CN110642931A - 一种多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多肽及其应用。该多肽包括带穿膜肽的线性多肽(如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所示)、无穿膜肽的环状多肽(如SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：8所示)和突变体多肽(SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：22所示)中的一种或多种。本发明的多肽缩短了在先申请中TAP21的肽段，并且能够保持原有活性并且具有更高的活性，降低了工艺的难度和合成成本；其在细胞以及动物模型中具有良好的抗肿瘤性能，且效果明显优于已有多肽产品，其在抑制肿瘤或阻断肿瘤细胞增殖中的应用为抗肿瘤治疗提供了良好的前景。

Description

一种多肽及其应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤技术领域，具体涉及靶标专一性抗肿瘤多肽及其应用。
背景技术
目前，癌症已经成为世界范围内一个重要的公共卫生问题，全球2012年新发病例近1400万例，且预计未来20年将增加约70％新增病例数。在过去的十年中，治疗癌症的费用也在不断增加，但仍然有几种癌症类型的死亡率居高不下，例如，肝癌和子宫癌的死亡率越来越高。此外，中国的癌症和肿瘤发病率和死亡率也一直在上升，也是我国的主要公共卫生问题之一。例如，肝癌是常见且死亡率高的癌症，常用治疗肝癌的药物有doxorubicin(阿霉素)，cisplatin(顺铂)，5-Fluorouracil(氟尿嘧啶)等通过细胞凋亡的途径杀死肿瘤细胞，但高达72％的患者带有多药耐药基因，促使治疗失败及复发。2005年上市最新口服药物Sorafenib(索拉非尼)为多靶点多激酶的抑制剂，相对于安慰剂治疗，索拉非尼仅延长晚期肝癌患者整体存活率约3个月，治疗方案尚不理想。目前大多数治疗采用化疗和/或放射疗法，免疫疗法，靶向疗法或激素疗法联合手术对肿瘤及癌症进行治疗，但依然会引起治疗影响健康组织或器官的副作用/问题。现在仍然缺乏对许多肿瘤和/或癌症的精确治疗，因此，寻求有效的、低毒、抗耐药性和价廉的抗肿瘤药物，是当前亟待解决的重大课题。
多肽药物被认为具有无毒或低毒副作用，高度选择性的优点，利用多肽对肿瘤进行治疗的方法越来越受欢迎。目前正在临床试验中，大约有140种以上的多肽处于临床试验阶段。超过500个多肽类药物处于临床前研究阶段。全球多肽药物市场规模在2011年为141亿美元，并以每年15％～20％的速度递增，预测到2018年为254亿美元，其中创新的多肽药物市场将从2011年86亿美元增加至2018年170亿美元。一项研究证明，多肽药物与病毒囊膜糖蛋白互相作用，阻止其构象变化，从而阻断了病毒囊膜语宿主细胞的融合，抑制病毒的复制，打到防治HIV感染的目的。肿瘤多肽药物方面，现有超过20个多肽与小分子,寡核糖核苷酸或抗体形成多肽偶连体在临床试验中，康哲医药研究(深圳)有限公司有两个抗癌的多肽药物正在临床或临床前研究。我国多肽药物的市售复合年增长率达到20.7％，在2009年达到195亿元。而且，国内在售的多肽类药物只有十余种，肿瘤多肽药物也仅在临床研究，尚未上市，因此开发多肽类新药空间巨大。
T-box家族的转录因子在进化中高度保守，在胚胎发育中发挥关键作用，其缺失或突变会造成人类的尺骨病变，并引发多种器官疾病。1999年我组首先克隆TBX2和TBX3并发现其DNA结合域、转录抑制结构域其中90％是同源的序列。TBX2/TBX3基因在多种恶性肿瘤如肝癌，乳腺癌，卵巢癌等组织中高表达，导致上皮间质转化(EMT)，促进肿瘤生长，侵袭及转移，并降低对抗肿瘤药物polyploidy和cisplatin的敏感性，TBX2/TBX3高表达与5年生存率成负相关。TBX2/TBX3通过与p19ARF，p21CIP的启动子结合并抑制其转录，并和原癌基因Myc，Ras等共同作用促使肿瘤细胞恶性转化。其中主要是由Tbx3中的C-末端阻遏结构域介导的，涉及氨基酸567-623序列，以及Tbx2中的N-和C-末端抑制结构域。除此之外，TBX3在诱导多功能干细胞(iPS)和维持胚胎干细胞(ES细胞)的自我更新中起了重要作用，可能与肿瘤手术后复发，耐受传统的化疗和放疗的原因之一。上述研究表明，TBX3在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，因此将TBX3有望成为肿瘤治疗的新靶点及预测患者预后的有效指标。
基于Tbx3在癌症发展中的生物学特性，有可能找到Tbx3的主要功能域作为靶向癌细胞的多肽。研究组经过十多年的研究，从TBX2和TBX3基因中找到能特异性抑制p19ARF，p21CIP转录调控的活性位点，并发现该位点与肿瘤细胞的生长、迁移相关，并设计特异性识别和抑制该位点的多肽分子TAP21，该多肽在体外能有效地抑制肝癌细胞生长，诱导肝癌细胞凋亡，而对正常细胞没有毒性。在动物实验中，TAP21显著抑制肿瘤的生长，迁移。美中不足的是TAP21太长(81氨基酸)，由此导致(1)半衰期较短，需要每天给药；(2)潜在的免疫反应；(3)制备成本太高；(4)技术难点大。因此，在某种程度上，TAP21的临床应用受到很大的限制。尽管该研究已被授予中国专利(专利申请号：201010110980.2，专利名称：抗肿瘤的核酸与多肽及其应用)，但距离开发出抗癌药物还有相当的距离。
发明内容
基于现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供靶标专一性抗肿瘤多肽，在具有自主知识产权的抗癌多肽的基础上，缩短TAP21氨基端的序列，经化学合成，测定其抗癌活性，以期解决缩短多肽的长度而保持其靶专一性、降低其潜在的免疫原性、降低生产的技术难度，从而得到更好的质量控制和降低开发及生产成本。再通过一系列的化学修饰方法，改变多肽氨基酸的构象如环状，引入非天然氨基酸等，以期提高其活性，透膜性，半衰期。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一方面，本发明提供一种多肽，该多肽包括带穿膜肽的线性多肽、无穿膜肽的环状多肽和突变体多肽中的一种或多种；
所述带穿膜肽的线性多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：1所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYASVHRHPFL(如SEQ ID NO：2所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：3所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAASAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：4所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPF(如SEQ ID NO：5所示)；
所述无穿膜肽的环状多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
LFPYPYTYAAVHRHP(如SEQ ID NO：6所示)；
LFPYPTY(如SEQ ID NO：7所示)；
RGDFLFPYPTYR(如SEQ ID NO：8所示)；
(其中，f代表D型脯氨酸，R与R连接成环肽)
所述突变体多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
RKKRRQRRRLFPYPYTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：11所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：12所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：13所示)；
RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：14所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：15所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：16所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：17所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：18所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：19所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：20所示)；
RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：21所示)；
PYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：22所示)。
本发明上述的多肽缩短了在先申请中TAP21的肽段，减少了肽段中间的重复丙氨酸、丝氨酸序列，并且能够保持原有活性并且具有更高的活性，降低了工艺的难度和合成成本。
上述的多肽中，优选地，所述多肽是根据其氨基酸序列，采用D型氨基酸进行多肽的合成，有助于延长多肽在癌细胞和体内的半衰期。
在一优选的实施方式中，针对多肽19采用D型氨基酸进行化学合成。
上述的多肽中，优选地，所述多肽是根据其氨基酸序列，采用beta型氨基酸进行多肽的合成，有助于延长多肽在癌细胞和体内的半衰期。
在一优选的实施方式中，针对多肽19采用beta型氨基酸进行化学合成。
另一方面，本发明还提供一种修饰的多肽，其为上述多肽(包括D型氨基酸进行的化学合成和beta型氨基酸进行的化学合成)进行N末端乙酰化和C末端酰胺化修饰后的多肽，进而进一步提高多肽的稳定性，同时也具有抗肿瘤的效果。
在一优选的实施方式中，针对多肽19先采用beta型氨基酸进行化学合成，然后在进行双端修饰。
再一方面，本发明还提供治疗肿瘤的药物组合物，其包含上述的多肽、修饰的多肽，以及其赋形剂。
本发明的药物组合物在体外能够进行更长时间的药效观察。
再一方面，本发明还提供上述的多肽、修饰的多肽在制备治疗个体肿瘤或癌症的药物、多肽药物或联合药物中的用途。
上述的用途，优选地，所述肿瘤或癌症选自肺癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、血管瘤、骨癌、宫颈癌、子官癌、卵巢癌、脂肪癌、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、胸腺癌以及脑或中枢神经系统癌症；
更加优选地，所述肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌或肺癌。所述癌症可以为原发性肿瘤，也可以是转移性癌症。
在一些优选的实施方法中，所述多肽药物或药物组合能以适于对哺乳动物个体，例如人、猴子、猪、马、牛、羊、狗、大鼠、小鼠、豚鼠、家免、猫等给药的适当形式，可单独提供本发明所述的活性多肽。如果需要的话，可将本发明的活性多肽与多种传统和现存的治疗癌症的药物或手段联合使用，例如与化疗药物和/或放疗联合使用。
上述的用途中，优选地，包括对个体进行有效量的所述药物、所述多肽药物或所述联合药物的给药。
本发明可使用常规的制药方法提供适合的药物制剂或组合物联合使用的药物对患有癌症的个体，优选人，进行所述化合物或所述药物的给药。可以采用任意适合的、例如非肠道的、静脉的、皮下的、肌肉的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内的、腹膜内的、鼻内的、气雾剂或口服给药方法。药物制剂或配方可以是液体溶液或悬液；片剂或胶囊；粉末，滴鼻剂或气雾剂形式。且制备所述制剂的方法是本领域公知的。对于治疗性或预防性组合物而言，可以足以中止或延缓肿瘤细胞增殖的量对个体给药所述化合物。
本发明所用术语“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗或预防有效量”是指在剂量上的有效量，并且在必需的实践阶段内，达到所需要的抑制肿瘤的结果。在通常情况下，术语“治疗有效量”是足以实现期望反应或改善，例如：转移或原发肿瘤紧张、大小或生长的症状或指征的量。针对特定个体的治疗有效量可以根据例如接受治疗个体的疾病状态、整体健康状况、给药方法、途径和剂量以及副作用的严重程度等因素变化。当在组合中时，洽疗有效量时相对组分组合的比例且效果不跟于单一组分。
本发明的多肽分子、药物或药物组合物的治疗有效量通常能够改善癌症症状至少约15％；通常至少约25％；优选至少约35％；或更优选至少约50％。癌症转移的抑制指肿瘤细胞的迁移或转移受到影响或抑制。这将导致例如受影响细胞数目的统计学显著的或可定量的变化，例如，在一段时间内或靶区域内受影响的靶细胞数的减少。还可以监测原发肿瘤进展的速度、大小、扩散或生长。
本发明活性成分或化合物的优选治疗或预防有效量范围可以是0.1nM-0.1M。
在本次发明中，根据在先的研究基础，通过对多肽TAP21的序列进行缩短、突变、修饰等方法，从而有效的提高了多肽的半衰期以及抑制肿瘤的效果。并且本次发明没计出能保持原有活性或活性更高的抗癌多肽，降低工艺的难度和合成成本，并且达到抑制或去除肿瘤细胞的目的。
一方面，缩短了TAP21肽段的长度、减少肽段中间的重复丙氨酸，丝氨酸序列等，总共设计出了21条多肽。另一方面，还对已筛选出的活性多肽进行结构改造，化学修饰，以提高其跨膜能力和生物活性。在确定多肽的结构后，优化制备工艺，确定—条基本适合生产的合成工艺，保证药物的物理化学和生物学性能的稳定性，同时还能达到稳定的抑制和去除肿瘤细胞的目的。
本发明中所述“多肽”或“肽”可以交替使用。“多肽”或“肽”是二种或更多种氨基酸的任意链，无论翻译后修饰的情况如何，包括自然发生或非自然发生的氨基酸或氨基酸类似物。
本发明的多肽也可以扩展为生物学等同的多肽，或保守性氨基酸替换而获得本发明所述多肽序列的部分序列的变体；或通过不影响生物学功能，例如在任意一个实施方式中，所述序列的非保守性替换而获得的本发明所属多肽序列的部分序列的变体。
本文所使用的术语“保守的氨基酸替换”是指在所述多肽的给定位置上一种氨基酸或多种氮基酸的替换，其中可以在基本不丧失相关功能的条件下进行氨基酸的替换。
在某些实施方式中，“保守取代”为用一氨基酸取代另一类具有相同特性的氨基酸，从而使得多肽的二级结构和亲水性等特性并不会发生实质性的改变。氨基酸的取代通常基于残疾的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或兼性性质的相似性进行。
在某些实施方式中，保守性改变还包括通过例如氨基酸的官能侧链反应，对非衍生残基进行化学衍生。多肽类似物还包括被化学改变的，例如甲基化，通过诸如乙胺、乙醇胺或乙二醇胺的烷基胺对C-末端氨酸进行化学修改改变。同时，也包括用取代的酰胺对酰胺键进行替换或酰胺键的同电子排列体。
本发明具备以下有益效果：
(1)本发明的多肽及其修饰的多肽缩短了在先申请中TAP21的肽段，减少了肽段中间的重复丙氨酸、丝氨酸序列，并且能够保持原有活性并且具有更高的活性，降低了工艺的难度和合成成本。
(2)本发明的多肽及其修饰的多肽在细胞以及动物模型中具有良好的抗肿瘤性能，且效果明显优于已有多肽产品，其在抑制肿瘤或阻断肿瘤细胞增殖中的应用为抗肿瘤治疗提供了良好的前景。
附图说明
图1显示了实施例1中多肽氨基酸序列以及各多肽处理肿瘤细胞48小时，测定对肿瘤细胞增殖影响的IC50数值(NS，IC50)40nM)；
图2显示了实施例2中各条多肽对肿瘤细胞增殖(48小时)的影响图；
图3显示了实施例2中修饰后的多肽序列中，多肽19通过beta/D氨基酸的修饰后，多肽对肿瘤细胞增殖的影响图；
图4显示了实施例2中商品多肽10对各种上述肿瘤细胞增殖的影响图(阳性对照多肽)；
图5显示了实施例2中修饰后的多肽序列中，多肽19通过beta/D氨基酸的修饰后，多肽对肿瘤细胞增殖影响的IC50数值；以及商品多肽10对不同肿瘤细胞增殖影响IC50数值。
图6显示了实施例2中修饰后的多肽序列中，多肽19以及beta氨基酸修饰后的多肽19，再通过N末端乙酰化和C末端酰胺化修饰，对肿瘤细胞增殖的影响图；
图7显示了实施例3中修饰后多肽19在体内对肿瘤的抑制效果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1多肽合成的参考流程
1.1、原料：
保护氨基酸：采用氨基酸原料，如果合成D型或者beta型多肽则采用D型或者beta型氨基酸原料进行以下合成工序。
起始树脂：Fmoc-Pro-2Cl-Trt-Cl-Resin。
缩合剂及有机碱：HBTU，NMM。
溶剂：DMF，DCM，甲醇，六氢吡啶。
1.2、设备及仪器：
80mL玻璃反应柱，真空水泵，干式加热器，低俗大容量离心机，恒温摇床，真空干燥皿。
1.3、各种试剂的配制：
(1)Kaiser test试剂的配制
A液：80％的苯酚+20％的无水乙醇
B液：重蒸吡啶
C液：5克茚三酮+100ML无水乙醇
(2)脱保护溶液的配制：
20％的六氢吡啶+80％的DMF
(3)多肽切割液的配制：
87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％苯酚+2.5％EDT+2.5％H2O
1.4、多肽的合成：
a、树脂溶胀：称Fmoc-Pro-2Cl-Trt-Cl-Resin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干。
b、脱保护：向反应柱中加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干。
c、称料：量取树脂3倍摩尔量的保护氨基酸，再称取3倍摩尔量的HBTU。
d、脱保护洗涤：向反应柱中加入适量DMF，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次。
e、投料：将已备好的保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入树脂6倍摩尔量的NMM，氮气搅拌鼓动30分钟。
f、反应后洗涤：将反应柱中的溶液抽干，加入适量DMF洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次。
g、检测：取适量(10-20颗)树脂于小试管中，加入A，B，C液各两滴。放入干式加热器中，加热3分钟(110摄氏度)。取出后若溶液显蓝色，树脂有杂色不透明，则反应没有完全，需要重新再反应一次。若溶液颜色微黄，树脂无色透明则为反应完全，可以连接下一个氨基酸，具体步骤重复以上b-f这五个步骤，直到连完最后一个氨基酸。
h、合成完毕后的洗涤和干燥：在连完最后一个氨基酸并已脱保护洗涤之后，抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割。
1.5、多肽的切割
切割：将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量配好的切割液(1g/10ml)，放置于恒温摇床中25C恒温振荡2小时。
过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入100ml的离心管内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品。
洗涤：将离心管密封后放入离心机中以4000转每分钟的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次。
干燥：将以洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时。最后的所得白色粉末即为所需多肽的粗品，称量，待纯化。
1.6、纯化工艺
1.6.1、粗品分析
分析条件：
仪器：高效液相色谱仪，配紫外检测器
波长：220nm
流速：1.0ml/min
制备柱：250*4.6mm C18柱
流动相：A:0.1％TFA in 100％acetonitrile
B：0.1％TFA in 100％water
分析粗品
取少量样品于0.5ml离心管中用纯水超声溶解至澄清，过滤进样。用梯度10-100％分析。
1.6.2、纯化方法
溶解样品：
称量5g样品于500ml的烧杯中，加入400ml纯水和100mlACN超声溶解，待样品完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤。
纯化方法：
仪器：高效液相色谱仪，配紫外检测器
波长：220nm
流速：180ml/min
制备柱：反相硅胶C18柱
流动相：A：100％acetonitrile
B： 0.1％TFAin 100％water
Gradient:A B
0min 17％ 83％
100min 27％ 73％
制备样品：
以制备条件17-17％平衡仪器约10分钟后停所有泵，将滤好的样品用进样泵进样，再执行17-27％的梯度，收集馏分。收集结束后，停泵。将收集的馏分在分析仪器上检验纯度，纯度合格的样品进行冷冻干燥。
1.6.3、冻干干燥
将收集的馏分用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂旋蒸掉之后上冷冻干燥机冷冻干燥。
采用以上方法制备获得本发明的多肽，所述多肽包括带穿膜肽的线性多肽、无穿膜肽的环状多肽和突变体多肽中的一种或多种；
所述带穿膜肽的线性多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
多肽1：RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：1所示)；
多肽2：RKKRRQRRRLFPYPTYASVHRHPFL(如SEQ ID NO：2所示)；
多肽3：RKKRRQRRRLFPYPTYAAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：3所示)；
多肽4：RKKRRQRRRLFPYPTYAASAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：4所示)；
多肽5：RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPF(如SEQ ID NO：5所示)；
所述无穿膜肽的环状多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
多肽6：Cyclo-LFPYPYTYAAVHRHP(如SEQ ID NO：6所示)；
多肽7：Cyclo-LFPYPTY(如SEQ ID NO：7所示)；
多肽8：Cyclo-RGDfLFPYPTYR(如SEQ ID NO：8所示)；
所述突变体多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
多肽9：LFPAAAT(如SEQ ID NO：9所示)；
多肽11：RKKRRQRRRLFPYPYTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：11所示)；
多肽12：RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：12所示)；
多肽13：RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：13所示)；
多肽14：RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：14所示)；
多肽15：RKKRRQRRRLFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：15所示)；
多肽16：RKKRRQRRRLFPYPYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：16所示)；
多肽17：RKKRRQRRRFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：17所示)；
多肽18：RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：18所示)；
多肽19：RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：19所示)；
多肽20：RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：20所示)；
多肽21：RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：21所示)；
多肽22：PYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：22所示)。
作为后续实验对比用的多肽还包括：
商业化的环状抗癌多肽10：Cyclo-RGDfV(如SEQ ID NO：10所示)，其保护一个D-氨基酸，具有较长的半衰期；其中，f代表D型脯氨酸；
非特异性的多肽23(NC)：NLARQWNNCAFLE(如SEQ ID NO：23所示)。
对本实施例的多肽处理肿瘤细胞48小时，测定对肿瘤细胞增殖影响的IC50数值(NS，IC50)40nM)；结果如图1所示，由图1结果可知：本次优化多肽中，大部分多肽的IC50低于20uM，甚至能够低于1uM，优于之前设计的TAP21(浓度在20uM左右)，抗癌活性提高了。
实施例2细胞实验
化学品和试剂：Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)和Gene TailorSite-Directed Mutagenesis System购自Invitrogen(CA，USA)。胎牛血清(FBS)来自HyClone Laboratories，Inc(USA)，而限制性内切酶和DNA连接酶购自New EnglandBioLabs Inc(USA)。二甲基亚砜(DMSO)购自西格玛。
细胞培养：将HepG2，Huh7，Hep3B和横纹肌肉瘤(RD)细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素的Dulbecco's改良伊格尔培养基(DMEM)中，并且在37℃下在潮湿的5％的二氧化碳。
首先在体外检测多肽的生物活性。釆用MTT(USE)检测法检测细胞增殖情况，先将HepG2(ATCC)细胞种植于96孔板中，每孔中含5×103个细胞，每孔含有10％FBS的l00μLDMEM，留空8个孔作为空白对照。孵育(37℃，5％CO2)过夜，使细胞附着到井上。加入不同浓度(5uM，10uM、20uM，40uM，80uM)精确溶于DMSO的设计多肽，每孔加入含2％FBS的DMEM。孵育(37℃，5％CO2)48小时/96小时，使多肽生效。每孔加入0.05％MTT溶液。孵育(37℃，5％CO2)3小时，使MTT代谢。弃去培养基，在100μL DMSO中重悬甲(MTT代谢产物)，将甲混入溶剂中。读取490nm处的光密度，记录结果。以浓度为横坐标，细胞活存力为纵坐标绘制生长曲线，结果如图2所示。由图2结果显示多肽12，13，15，18，19的抗癌活性显著高于商业化的多肽10的1倍以上，特别是多肽15和19的抗活性高于临床应用的多肽10的50-100倍。
在另一实验中，增加了不同种类的肿瘤细胞，包括HepG2，Huh7，Hep3B，RD细胞，并通过对修饰后的多肽19采用不同浓度(5uM，10uM，20uM，40uM)的多肽对细胞进行处理，并且仍然以非特异性空自对照多肽序列(NC)以及多肽10的阳性多肽进行对照处理，结果如图3、图4和图5所示，D-氨基酸及beta-氨基酸修饰后抗癌活性很高，作用效果长。
在另一个实验中，仍旧使用HepG2，Huh7，Hep3B，RD细胞，采用N末端乙酰化和C末端酰胺化修饰的多肽19序列，用不同浓度(5uM，10uM，20uM，40uM)的多肽对细胞进行处理，结果如图6所示，抗癌效果有所减弱。
实施例3
在体内评估多肽19的生物活性。采用BALB/c nude mice(15克-20克)，并选择在背部皮下注射2x106肿瘤细胞BEL7404，每组小鼠6只，并设有对照组，注射PBS，以及阳性对照组多肽。当肿瘤体积为50mm3左右，开始在肿瘤部位原位注射多肽或者对照试剂，持续l0天，每天注射100ug或者等体积的对照试剂。10天后，停止注射，继续测量10天。期间隔3天测量肿瘤大小，记录结果，以时间为横坐标、体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线。从图7结果可以见，与对照组相比，注射活性多肽的组别肿瘤体积明显降低，肿瘤体积小，且变化具有明显意义。并且修饰后的多肽对肿瘤的抑制效果明显好于阳性对照，其他肿瘤细胞在体实验中也观察到了类似的实验结果。
综上所述，本发明的多肽及其修饰的多肽缩短了在先申请中TAP21的肽段，减少了肽段中间的重复丙氨酸、丝氨酸序列，并且能够保持原有活性并且具有更高的活性，降低了工艺的难度和合成成本；其在细胞以及动物模型中具有良好的抗肿瘤性能，且效果明显优于已有多肽产品，其在抑制肿瘤或阻断肿瘤细胞增殖中的应用为抗肿瘤治疗提供了良好的前景。
序列表
<110> 香港城市大学深圳研究院
<120> 一种多肽及其应用
<130> GAI18CN3215
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Val His Arg His Pro Phe Leu
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Ser Val His Arg His Pro Phe Leu
20 25
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Ala Val His Arg His Pro Phe Leu
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ala Ala Val His Arg His Pro Phe Leu
20 25
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Thr Tyr
1 5 10 15
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20
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<212> PRT
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Leu Phe Pro Tyr Pro Tyr Thr Tyr Ala Ala Val His Arg His Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列()
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1 5
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<212> PRT
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1 5 10
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<212> PRT
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Arg Gly Asp Phe Val
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<400> 11
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Phe Pro Tyr Pro Tyr Thr
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Tyr Ala Ala Val His Arg His Pro Phe Leu
20 25
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<213> 人工序列()
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Ala Ala Ser His Arg His Pro Phe Leu
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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1 5 10 15
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20
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Ala Ala Ser His Arg His Pro Phe
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<213> 人工序列()
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<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 23
Asn Leu Ala Arg Gln Trp Asn Asn Cys Ala Phe Leu Glu
1 5 10

Claims (10)

1.一种多肽，该多肽包括带穿膜肽的线性多肽、无穿膜肽的环状多肽和突变体多肽中的一种或多种；
所述带穿膜肽的线性多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：1所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYASVHRHPFL(如SEQ ID NO：2所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：3所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAASAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：4所示)；
RKKRRQRRRLFPYPTYAAVHRHPF(如SEQ ID NO：5所示)；
所述无穿膜肽的环状多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
LFPYPYTYAAVHRHP(如SEQ ID NO：6所示)；
LFPYPTY(如SEQ ID NO：7所示)；
RGDfLFPYPTYR(如SEQ ID NO：8所示)；
所述突变体多肽的氨基酸序列包括如下氨基酸序列中的一种或多种：
LFPAAAT(如SEQ ID NO：9所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAAVHRHPFL(如SEQ ID NO：11所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：12所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：13所示)；
RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：14所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：15所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYAASHRHPFL(如SEQ ID NO：16所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTAASHRHPFL(如SEQ ID NO：17所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：18所示)；
RKKRRQRRRLFPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：19所示)；
RKKRRQRRRFPYPYTYAASHRHPF(如SEQ ID NO：20所示)；
RKKRRQRRRPYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：21所示)；
PYPYTYAASHRHP(如SEQ ID NO：22所示)。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽是根据其氨基酸序列，采用D型氨基酸进行多肽的合成。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽是根据其氨基酸序列，采用beta型氨基酸进行多肽的合成。
4.修饰的多肽，其为权利要求1-3任一项所述多肽进行N末端乙酰化和C末端酰胺化修饰后的多肽。
5.治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的修饰的多肽，以及其赋形剂。
6.权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的修饰的多肽在制备治疗个体肿瘤或癌症的药物、多肽药物或联合药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述肿瘤或癌症选自肺癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、肝癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴癌、血管瘤、骨癌、宫颈癌、子官癌、卵巢癌、脂肪癌、乳腺癌、脑瘤、鳞癌、皮肤癌、甲状腺癌、唇癌、黑色素癌、舌癌、胸腺癌以及脑或中枢神经系统癌症。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌或肺癌。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，包括对个体进行有效量的所述药物、所述多肽药物或所述联合药物的给药。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述有效量的范围为0.1nM-0.1M。
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