CN110638861A - 一种组合物在皮肤屏障基因修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组合物在制备皮肤屏障基因修复制剂中的应用，所述组合物包括以下组分：黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物；所述应用包括采用组合物调节角蛋白、丝聚蛋白、兜甲蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶、水通道蛋白、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶‑14中的至少一种蛋白或酶的表达。本发明填补现有技术中黄芩、苦参、甘草三种提取物的组合物在皮肤屏障相关基因修复中的空白，特别是与CE形成相关基因LOR、FLG和与丝聚蛋白降解相关基因CASP14，为后续与皮肤屏障相关的皮肤疾病治疗打下基础。

Description

一种组合物在皮肤屏障基因修复中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药和化妆品技术领域，具体地，涉及一种组合物在皮肤屏障基因修复中的应用。

背景技术

皮肤是人体内最大的器官，总重量大约占个体体重的16％，一方面维持机体稳定，另一方面也是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线。有研究表明，如果外界环境导致皮肤屏障中的相关基因异常或某些疾病涉及的某些先天基因缺陷，就会发生皮肤病，如敏感肌肤、湿疹、银屑病等。

皮肤的屏障主要结构在表皮，表皮的屏障结构主要在角质层。皮肤屏障功能与角质层中的角质形成细胞的核分裂、分化、退化直至消失有关，与相关基因的表达密切相关。

表皮细胞分化过程中，角蛋白(keratin，KRT)﹑中间丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)﹑内披蛋白(involucrin，INV)﹑兜甲蛋白(loricrin，LOR)﹑小分子富含脯氨酸蛋白(smallproline-rich regions，SPRRs)﹑转谷氨酰胺酶(transglutaminase 1，TGM1)等均参与角质化包膜(cornified envelope，CE)的形成，最终形成皮肤角质层的特殊结构。这些基因或蛋白的异常表达将直接影响表皮组织结构的完整性，导致皮肤屏障功能的异常。

另外，丝聚蛋白在半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14(caspase 14,CASP14)的作用下被分解成游离的氨基酸形成天然保湿因子(natural moisture factor，NMFs)，调节皮肤水合功能。此基因的表达异常，可导致表皮的稳态失衡，影响皮肤屏障功能。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是特异性转运水的蛋白家族，能显著增加细胞膜对水的通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外平衡的调节。皮肤中含量最多的为水通道蛋白3(Aquaporin 3，AQP3)，其可运输水和甘油，在保持表皮水合和损伤后的屏障修复方面发挥重要作用，也可影响皮肤弹性，同时也参与细胞迁移、增殖、分化、脂质代谢和屏障形成。

自古以来，黄芩具有清热燥湿、泻火解毒作用，用于温热病、肺炎、痈肿疖疮等症。苦参具有清热燥湿，杀虫，利尿之功，用于湿疹，湿疮，皮肤瘙痒等。而甘草具有清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效，其中甘草酸对炎症发生、发展和反应等许多环节具有对抗作用。最新的专利和文献报导黄芩、苦参、甘草三味药材可与干细胞因子结合从而进一步提高细胞修复效果，具有修复皮肤屏障的效果。但是针对皮肤屏障相关基因特别是与CE形成相关基因LOR、FLG和与丝聚蛋白降解相关基因CASP14，并未有任何报道。

发明内容

本发明为了填补现有技术中黄芩、苦参、甘草三味药材在皮肤屏障基因修复中的空白，提供了一种组合物在皮肤屏障相关基因修复中的应用，可通过激活和阻遏(上调或下调)皮肤屏障相关基因的表达，缓解皮肤刺激，修复皮肤屏障。

本发明以人皮肤来源的角质形成细胞(normal human epidermal keratinocyte，NHEK)为研究对象，先通过细胞毒性及形态学的分析，筛选出最大给药浓度，再运用实时荧光定量PCR技术(real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)，研究一种组合物作用NHEK细胞后，皮肤屏障相关基因在转录水平的表达变化，最终于人体皮肤上检测一种组合物对损伤后经表皮水分损失量(transepidermal water loss，TEWL)的影响，来探索一种组合物对NHEK细胞屏障相关基因修复及皮肤屏障修复的作用。

本发明中，所述组合物在调控NHEK细胞屏障相关基因时一般均保证细胞活性正常。所述组合物在NHEK细胞屏障相关的基因修复中的作用，可通过激活和阻遏(上调或下调)相关基因的表达来反映，所述靶标基因的相对表达倍数(上调和下调)可通过与十二烷基硫酸钠(selective laser sintering，SLS)处理条件下的NHEK细胞相同基因的表达量(cycle threshold，CT)比较来得到。具体的，所述靶标基因的相对表达倍数＝2^-ΔΔCT，-ΔΔCT＝(CT_靶标基因-CT_GAPDH)_{组合物或刺激物}-(CT_靶标基因-CT_GAPDH)_溶剂；其中溶剂为正常培养条件下的NHEK细胞的靶标基因表达量，刺激物为95μg/ml的SLS单独处理NHEK细胞后的靶标基因表达量，组合物为95μg/ml的SLS联合0.1％或0.2％的组合物共同处理NHEK细胞后的靶标基因表达量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为一种表达量较为恒定的基因，一般作为内参基因存在。靶标基因包括与屏障相关的13种不同信号通路的基因。NHEK细胞基因表达量的检测方法及靶标基因相对表达倍数的计算方法为本领域技术人员均知的方法。

而十二烷基硫酸钠(SLS)是化妆品中常用的表面活性剂，也是引起皮肤刺激性和眼刺激性的主要物质之一。在使用过程中，表面活性剂可以破坏细胞膜导致细胞质的释放，诱发细胞炎症，损伤皮肤屏障。

本发明中，所述组合物调控NHEK细胞屏障相关基因的表达是否与皮肤屏障损伤修复相关，通过检测TEWL的变化来解释。所述组合物对皮肤屏障损伤修复的作用，可通过降低皮肤屏障损伤后TEWL的升高来反映。具体的，TEWL变化率ΔTEWL＝TEWL_{模型或实组合物}-TEWL_空白。其中模型为5％SLS处理皮肤后所检测TEWL，组合物为0.5％、1％、2％实施例所获得组合物联合5％SLS处理皮肤后所检测TEWL，空白为未处理皮肤所检测TEWL。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种组合物在制备皮肤屏障基因修复制剂中的应用，所述组合物包括以下组分：黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物。

优选地，所述的应用包括采用所述组合物调节角蛋白、丝聚蛋白、兜甲蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶、水通道蛋白、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14中的至少一种蛋白或酶的表达。

角蛋白(keratin，KRT)是表皮内角质形成细胞的主要结构蛋白，也是上皮细胞的标志性成分，属中间丝蛋白家族，角蛋白可被分为Ⅰ型(酸性角蛋白，分子量较小，包括K10～20)和II型(碱性或中性角蛋白，分子量较大，包括K1～9)。在角质细胞中，分化成熟的角蛋白纤维是两种类型的角蛋白按1∶1比例特异性聚合成的异种二聚体。在特异性皮炎(atopicdermatitis，AD)患者的皮损区及非皮损区，均存在角质形成细胞的异常分化以及角蛋白的异常表达。其中，增生特异性相关的K5/K14及K6/K16和炎症性相关的角蛋白表达增加，而分化特异性相关的K1/K10表达减少。角蛋白异常表达直接影响表皮组织结构的完整性，导致皮肤屏障功能的异常。角蛋白16(keratin 16，KRT16)与细胞增殖相关，角蛋白10(keratin10，KRT10)与细胞分化相关，均由表皮层的角质形成细胞合成。

本发明所述组合物可通过上调NHEK细胞中KRT 16和KRT 10两种基因的表达，促进早期细胞增殖，增加细胞数目，同时又调节细胞分化，加速表皮层的形成，达到修复皮肤屏障的作用。

CE也称交叉连接膜、边缘带以及周边带，它的形成标志着表皮层终端分化结构——角质层的产生，是表皮作为一种防御屏障的基础。CE主要由FLG、INV、LOR、角蛋白等构成，这些蛋白广泛交叉连接，与细胞间脂质共同构成皮肤的“砖墙”结构，CE的形成也受到一些酶的调控，如TGM1、TGM3。FLG又称为微丝凝聚蛋白，主要存在于表皮颗粒层和透明层，由表皮颗粒层的透明角质颗粒中无活性的丝聚蛋白原经一些特异性磷酸酶和蛋白酶催化转化而来。它可以和角蛋白中间丝蛋白互相作用，聚集成角蛋白纤维束，从而形成最外层角质形成细胞的扁平支架结构。有研究表明，FLG基因的突变存在于高达50％的中度至重度AD患者中。LOR、INV主要表达于颗粒层与角质层，是最终分化的CE的主要构成成分，大约占其蛋白量的80％。在表皮棘层上部TGM1的催化下，LOR和INV交叉连接，形成不溶的CE，构成表皮独特的角层屏障结构。LOR基因突变所致的皮肤病有火棉胶婴儿、进行性对称性红斑角化症(symmetrical progressive erythrokeratoderma，PSEK)及变异性残毁性掌跖角化症(Vohwinkel syndrome，VS)等。LOR、INV、FLG表达异常可导致AD、银屑病等皮肤疾病的发生。

本发明所述组合物可通过上调FLG﹑LOR两种基因的表达，促进皮肤屏障中CE的形成，达到修复皮肤屏障的作用。

AQP是一类能快速转运水的膜整合蛋白，AQP由保守的三个跨膜结构域和NPA基序串联重复组成。皮肤中主要表达AQP3，其主要存在于皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中。AQP3可运输水和甘油，其在保持表皮水合作用方面发挥重要作用，可影响皮肤水合状态及皮肤弹性，同时也参与细胞迁移、增殖、分化、脂质代谢和屏障形成﹑屏障损伤修复。

本发明所述组合物可通过上调AQP 3基因的表达，促进皮肤水合、提升皮肤角质层屏障等生理功能，达到修复皮肤屏障的作用。

Caspase是一组半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，均为半胱氨酸蛋白酶类，并且都具有特异性天冬氨酸酶切位点，故又称为Caspase蛋白酶家族。皮肤主要表达的CASP14具有组织特异性，主要参与细胞终末分化，形成完整角质层，最终维持表皮稳态平衡，发挥皮肤屏障的作用。

本发明所述组合物可通过上调CASP14基因表达，促进丝聚蛋白水解成天然保湿因子，维持表皮的稳态平衡，达到修复皮肤屏障的作用。

皮肤屏障主要包括微生物屏障、角质层屏障、免疫屏障、神经屏障和色素屏障等。皮肤屏障一方面可保护皮肤不被外界不利因素入侵，另一方面可防止皮肤和机体内的水分、营养成分和电解质等物质的流失，帮助维持机体内环境的相对稳定。皮肤屏障功能的损伤主要表现在角质层含水量减少、TEWL升高、pH值改变、皮肤脂质含量和成分异常，以及结构的改变。其中TEWL的升高是角质层屏障损伤的最重要检测指标。

本发明所述组合物可通过降低损伤后TEWL，达到修复皮肤屏障的作用。

优选地，所述黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物的质量比为3-5:2-4:2-4。

优选地，所述组合物还包括丁二醇和水，具体包括以下质量百分比含量的各组分：黄芩根提取物含3-5％，苦参根提取物2-4％，胀果甘草根提取物2-4％，丁二醇30-40％，水47-63％。

本发明通过前期试验发现，由于黄芩根提取物、胀果甘草根提取物为醇溶性物质，在水中溶解性不好，所以当黄芩根提取物用量超过5％，或胀果甘草根提取物超过4％时，组合物液体都不能保持长期稳定。

另外，本发明通过前期试验也发现，单个提取物、两两组合提取物对于上调LOR﹑FLG、CASP14基因表达的效果不如三种提取物的联合使用效果强。

优选地，所述黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物可从单个药材提取分离纯化得到，也可两两药材组合提取分离纯化得到，也可三种药材组合提取分离纯化得到。

优选地，所述组合物的制备方法包括以下步骤：

S1、取胀果甘草根提取物加水分散，加热至70-90℃，搅拌溶解30min-1h，然后降温至40-60℃，得甘草提取液；

S2、于步骤S1中的甘草提取液中加入丁二醇，然后加入苦参根提取物，黄芩根提取物，40-60℃搅拌溶解30min-2h，得组合物粗提取液；

S3、将步骤S2中的组合物粗提液进行脱色脱味，过滤，调节pH，再过滤，即得所述组合物的提取液。

优选地，步骤S3中，采用加入活性炭进行所述脱色脱味，调节所述pH至5.5-7.5。

上述制备方法也可以通过两两提取物组合，然后加入第三种提取物制备得到组合物液体，也可三种提取物同时加入制备得到组合物液体，三种方式制备得到的组合物实现效果一致。

本发明还提供了一种具有皮肤屏障基因修复功效的组合物，所述组合物包括以下质量比的各组分：黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物的质量比为3-5:2-4:2-4。

与现有技术相比，本发明填补现有技术中黄芩、苦参、甘草三种提取物的组合物在皮肤屏障相关基因修复中的空白，特别是与CE形成相关基因LOR、FLG和与丝聚蛋白降解相关基因CASP14，为后续与皮肤屏障相关的皮肤疾病治疗打下基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是刺激物与不同浓度组合物处理后的细胞形态图；

图2是组合物对屏障相关基因表达的差异图；

图3是组合物对皮肤屏障TEWL的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明中，以人皮肤来源的角质形成细胞(normal human epidermalkeratinocyte，NHEK)细胞为研究对象，先通过细胞毒性及形态学的分析，筛选出最大给药浓度，再运用实时荧光定量PCR技术(real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)，研究一种组合物作用NHEK细胞后，皮肤屏障相关基因在转录水平的表达变化，最终于人体皮肤上检测一种组合物对损伤后经表皮水分损失量(transepidermal water loss，TEWL)的影响，来探索一种组合物对NHEK细胞屏障相关基因修复及皮肤屏障修复、屏障修复等方面的作用。

实施例1

样品的制备：取胀果甘草根提取物3％，加55％的水分散，加热至80℃，搅拌溶解30min，降温至50℃，得甘草提取液；然后加入35％的丁二醇，苦参根提取物3％，黄芩根提取物含4％，50℃搅拌溶解30min，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

实施例2

样品的制备：取胀果甘草根提取物2％，加54％的水分散，加热至70℃，搅拌溶解60min，降温至40℃，得甘草提取液；然后加入35％的丁二醇，苦参根提取物4％，黄芩根提取物含5％，40℃搅拌溶解2h，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

实施例3

样品的制备：取胀果甘草根提取物4％，加56％的水分散，加热至90℃，搅拌溶解40min，降温至60℃，得甘草提取液；然后加入35％的丁二醇，苦参根提取物2％，黄芩根提取物含3％，60℃搅拌溶解60min，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

对比例1

样品的制备：取胀果甘草根提取物4％，加56％的水分散，加热至90℃，搅拌溶解40min，降温至60℃，得甘草提取液；然后加入35％的丁二醇，苦参根提取物5％，60℃搅拌溶解60min，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

对比例2

样品的制备：取苦参根提取物4％，黄芩根提取物5％，加入35％的丁二醇和56％的水，60℃搅拌溶解60min，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

对比例3

取胀果甘草根提取物4％，加56％的水分散，加热至90℃，搅拌溶解40min，降温至60℃，得甘草提取液；然后加入35％的丁二醇，黄芩根提取物5％，60℃搅拌溶解60min，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

对比例4

样品的制备：取苦参根提取物3％，黄芩根提取物4％，加入35％的丁二醇，60℃搅拌溶解60min，得组合物粗提取液；然后加入55％的水，胀果甘草根提取物3％，加热至90℃，搅拌溶解40min，降温至60℃，得组合物粗提取液；然后加入0.1％活性炭进行脱色脱味，调节pH至5.5-7.5，过滤，得组合物的提取液。

功效验证

步骤1：细胞培养

NHEK细胞使用完全培养基(DMEM，10％FBS，1％P/S)，在37℃的5％CO₂细胞培养箱培养，至90％汇合时，消化种板。

步骤2：角质形成细胞毒性实验

人NHEK细胞经胰酶消化后以每孔10000个细胞的量接种至96孔板，在37℃的5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。将实施例1-3和对比例1-4所获得的组合物按照表1配置成不同浓度的储存液，用培养基稀释10倍加入96孔板中，使其在细胞板中的最终浓度分别为4％、2％、1％、0.5％(P1-P4)。将细胞板继续于37℃的5％CO₂细胞培养箱中培养24h。为确保实验方法的有效性，设置阳性对照组(8％DMSO，PC)和阴性对照组(培养基，NT)。

表1.样品配制

样品编号	溶剂	储存液浓度，％	终浓度，％
				P1	培养基	40	4
P2	培养基	20	2
				P3	培养基	10	1
P4	培养基	5	0.5
				PC	培养基	80	8
NT	培养基	0	0

培养结束后，弃掉上清液，每孔加入200μl终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，37℃避光孵育4h后弃掉上清，每孔再加入150μl DMSO，室温振荡10min后于酶标仪490nm波长处读取OD值。以8％DMSO作为参照，定义样品孔为T，未处理孔为NT，以T与NT的比值(T/NT)，即NHEK细胞活性≥90％视为无细胞毒性，活性＜90％视为有细胞毒性。

细胞毒性的实验结果如表2所示，后续实验选取无细胞毒性以下的浓度点进行。

表2.MTT实验结果

由表2可知，实施例1、2、3对细胞活性的影响差别不大，而对比例2、4的细胞毒性较强，且其水溶性、稳定性也较差，因此后续实验中仅选择实施例1、3和对比例1、3进行验证。

步骤3：角质形成细胞形态学实验

NHEK细胞经胰酶消化后以每孔50000个细胞的量接种至12孔板，在37℃的5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。按照表1所述方法配制样品。刺激物SLS的最终浓度为95μg/ml，实施例1、3和对比例1、3制备的组合物的最终浓度为0.1％、0.2％和0.5％。加入样品的细胞板继续于37℃的5％CO₂细胞培养箱中培养24h。孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照，结果如图1所示。0.2％和0.1％的实施例1组合物处理细胞后，与刺激物SLS组相比，细胞形态无明显变化，而0.5％的组合物处理细胞，细胞形态明显变差。实施例3和对比例1、对比例3的结果与实施例1相似。结合之前MTT的检测结果，最终选取0.2％和0.1％的组合物浓度用于基因表达实验。

步骤4：角质形成细胞基因表达实验

NHEK细胞按上述方式接种至12孔板中，加入SLS和实施例1、3和对比例1、3制备的组合物处理24h。孵育结束后，弃掉上清液，利用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测定核酸浓度及完整性，再以500ng总RNA为模板，按照

RNA-to-CT^TM一步法试剂盒所提供的方法，于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上检测实时荧光值(CT)。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，根据相对定量法(2^-ΔΔCT)分别计算13个靶标基因的相对表达量。-ΔΔCT＝(CT_靶标基因-CT_GAPDH)_{组合物或刺激物}-(CT_靶标基因-CT_GAPDH)_溶剂

如图2所示，与阴性对照组相比，刺激物SLS处理组﹑实施例1组合物处理组(0.1％和0.2％)的基因表达存在一定的差异性，特别是与细胞增殖和分化相关的基因KRT10和KRT16，与角化包膜形成相关的基因LOR﹑FLG，和与皮肤含水量相关的基因CASP14﹑AQP3，在组合物的处理下，与刺激物SLS组相比，均具有显著差异性。

SLS处理细胞24h后，KRT10和KRT16基因的表达量分别下调至0.11和0.12，与阴性对照相比，具有显著差异(P<0.001)，说明SLS可下调细胞增殖及分化。而0.2％的实施例1组合物存在时，KRT10和KRT16基因的表达量可上升至0.32和0.23，与SLS组相比，也具有显著差异(P<0.05)。

SLS处理细胞24h后，LOR﹑FLG基因的表达量分别上调至5.04和3.47，与阴性对照相比，具有显著差异(P<0.01)，而INV﹑TGM1的表达量不太受影响，为1.01和1.04。而0.2％的实施例1组合物存在时，LOR﹑FLG基因的表达量可分别上升至7.45﹑3.69，与SLS组相比，也具有显著差异性(P<0.05)，而INV、TGM1基因的相对表达量为1.20、1.27，无显著性差异(P>0.05)，说明实施例1组合物有选择性的加速与角化包膜形成相关的蛋白LOR和FLG的基因修复，而不影响INV、TGM1的基因修复。

SLS处理细胞24h后，CASP14和AQP3基因的表达量分别受调控至6.81和0.08，与阴性对照相比，具有显著差异(P<0.01)，说明SLS可影响皮肤水合，进而影响皮肤屏障。而0.2％的实施例1组合物存在时，CASP14和AQP3基因的表达量可上升26.92和0.25，与SLS组相比，也具有显著差异(P<0.05)。

除上述8种与角质层屏障相关的基因外，我们还检测了另外5种与免疫屏障相关的基因，包括Toll样受体2(toll-like receptor 2，TLR2)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，IGF1R)和NF-kB转录因子RELA、白细胞介素-8(interleukin-8，IL8)、白细胞介素1α(interleukin-1α，IL1A)。结果如表3所述，SLS可下调TLR2的表达量，上调其他4种基因的表达量，从而诱导免疫屏障发生破坏，导致炎症的产生。而0.2％的实施例1组合物处理细胞后，除能显著上调TLR2的表达量至1.05(P<0.05)外，对其他4种基因并无显著的下调作用，反而使其表达量有一定上调，说明实施例1组合物并不能针对所有基因产生正向调控作用。组合物对皮肤屏障的正向作用取决于与皮肤屏障相关关键基因的调控力度和整体基因调控的平衡性。

表3.免疫屏障相关基因检测结果

角质形成细胞在从基底层向上移至角质层的过程中，细胞器和细胞核消失，细胞膜间发生广泛的交联形成不溶性的坚韧外膜——角化细胞套膜(CE)。同时，角质形成细胞合成多种脂类和与脂代谢相关的酶，通过板层小体将这些脂类和酶转运至颗粒层和角质层之间，与CE一起构成屏障功能的主要结构。LOR﹑INV﹑TGM1和FLG等是CE形成的重要结构蛋白。并且FLG可在CASP14的作用下被分解成游离的氨基酸形成天然保湿因子(NMFs)，调节皮肤水合功能。水通道蛋白(AQPs)是特异性转运水的蛋白家族，能显著增加细胞膜对水的通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外平衡的调节。研究表明AQP-3的甘油转运功能对皮肤的保湿、弹性及损伤后的屏障修复功能起着关键性的作用。

实施例1组合物通过对LOR、FLG、CAPS14、AQP3、KRT10和KRT16基因的调控，来发挥屏障基因修复的作用，特别是针对CE形成关键基因LOR、FLG和皮肤稳态调控关键基因CASP14，有非常显著的正向作用。

同样，我们也检测了实施例3和对比例1、对比例3对这3个关键基因的调控作用，结果如表4所示。实施例3组合物处理组与SLS组相比，这3个基因的相对表达倍数均显著上调(P<0.05)，结果与实施例1类似。而对比例1对这3个基因的调控基本无影响，与SLS组相比，其相对表达倍数反而有一定的下降，说明对比例1不能调控皮肤屏障相关关键基因。对比例3组合物也对这3个基因有一定的调控作用，但其效果明显弱于实施例1和实施例3。

表4.屏障相关关键基因检测结果

步骤5：皮肤屏障损伤修复实验

皮肤屏障功能的损伤主要表现在角质层含水量减少、TEWL升高、pH值改变、皮肤脂质含量和成分异常，以及结构的改变。其中TEWL对评估皮肤屏障功能是非常重要的，在国际上已经得到了广泛的认可。TEWL值越高，提示经皮肤散失的水分越多，角质层的屏障功能越差。

由基因表达实验可知，实施例组合物对屏障相关基因有显著的调控作用，如LOR、FLG、CASP14、AQP3、KRT10、KRT16、TLR2等，但并不是调控所有屏障相关基因的表达，如INV、TGM1、IL8、IL1A等。因此，我们选择实施例1组合物，继续于人体皮肤上验证基因调控与皮肤屏障修复的相关性，来阐述组合物对屏障的修复作用。

本实验筛选年龄21-45岁正常受试者14人，洗净前臂内侧皮肤，进入临床实验室，将加有受试物(CK为空白组、5％SLS为模型组,5％SLS+0.5％、1％、2％实施例1组合物为实施例组)的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地敷于皮肤上，持续24小时。封闭24小时后去除斑试器，洗净受试部位，待压痕消失(约30min)后观察皮肤反应(注意斑试部位的标记)。用TM300皮肤探头测试TEWL值，每个点测试三次取平均值。ΔTEWL＝TEWL_{模型组或实施例组}-TEWL_空白组

由图3可以得出，相对于空白组(CK)，模型组(5％SLS)的TEWL值提高，ΔTEWL为10.92，说明造模成功，SLS可损伤皮肤屏障。实施例组中，TEWL均呈现下降趋势，且具有剂量依赖性，2％的实施例1组合物可将TEWL降低至5.52(P<0.05)，最大减少率达到49.45％，说明本发明能有效降低TEWL流失，修复皮肤屏障。

由上所述，本发明所制备的组合物可调控角质形成细胞与皮肤屏障相关基因的表达，特别是与CE形成相关基因LOR、FLG和与丝聚蛋白降解相关基因CASP14，且具有一定的剂量依赖性。同时组合物对基因修复的效果，与人体临床效果关联性强，可发挥皮肤屏障损伤修复的作用。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种组合物在制备皮肤屏障基因修复制剂中的应用，其特征在于，所述组合物包括以下组分：黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用包括采用所述组合物调节角蛋白、丝聚蛋白、兜甲蛋白、内披蛋白、转谷氨酰胺酶、水通道蛋白、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14中的至少一种蛋白或酶的表达，达到修复皮肤屏障的作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述组合物上调兜甲蛋白、丝聚蛋白和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14的基因表达，达到修复皮肤屏障的作用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物通过上调兜甲蛋白和丝聚蛋白的基因表达，调控角质化包膜的形成；上调半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14的基因表达，促进丝聚蛋白水解成天然保湿因子，维持表皮的稳态平衡。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物的质量比为3-5:2-4:2-4。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括丁二醇和水，具体包括以下质量百分比含量的各组分：黄芩根提取物含3-5％，苦参根提取物2-4％，胀果甘草根提取物2-4％，丁二醇30-40％，水47-63％。

7.根据权利要求1-6所述的应用，其特征在于，所述黄芩根提取物、苦参根提取物、胀果甘草根提取物可从单个药材提取分离纯化得到，也可两两药材组合提取分离纯化得到，也可三种药材组合提取分离纯化得到。

8.根据权利要求1-6所述的应用，其特征在于，所述组合物的制备方法包括以下步骤：

S1、取胀果甘草根提取物加水分散，加热至70-90℃，搅拌溶解30min-1h，然后降温至40-60℃，得甘草提取液；

S2、于步骤S1中的甘草提取液中加入丁二醇，然后加入苦参根提取物，黄芩根提取物，40-60℃搅拌溶解30min-2h，得组合物粗提取液；

S3、将步骤S2中的组合物粗提液进行脱色脱味，过滤，调节pH，再过滤，即得所述组合物的提取液。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S3中，采用加入活性炭进行所述脱色脱味，调节所述pH至5.5-7.5。

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