CN110679364B - 一种提高三七抗叶部病害能力的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高三七抗叶部病害能力的方法及应用，即用褪黑素促进三七气孔免疫，降低病原菌入侵。实验结果表明，在三七叶面喷施褪黑素，可以有效的降低三七叶部病害感病率。

Description

一种提高三七抗叶部病害能力的方法及应用
技术领域
本发明属于增强植物免疫和抗叶部病害领域，具体涉及一种提高三七抗叶部病害能力的方法及应用。
背景技术
从控制作物病害的角度来说，目前杀菌剂有着其他物质无法替代的作用，但是杀菌剂的药害问题和病原菌对其抗药性都在逐年加重，并且其长期大量使用会造成环境污染、生态平衡破坏。我国种植业要向着健康可持续方向发展，必须研发出高效、低毒、低残留和环境友好型的杀菌剂应用于生产实践中。
本发明提供对方法简单、效果显著；该方法显著降低了植物叶部病害的感病率。本发明开辟了无农药植物叶面病害大幅降低的新方法，有助于科技工作者对褪黑素溶液增强植物气孔免疫分子机理的研究，农业生产上有较广阔的前景。
发明内容
本发明公开了一种提高三七抗叶部病害能力的方法及应用，即向三七叶面喷施褪黑素溶液，可以降低三七叶部病害的感病率。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
(1)取同时播种长势一致的三年生三七下表皮(中叶和复叶)，以表皮缓冲液(KCl50mM、CaCl20.1mM、MES-KOH 10mM调PH至6.15)为空白组做对照，10μM褪黑素和5μM flg22(flg22为细菌鞭毛蛋白N端的多肽提取物。位于植物保卫细胞中的鞭毛蛋白受体感应到flg22后会引发先天免疫使气孔关闭)处理；分析三七叶片气孔包围细胞开度、活性氧的产生；
(2)以灭菌的10mM MgCl2(增强细胞通透性)为对照，对三七叶面喷施10μM褪黑素溶液(10mM MgCl2配制)后喷病原菌Pst DC3000(OD 600＝0.8-1.0以10mM MgCl2稀释一万倍)；喷施病原菌PstDC3000后第0天、3天用打孔器取叶片做菌落数分析；
(3)田间选择长势一致的三七，以表皮缓冲液为空白组做对照，喷施褪黑素溶液后统计实验组与对照组三七叶部病害感病株数。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明所述提高三七抗叶部病害的方法，具有成本低、操作简单、效益高、对植物和人体无毒害的特点。在无农药下，褪黑素溶液是比较理想的增强植物抗叶部病害的免疫调节剂，褪黑素可以显著提高植物叶片保卫细胞中活性氧的产生，使气孔关闭减少病菌的入侵；有助于减少因过量使用农药引起的抗病性和农药残留等问题，对农业绿色可持续性发展具有重要意义。
附图说明
图1为褪黑素和flg22处理对三七气孔影响结果。
图2为褪黑素处理后的三七保卫细胞中活性氧的影响结果。
图3为褪黑素处理对三七叶片中菌落的影响结果。
图4为褪黑素溶液处理对三七感病率的影响。
图中，CK为对照组，MT为褪黑素组，flg22为flg22组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规市购试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1:三七叶片保卫细胞对褪黑素和flg22的敏感性的测定，包括如下步骤：
实验材料为三年生三七；
选择长势一致的三七植株；用镊子小心撕取四株混合(中叶和复叶)部位的三七叶片下表皮条，置于表皮条缓冲液中光照2小时。以10μM褪黑素和5μM flg22处理2小时后显微镜下观察气孔开度。
图1所示，褪黑素(MT)和flg22处理对三七气孔影响结果表明，三七保卫细胞对褪黑素和flg22都有较强的敏感性。
实施例2:三七保卫细胞中活性氧含量的测定，包括如下步骤：
将三七下表皮条光照2小时后，以10μM褪黑素处理1小时，加活性氧荧光染料染色10分钟，去离子水洗涤3次，空白组为对照，激光共聚焦显微镜拍摄活性氧含量。
图2显示，褪黑素处理后的三七保卫细胞中活性氧的影响结果表明，处理组的活性氧含量显著高于对照组CK,荧光强度大于对照组的三倍。本实例说明外源添加褪黑素大大提高了保卫细胞中活性氧的含量。
实施例3:提高三七抗叶面病害的褪黑素溶液，包括如下步骤：
配制10μM含0.1％表面活性剂TritonX-100的褪黑素溶液；将褪黑素溶液均匀喷施在三七叶面上，接着喷病原菌Pst DC3000(OD600＝0.8-1.0以10mM无菌的MgCl2稀释一万倍)；同时以含0.1％表面活性剂TritonX-100的无菌10mM MgCl2喷施的三七为对照。处理第0天、3天用打孔器取三株长势一致的三七叶片，10mM MgCl2研磨后涂平板计算叶片中菌落数。
图3所示，经褪黑素处理对三七叶片中菌落的影响结果表明，采用本发明褪黑素处理剂处理三七叶面后，三七叶片中菌落数含量显著低于对照组，菌落数降低10.3％。
实施例4:验证褪黑素溶液对三七抗叶部病害的影响，包括如下步骤：
田间选择长势一致的三七种植面积两排，共20空，每空面积在3.72m2(宽1.55m长2.4m)左右，每空总株数在90-120之间，喷施10μM褪黑素溶液，空白组为对照。2个月后去除边缘空组，取中间4空统计三七感染叶部病害株数。
图4所示，经褪黑素溶液处理对三七感病率的影响结果表明，采用本发明喷施褪黑素溶液处理三七能提高三七抗叶部病害的能力。与对照组相比，经褪黑素溶液处理的三七叶部病害感病率降低了12.19％。
从上述实验结果中可以得出，褪黑素可以显著增强植物叶片保卫细胞中活性氧的产生，使气孔关闭减少病菌的入侵，有效的降低三七叶部病害感病率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种提高三七抗叶部病害能力的方法，其特征在于：向三七叶面喷施浓度为10μM的褪黑素溶液；
具体的喷施方法由如下步骤构成：(1)取同时播种长势一致的三年生三七下表皮中叶和复叶，以表皮缓冲液-KCl 50mM、CaCl2 0.1mM、MES-KOH 10mM调PH至6.15为空白组做对照，10μM褪黑素和5μM flg22处理；其中，flg22为细菌鞭毛蛋白N端的多肽提取物；位于植物保卫细胞中的鞭毛蛋白受体感应到flg22后会引发先天免疫使气孔关闭分析三七叶片气孔包围细胞开度、活性氧的产生；
(2)以灭菌的10mM MgCl2以增强细胞通透性为对照，对三七叶面喷施10μM褪黑素溶液后喷病原菌Pst DC3000其中，OD600＝0.8-1.0以10mM MgCl2稀释一万倍；喷施病原菌PstDC3000后第0天、3天用打孔器取叶片做菌落数分析；
(3)田间选择长势一致的三七，以表皮缓冲液为空白组做对照，喷施褪黑素溶液后统计实验组与对照组三七叶部病害感病株数。
2.根据权利要求1所述的一种提高三七抗叶部病害能力的方法，其特征在于：褪黑素通过提高植物叶片保卫细胞中活性氧的产生，使气孔关闭减少病菌的入侵，达到提高三七抗叶部病害能力的目的。
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