CN110643554A

CN110643554A - 一株能够高效去除水体中无机磷的菌株及其应用

Info

Publication number: CN110643554A
Application number: CN201911170551.1A
Authority: CN
Inventors: 杨顶珑; 吕成杰; 赵建民
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN110643554B

Abstract

本发明公开了一株能够高效去除水体中无机磷的菌株及其应用，该菌株的分类命名为类芽孢杆菌（Bacillus jeotgali），筛选自海南省红树林区域的底泥样品，保藏编号为：CGMCC No.18276，保藏日期为2019年7月22日，该菌株可应用于污水脱磷处理，工作浓度为≥1.0×10³CFU/mL，实施温度为15‑30℃。该菌株对水体中的无机磷具有较高的去除能力，对改善养殖水体水质、生活污水水质等具有重要的应用价值；该菌株无毒，可以放心使用；该菌株可以去除水体中的无机磷，操作方便，容易推广。

Description

一株能够高效去除水体中无机磷的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株菌株及其应用，具体涉及一株能够高效去除水体中无机磷的菌株及其应用，属于利用微生物处理污水技术领域。

背景技术

近几年，我国城市污水和养殖水体富营养化的问题仍然存在。生物污水和养殖废水排放量较大，水质净化和污水处理问题亟需解决。

城市污水处理厂的尾水和养殖污水，都含有不同种类的氮磷等营养元素，并且含量都较高。水体底泥中赋存着大量不同形态的磷，且赋存形态随着水环境等理化特性的变化而改变。同时，底泥中磷的释放是造成水体富营养化的原因之一。

由于环境理化性质差异、水体体量差异以及化学除磷法成本较高，而利用功能微生物去除无机磷的方法又具有安全、经济、方便和无二次污染的优点，所以后者逐渐成为养殖污水和生活废水处理的主要方式。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够高效去除水体中无机磷的菌株及其应用。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一株能够高效去除水体中无机磷的菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为类芽孢杆菌（Bacillus jeotgali），其筛选自海南省红树林区域的底泥样品，对水体中的无机磷具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：CGMCC No.18276，保藏日期为2019年7月22日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

前述的能够高效去除水体中无机磷的菌株在污水脱磷处理当中的应用，其特征在于，该菌株的工作浓度为≥1.0×10³CFU/mL，该菌株的实施温度为15-30℃。

本发明的有益之处在于：

（1）本发明筛选得到的菌株（保藏编号为CGMCC No.18276）对水体中的无机磷具有较高的去除能力，是一株无机磷高效去除菌株，其对改善养殖水体水质、生活污水水质、工业污水水质等具有重要的应用价值；

（2）本发明筛选得到的无机磷高效去除菌株（保藏编号为CGMCC No.18276）无毒，可以放心使用；

（3）利用本发明筛选得到的无机磷高效去除菌株（保藏编号为CGMCC No.18276）去除水体中的无机磷操作方便，容易推广。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、筛选分离菌株

选择性液体培养基：

物质名称	用量
		NaCl	2g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.5g
		CaCO<sub>3</sub>	5g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.4g
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	5g
纯水	定容至1L

选择性固体培养基：

物质名称	用量
		NaCl	2g
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.5g
		CaCO<sub>3</sub>	5g
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.4g
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	5g
琼脂	20g
		纯水	定容至1L

菌株筛选自海南省红树林区域的底泥样品，该区域的底泥无机磷含量较高，其中可能含有能够高效去除无机磷的菌株，所以我们从该区域的底泥样品中来筛选菌株，筛选过程具体如下：

将底泥样品与无菌蒸馏水按照1g：1mL的比例混合，然后静置30min，之后取500μL水样接入100mL选择性液体培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养7d，每天向培养瓶中补加1mL质量浓度为5%的KH₂PO₄溶液，连续驯化富集。将富集培养液梯度稀释，然后涂布于选择性固体培养基上，30℃恒温培养16h。之后从选择性固体培养基上挑取颜色不同、形态有差异的单菌落进行划线分离纯化，在这一步我们一共挑取到了8个单菌落，这8个单菌落纯化后分别接到8个LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，然后收集菌体于30%甘油中，并置于-80℃冰箱保存，我们将这8株菌株依次命名为：P-A、P-B、P-C、P-D、P-E、P-F、P-G、P-H。

二、分析菌株的安全性

用兔血琼脂平板划线法检测上述各菌株的安全性：

（1）若菌落周围有透明圈，则菌株为α溶血（严重），有毒性；

（2）若菌落周围有草绿圈，则菌株为β溶血（轻微），有毒性；

（3）若菌落周围无变化，则菌株为γ溶血（不溶血），安全无毒。

溶血结果如下：

菌株命名	溶血环类型	溶血类型
			P-A	-	不溶血
P-B	-	不溶血
			P-C	-	不溶血
P-D	-	不溶血
			P-E	-	不溶血
P-F	-	不溶血
			P-G	-	不溶血
P-H	-	不溶血

由上表可知，这8株菌株均为无毒性菌株，都对水生生物无害，可以应用到污水处理当中。

三、检测菌株去除无机磷的能力

用微量移液器移取15µl步骤一所得的冻存菌（菌株P-A、P-B、P-C、P-D、P-E、P-F、P-G和P-H），将它们分别接种于1.5mL液体LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h，将菌株活化。然后将活化菌株按1:1000的体积比加入到100mL实验室养殖污水（无机磷含量为0.5mg/L）中，室温下静置24h。

用分光光度法测定污水中的无机磷含量，计算出无机磷去除率，计算结果如下：

菌株命名	无机磷去除率
		P-A	85.03%
P-B	74.18%
		P-C	61.16%
P-D	59.92%
		P-E	49.92%
P-F	45.30%
		P-G	34.77%
P-H	30.96%

由上表可知，菌株P-A、P-B、P-C、P-D、P-E、P-F、P-G和P-H均能降低水体中无机磷的含量，对污水中的无机磷都具有去除能力，其中，菌株P-A能够显著降低水体中无机磷的含量（无机磷去除率达到了85.03%），对污水中的无机磷具有较高的去除能力。

四、鉴定菌株

提取菌株P-A、P-B、P-C、P-D、P-E、P-F、P-G和P-H的基因组，PCR扩增16S-rRNA基因，用少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，其余PCR产物送于北京睿博（青岛）有限公司纯化并进行测序，测序结果用Blast软件进行序列分析，并与GenBank中已知的16S-rRNA基因进行最高同源性比对。

引物信息见下表：

PCR反应体系见下表：

PCR反应程序为：94℃变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸15min。

测序比对结果如下：

菌株命名	Blast结果	中文名称
			P-A	<i>Bacillus jeotgali</i>	类芽孢杆菌
P-B	<i>Thalassobacillus </i>sp.	产蛋白酶中度嗜盐菌
			P-C	<i>Exiguobacterium </i>sp.	微小杆菌
P-D	<i>Bacillus methylotrophicus</i>	甲基营养型芽孢杆菌
			P-E	<i>Bacillus aquimaris</i>	海水芽孢杆菌
P-F	<i>Bacillus baekryungensis</i>	查朴图芽孢杆菌
			P-G	<i>Bacillus haikouensis</i>	海口芽孢杆菌
P-H	<i>Bacillus subtilis</i>	枯草芽孢杆菌

五、检测不同浓度的菌株P-A的无机磷去除能力

将活化菌株P-A按照1%的接种量接种到200mL LB培养基中，120r/min、30℃恒温振荡培养16h。将菌液转入离心设备，高速离心收集菌体，以pH=7.4的PBS清洗菌体，并调节菌体浓度到1.0×10⁹CFU/mL。

将上述菌液进行梯度稀释，得到菌体浓度分别为1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL和1.0×10⁹CFU/mL的菌液，按照1:100的体积比将上述各浓度梯度的菌液分别加入到200mL实验室养殖污水（无机磷含量为0.5mg/L）中，室温下静置24h。

混合前菌体浓度（CFU/mL）	无机磷去除率
		1.0×10<sup>4</sup>	56.76%
1.0×10<sup>5</sup>	83.27%
		1.0×10<sup>6</sup>	84.02%
1.0×10<sup>7</sup>	82.07%
		1.0×10<sup>8</sup>	82.32%
1.0×10<sup>9</sup>	93.27%

由上表可知，按照1:100的体积比混合菌液和污水，当菌株P-A混合前的菌体浓度达到1.0×10⁵CFU/mL时（工作浓度为1.0×10³CFU/mL），其即可高效去除水体中的无机磷，无机磷去除率在80%以上。

六、验证菌株P-A的无机磷去除能力

案例1：取烟台某水产品加工厂排放的废水，测得其无机磷的含量为0.67mg/L。将菌株P-A按照前述方法制成菌体浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后测得该废水的无机磷的含量为0.12 mg/L，无机磷去除率达到了82.09%。

案例2：取烟台某水产品加工厂排放的废水，测得其无机磷的含量为0.67mg/L。将菌株P-A按照前述方法制成菌体浓度为1.0×10⁹CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂用原池水（菌剂与原池水的体积比为1：99）添加红糖（每升混合水添加100g红糖）进行扩繁（扩繁的条件：37℃、静置24h），扩繁后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该废水中，24℃静置处理24h后测得该废水的无机磷的含量为0.11mg/L，无机磷去除率达到了83.58%。

案例2与案例1相比，施用前用原池水添加红糖进行扩繁，无机磷去除效果差不多，但是减少了购买大量制剂的费用，降低了养殖成本。

案例3：取烟台某食品加工厂排放的废水，测得其无机磷的含量为0.36mg/L。将菌株P-A按照前述方法制成菌体浓度为1.0×10⁵CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该废水中，22℃静置处理24h后测得该废水的无机磷的含量为0.05mg/L，无机磷去除率达到了86.11%。

案例4：取烟台某河流入海口的流水，测得其无机磷的含量为0.24 mg/L。将菌株P-A按照前述方法制成菌体浓度为1.0×10⁵CFU/mL的菌剂，随后将该菌剂按照1:100的体积比加入到该水样中，18℃静置处理24h后测得该水样的无机磷的含量在0.01mg/L以下，无机磷去除率达到了95.83%以上。

由此可见，菌株P-A确实可以显著降低水体中的无机磷含量，高效去除水体中的无机磷，改善水质，但是处理能力受实施温度的影响，实施温度一般控制在15-30℃比较适宜。

理论上，菌株P-A对养殖废水、城市生活污水等高磷污染水体亦有稳定、高效的去磷效果。

八、保藏

由前面的研究可知，本发明筛选得到的菌株P-A对水体中的无机磷具有明显并且稳定的去除效果，相比其他7株菌株更易维持一个稳定良好的水质环境，所以该菌株可以应用到养殖污水、生活污水、工业污水等污水的脱磷处理当中，具有非常重要的应用价值和广泛的应用前景。

我们将筛选得到的对无机磷具有较好的去除效果并且对水生生物无毒的菌株P-A保藏在了中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为：2019年7月22日，保藏编号为：CGMCC No.18276。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一株能够高效去除水体中无机磷的菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为类芽孢杆菌（Bacillus jeotgali），其筛选自海南省红树林区域的底泥样品，对水体中的无机磷具有较高的去除能力，并且对水生生物无害，保藏编号为：CGMCC No.18276，保藏日期为2019年7月22日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的能够高效去除水体中无机磷的菌株在污水脱磷处理当中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该菌株的工作浓度为≥1.0×10³CFU/mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该菌株的实施温度为15-30℃。