液，蒽酮-硫酸法与分光光度计法跟踪监测每管洗脱液，根据吸光值绘制曲线，收集洗脱峰，透析后冻干；获得阿魏菇抗氧化多糖提取物G-1、AG-1和AG-2。
3.权利要求1或2所述的阿魏菇中抗氧化多糖提取物的应用，该多糖具有较强的抗小鼠红细胞溶血和一定的清除DPPH及羟基自由基的作用，其特征在于：用于治疗因自由基等引起氧化应激水平升高导致疾病的有效、无毒药物方面的应用。
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