CN110684800A - 一种携带肿瘤-睾丸抗原10基因的重组腺相关病毒载体及其应用价值 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带肿瘤‑睾丸抗原10(Cancer‑testis antigen 10，CT10)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体，并证明了其应用价值。该rAAV载体是将CT10抗原基因插入本发明人构建的AAV出发载体从而构建成功的。本发明的研究证明rAAV的病毒载体可有效地将其携带的CT10抗原基因导入人单核细胞‑树突状细胞系中，用于刺激CT10抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生。实验证明，被本发明的rAAV感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解CT10抗原阳性的恶性肿瘤细胞。因此，本发明的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体或其相关产品具有实用价值，可被用于制备CT10抗原特异性CTL，裂解CT10抗原阳性的恶性肿瘤细胞，发挥抗肿瘤细胞免疫治疗的作用。

Description

一种携带肿瘤-睾丸抗原10基因的重组腺相关病毒载体及其 应用价值

【技术领域】

本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带肿瘤-睾丸抗原10(Cancer-testis antigen 10，CT10)基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗CT10抗原阳性的肿瘤的靶向性细胞免疫治疗的应用价值。

【背景技术】

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ,Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus fromrecombinant plasmids:gene correction within the terminal repeats ofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL,Labow MA,Wright R,Berns KI,Muzyczka N.Genetics ofadeno-associated virus:isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector:transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(Labow MA,Hermonat PL,Berns KI.Positive and negativeautoregulation of the adeno-associated virus type 2 genome.J Virol.160:251-258.)。

1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。美国FDA批准的Spark Therapeutics公司开发的Luxturna，是通过腺相关病毒Ⅱ型(AAV-Ⅱ)携带外源基因来治疗RPE65突变引起的遗传性视网膜疾病。

AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括Rep和Cap基因。

肿瘤-睾丸抗原10(Cancer-testis antigen 10，CT10)，属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer/testis antigen，CT抗原)家族，基因定位于X染色体q27.2。生理情况下CT10局限表达于睾丸，而不表达于其他正常组织。研究发现CT10可表达于多种肿瘤组织，包括黑色素瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等。CT10最早被发现于黑色素瘤细胞，因此又可被称为黑色素抗原C2(Melanoma antigen C2，MAGE-C2)。已有研究表明，CT10抗原对于恶性肿瘤的诊断、治疗效果及预后评估具有重要的意义。而且由于睾丸组织无人白细胞抗原(Humanleukocyte antigen,HLA)或人主要组织相容性复合物(MHC)分子，故其表达的CT10抗原不会引起机体免疫反应。CT10抗原具有的上述特点使CT10抗原成为抗肿瘤免疫治疗的非常重要的靶点。

树突状细胞(dendritic cells,DC)具有强大的发动免疫反应的功能，是最主要的抗原提呈细胞。而细胞免疫反应，即产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocytes)，在抗恶性肿瘤和病毒感染中发挥非常重要的作用。但大量的研究资料证明无论是抗原蛋白还是抗原肽刺激DC的效率不高，并导致由DC诱导产生抗原特异性CTL反应的能力不足，使得抗恶性肿瘤和病毒感染的效果不佳。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，发明一种能够高效并持续性刺激DC的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV)载体，并阐明其构建方法和应用价值。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种携带CT10抗原基因的rAAV载体，将本发明人构建的出发载体--腺相关病毒(AAV)载体中已经被剔除的结构基因的位置上插入CT10抗原基因，得到rAAV载体。

已知的AAV载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将CT10抗原基因插入已经成功构建的启动子为巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的一种的AAV载体中。

本发明所使用的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法为在AAV载体的已经被剔除结构基因的位置上，在限制性内切酶Mlu I和Xba I位点之间插入CT10抗原基因，得到携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体。具体为，使用基因重组的方法，以MluI和Xba I先分别将AAV载体DNA和CT10 cDNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因CT10与AAV载体DNA进行连接，得到携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA。该重组腺相关病毒载体的启动子分别为AAV p5启动子、巨噬细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子。

一种与携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/CT10)载体相关的产品，包括AAV/CT10质粒(DNA)、AAV/CT10病毒载体(感染性病毒颗粒)。所述AAV/CT10质粒由上述基因重组技术构建制得；所述具有感染性的AAV/CT10病毒载体由所述的AAV/CT10质粒进行转染后，进行细胞培养获得的。

AAV/CT10病毒载体相关的产品的制备方法为，AAV/CT10质粒的制备：将如上述构建的AAV/CT10质粒导入基因工程大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄青霉素的培养基进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的AAV/CT10质粒。具有感染性的AAV/CT10病毒载体的制备：以AAV/CT10质粒和pHelper质粒共转染AAVp细胞后，可获得具有感染性的AAV/CT10病毒，即病毒载体。

如上所述的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体具有实用价值。

该重组腺相关病毒载体可转染或感染人的单核细胞—树突状细胞系，表达并受到CT10抗原刺激的树突状细胞能够有效地激活并产生CT10抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。该CTL能够靶向性，即特异性地裂解CT10阳性的恶性肿瘤细胞。

AAV/CT10病毒载体及其相关产品可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。

应用AAV/CT10病毒载体方式可为先从人外周血中分离出单核细胞和淋巴细胞，再将AAV/CT10病毒载体感染或转染单核细胞。在细胞培养过程中，单核细胞转化为树突状细胞(DC)。DC细胞与淋巴细胞混合培养后，DC刺激T淋巴细胞，诱导并产生CT10抗原特异性CTL，并有效裂解CT10阳性的恶性肿瘤细胞。

本发明与现有技术对比的有益效果是：

本发明提供了一种携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/CT10)载体。在本发明的AAV/CT10病毒载体可将其携带的CT10抗原基因导入单核细胞-树突状细胞系中，存在CT10抗原基因的树突状细胞(DC)被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的AAV/CT病毒感染的DC诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可有效地裂解CT10抗原阳性的恶性肿瘤细胞，对CT10抗原阴性的细胞无裂解作用，因而，本发明的AAV/CT10病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备CT10抗原特异性的CTL，发挥细胞免疫治疗作用。本发明在恶性肿瘤的细胞免疫治疗的应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。

【附图说明】

图1.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)的结构示意图.

图2.构建携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)以及制备具有感染性的重组腺相关病毒的流程图。

图3.PCR扩增获得CT10 cDNA的结果图。

图4.重组腺相关病毒(AAV/CT10)载体的双酶切鉴定结果图。

图5.所获得的CT10抗原基因序列与美国NCI Gene Bank公布的基因序列(NM_016249)的对比图。

图6.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染外周血单核细胞为基础的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)裂解CT10抗原阳性的恶性肿瘤细胞的实验流程图。

图7.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染外周血单个核细胞的效率检测结果图。

图8.携带SV40启动子的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染的DC表达CD80和CD86水平的检测结果图。

图9.携带CMV启动子的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ水平的检结果图。

图10.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染的DC所诱导的CTL裂解CT10抗原阳性和阴性细胞的⁵¹Cr(铬-51)实验结果图。

图11.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)感染的DC所诱导的CTL杀伤作用的MHC Class I限制性的试验结果。

【具体实施方式】

下面结合具体实施方式并对照附图对本发明做进一步详细说明。

发明人已经成功地将含AAV 2型全基因组DNA的pBR322质粒(pBR-AAV2)中的AAV-2的包括rep和cap基因在内的全部结构基因删除，经保留末端重复片段和/或p5启动子，并插入寡核苷酸片断，以提高重组腺相关病毒(rAAV)DNA复制的效率和重组腺相关病毒的稳定性，由此获得AAV-2载体的基本骨架。此外，也成功地用巨细胞病毒(CMV)启动子、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、beta肌动蛋白启动子取代AAV-2载体中的p5启动子。而且在此基础上成功地制备具有感染性的rAAV病毒颗粒(参见中国专利ZL201110125683.X)，为研制新的rAAV产品奠定了基础。

本发明的AAV/CT10即是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入CT10抗原基因得到重组腺相关病毒载体，与载体相关的产品包括质粒、病毒和细胞系。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Life Technologies公司完成。

实施例1、CT10重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

一、材料及其来源：

1.四种具有不同启动子的AAV 2型(AAV-2)pBR322质粒(pBR-AAV2)：该质粒由发明人构建成功(见中国专利ZL201110125683.X，0056～0059段pBR-AAV2质粒的改建、PCR扩增启动子、将扩增的启动子插入改建的pBR-AAV2质粒中等内容)。四种启动子分别为AAV p5启动子(AAV p5)、巨噬细胞病毒(CMV)启动子(CMVp)、SV40早期启动子(SV40p)和人β-肌动蛋白(β-actin)启动子(β-actinp)。该质粒的特点为两端完整的重复末端片断(TR)序列,并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒(rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率，并且剔除AAV-2的包括复制蛋白基因(rep)和包膜蛋白基因(cap)在内的全部结构基因。

2.人胃癌组织：来源于手术切除的胃癌组织，免疫组化证实CT10抗原阳性。

3.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的人CT10基因序列设计(美国NCI基因库：NM_016249)。上游引物：5’-ATACGCGTTCCTGAAGAAGTCGTCATGC-3’，其5’端连接AT保护碱基和Mlu I限制性内切酶识别碱基序列。下游引物：5’-ATTCTAGACTCTGAAGCTAACTACCTGC-3’，其5’端连接AT保护碱基和Xba I限制性内切酶识别碱基序列。

二、构建本实施例携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体

构建方法主要采用分子生物学的基因克隆和重组技术。

如图1和2所示，具体过程包括以下步骤：

1.获取总c DNA的具体方法：采用Trizol试剂(美国Life Technology公司生产)获取肿瘤组织的总mRNA。首先将CT10抗原阳性的人胃癌癌组织反复碾磨后，加入5ml Trizol，按照其说明书进行操作。离心获取上清液后，以75％(V/V)乙醇洗涤二次，再加入无水乙醇，离心沉淀。沉淀物以去离子水溶解，得到总mRNA溶液，将浓度调至10ng/μl。以10μl总mRNA溶液为模板，进行逆转录反应(RT)，合成总cDNA。逆转录反应体系，以总反应体系为25μl为例，包括：0.5μg oligo(dT)15(美国Promega公司)、0.5mM dNTPs(美国Promega公司)以及200UM-MLV逆转录酶(美国Promega公司)。反应条件为37℃，1小时，得到总cDNA。

2.获取CT10 cDNA的具体方法：以所述总cDNA为模板，CT10为靶基因，在CT10抗原基因的上、下引物的引导下进行PCR扩增，得到CT10 cDNA。PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃90秒，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，在1345bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到长度为1345bp CT10 cDNA。图3所示，为经PCR扩增获得CT10 cDNA的实验结果。

3.构建携带CT10 cDNA的重组腺相关病毒载体：分别对携带4种不同启动子的pBR-AAV2质粒和CT10 cDNA进行酶切反应。酶切反应体系：1μg pBR-AAV2质粒或CT10 cDNA；10U限制性内切酶Mlu I和Xba I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液C以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴8小时。随后进行连接反应，连接反应体系为：300ng酶切后的质粒；300ng酶切后的CT10 cDNA；10IU T₄ DNA连接酶(购自美国Promega公司)；1.5μl 10×T₄ DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水。反应条件为：在4℃下8小时。分别得到携带有AAV的p5启动子和CT10 cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有CMV启动子和CT10 cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有SV40早期启动子和CT10 cDNA的重组腺相关病毒载体、携带有beta肌动蛋白(β-actin)启动子和CT10 cDNA的重组腺相关病毒载体。

4.将连接后的重组腺相关病毒载体分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到大量的重组腺相关病毒(AAV/CT10)的质粒载体。

三、重组腺相关病毒的质粒载的鉴定

1.限制性内切酶酶切分析：将AAV/CT10的质粒载体以限制性内切酶Mlu I和Xba I进行酶切反应，反应体系、条件以及操作过程同上述构建过程二中的步骤3。分析后的结果见图4。图4中，从左至右，泳道9为DNA分子量标准；泳道1～8表示8个克隆。其中，泳道1-4及泳道6-8为7个阳性克隆，说明8个克隆中7个克隆正确。证明AAV/CT10的质粒载体构建成功。

2.DNA序列测定:将AAV/CT10进行DNA序列测定。其测序结果的核苷酸序列如图5所示，与美国NCI基因库中公布的CT10的基因序列对比，99％同源，证明所获得的AAV/CT10正确，进一步证明构建AAV/CT10的质粒载体成功。

实施例2、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备及滴度测定(如图2所示)

材料及其来源：

A.实施例1-1构建的携带有CT10抗原基因的重组腺相关病毒质粒载体。

B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper：由本专利申请的发明人构建(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,andHermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervicalcancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery intohuman dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy8:948-957.)。

C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAVp细胞株：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心建立(Liu,Y.,Chiriva-Internati,M.,Grizzi,F.Salati,E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapidinduction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by humanpapillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendritic cells byan adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)。

D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Invotrogen公司。

E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。

F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。

G.DNA拷贝数标准：分别为10¹²拷贝数(copies)/μl至10⁹(copies)/μl，购自美国ProMAGE公司。

一、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒载体的制备

参照图2，用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAVp细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：

A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg AAV/CT10的质粒载体，1.0μgpHelper质粒，4.0μl Lipofectin和50.0μl含5％(V/V)胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。

B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。

C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。

D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV的病毒液。

E.将收集的rAAV的病毒液过滤除菌。将获得具有感染性的rAAV，命名为携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)。

二、携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体的病毒滴度测定

采用常规的斑点杂交法，对获得的具有感染性的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体进行病毒滴度测定。所用的DNA探针为针对CT10抗原基因的特异性探针。

A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒DNA。

B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。

C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。

D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为“实施例1中所获得的CT10 cDNA”。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行2.0％(V/V)琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。

E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA进行DNA杂交。该病毒载体的检测结果表明其病毒滴度在1×10¹¹～5×10¹¹拷贝(copies)/ml。

实施例3、携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体导入单核细胞-树突状细胞系的裂解CT10抗原阳性的肿瘤细胞的实验

材料及其来源：

A.携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体(AAV/CT10)。

B.AIM-V细胞培养基：购自美国Life Technologies公司。

C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素2，4(IL-2，IL-4)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)购自美国R&D公司。

D.CT10抗原阳性的原代肿瘤细胞：分别为从胃癌、肾癌、结肠癌的组织分离获得，免疫组化已经证实为CT10抗原阳性。

E.CT10抗原阴性原代细胞：分别为从胃癌、肾癌、结肠癌的组织分离获得的肿瘤细胞，免疫组化已经证实为CT10抗原阴性。

F.MHC I类(MHC Class I)抗体：购自美国Abcam公司。

一、裂解肿瘤细胞实验

如图6所示，将本发明的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/CT10)感染人单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验的整个过程包括以下步骤：

A.100毫升外周血，用血细胞分离仪和淋巴细胞分离液按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入10cm细胞培养皿，置于二氧化碳培养箱中培养2小时。

B.分离细胞：悬浮细胞(淋巴细胞)和贴壁细胞(单核细胞)在AIM-V培养中继续培养备。

C.在单核细胞中加入AAV/CT10病毒，加入量为100MOI，同时再加入GM-CSF(800IU/mL)，继续培养8小时。

D.除去步骤C的旧培养基，补充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-α(20IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。

E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合，在AIM-V培养基中加入IL-2(20IU/mL)继续培养。

F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。

二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测

A.AAV/CT10病毒感染外周血单个核细胞的效率检测

采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对肿瘤相关抗原CT10的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记上述获得的被本发明的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/CT10)感染的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。如图7所示，为携带四种不同启动子的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体的感染效率，其感染效率为65.1±19.3％、69.6±17.5％、73.4±13.1％和83.2±9.0％。证明本发明的AAV/CT10病毒具有较高的感染效率和刺激DC的效率。

B.树突状细胞(DC)表达的CD分子水平的检测

DC表达CD80和CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80和CD86的水平进行检测。其中，以携带SV40启动子的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/SV40p/CT10)感染的DC为例，其表达CD80和CD86的平均水平分别为62.3±4.1％和81.5±7.3％，证明构建和制备的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒感染外周血单核细胞后，所诱导的DC的功能强大，表明被该重组腺相关病毒感染的DC可有效刺激Th1反应，即CTL反应。

C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测

CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平，DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。以携带CMV启动子的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/CMVp/CT10)感染的DC所诱导的CTL为例，其IFN-γ表达水平如图9所示，其CTL表达IFN-γ的水平(平均表达率为42.1±5.8％)。证明本发明制备的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的DC所诱导的CTL功能强大，亦即CTL的杀伤活性高。

三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)裂解CT10抗原阳性的肿瘤细胞试验

本实验均重复5次，以便于应用统计学对实验数据进行分析和处理。

被携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒感染的DC与淋巴细胞混合培养结束后，将该混合细胞按20:1(淋巴细胞:肿瘤细胞)与CT10阳性的肿瘤细胞(胃癌细胞、肾癌细胞和结肠癌细胞)分别混合后，采用传统的51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性和杀伤特异性。检测结果如图10所示，被本发明的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL能够有效地裂解(杀伤)CT10阳性的肿瘤细胞，杀伤率为60.9％～72.5％。但该CTL对CT10抗原阴性的胃癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞无明显杀伤作用。证明携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL具有CT10抗原特异性裂解(杀伤)作用，对CT10抗原阴性的细胞无杀伤作用。

为验证上述CTL的杀伤作用具有MHC Class I限制性，先用MHC class I抗体对该CTL进行预处理后，再采用51Cr(铬-51)杀伤试验。结果表明CT10阳性的上述肿瘤细胞杀伤效率显著性降低(p<0.01)，如图11所示。证明携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL具有MHC Class I限制性。

综合上述检测结果，证明被本实施例构建和制备携带抗原CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的DC所诱导的CTL对CT10阳性的肿瘤细胞具有明显的杀伤(裂解)作用，具有临床实用价值，为今后应用于临床抗CT10阳性的肿瘤的T细胞免疫治疗提供了理论依据和实验室数据。

工业应用性

实验证明，被本发明携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染的树突状细胞所诱导的细胞毒性T淋巴细胞可有效地裂解CT10抗原阳性的肿瘤细胞。因而，本发明的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体及其相关产品可被用于临床实践，在CT10阳性的恶性肿瘤的临床抗肿瘤细胞免疫治疗和应用中具有重要的意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：重组腺相关病毒载体中无腺相关病毒的结构基因，仅为CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体。

2.根据权利要求1，携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法为：

从CT10抗原阳性的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，获得总cDNA。在上游引物(ATACGCGTTCCTGAAGAAGTCGTCATGC)和下游引物(AT TCTAGACTCTGAAGCTAACTACCTGC)的引导下进行PCR扩增，获得带有Mlu I和XbaⅠ限制性内切酶识别序列的CT10 cDNA。再将该CT10 cDNA插入本发明人已经成功构建的出发载体，即腺相关病毒载体，在剔除腺相关病毒的结构基因的位置上，插入CT10抗原基因，得到该重组腺相关病毒载体。

3.一种与携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，其特征在于：包括携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA以及具有感染性的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体。所述携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA是由权利要求1～2所述的构建方法制得的；所述具有感染性的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体是由转染所述携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA，并进行细胞培养制得的。

4.一种表达CT10抗原的细胞系，其特征在于：所述细胞系为人单核细胞-树突状细胞系，且被由权利要求1～3所述的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或转染得到的。

5.一种具有CT10抗原特异性的T淋巴细胞系，其特征在于：所述细胞系为人淋巴细胞，且被由由权利要求4所述的携带CT10抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或转染的树突状细胞与人淋巴细胞混合培养产生的。

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