CN110684208A - 一种高机械强度的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高机械强度的蛛丝蛋白‑胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,属于水凝胶技术领域。该方法是将蛛丝蛋白溶解于甲酸,胶原蛋白溶解于酸溶液,得到蛛丝蛋白甲酸溶液和胶原蛋白酸溶液,将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液中,经由碱性溶液中和至pH呈中性,室温静置,形成蛛丝蛋白‑胶原蛋白复合水凝胶。本发明制得的复合水凝胶具有生物可降解性、生物相容性、细胞粘附性,蛛丝蛋白的加入显著提高了复合水凝胶的机械性能,制备工艺简单、易操作,制备过程不涉及毒副作用试剂,绿色环保,成本低廉,在组织工程、医学等领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高机械强度的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,属于水凝胶技术领域。
背景技术
蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维,具有高强度、高弹性、高断裂能等优良的机械性能,以及生物相容性和生物可降解性等生物学性能,综合性能远超蚕丝以及人造纤维,因此蛛丝蛋白在材料、纺织、军事装备和生物医学等领域具有潜在的应用价值。蜘蛛不易大规模饲养,因此天然蜘蛛丝主要来源于结网,产量非常低。为了提高蛛丝蛋白的产量,通过基因工程改造的手段实现了蛛丝蛋白在工程菌中的稳定表达。目前蛛丝蛋白的应用形式包括微球和纺丝纤维膜,用于药物递送系统和伤口敷料等领域。受蛛丝蛋白水溶性的影响,单纯蛛丝蛋白难以形成凝胶类材料,在一定程度限制了其应用。
胶原蛋白是细胞外基质中的主要成分,具有生物相容性、生物可降解性、细胞粘附性、低免疫原性等特点,在药物递送、皮肤替代物、组织工程等方面有广阔应用。目前商业化的胶原蛋白主要来源于猪皮和牛跟腱等,但是较高的提取成本以及病毒传播的可能性限制了哺乳动物胶原蛋白的应用。鱼皮等水产品加工废弃物是胶原蛋白的获取来源之一,价格低廉,安全性高,因此鱼类胶原蛋白逐渐在市场应用中占有一席之地。但是,无论哺乳动物来源或是海洋生物来源的胶原蛋白,形成的水凝胶均具有较差的机械性能,在一定程度上限制了其应用。
文献报道了交联剂的加入可以提高胶原蛋白水凝胶的机械性能,但是交联剂的生物安全性存在一定隐患。为此,开发生物来源的胶原蛋白复合水凝胶既可以保证材料的生物安全性,同时又可以提高其机械性能。目前,没有关于蛛丝蛋白与胶原蛋白复合材料的相关报道。
发明内容
为了弥补胶原蛋白水凝胶和蛛丝蛋白材料在应用方面各自存在的缺点和不足,本发明提供了一种高机械性能的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,制备出的复合水凝胶结合了蛛丝蛋白和胶原蛋白的优点,兼具良好的机械性能和生物安全性,可应用于组织工程等领域,采用的技术方案如下:
本发明的目的在于提供一种高机械性能的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,该方法包括如下步骤:
1)将蛛丝蛋白溶解于甲酸中,获得蛛丝蛋白甲酸溶液;
2)将胶原蛋白溶解于酸溶液中,获得胶原蛋白酸溶液;
3)将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液中,4℃搅拌得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液;
4)调节蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液的pH值至中性,室温静置,形成蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶。
优选地,步骤2)所述酸溶液为盐酸溶液或醋酸溶液。
优选地,步骤1)所述蛛丝蛋白甲酸溶液的浓度为0.01g/mL-1g/mL。
优选地,步骤2)所述胶原蛋白酸溶液的浓度为5mg/mL-20mg/mL。
优选地,步骤3)在将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液的过程中控制蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为(0.01-5):1。
更优选地,步骤3)在将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液的过程中控制蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为(0.1-0.5):1。
最优地,步骤3)在将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液的过程中控制蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为0.5:1。
优选地,步骤2)所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白、哺乳动物胶原蛋白(如猪、牛)或类人胶原蛋白。最优地,步骤2)所述胶原蛋白为鱼皮胶原蛋白。经过实验发现,本发明中胶原蛋白可以选自鱼皮胶原蛋白、类人胶原蛋白和哺乳动物胶原蛋白(如猪、牛),上述胶原蛋白都适用于本发明方法,并且使用上述胶原蛋白制备的复合水凝胶相比于单纯的胶原蛋白水凝胶的机械性能都得到了显著提升,其中使用鱼皮胶原蛋白获得的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的机械强度提升效果最好。
优选地,步骤1)所述蛛丝蛋白为天然蛛丝蛋白或由基因工程菌发酵获得的人工合成蜘蛛丝蛋白。
优选地,步骤1)所述蛛丝蛋白的氨基酸序列来源于金丝圆蛛(NephilaClavipes)、金圆网蛛(Nephila antipodiana)、乳头棘蛛(Gastheracanthacancriformis)、三角园蛛(Parawixia bistriata)、金蛛(Argiope aurantia)、十字园蛛(Araneus diadematus)中的任意一种或多种。
优选地,步骤1)所述蛛丝蛋白的分子量为3kDa-300kDa;所述蛛丝蛋白的氨基酸序列中包含多个丙氨酸重复序列和多个甘氨酸重复序列,其中甘氨酸含量为20%-60%,丙氨酸含量为10-60%。
优选地,所述蛛丝蛋白的氨基酸序列选自MaSp1、MaSp2和eADF4中的任意一种;其中:
所述MaSp1(大壶状腺蛛丝蛋白1)的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.1所示氨基酸重复单元构成,具体氨基酸序列为:[SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT]n;其中n为大于或等于1的整数;
所述MaSp2(大壶状腺蛛丝蛋白2)的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.2所示氨基酸重复单元构成,具体氨基酸序列为:[GPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAAGPGGYGPGQQTS]n;其中n为大于或等于1的整数。
所述eADF4(十字园蛛蛛丝蛋白4)的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.3所示氨基酸重复单元构成,具体氨基酸序列为:[GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP]n;其中n为大于或等于1的整数。
本发明的蛛丝蛋白的氨基酸序列不局限于以上三种,凡是经由同时符合以上要求的蛛丝蛋白氨基酸序列发酵获得的蛛丝蛋白均适用于本发明。
本发明的一种高机械强度的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,具体操作步骤包括:
(1)蛛丝蛋白溶解于甲酸,胶原蛋白溶解于酸性溶液(盐酸或醋酸),4℃搅拌过夜,获得蛛丝蛋白甲酸溶液和胶原蛋白酸溶液。
(2)将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液。
(3)在0-5℃条件下,逐滴加入碱性溶液(氢氧化钾、氢氧化钠)至溶液pH值为7。室温静置4-6小时,凝胶形成后用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶。
本发明的鱼皮胶原蛋白可以直接购买,也可以从鱼皮中提取纯化,如鲈鱼和罗非鱼,但不局限于这两种鱼类,我国常见的经济鱼类均包含在内,其他鱼类鱼皮提取的胶原蛋白均适用于本发明。
本发明蛛丝蛋白和胶原蛋白的复合水凝胶中蛛丝蛋白和胶原蛋白以物理混合方式复合在一起,两者之间主要通过氢键相连,伴有一定几率蛛丝蛋白与胶原蛋白分子间酰胺键的形成,蛛丝蛋白形成的β-折叠结构穿插在胶原蛋白形成的网状结构之中,β-折叠结构的抗拉伸和抗压缩能力在一定程度上提高了复合水凝胶的机械强度。
本发明中胶原蛋白酸溶液的浓度可以采用5mg/mL-20mg/mL,由于在制备胶原蛋白水凝胶的过程中,胶原蛋白的浓度对于胶原蛋白水凝胶的机械性能影响较大,胶原蛋白浓度越大,相应地,制备得到的胶原蛋白水凝胶的机械强度就会高一些,因此,在比较机械强度是否有提升时,应当采用相同浓度的胶原蛋白酸溶液来制备胶原蛋白水凝胶和本发明的复合凝胶,这样比较的结果才能够具有可比性。而本发明制备的复合水凝胶,相比于同浓度胶原蛋白酸溶液制备的水凝胶的机械强度得到了显著提高,在实验过程中发现采用10mg/mL-20mg/mL都可以获得较好的机械强度效果,并且采用20mg/mL的胶原蛋白酸溶液制备的复合水凝胶的机械强度会比采用10mg/mL的胶原蛋白酸溶液制备的复合水凝胶的机械强度明显提高,但是从经济成本、制备过程的易操作性及实际需要的机械强度要求等角度考虑采用10mg/mL的胶原蛋白酸溶液制备的复合水凝胶为最优。
本发明有益效果:
本发明首次将蛛丝蛋白和胶原蛋白复合制备成水凝胶,既解决了蛛丝蛋白难以形成凝胶类材料的问题,又解决了提高胶原蛋白水凝胶机械性能的问题,制得的复合水凝胶既可以保证材料的生物安全性,同时又可以获得很好的机械性能,蛛丝蛋白的加入相比于单纯的胶原蛋白水凝胶的机械性能得到了显著提升并且本发明复合水凝胶结合了蛛丝蛋白和胶原蛋白的优点,如兼具生物可降解性、生物相容性和细胞粘附性等特性。
本发明制备的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶安全无毒副作用,具有良好的生物安全性、细胞粘附性和机械性能,压缩强度明显高于胶原蛋白水凝胶,压缩强度最高可达0.56MPa,具有广阔的应用前景。
本发明以蛛丝蛋白和胶原蛋白为原料,通过酸溶解、碱中和的方法,将两者以不同比例混合制备复合水凝胶,本发明制备过程无需添加毒副作用的试剂,绿色环保,成本低廉,工艺简单,易于操作,在组织工程、医学等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为蛛丝蛋白-胶原蛋白(SF/Col)复合水凝胶的应力-应变曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。
本发明方法所采用的胶原蛋白可以通过商业途径购买,也可以自行提取纯化获得,以下实施例以鱼皮胶原蛋白为例进行说明,自行提取纯化的鱼皮胶原蛋白可以经由胃蛋白酶消化法提取纯化获得,具体提取方法为:5g干燥鱼皮剪碎后,加入0.1M氢氧化钠溶液洗涤36小时,每12小时更换溶液,离心去上清;沉淀中加入10%异丙醇溶液搅拌36小时,每12小时更换溶液,离心去上清;沉淀中加入含有胃蛋白酶(1.25g)的0.5M冰醋酸溶液消化48小时,离心去沉淀;上清液中缓慢加入4.45M氯化钠溶液至氯化钠终浓度为0.84-0.89M,离心去上清;沉淀物溶于0.1M冰醋酸溶液,0.02M磷酸氢二钠溶液透析36小时,离心去上清;沉淀物溶于0.5M冰醋酸溶液,过滤,蒸馏水透析48小时,冷冻干燥,最终获得鱼皮胶原蛋白样品,纯度高于99%。
以下实施例中所用的蛛丝蛋白通过商业途径购买获得。本发明方法所采用的蛛丝蛋白可以是天然蛛丝蛋白,也可以是由基因工程菌发酵获得的人工合成蜘蛛丝蛋白。蛛丝蛋白的氨基酸序列可以来源于金丝圆蛛(Nephila Clavipes)、金圆网蛛(Nephilaantipodiana)、乳头棘蛛(Gastheracantha cancriformis)、三角园蛛(Parawixiabistriata)、金蛛(Argiope aurantia)、十字园蛛(Araneus diadematus)中的任意一种或多种。蛛丝蛋白的分子量为3kDa-300kDa;蛛丝蛋白的氨基酸序列中包含多个丙氨酸重复序列和多个甘氨酸重复序列,其中甘氨酸含量为20%-60%,丙氨酸含量为10-60%。以下实施例以能够满足上述要求的以下几种蛛丝蛋白为例进行说明:MaSp1(大壶状腺蛛丝蛋白1):[SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT]n、MaSp2(大壶状腺蛛丝蛋白2):[GPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAAGPGGYGPGQQTS]n、eADF4(十字园蛛蛛丝蛋白4):[GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP]n、其中n是大于或等于1的整数。
蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法为:将蛛丝蛋白溶解于甲酸,胶原蛋白溶解于酸性溶液(盐酸或醋酸),4℃搅拌过夜。将得到的蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液。0-5℃条件下,将碱性溶液(氢氧化钾、氢氧化钠)逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,直至pH为7,将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶。
实施例1:
将eADF4的12倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为0.01g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M盐酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为5mg/mL的胶原蛋白盐酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白盐酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为0.01:1。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.6mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.09MPa。
实施例2
将MaSp2的24倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为0.1g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为7mg/mL的胶原蛋白醋酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白醋酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为0.1:1。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.11MPa。
实施例3
将MaSp1的48倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为0.3g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M盐酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为10mg/mL的胶原蛋白盐酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白盐酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为0.5:1。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.6mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.36MPa。
实施例4
将MaSp1的96倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为0.5g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的胶原蛋白醋酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白醋酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为0.5:1。将4M氢氧化钾溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.56MPa。
实施例5
将MaSp1的96倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为1g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的胶原蛋白醋酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白醋酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为1:1。将4M氢氧化钾溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.41MPa。
实施例6
将MaSp1的48倍体蛛丝蛋白溶解于甲酸,得到浓度为1g/mL的蛛丝蛋白甲酸溶液。将胶原蛋白溶解于0.1M醋酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的胶原蛋白醋酸溶液。将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入胶原蛋白醋酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液,蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为5:1。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶,压缩强度为0.16MPa。
为说明本发明方法所能够获得的效果,进行了如下实验:
一、为考察蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比对于效果的影响,进行了如下实验:
在实施例3的基础上,改变蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比,分别设置成5:1、1:1、0.2:1、0.1:1和0.01:1,其他与实施例3的步骤均相同,依次将上述实验命名为实验组1、实验组2、实验组4、实验组5和实验组6,实施例3为实验组3。用万能测试机检测压缩强度,结果如表1所示。
表1不同蛛丝蛋白与胶原蛋白投料质量比获得的复合水凝胶机械性能对比
实验结果表明,蛛丝蛋白与胶原蛋白的投料质量之比在(0.01-5):1时,可以形成复合凝胶;当蛛丝蛋白与胶原蛋白质量之比大于5:1后,不能形成凝胶。蛛丝蛋白与胶原蛋白的投料质量之比在(0.1-0.5):1时,随着蛛丝蛋白浓度的升高,水凝胶的机械强度逐步得到提高,其中最优的投料质量之比为0.5:1,而超出此范围时机械性能的提高效果不明显。
二、为考察以不同来源的胶原蛋白(鱼皮胶原蛋白、哺乳动物胶原蛋白和类人胶原蛋白)为原料制备的复合水凝胶的效果,进行了如下实验:
实验组1(蛛丝蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶):实施例4;
实验组2(蛛丝蛋白-猪胶原蛋白复合水凝胶):采用猪胶原蛋白替换鱼皮胶原蛋白,其他步骤与实施例4相同;
实验组3(蛛丝蛋白-类人胶原蛋白复合水凝胶):采用类人胶原蛋白替换鱼皮胶原蛋白,其他步骤与实施例4相同;
对照例1(鱼皮胶原蛋白水凝胶):将鱼皮胶原蛋白溶解于0.1M盐酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的鱼皮胶原蛋白盐酸溶液。将与实施例4中使用的等体积甲酸逐滴加入鱼皮胶原蛋白盐酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到鱼皮胶原蛋白酸溶液。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入鱼皮胶原蛋白酸溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到鱼皮胶原蛋白水凝胶。
对照例2(猪胶原蛋白水凝胶):将猪胶原蛋白溶解于0.1M盐酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的猪胶原蛋白盐酸溶液。将与实施例4中使用的等体积甲酸逐滴加入猪胶原蛋白盐酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到猪胶原蛋白酸溶液。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入猪胶原蛋白酸溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到猪胶原蛋白水凝胶。
对照例3(类人胶原蛋白水凝胶):将类人胶原蛋白溶解于0.1M盐酸溶液,4℃搅拌过夜,得到浓度为20mg/mL的类人胶原蛋白盐酸溶液。将与实施例4中使用的等体积甲酸逐滴加入类人胶原蛋白盐酸溶液中,4℃搅拌4小时,得到类人胶原蛋白酸溶液。将4M氢氧化钠溶液逐滴加入类人胶原蛋白酸溶液中,加入量约为0.5mL,直至pH为7。将中和后的混合溶液倒入模具中,室温静置4-6小时,完成凝胶化后,用去离子水润洗凝胶2-3次,得到类人胶原蛋白水凝胶。
用万能测试机检测上述实验组1-3和对照组1-3制备的水凝胶的压缩强度,结果如表2所示。
表2实验组1-3和对照例1-3的机械性能对比
经过检测发现:1、采用鱼皮胶原蛋白、猪胶原蛋白和类人胶原蛋白与蛛丝蛋白复合都可以形成水凝胶,说明鱼胶原蛋白、类人胶原蛋白和哺乳动物胶原蛋白(如猪、牛)均适用于本发明方法,本发明方法中的胶原蛋白具有普遍适用性;2、通过分别将实验组1-3和对照例1-3比较发现:使用鱼皮胶原蛋白、猪胶原蛋白和类人胶原蛋白制备的复合水凝胶相比于单纯鱼皮胶原蛋白、猪胶原蛋白和类人胶原蛋白制备的水凝胶的机械性能都得到了显著提升,单纯的鱼皮胶原蛋白水凝胶的压缩强度为0.14MPa,蛛丝蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶压缩强度为0.56MPa,蛛丝蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶的压缩强度相比于单纯的鱼皮胶原蛋白水凝胶的压缩强度提高了3倍;单纯的猪胶原蛋白水凝胶的压缩强度为0.01MPa,蛛丝蛋白-猪胶原蛋白复合水凝胶压缩强度为0.03MPa,蛛丝蛋白-猪胶原蛋白复合水凝胶的压缩强度相比于单纯的猪胶原蛋白水凝胶的压缩强度提高了2倍;单纯的类人胶原蛋白水凝胶的压缩强度为0.10MPa,蛛丝蛋白-类人胶原蛋白复合水凝胶压缩强度为0.39MPa,蛛丝蛋白-猪胶原蛋白复合水凝胶的压缩强度相比于单纯的猪胶原蛋白水凝胶的压缩强度提高了近3倍,此外采用不同来源的胶原蛋白制备的单纯胶原蛋白水凝胶和蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的机械强度差异较大主要是由于不同胶原蛋白其自身机械能有所差异,但是只要按照本发明方法将蛛丝蛋白与胶原蛋白制备成复合水凝胶均可以显著提高相应胶原蛋白水凝胶的机械性能;3、通过比较实验组1-3可知:蛛丝蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶的压缩强度显著高于蛛丝蛋白-猪胶原蛋白复合水凝胶和蛛丝蛋白-类人胶原蛋白复合水凝胶,因此,使用鱼皮胶原蛋白获得的蛛丝蛋白-鱼皮胶原蛋白复合水凝胶的机械强度效果最好,并且使用鱼皮胶原蛋白获得的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的机械强度提升效果也是最好的。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种高机械强度的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法
<130> 0
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> MaSp1的氨基酸重复单元
<400> 1
Ser Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Thr
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> MaSp2的氨基酸重复单元
<400> 2
Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
20 25 30
Gly Gln Gln Thr Ser
35
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> eADF4的氨基酸重复单元
<400> 3
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Glu Asn Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
20 25 30
Gly Gly Pro
35
Claims (10)
1.一种高机械强度的蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)将蛛丝蛋白溶解于甲酸中,获得蛛丝蛋白甲酸溶液;
2)将胶原蛋白溶解于酸溶液中,获得胶原蛋白酸溶液;
3)将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液中,4℃搅拌得到蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液;
4)调节蛛丝蛋白-胶原蛋白混合溶液的pH值至中性,室温静置,形成蛛丝蛋白-胶原蛋白复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述蛛丝蛋白甲酸溶液的浓度为0.01g/mL-1g/mL;步骤2)所述胶原蛋白酸溶液的浓度为5mg/mL-20mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤2)所述酸溶液为盐酸溶液或醋酸溶液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)在将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液的过程中控制蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为(0.01-5):1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)在将蛛丝蛋白甲酸溶液逐滴加入到胶原蛋白酸溶液的过程中控制蛛丝蛋白与胶原蛋白的质量比为(0.1-0.5):1。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述胶原蛋白选自鱼皮胶原蛋白、哺乳动物胶原蛋白和类人胶原蛋白中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述蛛丝蛋白为天然蛛丝蛋白或由基因工程菌发酵获得的人工合成蜘蛛丝蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述蛛丝蛋白的氨基酸序列来源于金丝圆蛛(Nephila Clavipes)、金圆网蛛(Nephila antipodiana)、乳头棘蛛(Gastheracantha cancriformis)、三角园蛛(Parawixia bistriata)、金蛛(Argiopeaurantia)、十字园蛛(Araneus diadematus)中的任意一种或多种。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述蛛丝蛋白的分子量为3kD-300kDa;所述蛛丝蛋白的氨基酸序列中包含多个丙氨酸重复序列和多个甘氨酸重复序列,其中甘氨酸含量为20%-60%,丙氨酸含量为10-60%。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述蛛丝蛋白的氨基酸序列选自MaSp1、MaSp2和eADF4中的任意一种;其中:MaSp1的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.1所示氨基酸重复单元构成,MaSp2的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.2所示氨基酸重复单元构成,eADF4的氨基酸序列由n个如SEQ ID NO.3所示氨基酸重复单元构成,上述n均为大于或等于1的整数。
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