CN110637026A - 光转换的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及光转换的多肽。具体而言，本发明涉及一种包含光响应元件的多肽，其中可以通过用特定波长的光照射该多肽而将该光响应元件的构型(即构型状态)在反式和顺式异构体之间转换，并且其中所述构型的转换改变了所述多肽的构象和与配体(例如目标分子)的结合活性。而且，本发明包括使用所述光转换多肽来分离和/或纯化目标分子。本发明还提供了包含本发明的光转换多肽的亲和基质、亲和色谱柱和亲和色谱设备。

Description

光转换的多肽及其用途

本发明涉及光转换的多肽。具体而言，本发明涉及一种包含光响应元件的多肽，其中可以通过用特定波长的光照射该多肽，将该光响应元件的构型(即构型状态)在反式和顺式异构体之间转换，并且其中所述构型的转换改变了所述多肽的构象和与配体(例如目标分子)的结合活性。同样，本发明包括使用所述光转换多肽来分离和/或纯化目标分子。本发明进一步提供了包含本发明的光转换多肽的亲和基质、亲和色谱柱和亲和色谱设备。

亲和色谱是一种高分辨率和高容量的分离方法，其对于分离和纯化蛋白质和其它生物分子已变得越来越重要。自从五十年前亲和色谱法问世以来(Cuatrecasas等人1968Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 61:636-643)，基于pH、离子强度或温度的传统纯化技术已在很多情况下被该技术取代。

如今，亲和色谱代表了可用于纯化生物活性化合物的最强大的技术之一。该方法也是用于研究多种生物学过程例如酶活性、激素起到的生理调节、蛋白质-蛋白质或细胞-细胞相互作用等的有价值的工具(Wilchek 2004Protein Sci.13:3066-3070)。亲和色谱的广泛适用性是基于两个分子之间的高度特异性、可逆性的生物学相互作用：亲和分子和目标分子(即目标分子或配体)。亲和分子附着在固体基质上，即所谓的固相或固定相(也称为亲和载体)。待纯化的目标分子存在于液相(也称为流动相)中(Hage2012J.Pharm.Biomed.Anal.69:93-105)。

通常情况下，亲和纯化包括3个步骤：(i)将液体粗样品与亲和载体一起孵育，以使样品中的目标分子(配体)与固定的亲和分子结合，(ii)从色谱基质上洗去未结合的样品成分，并(iii)通过改变缓冲液条件使亲和分子与配体的结合相互作用不再发生，从而从亲和载体上解离和回收目标靶分子(即洗脱)(Magdeldin&Moser 2012Affinitychromatography:Principles and applications,In:Affinity Chromatography,S.Magdeldin编辑,InTech,pp.1-28)。由于许多亲和分子具有高度选择性的结合功能，因此即使是在复杂生物样品中和/或以微量存在，该方法也可用于分离、检测或研究特定目标分子(Hage 2012J.Pharm.Biomed.Anal.69:93-105)。

具体而言，重组蛋白的纯化可以通过将目标靶蛋白与通常称为亲和标签的不同氨基酸序列融合来简化。该标签的范围可以从氨基酸的短序列到结构域甚至整个蛋白质(Terpe 2003Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-533)。此外，某些标签可增加蛋白质溶解度，从而提高产率并促进纯化。下表1显示了一些用于亲和色谱的常用标签的概述。

高度有用的亲和标签的一个例子是Strep-标签，它被开发为纯化和检测重组蛋白的通用工具。该亲和标签最初是从基因随机文库中选择的，是一种九氨基酸肽(AWRHPQFGG,SEQ ID NO:13)，该肽特异性地和可逆地与链霉亲和素结合(Schmidt&Skerra 1993ProteinEng.6:109-122)。因此，Strep-标签可用于有效纯化链霉亲和素亲和柱上的相应融合蛋白。在温和的缓冲液条件下以生物化学活性状态，通过与天然链霉亲和素配体(如D-生物素或D-脱硫生物素)竞争来洗脱结合的重组蛋白。Strep-标签可以在其cDNA或基因的亚克隆过程中直接融合到重组多肽上，并且其通常不干扰蛋白质功能、折叠或分泌。

多年来，对Strep-标签/链霉亲和素系统进行了系统优化，包括对链霉亲和素本身进行工程改造(产生了链霉亲和素突变体1，也称为“Strep-Tactin”)，并对链霉亲和素-肽复合物进行了X射线晶体学分析，发现了构象驱动的结合机制(Schmidt&Skerra1994J.Chromatogr.A 676:337-345；Schmidt&Skerra 1996J.Mol.Biol.255:753-766；Voss&Skerra1997Protein Eng.10:975-982.；Korndoerfer&Skerra 2002Protein Sci.11:883-893；Schmidt&Skerra 2007Nat.Protoc.2:1528-1535)。结果，Strep-标签或其改良版Strep-标签II为生物制药开发、工业生物技术和蛋白质/蛋白质组研究中的多种基因产物的平行分离和功能分析提供了可靠工具。

最重要地是，Strep-标签配体与链霉亲和素亲和分子之间的充分表征的相互作用，可以一步纯化带标签的目标蛋白，这使得这种亲和色谱成为一种卓越的纯化技术。与常规色谱程序例如凝胶过滤或离子交换色谱法不同，亲和色谱法能够一次性地选择性分离一个目标分子，而那些常规方法通常会富集具有相似生物物理特征(大小、形状、电荷、疏水性等)的分子(Bruemmer 1979J.Solid-Phase Biochem.4:171-187)。

但是，本领域已知的亲和色谱方法也有缺点。在使目标分子牢固结合的条件下将样品加载到亲和柱上，并随后耗尽宿主细胞成分后，需要在最后一步使用洗脱缓冲液从亲和基质/载体上解离目标分子(配体)。该洗脱步骤通常认为是亲和色谱方案中最精密的步骤，理想情况下应以保持亲和基质完整、允许该色谱柱再生和多次使用的方式进行(Firer2001J.Biochem.Biophys.Methods 49:433-442)。虽然目标分子与亲和分子的结合是在模拟天然环境的pH和离子强度的条件下发生，但该洗脱步骤通常需要剧烈改变流动相，例如通过剧烈改变pH、极性或离子强度(Hage 2012J.Pharm.Biomed.Anal.69:93-105)。

或者，可以将竞争剂添加到流动相中，以置换与固定在色谱柱上的亲和分子结合的靶分子(Hage 2012J.Pharm.Biomed.Anal.69:93-105)，例如在Strep-标签情况下使用D-脱硫生物素(Schmidt&Skerra 2007Nat.Protoc.2:1528-1535)或在His(6)-标签情况下的使用咪唑(Skerra等人，1991Biotechnology(N Y)9:273-278)。显然，使用这样的小分子作为洗脱的竞争剂会导致包含该纯化的目标分子的溶液受到污染。因此，如果与后续实验或应用不兼容，那么这些试剂必须在耗时的额外纯化步骤中除去，例如通过透析或凝胶过滤。另一方面，非特异性的洗脱条件通常对目标分子有害，如改变的pH值、盐的高浓度、有机助溶剂、去污剂、金属离子、螯合剂或还原剂。特别地，如果目标分子是蛋白质，那么这种洗脱条件可导致变性、聚集或化学修饰，例如脱酰胺，从而阻碍了功能活性。

此外，洗脱目标分子后，必须在下一轮样品加样之前以耗时的操作将亲和柱再生。对于Strep-标签亲和色谱，该步骤涉及用HABA(4'-羟基偶氮苯-2-甲酸)洗涤色谱柱，以从固定的亲和分子(例如链霉亲和素或其突变体)中有效地去除竞争剂D-脱硫生物素，然后通过用缓冲液充分洗涤来清除HABA。

因此，本发明所面对的技术问题是提供允许快速分离和/或纯化目标分子的手段和方法，其中减少了洗脱的目标分子中的污染和生化修饰。

通过提供如本文所定义的以及如权利要求中所表征的实施方案来解决该技术问题。

因此，本发明涉及包含光响应性元件(例如，光响应性基团或光响应性氨基酸侧链)的多肽，其中可以通过用特定波长的光对所述多肽进行照射来转换光响应性元件的构型，并且其中所述构型的转换改变了多肽与配体的结合活性。

因此，本发明提供了包含光响应元件的多肽，其在本文中也被称为“光转换多肽(light-switchable polypeptide)”。与常规的纯化方法相比，这种光转换多肽为快速且经济的分离和纯化方法铺平了道路，对所洗脱的目标分子的污染更少。

具体而言，本发明的光转换多肽(亲和多肽)可以包含在亲和色谱柱的基质中。在基态(在黑暗中)或如果用特定波长的光(例如约400至530nm，例如400至500nm的可见光)照射本发明的光转换多肽，则该光转换多肽具有与配体例如目标分子有结合活性的构型(在一个实施方案中，通过结合与目标分子融合的亲和标签)。如果光响应元件具有这种构型，则光转换多肽从混合物(例如细胞提取物或培养物上清液或其它种类的混合物)中特异性地捕获目标分子(例如重组蛋白)。随后，可以例如用缓冲溶液洗涤色谱柱去除混合物中不需要的组分(例如细胞提取物或培养物上清液中的不需要的生物分子)。为了随后洗脱目标分子，仅用特定(不同)波长的光(例如，用波长为300至390nm的紫外(UV)光)照射所述光转换多肽。因此，光转换多肽转换为不具有与目标分子结合活性的构象。因此，可以用任何所需的缓冲液或溶液洗脱目标分子，并且所洗脱的目标分子不会被任何攻击性的化学物质污染。

因此，本文提供的光转换多肽具有以下优点：通过用特定波长的光照射所述光转换多肽，目标分子与光转换多肽(例如在亲和色谱柱的基质内)的结合以及目标分子的洗脱可以容易且廉价地实现。另外，所述光转换多肽能够实现在生理学纯化条件下进行亲和色谱方法，其中不需要专门的洗脱缓冲液。因此，使用本文提供的光转换(亲和)多肽允许纯化目标生物活性重组蛋白。因此，本文提供的光转换多肽是可用于(例如在生理学纯化条件下)纯化目标蛋白的亲和多肽。另外，使用本发明的光转换多肽能够使目标分子进行清晰且易于控制的洗脱，并得到纯净的样品，而不会受到小分子或溶剂的污染。特别是如果将目标分子用于治疗目的，避免污染是非常重要的。特别地，减少包含所洗脱的治疗分子的溶液中的污染物可以提高耐受性并避免治疗分子的副作用。而且，污染物会干扰基础研究中目标生物分子的许多分析或检测。此外，用本文提供的光转换多肽官能化的亲和色谱柱具有短的再生时间，这可以显著加快一种或几种靶分子的纯化。这对于目标分子的自动化的高通量分离和/或纯化，例如在筛选所需治疗性蛋白质中特别令人感兴趣。

因此，本文提供的手段和方法的优点是，例如：(a)在所需缓冲液中洗脱目标分子，适合于后续使用，而不受常规用于实现目标分子洗脱的试剂的污染；(b)快速和任选的自动化色谱循环；且(c)由于洗脱峰非常尖锐，因此洗脱流分中的目标分子浓度很高(因为本文提供的光转换多肽的光转换比亲和色谱柱通过液体流的常规再缓冲更有效且速度更快)。

本发明的光转换多肽的另一个优点是它没有共价或非共价结合的辅基(辅因子或辅酶)，例如在天然的光敏蛋白或光敏结构域中所发现的黄素单核苷酸(FMN)或视黄醛。

本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽(即，包含光响应元件的多肽)在分离和/或纯化目标分子中的用途。

术语“分离目标分子”和“纯化目标分子”及其语法变体在本文中可互换使用，是指减少除目标分子以外的分子数量。这些术语包括减少、最小化或除去目标分子以外的许多、大多数或所有物质。如下文更详细地描述，所述目标分子可以是任何分子。例如，所述目标分子可以选自肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，免疫球蛋白或其片段、酶、激素、细胞因子、复合物、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞、生物大分子、生物分子和小分子。本文中的术语“分离目标分子”和“纯化目标分子”包括将除了目标分子以外的细胞物质，例如细胞提取物或培养基的成分减少、最小化或去除。因此，术语“分离/纯化目标分子”还包括将目标分子与其自然环境的一种或多种组分(包括，例如其它蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、辅助因子、代谢产物等)分离。根据本发明，可以例如通过电泳(例如，琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)、色谱法(例如离子交换、尺寸排阻或反相HPLC)或其它方法(例如质谱、MS、酶联免疫吸附分析、ELISA、流式细胞术如FACS)将目标分子纯化至至少70％、更优选至少80％以及最优选至少90％的纯度。测定目标分子纯度的此类方法是本领域公知的。优选地，给定目标分子的分离/纯化是指使目标分子基本上纯净。

本文提供的光转换多肽可以是固相的一部分(即包含在其中)。例如，所述光转换多肽可以是亲和色谱系统的固相的一部分，并且目标分子可以是相应液相的一部分。

因此，本发明的另一方面涉及分离和/或纯化目标分子的方法，该方法包括以下步骤：

(i)使包含目标分子的液相与本发明的光转换多肽接触，

其中所述光转换多肽是固相的一部分(即包含在其中)，

且其中光响应元件处于第一构型，以使该多肽(即光转换多肽)对目标分子具有高亲和力；和

(ii)使用将光响应元件改变为第二构型的波长照射所述光转换多肽，使得该多肽(即光转换多肽)对目标分子具有与步骤(i)的亲和力相比降低的亲和力，并洗脱所述目标分子。

在上述方法的步骤(ii)中，优选在用光的特定波长照射光转换多肽的同时进行目标分子的洗脱。然而，由于光响应元件的缓慢弛豫，步骤(ii)也可以以逐步的方式进行，也就是说，更具体地，可以在第一步中照射光转换多肽；目标分子的洗脱可以在第二步骤中进行，例如在黑暗中。

在本发明的上下文中，已经设计了已知的链霉亲和素突变蛋白(特别是Strep-Tactin)的光转换变体，并将其制备为重组蛋白。因此，本发明的光转换多肽可以是包含光响应元件的链霉亲和素或包含光响应元件的链霉亲和素的变体或突变蛋白。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中所述光转换多肽是包含光响应元件的链霉亲和素或包含光响应元件的链霉亲和素的变体或突变蛋白。

本文提供的光控的链霉亲和素突变蛋白也为使用其它基于蛋白质的亲和分子的光控色谱法铺平了道路。因此，在本发明的上下文中设想将光响应元件(例如光响应的氨基酸侧链)整合到能够结合限定的配体(目标分子，例如蛋白或免疫球蛋白)的其它蛋白中，例如蛋白A、蛋白G、蛋白L或抗-myc-标签抗体(例如抗体片段Fab 9E10)。因此，本发明的光转换多肽可以是选自以下的任何多肽：

(i)链霉亲和素或其变体或突变蛋白，其包含光响应元件；

(ii)蛋白A或其片段、变体或突变蛋白，其包含光响应元件；

(iii)蛋白G或其片段、变体或突变蛋白，其包含光响应元件；

(iv)蛋白L或其片段、变体或突变蛋白，其包含光响应元件；或

(v)抗-myc-标签抗体或其片段、变体或突变蛋白，其包含光响应元件。

链霉亲和素是阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)产生的一种胞外蛋白，它与D-生物素紧密结合。未加工的蛋白质由159个氨基酸组成，分子量约为16kDa。加工的蛋白质(即核心链霉亲和素)由约127个氨基酸组成。功能性链霉亲和素具有包含四个链霉亲和素亚基的四聚体结构。链霉亲和素对生物素的高亲和力是许多生物学和生物技术标记和结合实验的基础。实际上，K_d值为10^-14mol/l，链霉亲和素与生物素的结合代表了已知的最强的非共价亲和力之一(Green 1975Adv.Protein Chem.29:85-133)。术语"K_d"(也称为“K_D”)是指平衡解离常数(平衡结合常数的倒数)，并且根据本领域提供的定义在本文中使用。

Strep-标签和Strep-标签II是链霉亲和素的人工肽配体(Schmidt&Skerra1993Protein Eng.6:109-122)。Strep-标签和Strep-标签II与生物素竞争性地结合到链霉亲和素上。链霉亲和素及其变体和突变蛋白通常用于分离和/或纯化包含Strep-标签、Strep-标签II或生物素的分子。链霉亲和素的已知突变蛋白是Strep-Tactin。核心链霉亲和素和Strep-Tactin的氨基酸序列在本文中分别以SEQ ID NO：10和8提供。

蛋白G、蛋白A和蛋白L是结合免疫球蛋白的细菌蛋白，可用于分离和/或纯化免疫球蛋白或抗体。

蛋白A是一种42kDa的表面蛋白，最初在金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的细胞壁中发现。蛋白A具有结合免疫球蛋白(Ig)、包括抗体(例如单克隆抗体、MAb)及其片段的能力。蛋白A包含五个同源的Ig结合域，其各自都折叠成三螺旋束。这五个结构域中的每一个都能够结合来自许多哺乳动物物种的抗体，最著名的是那些属于免疫球蛋白G(IgG)类的抗体。为了亲和纯化的目的，通常使用包含蛋白质A的残基212至269(UniProt数据库条目P38507)的重组片段。该片段包含蛋白质A的结构域B或由其组成。更具体地，蛋白A结合到大多数免疫球蛋白的F_c区域内以及Fab区域内的重链，特别是在人VH3家族的情况下。为了提高结构域B对使用羟胺对融合蛋白进行位点特异性化学切割的耐受性，通过定点诱变将Asn-Gly二肽残基28-29改变为Asn-Ala，得到所谓工程化的Z结构域(Hober2008J.Chromatogr.B 848:40-47)。与色谱载体偶联的蛋白A的Z结构域可用于抗体的亲和纯化。蛋白质A的结构域Z的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：16提供。该序列内的适合于掺入光响应元件例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的氨基酸位置是SEQ ID NO:16的Phe5、Gln9、Phe13、Tyr14、Glu25、Gln26、Arg27、Asn28、Ala29、Phe30、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36、Asp37、Gln40、Asn43、Leu45、Glu47、Leu51和/或Asn52(在UniProt数据库条目P38507中分别对应于位置216、220、224、225、236、237、238、239、240、241、242、243、246、247、248、251、254、256、258、262和263)。可以在这些氨基酸位置中的一处或多处将光响应元件掺入蛋白A中。Ala29对应于蛋白A的野生型B结构域中的Gly29。

因此，如果本文提供的光转换多肽是包含光响应元件的蛋白A(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或其片段，特别是包含Z结构域)，那么优选的目标分子(配体)是抗体或其片段，更优选IgG(例如人IgG，例如人IgG1、IgG2或IgG4；或鼠IgG，例如鼠IgG2a、IgG2或IgG3)或其片段。在这种情况下，目标分子(配体)也可以是人IgG3或鼠IgG1；或其片段。因此，如果本文提供的光转换多肽是包含光响应元件的蛋白A(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或其片段，优选包含Z结构域的片段)，则目标分子(配体)优选为抗体或其片段，更优选为IgG(例如人IgG，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或鼠IgG，例如鼠IgG1、IgG2a、IgG2或IgG3)或其片段。就这一点而言，如果目标分子是IgG抗体的片段，则该片段优选包含Fc区和/或Fab区。同样在这方面，如果目标分子是属于人VH3家族的抗体的片段，则其优选包含Fab区。

蛋白G是在G Streptococi组中发现的另一种免疫球蛋白结合蛋白。它由三个Fc结合结构域(C1、C2和C3)以及白蛋白结合部分组成，并与抗体结合，特别是与IgG的Fc区结合(Cao 2013Biotechnol.Lett.35:1441-1447)，也结合Fab片段。天然的蛋白G也结合白蛋白，但是由于血清白蛋白是抗体来源的主要污染物，因此白蛋白结合位点已从几种重组形式的蛋白G中去除。蛋白G的结构域C1、C2和C3的氨基酸序列在本文中分别提供为SEQ ID NO：17、18和19。SEQ ID NO：17、18和19的序列分别对应于UniProt数据库条目P19909中的位置223-357、373-427和443-497。每个结构域C1、C2和C3的序列中适合掺入光响应元件例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的氨基酸位置是SEQ ID NO：18的Lys3、Val5或Ile5、Thr10、Thr16、Val28或Ala28、Tyr32和/或Asp35(分别对应于UniProt数据库条目P19909中的位置375、377、382、388、400、404和407)。可以在这些氨基酸位置中的一个或多个处将光响应元件掺入蛋白G中。

因此，如果本文提供的光转换多肽是包含光响应元件的蛋白G(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或其片段)，那么目标分子优选是抗体或其片段，例如Fc的Fab，更优选IgG或其片段。就这一点而言，如果目标分子是IgG抗体的片段，则该片段优选包含Fc和/或Fab区。

蛋白L在大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的表面表达，并发现与免疫球蛋白轻链结合。全长的蛋白L由719个氨基酸组成。蛋白L的基因编码五个区域：具有18个氨基酸的信号序列；具有79个残基的氨基末端区域“A”；五个同源的各自具有72-76个氨基酸的“B”重复序列；各自具有两个另外的52个氨基酸的“C”重复序列的羧基末端区域；亲水、富含脯氨酸的推定的细胞壁-跨越区域“W”；疏水的膜锚定点“M”。B重复区(36kDa)负责与Ig轻链的相互作用。用于抗体纯化的蛋白L的片段表示为结构域B1，包含78个氨基酸残基(Wikstroem 1995J.Mol.Biol.250:128–133)。结构域B1的78个氨基酸对应于UniProt数据库条目Q51918中的位置324-389。由于免疫球蛋白重链的任何部分均未参与结合相互作用，因此蛋白L与蛋白A或G相比结合的抗体种类范围更大，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD及其亚类。蛋白L还结合抗体的单链可变片段(scFv)和Fab片段。特别地，蛋白L与含有κ轻链的抗体结合。蛋白L的结构域B1的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：20提供。结构域B1的序列内适合于掺入光响应性元件例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的氨基酸位置是SEQ ID NO：20的Thr5、Asn9、Ile11、Phe12、Lys16、Phe26、Lys32、Ala35、Glu43和/或Tyr47(分别对应于UniProt数据库条目Q51918中的位置330、334、336、337、341、351、357、360、368和372)。其它位置是SEQ ID NO：20的Phe22、Leu39和/或Asn44(分别对应于UniProt数据库条目Q51918中的位置347、364和369)。结构域B1的序列中适合于掺入光响应元件例如4′-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3′-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的其它氨基酸位置是SEQID NO：20的Phe22、Leu39和/或Asn44(分别对应于UniProt数据库条目Q51918中的位置347、364和369)。在考虑蛋白L的结构域B1中引入光响应元件的这些位置中，例如引入4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸(Caf)时，Phe22、Ala35、Leu39、Glu43和Asn44不太优选。

可以在这些氨基酸位置中的一个或多个处将光响应元件引入蛋白L中。优选地，本文提供的光转换多肽包含了蛋白L的结构域B1(SEQ ID NO:20)，其中光响应元件(例如4'-羧基苯基偶氮苯基丙氨酸(Caf))是在SEQ ID NO：20的位置Phe12对应的位置引入。这样的光转换多肽还可以在SEQ ID NO：20的36位具有突变，并且在SEQ ID NO：20的40位具有其它突变。例如，可以将SEQ ID NO：20的Tyr36突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val。优选地，将SEQ ID NO：20的Tyr36突变为Asn。SEQ ID NO：20的Leu40可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。优选地，将SEQ ID NO：20的Leu40突变为Ser。

因此，如果本文提供的光转换多肽是蛋白L或其变体或突变蛋白或其片段或融合蛋白，则目标分子优选是抗体或其片段，更优选人或小鼠抗体或其片段，甚至更优选IgG，甚至更优选包含κ轻链的抗体或其片段(例如Fab或scFv)，甚至更优选包含人VκI、VκIII和/或VκIV轻链和/或小鼠VκI轻链的抗体或其片段。

如上所述，本文提供的光转换多肽可以是蛋白L的融合蛋白或其片段。例如，该融合蛋白可以包含密码子优化的蛋白L结构域B1(在本文中称为ProtL；SEQ ID NO:20)，其通过短的接头序列与人白蛋白结合结构域(ABD；SEQ ID NO:59)融合。这种蛋白L-ABD融合蛋白在本文中显示为SEQ ID NO:61(在本文中也称为ProtL-ABD)。优选地，该融合蛋白在SEQID NO：61的第13位点携带光响应元件，例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸，优选4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸(Caf)。这种融合蛋白还可在SEQ ID NO：61的第37位具有一个突变，和在SEQ ID NO：61的41位具有其它突变。例如，SEQ ID NO：61的Tyr37可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val。优选地，将SEQ ID NO：61的Tyr37突变为Asn。SEQ ID NO：61的Leu41可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。优选地，将SEQ ID NO：61的Leu41突变为Ser。例如，本文提供的光转换多肽可包含SEQID NO：86的氨基酸序列或由其组成。

蛋白A、蛋白G和蛋白L或其片段或融合蛋白是抗体纯化的常用工具，因为它们与人类和动物的许多抗体的亚类结合，从而使通过生物技术产生的抗体被捕获在相应的亲和基质上(参见，例如，Nilsson等人1997Protein Expr.Purif.11:1-16)。但是，通过离液盐或低pH条件进行常规洗脱可能会导致目标蛋白质发生化学修饰或变性，从而影响功能。修饰蛋白A、蛋白G或蛋白L以显示出对抗体的光敏结合活性，并将其应用于亲和基质的产生将减少这种常规纯化技术的缺点。

抗-myc-标签抗体是本领域公知的。例如，抗-MYC抗体克隆9E10(DrMAB-150)是一种单克隆小鼠抗体，其选择性结合myc-标签，即与人c-MYC的C-末端区域中的一段氨基酸相对应的肽(SEQ ID NO：15)(Schiweck等人1997FEBS Lett.414:33-38)。因此，该抗体用于分离和/或纯化分子，特别是包含myc-标签的重组蛋白。所述9E10抗体的重组Fab片段可以很容易地在大肠杆菌(Escherichia coli)中生产。但是，当在亲和色谱中使用固定在固相载体上的常规抗-myc-标签抗体或其Fab或其变体或突变蛋白时，目标分子会通过低pH条件从亲和基质中洗脱下来，这可能会影响目标分子的性质。该缺点可以通过产生本发明的光转换的抗-myc-标签抗体(或抗-myc-标签抗体片段，如Fab 9E10)来克服。光转换抗-myc-标签抗体或抗-my-标签Fab片段与色谱基质的化学偶联有利地允许带有myc-标签的分子的光控洗脱。抗-MYC抗体克隆9E10及其Fab片段(Fab9E10)在例如Krauss,(2008Proteins 73:552-565)有描述。鼠IgG1/κ抗体9E10的成熟(没有信号序列)重链和轻链的氨基酸序列在本文中分别以SEQ ID NO：21和22提供。抗体9E10的Fab片段包含相同的轻链以及重链的氨基末端区域，即SEQ ID NO：21中的19-228位残基(任选地带有His₆-标签)。如果本发明的光转换多肽是光转换的抗-myc-标签抗体(或其变体，例如光转换的Fab 9E10)，那么优选将光响应元件引入到互补决定区(CDR)中的至少一个。9E10重链序列中适合掺入光响应元件例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的氨基酸位置是SEQ ID NO：21的Tyr76、Phe121、Tyr122、Tyr123、Tyr124、Tyr128和/或Tyr129。另一个位置是SEQ ID NO：21的Tyr130。可以在这些氨基酸位置的一个或多个处将光响应元件掺入9E10重链的序列中。

如上所述，本文提供的光转换多肽可以是包含光响应元件的链霉亲和素、包含光响应元件的蛋白A、包含光响应元件的蛋白G、包含光响应元件的蛋白L或包含光响应元件的抗-myc-标签抗体或Fab 9E10。但是，本文提供的光转换多肽也可以是上述任何多肽的“变体”(例如，片段)或“突变蛋白”或“融合蛋白”。在此，所提供多肽的变体或突变蛋白是该多肽的任何修饰形式(例如片段)，条件是该多肽仍是功能性的。优选地，这种光转换多肽的突变蛋白可在与带有光响应元件的位置不同的位置处包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代改变或增强光转换的构型对所述多肽的构象和与配体结合活性的影响。

例如，在SEQ ID NO：61的氨基酸13位处带有Caf作为光响应元件的蛋白L的光转换结构域B1中，SEQ ID NO：61的37位的Tyr向Asn突变和SEQ ID NO：61的41位的Leu向Ser突变增强了Caf的光转换构型对所述多肽与免疫球蛋白配体的构象和结合活性的影响。因此，本发明的光转换多肽可包含(除了光响应元件之外的)一个、两个或更多个(例如1至10、1至5，优选2个)其它突变，它们增强光对光转换多肽与配体(例如与目标分子)的结合活性。

例如，在基态(例如，在黑暗中或在具有约400至530nm波长的可见光下)下，所述光转换多肽可对目标分子具有一定的结合活性。用具有不同波长的光照射所述光转换多肽(例如，用波长为300至390nm的紫外光)可导致所述光转换多肽与所述目标分子的结合活性降低或提高(优选降低)。所述具有不同波长的光对光转换多肽的结合活性的影响可通过光转换多肽内的突变来增强。因此，本发明的光转换多肽还可包含除光响应元件外的增强所述光转换多肽可被光控制的程度的突变。

因此，本发明提供了一种鉴别突变的方法，所述突变增强了本发明的光转换多肽被光控制的程度，其中该方法包括：

(a)分析光转换多肽的三维(3D)结构或三级结构或构象(例如通过使用本领域已知的用于图形显示的计算机程序，例如PyMOL或Chimera；参见Jarasch 2016 ProteinEng.Des.Sel.29:263-270)；和

(b)选择光响应元件附近的氨基酸侧链(例如距离以内，优选以内，更优选以内)，其在空间上与对应于对配体具有高结合亲和力的光转换多肽的构象的光响应元件(例如Caf)的构型状态(例如反式构型)重叠(例如共享至少一对原子，所述原子的距离比它们的范德华半径总和更小)；和

(c)通过用另一种氨基酸替换与所选择的氨基酸侧链对应的氨基酸来制备突变的光转换多肽；并且

(d)分析在光响应元件的所有可能构型(例如，顺式和反式构型)中突变的光转换蛋白的结合活性。

在上述步骤(c)中，对应于所选氨基酸侧链的氨基酸优选地被下述氨基酸所取代：减少与光响应元件的空间重叠的氨基酸(例如，具有较小侧链的氨基酸)，或导致有利的相互作用的氨基酸(例如，产生一个或多个氢键、盐桥或范德华接触的氨基酸)。

例如，增强所述光转换多肽可被光控制的程度的突变可通过导致以下结果的突变来实现：

(i)与未突变的光转换多肽的相应结合活性相比，以结合构象(例如，在黑暗中或在具有约400至530 nm波长的可见光下)的突变的光转换多肽与配体的结合活性增加；

(ii)与未突变的光转换多肽的相应结合活性相比，以非结合构象(例如，在具有约300至390 nm波长的紫外光下)的突变的光转换多肽与配体的结合活性降低；或者

(iii)(i)和(ii)的组合。

因此，如上所述，可以通过在光响应元件附近(例如在优选更加优选距离)搜索与对应于光转换多肽的高亲和构象的光响应元件(例如Caf)的构型状态(例如反式构型)在空间上重叠的氨基酸侧链来鉴定本发明的光转换多肽内增强性的其它突变，例如通过使用本领域已知的用于图形显示的计算机程序(例如PyMOL或Chimera,参见：Jarasch等人2016Protein Eng.Des.Sel.29:263-270)。然后，在避免发生空间重叠(例如通过使用较小的侧链)或可能发生有利相互作用(例如一个或多个氢键、盐桥或范德华接触)的位置选择氨基酸替代。

如果可以通过用一种或多种特定波长的光照射多肽来转换其光响应元件的构型，并且如果所述构型的转换改变了多肽对配体(例如目标分子)的结合活性(优选亲和力)，则本文提供的光转换多肽是功能性的。给定多肽的变体或突变蛋白可以是其中一个至几个氨基酸被取代、添加或缺失的给定多肽，并且其中所述多肽仍有功能性。例如，给定多肽的变体或突变蛋白可以是具有与给定多肽至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或最优先至少99％的同一性的多肽，条件是所述变体或突变蛋白是功能性的。链霉亲和素的已知突变蛋白优选在本发明的上下文中使用的Strep-Tactin。

给定多肽的变体也可以是该多肽的片段，条件是该片段仍具有功能性。例如，抗-myc-标签抗体克隆9E10的变体是本文所述的Fab 9E10。

给定多肽的变体也可以是包含给定多肽和另一种蛋白质的融合蛋白。另一种蛋白质可以例如是标志物蛋白质，诸如绿色荧光蛋白质(GFP)、增强的GFP(eGFP)或黄色荧光蛋白质(YFP)。本文提供的光转换多肽的其它融合伴侣可以包含酶、增强溶解性的蛋白质、寡聚结构域或具有另一种结合功能的蛋白质，如ABD。给定多肽的变体也可以是包含给定多肽和非蛋白质的化合物例如DNA的缀合物。

因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中所述光转换多肽包含以下部分或由以下组成：

(i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或

(iv)具有与(i)到(iii)中任何一个氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或最优先至少99％的同一性的氨基酸序列，

其中所述多肽包含光响应元件，其中所述光响应元件的构型可以通过用特定波长的光照射所述多肽来转换，并且其中所述构型的转换改变多肽对配体的结合活性(优选亲和力)。

本发明的另一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中所述光转换多肽包含以下部分或由以下组成：

(i)SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：20的第12位的残基被光响应元件取代；

(ii)SEQ ID NO:86的氨基酸序列；

(iii)SEQ ID NO:61的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：61的第13位的残基被光响应元件取代；或

(iv)具有与(i)到(iii)中任何一个氨基酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或最优先至少99％的同一性的氨基酸序列，

其中所述多肽包含光响应元件，其中所述光响应元件的构型可以通过用特定波长的光照射所述多肽来转换，并且其中所述构型的转换改变所述多肽与配体的结合活性。

如上文(i)中所定义的光转换多肽还可以在SEQ ID NO：20的位置36处和SEQ IDNO：20的位置40处具有突变。例如，SEQ ID NO：20的Tyr36可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val。优选地，将SEQ IDNO：20的Tyr36突变为Asn。SEQ ID NO：20的Leu40可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。优选地，将SEQ ID NO：20的Leu40突变为Ser。

如上文(iii)中所定义的光转换多肽还可以在SEQ ID NO：61的位置37处和SEQ IDNO：61的位置41处具有突变。例如，SEQ ID NO：61的Tyr37可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val。优选地，SEQ IDNO:61的Tyr37突变为Asn。SEQ ID NO:61的Leu41可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。优选地，SEQ ID NO:61的Leu41突变为Ser。例如，本文提供的光转换多肽可包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或由其组成。

(iv)中定义的光转换多肽，其与(i)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，在与SEQ ID NO：20的位置36同源(即对应)的位置处也可以具有突变，并且在与SEQ ID NO：20的位置40同源(即对应)的位置处也可以具有突变。例如，可以将与SEQ ID NO：20的位置36同源(即对应)的位置突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，优选Asn。与SEQ ID NO：20的位置40同源(即对应)的位置可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选Ser。

(iv)中定义的光转换多肽，其与(iii)的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，在与SEQ ID NO：61的位置37同源(即对应)的位置处也可以具有突变，在与SEQ ID NO：61的位置41同源(即对应)的位置处也可以具有突变。例如，可以将与SEQ ID NO：61的位置37同源(即对应)的位置突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Val，优选Asn。与SEQ IDNO：61的位置41同源(即对应)的位置可以突变为Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，优选Ser。

因此，本文提供的光转换多肽可包含融合蛋白或由其组成，该融合蛋白包含蛋白L的结构域B1和ABD，例如具有SEQ ID NO：86序列的氨基酸；或具有与SEQ ID NO：86至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并包含例如在与SEQ ID NO：86的位置13同源的位置上的光响应元件的氨基酸序列。但是，也如下所述，为了在亲和基质中应用，优选在没有ABD融合伴侣的情况下应用蛋白L的光转换结构域B1，特别是在避免白蛋白共纯化的情况下。因此，在一个优选的实施方案中，本文提供的光转换多肽包含蛋白L的结构域B1(例如具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列)或由其组成，其中残基12被光响应元件例如Caf替代；或具有与SEQ ID NO：20具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，其中将与SEQ ID NO：12的残基12同源的残基替换为光响应元件，例如Caf。

如上所述，还可以包括，本发明的光转换多肽是包含光响应元件的蛋白A(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)、包含光响应元件的蛋白G(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)、包含光响应元件的蛋白L(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)或包含光响应元件的抗-myc-标签抗体(或其变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)。蛋白A、蛋白G、蛋白L和抗-myc-标签抗体的氨基酸序列，以及这些序列中适合引入光响应元件(例如4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)的氨基酸序列如上下文中所提供。

在所附的实施例中，示例性地将光响应元件(即光响应性氨基酸侧链)引入链霉亲和素的突变蛋白中。因此，在本发明的一方面，所述光转换多肽包含以下或由以下组成：

(i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；或

(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在本发明的一个特定实例中，光转换多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由其组成。

在所附的实施例中，光响应元件(即光响应氨基酸侧链)也被引入到融合蛋白中，该融合蛋白包含与白蛋白结合结构域(ABD)融合的蛋白L的密码子优化域B1。因此，在本发明的一方面，所述光转换多肽包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或由其组成，其中SEQ IDNO：61的位置13处的残基被光响应元件(例如Caf)替代。这样的融合蛋白还可以在SEQ IDNO：61的位置37处具有突变(例如，从Tyr到Asn的突变)和在SEQ ID NO：61的位置41处具有突变(例如，从Leu到Ser的突变)。例如，本发明的光转换多肽可包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列或由其组成。

但是，本文提供的原理可以应用于在亲和色谱中用作亲和分子的任何蛋白质。下表1给出了常用标签和相应亲和分子的概述。根据本发明，其中描述的任何亲和分子可以被修饰以成为光可控的。例如，本发明还包括光转换的抗-HA抗体、抗-FLAG-标签抗体或抗-T7-标签抗体的产生和使用。

表1:亲和色谱的一些常用标签概述

本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中光响应元件的一种构型(即构型状态)向另一种构型(构型状态)的转换改变了多肽(即光转换多肽)的配体结合口袋或位点的构象或形状。在此，术语“改变构象”或其语法变化与术语“改变形状”或其语法变化同义地使用。具体而言，本文中配体结合口袋的构象变化是配体结合口袋或配体结合位点的形状变化。如本文所定义，配体结合口袋的每种可能的形状是配体结合口袋的“构象”。在此，不同构象之间的过渡是构象变化。

根据本发明，本文提供的光转换多肽的光响应元件的构型的转换改变了光转换多肽与配体的结合活性。或者，换句话说，光响应元件的构型决定本文提供的光转换多肽是否对其配体具有结合活性。设想光响应元件有助于光转换多肽的配体结合口袋或位点的形状。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中光响应元件在多肽的配体结合袋或位点中或附近。如果配体与本发明的光转换多肽结合，则光响应元件与所述配体的距离优选小于更优选小于甚至更优选小于甚至更优选小于并且最优选小于而且，光响应元件可参与配体与亲和分子(即与光转换多肽)的结合。

成熟的(无信号序列)野生型链霉亲和素(UniProt条目：P22629)的氨基酸序列中，Strep-Tactin的Trp108位置位于Strep-Tactin结合腔的底部。Trp108对应于前链霉亲和素中的位置132，所述前链霉亲和素包含具有氨基末端信号序列的全长链霉亲和素(SEQ IDNO:12)，并且Trp108对应于重组核心链霉亲和素(SEQ ID NO:10)中的位置96。重组核心链霉亲和素(包括其突变蛋白和变体(SEQ ID NO:2、4、8和10))不含信号序列，并在氨基末端和羧基末端被截短，任选地带有一个其它起始甲硫氨酸残基，如(Schmidt&Skerra1994J.Chromatogr.A 676:337-345)中所公开。在本发明的上下文中，令人惊讶地发现，在该位置处引入的光响应元件的构型状态的变化会影响Strep-Tactin对其配体(即Strep-标签或Strep-标签II)的亲和力。因此，该位置特别适合作为本发明的光转换多肽内的光响应元件的位置。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中光响应元件是

(i)在SEQ ID NO：2、4、8和10中任一个的氨基酸位置96处；

(ii)在SEQ ID NO：6和12中任何一个的氨基酸位置132处；

(iii)在分别具有与SEQ ID NO：2、4、8和10中任一个的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，或最优选至少99％的同一性的氨基酸序列中在SEQ ID NO:2、4、8或10的氨基酸位置96同源的氨基酸位置上；或者

(iv)在分别具有与SEQ ID NO：6和12中任一个的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，或最优选至少99％的同一性的氨基酸序列中在SEQ ID NO:6或12的氨基酸位置132同源的氨基酸位置上。

在本发明的上下文中，还发现如果在蛋白L的结构域B1中对应于SEQ ID NO：20的位置Phe12的位置处引入光响应元件，则对其配体的亲和力(例如免疫球蛋白或抗体)可以通过光照射来调节。更具体地，在本发明的上下文中，已经制备了包含蛋白L结构域B1和白蛋白结合结构域的融合蛋白，并且在SEQ ID NO:61的位置13相对应的位置将光响应元件引入了该融合蛋白中。所得蛋白L结构域B1融合蛋白对其配体的亲和力可以通过光照射来调节。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中光响应元件是

(i)在SEQ ID NO:20的位置12；

(ii)在SEQ ID NOs:61和86中任一个的位置13；

(iii)在分别具有与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，或最优选至少99％的同一性的氨基酸序列中在SEQ ID NO:20的氨基酸位置12同源的氨基酸位置上；或

(iv)在分别具有与SEQ ID NO：61和86中任一个的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，或最优选至少99％的同一性的氨基酸序列中在SEQ ID NO:61的氨基酸位置13同源的氨基酸位置上.

根据(i)的光转换多肽可在如上文所定义的SEQ ID NO：20的第36位具有突变(例如，从Tyr到Asn)，和/或如上文所定义在SEQ ID NO：20的第40位具有突变(例如，从Leu到Ser)；优选地，该光转换多肽具有这两个突变。根据(ii)的光转换多肽可在如上文所定义的SEQ ID NO：61的37位具有突变(例如，从Tyr到Asn)，和/或如上文所定义在SEQ ID NO：61的41位具有突变(例如，从Leu到Ser)；优选地，该光转换多肽具有这两个突变。在一个实施方案中，根据(iii)的光转换多肽在与如上文所定义的SEQ ID NO：20的位置36同源(即对应)的位置处具有突变(例如，从Tyr到Asn)，和/或如上文所定义与SEQ ID NO：20的位置40同源(即对应)的位置处具有突变(例如，从Leu到Ser)；优选地，该光转换多肽具有这两个突变。在另一个实施方案中，根据(iii)的光转换多肽在与如上所定义的SEQ ID NO：61的37位同源(即对应)的位置处具有突变(例如，从Tyr到Asn)，和/或如上文所定义与SEQ ID NO：61的位置41同源(即对应)的位置具有突变(例如，从Leu到Ser)；优选地，该光转换多肽具有这两个突变。

技术人员可以容易地评估具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、20或61的氨基酸序列的同一性的给定序列的特定氨基酸位置是否分别与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、20或61的氨基酸序列的氨基酸位置96、132、12或13同源(即对应)。例如，通过在给定序列与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、20或61的氨基酸序列之间进行序列比对，可以容易地鉴定出此类同源位置。比对的氨基酸序列通常表示为矩阵内的行。在这些行中，同源(即对应)的氨基酸彼此位于下方。将间隙插入残基之间，以便在连续的列中比对相同或相似的字符。存在多种计算算法，其可用于执行序列比对，以便鉴定与另一序列的氨基酸位置同源的氨基酸位置。例如，通过使用NCBI BLAST算法(Altschul等人1997Nucleic Acids Res.25:3389-3402)或CLUSTALW软件(Sievers&Higgins2014Methods Mol.Biol.1079:105–116.)可以进行序列比对。但是，序列也可以手动比对。

本发明的一个方面涉及本文提供的光转换的多肽、用途或方法，其中与包含第二个构型的光响应元件的多肽相比，包含第一个构型的光响应元件的多肽对配体具有更高的亲和力。优选地，包含光响应元件的第一构型的多肽对配体具有高亲和力，而包含光响应元件的第二构型的多肽对所述配体具有低亲和力。

术语“亲和力”是本领域公知的，是指一个分子与另一个分子的固有结合强度。或者，换句话说，亲和力是分子彼此缔合的趋势。具体而言，如果多肽能够在亲和色谱柱中保留至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，且最优选至少90％的目标分子，则该多肽对配体具有“高亲和力”。可以想到，如果亲和色谱柱用适当的缓冲液(如磷酸盐缓冲液(PBS)或tris缓冲液(TBS))洗涤时，对配体具有“高亲和力”的多肽甚至能够在亲和色谱柱中保留至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，且最优选至少90％的目标分子。

另一方面，如果通过使用适当的洗脱缓冲液(例如PBS或TBS)，从亲和色谱柱上洗脱至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，且最优选至少90％的目标分子，则本文的多肽对配体具有“低亲和力”。。

例如，本文的“高亲和力”包括解离常数(K_d)值＜10μM，优选≤1μM，更优选≤100nM，甚至更优选≤10nM，且最优选≤1nM的亲和力。另一方面，本文的“低亲和力”包括K_d值＞10μM，优选≥100μM，更优选≥1mM，甚至更优选≥10mM，且最优选≥100mM的亲和力。

因此，在本发明的上下文中，对配体具有“低亲和力”的多肽包括具有比对配体具有“高亲和力”的多肽的K_d值大≥10倍、优选≥100倍、更优选≥1000倍、且最优选≥10000倍的K_d值。或者，换句话说，本文中包含光响应元件的第二种构型的光转换多肽具有比包含光响应元件的第一种构型的光转换多肽K_d值大≥10倍、优选≥100倍、更优选≥1000倍、且最优选≥10000倍的K_d值的亲和力。

多肽与给定配体结合的K_d值可以通过众所周知的方法确定，包括但不限于荧光滴定、ELISA或竞争ELISA、量热法，例如等温滴定热法(ITC)、流式细胞仪滴定分析(FACS滴定)和表面等离子共振(BIAcore)。优选地，用ELISA测定多肽与给定配体结合的K_d值。这样的方法是本领域众所周知的，且如例如(De Jong 2005J.Chromatogr.B 829:1-25；Heinrich2010J.Immunol.Methods 352:13-22；Williams&Daviter(Eds.)2013Protein-LigandInteractions,Methods and Applications,Springer,New York,NY)中所述。

如所附实施例中所述，可以通过将光致异构化基团引入亲和分子(例如链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗-myc-标签抗体，或其变体、融合蛋白、突变蛋白或片段)中而获得光转换多肽。例如，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中所述光响应元件包含亲水性化合物或包含偶氮基团的分子部分。因此，本文提供的光转换多肽、用途或方法的光响应元件可包含偶氮基。术语“偶氮基”是本领域公知的，是指N＝N基团。根据本发明，光响应元件可以包括偶氮化合物。偶氮化合物是重氮(二亚胺)HN＝NH的任何衍生物，其中两个氢均被烃基取代，例如PhN＝NPh偶氮苯或二苯基二氮烯，其自身可以带有取代基。因此，本文的偶氮化合物是带有官能团R–N＝N–R′的任何化合物，其中R和R'可以是芳基或烷基。优选的是带有亲水或极性取代基例如-COOH、-SO₃H、-B(OH)₂、-CONH₂、-CONR”R”'、-NH₂、-NR”R”'的烃基，其中R”和R”'可以是芳基或烷基。

在本领域中已经描述了用光活性配体例如偶氮苯对蛋白质进行的化学修饰(Kramer等人2005Nat.Chem.Biol.1:360-365)。由于N＝N双键的立体化学顺/反异构化很容易被光源引发，偶氮苯的光致变色特性引起了人们的极大兴趣(Merino&Ribagorda2012Beilstein J.Org.Chem.8:1071-1090)。在基态上能量有利的反式-偶氮苯通过在300至390nm之间的波长照射而异构化为顺式异构体。当用400至530nm的光照射顺式异构体时(Merino&Ribagorda 2012Beilstein J.Org.Chem.8:1071-1090)或通过热弛豫的方式，该光反应是可逆的并且恢复反式异构体。

对于许多偶氮苯而言，两种类型的光化学转化(反式至顺式和顺式至反式)都在皮秒内发生，而顺式异构体向反式异构体(基态)的热弛豫要慢得多(在环境温度下为毫秒至数天，或如果在加热情况下更快)。偶氮苯的光诱导异构化导致其物理性质发生变化，特别是分子几何形状、偶极矩和光吸收(Henzl等人2006Angew.Chem.Int.Ed.Engl.45:603-606)。在偶氮苯及其衍生物中，该异构化过程涉及到偶氮基团两侧芳香环的两个对位碳原子之间的距离从反式形式的到顺式形式的的明显减少(Koshima等人2009J.Am.Chem.Soc.131:6890-6891)。

为了将偶氮苯部分生物合成地引入蛋白质中，在现有技术中产生了被称为AzoPhe的非天然氨基酸，并且已经描述了其通过琥珀抑制技术基因整合入重组蛋白质中(Bose等人2006J.Am.Chem.Soc.128:388-389)。但是，这种光响应氨基酸在水和培养基中的溶解度极差，这限制了其用于生物合成的目的。后来，还研究了基于四邻氟取代的偶氮苯的光可转换氨基酸(John等人2015Org.Lett.17:6258-6261)，但显示出较差的反式至顺式的光转换特性。

偶氮苯的其它衍生物是非天然氨基酸4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸(即4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸)和3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸(即4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸)。这些非天然氨基酸仍然具有可以用特定波长的光转换顺式和反式构型异构体的能力。另外，可以将这些人工氨基酸引入多肽中，从而产生光转换多肽。令人惊讶地，在本发明的上下文中，发现4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸和3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸在生理pH下在水和LB培养基中具有良好的溶解性，这构成了相当大的优势。此外，这些化合物的其它优点是它们具有生理结构(生化羧酸根部分代替氟原子)，从而降低了毒性和免疫原性的风险。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中光响应元件包括

(i)3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或其衍生物；或

(ii)4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或其衍生物。

3’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸和4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的式分别如本文图3和2中所示。

最优选地，本发明的光转换多肽的光响应元件包含4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸(缩写：Caf)。

如所附实施例所示，本发明的光转换多肽的结合特性的光诱导修饰可通过例如非天然(特别是非蛋白原性)光转换氨基酸的位点定向引入来实现。该非天然氨基酸具有光转换的侧链。或者，换句话说，可以通过用特定波长的光照射非天然氨基酸的侧链来改变其构型。这种构型变化有利地导致相应多肽(亲和分子)的构象和/或结合活性的变化。因此，根据本发明，光响应元件可以包含光转换的氨基酸侧链。例如，光响应元件可以包含非天然(即非蛋白原性)氨基酸或由其组成，其中可以通过施加(一个或多个)特定波长的光来转换非天然氨基酸的两个构型异构体。

具有非天然(即非蛋白原性)氨基酸的蛋白质的生物合成已经建立了多年，并为生物物理、结构和生化研究以及生物技术和生物制药应用的新型生物分子试剂开辟了道路(Wals&Ovaa 2014Front.Chem.2:15)。用于非天然(即非蛋白原性)氨基酸的位点特异性引入的通用方法利用了宿主细胞的遗传密码未积极使用的核酸密码子。因此，琥珀终止密码子(UAG)也受天然无义抑制机制的约束，已被采用为新氨基酸的其它编码三联体，以提供重组蛋白中的新侧链化学。最初是为使用合成氨酰基-tRNA的体外翻译系统开发，此通用方法已通过利用具有所需氨基酸底物特异性的人工氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)而用于活细胞中蛋白质的异源过表达(Young&Schultz 2010J.Biol.Chem.285:11039-11044)。重要地是，此类aaRS不得将任何内源性细胞tRNA氨酰化，而体内共过量表达的同源抑制因子tRNA不得通过任何内源性氨酰基tRNA合成酶被天然氨基酸氨酰化。换句话说，抑制物tRNA和外源或工程化的aaRS必须与所选宿主细胞中的内源对应物正交。

在来自詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii(Mj))的酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)及其同源tRNA^Tyr中发现了适用于在大肠杆菌(E.coli)中进行体内翻译的第一个有效的tRNA和aaRS正交对，其被突变为特异性识别和抑制琥珀终止密码子(Wang&Schultz2001Chem.Biol.8:883-890)。后来，通过基于第22种蛋白原性氨基酸L-吡咯赖氨酸(Pyl)的系统扩展了用于引入非天然氨基酸的工具箱，其通过吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)及其相关的天然抑制因子tRNA^Pyl的作用响应于琥珀终止密码子进行翻译(Fekner&Chan2011Curr.Opin.Chem.Biol.15:387-391)。该系统最初在产甲烷的古细菌巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri(Mb))和马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)中发现(James等人2001J.Biol.Chem.276:34252-34258)，且现在越来越多地用作遗传密码扩展工具(Wan等人，2014Biochem.Biophys.Acta 1844:1059-1070)。由于其对天然底物Pyl的选择性较低，PylRS(部分在蛋白质工程化后)已允许超过100种天然氨基酸的遗传掺入(Wan等人，2014Biochem.Biophys.Acta 1844:1059-1070)。

因此，存在用于实现具有非蛋白原性氨基酸的蛋白质的生物合成的几种完善的系统。如所附实施例中记录的，这些方法清楚地使得能够产生本文提供的光转换多肽。更具体地，可以通过将光可异构化的氨基酸引入蛋白质(例如链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗-myc标签抗体，或其变体、融合蛋白、突变蛋白或片段)中来制备本发明的光转换多肽，其进而在亲和色谱中用作亲和分子。

为了测试新设计的多肽是否显示出对配体的亲和力的光诱导变化(即，为了测试是否是本发明的光转换多肽)，可以进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。在这方面可以使用的ELISA在图7(A)中示例。更具体地，图7(A)显示了ELISA的示意图，其可用于检测配体(例如，包含合适的亲和标签的目标蛋白质)与给定多肽(亲和分子)之间的相互作用。这种ELISA设置原则上对应于亲和色谱法的简单形式。在图11中示例了在这方面可以优选使用的另一种ELISA。

具体而言，这种ELISA可以如下进行。平板(例如微量滴定板)可以用潜在的光转换多肽包被。随后，可以添加与潜在的光转换多肽的肽配体(例如亲和标签，例如Strep-标签或Strep-标签II)融合的报告酶(例如碱性磷酸酶)。然后，可以进行暴露于不具有或具有特定波长的光(例如具有300至390nm波长的紫外光)的洗涤步骤。然后，可以通过生色底物(例如磷酸对硝基苯基酯)的生物催化转化来检测剩余的结合酶，并例如在光度计中作为吸收量进行定量。

在该ELISA中，潜在的光转换多肽可被认为是本发明的光转换多肽：

(1)如果在将潜在的光转换多肽暴露于具有特定波长的光(例如波长为300至390nm的紫外光)后检测到残留酶活性的降低；且

(2)当潜在的光转换多肽暴露于具有不同的特定波长的光(例如具有约400至530nm、例如400至500nm波长的可见光)或保持在黑暗中，没有检测到残留酶活性的降低或只有较少的降低。

如上所述，本发明提供了包含光响应元件(例如3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)的多肽，其中光响应元件的构型转换改变了多肽与配体的结合活性。如本领域通常已知的，“异构体”是具有相同分子式或组成但不同结构的化合物。“立体异构体”仅在其组成原子的空间朝向上不同。因此，立体异构体要求在IUPAC名称中添加一个附加的命名前缀，以指示其空间方向。用来区分立体异构体的常用前缀是顺式(拉丁语，意思是“在这一侧”)和反式(拉丁语，意思是“交叉”)。更具体地，在有机化学中，“顺式”是指取代基在一对原子的同一侧，所述的一对原子通常是碳，但也有氮，例如在偶氮化合物的情况下，它们通过不可旋转的键连接，例如双键，而“反式”是指取代基(例如官能团)在所述原子对的相反侧。这样的异构状态通常被称为构型或构型异构体或状态。

对于某些化合物，尚不清楚哪个异构体应称为顺式和哪个反式。因此，国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)提出了定义此类立体异构体的明确规则体系。该体系基于一组在取代基上的组优先级规则(称为Cahn-Ingold-Prelog或CIP规则)，这些规则将Z(德语,“zusammen”为“一面”)或E(德语,“entgegen”为“反面”)来指定立体异构体。通常情况下，对于顺式-反式表示法适当的异构体，Z等于顺式，E等于反式。

根据本发明，光响应元件的异构体可以是反式异构体和顺式异构体。另外或可替代地，光响应元件的异构体可以是E异构体和Z异构体。因此，本文中，光响应元件构型的转换可以是从光响应元件的反式(或E)异构体到相应的顺式(或Z)异构体的转化，反之亦然。图3和2分别显示了3’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸和4’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式和反式异构体。

本发明的一个方面涉及本文提供的光转换的多肽、用途或方法，其中包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体的多肽与分别包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体的多肽相比，其与配体的亲和力增加。例如，包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体的多肽可能对配体具有“高亲和力”；并且包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体的多肽可能对同一配体具有“低亲和力”。上文定义了术语“高亲和力”和“低亲和力”。

但是，本发明的光转换多肽也可以以与反式异构体相比对配体具有更高亲和力的顺式异构体的方式构建。因此，本发明的一个实施方案涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体的多肽分别与包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体的多肽相比对配体的亲和力增加。在该实施方案中，包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体的多肽可对配体具有“高亲和力”；且包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体的多肽可能对同一配体具有“低亲和力”。如所提及，上文中给出了术语“高亲和力”和“低亲和力”的明确定义。

作为潜在的光转换多肽的实例，制备了光转换的链霉亲和素突变体并在所附的实施例中表征。在约400至530nm波长的可见光下，该光转换的链霉亲和素突变体的80-90％包含光响应元件的反式异构体(例如3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体)。在波长为300至390nm左右的紫外光下，示例性的光转换链霉亲和素突变体的80-90％包含光响应元件的顺式异构体(即3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体)。

通常情况下，可见光覆盖400至780nm的波长。这种光通常也称为日光。

所附的实施例表明，如果将本发明的光转换多肽用于亲和色谱方法，则目标分子的最高结合度和最高洗脱度分别发生在约430nm和约330nm处。因此，在本发明的背景中可以施加具有大约430nm(可见光)和330nm(紫外光)波长的光。然而，常规光源通常提供具有大约530nm(可见光)和365nm(紫外光)波长的光。因此，根据本发明还可以使用提供这些波长(即约530nm和/或约365nm)的光。

因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中在具有约400至530nm，例如400至500nm，优选405至470nm，更优选410至450nm，且最优选约430nm的可见光下，至少60％，优选至少70％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，且最优选至少95％的光转换多肽包含所述光响应元件的反式异构体。

本发明的另一方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中在具有300至390nm，优选310至370nm，甚至更优选320至350nm，且最优选约330nm的紫外光下，至少60％，优选至少70％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，且最优选至少95％的光转换多肽包含所述光响应元件的顺式异构体。如上所述，常规光源通常提供波长约为365nm的紫外光。因此，本发明的另一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中在具有约365nm的紫外光下，至少60％，优选至少70％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，且最优选至少95％的光转换多肽包含所述光响应元件的顺式异构体。

本领域技术人员已知光响应元件的异构化或构型转换的程度(例如比例、分数或产率)不仅取决于波长，而且取决于用于照射的光的强度。当应用常规光源例如LED或多个LED与组合电功率至少为0.1mW，优选至少为1mW，更优选至少为10mW，更优选至少为100mW，最优选至少1000mW照射1mL(湿)体积的载有光转换多肽(亲和分子)的亲和基质或色谱基质时，可达到根据本发明的有用的光强度，所述光源置于与基质小于1m，优选小于10cm，更优选小于2cm，且最优选小于1cm的距离处。对于较大体积的亲和基质或色谱基质，将按比例施加较大的电功率值。或者，可以使用提供与所述LED相似的光强度和波长的其它光源，例如(一个或多个)管状荧光灯。对于较大体积的亲和基质，也可以将光源放置在色谱柱的柱床内，例如使用光纤。

本发明的紫外光落入电磁辐射光谱的区域中，其通常被称为近紫外(UV)光。本发明的紫外光的波长基本上不被许多目标生物分子吸收，包括蛋白质、核酸和碳水化合物。因此，如果与使用例如具有较短波长和较高能量的远紫外光相比，所述紫外光可被认为是温和的，因为辐射损坏的风险较低。

如上所述，本发明的光转换多肽可用于分离和/或纯化目标分子，例如在亲和色谱过程中。因此，所述光转换多肽优选包含在固相中(例如固相载体或吸附在固相表面或溶胀的聚合物凝胶上)。

所述固相优选是亲水的。术语“固相”和“液相”是本领域公知的，分别指固体物质和液体物质。液相可以是任何溶液、溶液混合物或悬浮液。例如，液相可以包含细胞提取物或培养物上清液，任选地与缓冲溶液混合。根据本发明，固相可以是任何合适的载体。例如，固相可以是基质(例如，可能包含交联的有机或生物分子物质的聚合物)、水凝胶(通常是通过水性微环境中亲水性聚合物链的交联形成)、珠子、磁珠、芯片、玻璃表面、塑料表面、金表面、银表面或平板。所述基质、水凝胶、珠子、芯片、玻璃表面、塑料表面或平板优选是透光的。所述基质、水凝胶或珠子可以是亲和色谱柱的固相。所述基质可以是例如N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化的CH-琼脂糖凝胶。所述平板可以是微量滴定孔板。下表2中给出了适用于偶联本发明的光转换多肽的一些活化的色谱物质的概述。

表2：适用于偶联光转换多肽的一些活化的色谱物质的概述。

根据本发明，光转换多肽可以共价或非共价连接于固相。最优选将光转换多肽共价连接于固相。这具有的优点是，光转换多肽固定在固相上，因此不会与目标分子一起洗脱。因此，通过将光转换多肽共价连接于固相(例如亲和色谱基质)，避免了对洗脱的目标分子的污染。

然而，本发明还包括光转换多肽与固相的非共价结合。例如，光转换多肽可以是融合蛋白的一部分。所述融合蛋白的另一部分可以共价或非共价结合至固相(例如亲和色谱柱的基质)。

在本发明的一个实施方案中，所述载体共价或非共价连接到生物素、生物素化的蛋白质或分子和/或光转换多肽的肽配体(例如Step-标签)。在该实施方案中，光转换多肽可以通过与生物素、生物素化的蛋白质或分子和/或多肽的肽配体的非共价结合而与载体连接。在本发明的另一个实施方案中，载体与白蛋白共价或非共价连接于白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。在该实施方案中，可将光转换多肽通过和作为例如与ABD融合蛋白的一部分的HSA的非共价结合连接至载体。例如，如所附实施例所示，携带光响应元件的蛋白L的光转换结构域B1可以方便地作为与ABD的融合蛋白来生产，并在ELISA中测试其对免疫球蛋白的光可控亲和力。但是，为了在包含本文定义的光转换多肽的亲和基质中应用，携带光响应元件的蛋白L的光转换域B1优选在没有ABD融合伴侣的情况下应用，特别是在例如从细胞培养基中共纯化白蛋白的情况下避免使用。

本文提供的光转换多肽的优点在于，可以简单地通过用特定波长的光照射所述光转换多肽来控制其结合活性。因此，在本发明的背景中，希望所使用的固相(例如载体)是耐光的。优选地，载体至少在300nm至500nm，优选地330nm至450nm的波长范围内是耐光的。

光响应元件的构型的转换改变了光转换多肽与配体的结合活性。在本文中，“配体”可以是以其构型状态之一(例如，反式的基态)对本文提供的光转换多肽具有亲和力的任何分子。如果目标分子对光转换多肽本身具有亲和力，则配体可以是目标分子本身，即无需进一步修饰。例如，如果光转换的多肽是光转换的蛋白A、蛋白G或蛋白L(或其光转换的变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)，则免疫球蛋白、抗体或抗体片段可以是目标配体和分子。然而，如果目标分子对光转换多肽本身不具有亲和力，则配体优选是包含目标分子和亲和标签的融合分子。例如，如果光转换多肽是光转换的链霉亲和素或抗myc-标签抗体(或其光转换的变体、突变蛋白、融合蛋白或片段)，则配体优选为分别与Strep-标签/Strep-标签II或myc-标签融合的目标分子。

优选地，所述配体是生物分子配体，其包括选自以下的分子：肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段、免疫球蛋白或其片段、酶、激素、细胞因子、复合物、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞、生物大分子、生物分子和小分子。例如，配体可以是多肽、复合物、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞或小分子。如上所述，该配体也可以是包含上述分子中的任何一个(目标分子)和亲和标签(例如Strep-标签、Strep-标签II或myc-标签)的融合分子。最优选地，该配体是蛋白质或肽。如果光转换多肽是包含光响应元件的链霉亲和素(或其突变蛋白或变体，例如Strep-Tactin)，那么该配体可以是Strep-标签(即Strep-标签或Strep-标签II)或生物素，优选Strep-标签。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的光转换多肽、用途或方法，其中所述肽配体包含以下或由以下组成：

(i)SEQ ID NO:13的氨基酸序列[Strep-标签]；

(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸序列[Strep-标签II]；或

(iii)氨基酸序列，其具有与SEQ ID NO:13或14至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％，或最优选至少99％的同一性，且具有与链霉亲和素或其突变体或变体的亲和力。如上所述，广泛用于研究和工业中的链霉亲和素的已知突变体是Strep-Tactin。因此，在本发明的背景中，所述链霉亲和素突变体可以是具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质的四聚体。

如果所述光转换多肽是包含光响应元件的抗-myc-标签抗体(例如克隆9E10)或其片段、突变蛋白或其变体(例如Fab 9E10)，则配体可以是myc-标签。该myc-标签的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO：15。

如上所述，蛋白A和蛋白G结合至抗体的Fc区，特别是包括人和小鼠IgG的IgG以及来自其它物种的Ig的Fc区。蛋白L也可与Ig或抗体结合，例如包含κ轻链的抗体或其片段。因此，如果光转换多肽是包含光响应元件的蛋白质A或包含光响应元件的蛋白质G，则该配体优选是抗体或其片段，优选是IgG或其变体、突变蛋白或片段，其中所述变体、突变蛋白或片段包含IgG抗体的Fc区和/或IgG抗体的Fab区。如果所述光转换多肽是包含光响应元件的蛋白L，则所述配体优选为抗体(或其片段，例如Fab片段、Fv片段、scFv片段或单个结构域片段)，其包含κ轻链，例如人VκI、VκIII和/或VκIV轻链；和/或小鼠VκI轻链。因此，可以通过使用本发明的光转换的蛋白A、蛋白G或蛋白L来纯化各种不同的抗体。例如，除其它以外，可通过应用本文所述的手段和方法分离或纯化在Reichert 2017mAbs 9:167-181中描述的治疗性抗体。

根据本发明，术语“序列同一性％”或“同一性％”描述了与组成氨基酸序列总长度(或用于比较的其整体部分)的氨基酸残基数量相比时，两个或多个比对氨基酸序列的相同氨基酸的匹配数(“hits”)。通过将相同残基的数目除以用于比较的最长序列的残基总数并将结果乘以100，可以确定同一性百分比。换句话说，使用比对法，可以将两个或多个序列或子序列(在这些(子)序列比较和比对最大对应性时)在用于比较的序列窗口上或在使用本领域已知的序列比较算法或手动比对和目视检查时所测量的指定区域上测定相同的氨基酸残基百分比(例如80％同一性)。

本领域技术人员知道如何使用例如基于NCBI BLAST算法(Altschul1997NucleicAcids Res.25:3389-3402)、CLUSTALW计算机程序(Tompson 1994Nucleic Acids Res.22:4673-4680)或FASTA(Pearson 1988Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444-2448)的算法来确定序列之间的序列同一性百分比。根据本发明，优选地使用NCBI BLAST算法。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3和期望值(E)为10。因此，所有用NCBI BLAST或BLASTP程序所测定的具有序列同一性为至少80％，优选至少为85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％或最优选至少99％的同一性的(多)肽，都落入本发明的范围。

如上所述，本发明的一个实施方案涉及一种通过使用本文提供的光转换多肽来分离和/或纯化目标分子的方法。在该方法的步骤(i)中，目标分子与本发明的光转换多肽结合。因此，在该步骤中，光响应元件(例如3’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)是导致多肽对目标分子具有高结合亲和力的构型。这可以通过用特定波长的光照射所述光转换多肽来实现。例如，在本文提供的方法中，在步骤(i)之前和/或期间，可以用具有约400至530nm，例如400至500nm，优选405至470nm，更优选410至450nm，且最优选约430nm的可见光照射光转换多肽。

在目标分子与光转换多肽结合后，可以洗涤固相(例如亲和色谱基质)以从柱上除去未结合的物质。因此，在本发明的一方面，本文提供的方法还包括以下步骤：

(i’)用合适的缓冲液洗涤固相。

可以想到，在该洗涤步骤中，目标分子停留在柱内或与固相结合。因此，在该洗涤步骤期间，本文提供的光转换多肽的光响应元件优选地以导致该光转换多肽与目标分子的结合活性的构型。在本文提供的方法的步骤(i’)期间(即在洗涤步骤期间)，可以用具有约400至530nm，例如400至500nm，优选405nm至470nm，更加优选410nm至450nm，且最优选约430nm的可见光照射所述光转换多肽。

在所附实施例中生产的示例性的光转换的Strep-Tactin以光响应元件的反式构型，即反式3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或反式-4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸，具有与其配体的结合活性。对于这种光响应元件，反式构型是具有最有利(即最低)能量的状态。因此，即使在黑暗中或在波长大于500nm的照射下，这种示例性的光转换的Strep-Tactin也会与其配体结合。因此，如果本文提供的光转换多肽以最低能量的构象或构型结合其配体，则步骤(i)(例如，柱上样)和(i’)(例如，柱洗涤)也可以在黑暗中或在波长大于500nm的照射下进行。

为了洗脱目标分子，必须将光转换多肽转化为对目标分子具有较低结合活性的构象。当其光响应元件(即3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)是以顺式构型时，本文示例性设计的光转换Strep-Tactin具有低结合活性。该光响应性元件的顺式构型(即顺式-3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或顺式-4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)可以通过紫外光照射获得。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法，其中在步骤(ii)(即洗脱步骤)中，用300至390nm，优选310至370nm，更优选320-350nm，或最优选约330nm的紫外光照射光转换多肽。或者，在该步骤期间，可以用具有约365nm的紫外光照射所述光转换多肽。

但是，如果需要，也可使用波长比近紫外光更低的光，以将光响应元件的反式构型(例如，反式3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或反式4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)转变为顺式构型。因此，在本文提供的方法的步骤(ii)(即洗脱步骤)期间，还可以用小于300nm的波长，例如用波长在300-200nm的波长的光照射所述光转换多肽。然而，如上所述，在本发明的上下文中，优选使用具有300至390nm的波长的温和的紫外光。

在洗脱后，所述光转换多肽通常被转化回具有与配体结合活性的构象。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：

(iii)将所述光转换多肽再生为对目标分子具有亲和力的第一构象。

在该步骤(iii)期间，可以通过用约400至530nm，例如400至500nm，优选405至470nm，更优选地410至450nm，且最优选约430nm的可见光照射所述光转换多肽来再生光响应元件。同样，在步骤(iii)期间，固相可用适当的缓冲液例如PBS或TBS洗涤。

在本文提供的方法中，包含目标分子的液相可以是细胞提取物或培养物上清液。例如，细胞提取物可以是胞质提取物或全细胞提取物。在使包含目标分子的液相与光转换多肽接触之前，可以将所述液相透析或用缓冲液稀释。

根据本发明，可以通过使用本文提供的光转换多肽来分离(和/或分离或纯化)任何目标分子。优选地，目标分子是选自以下的分子：肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，免疫球蛋白或其片段、酶、激素、细胞因子、复合物、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞、生物大分子、生物分子和小分子。例如，目标分子可以是多肽、复合物、多核苷酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞或小分子。优选目标分子是天然(即天然/内源)蛋白质或重组产生的蛋白质。例如，目标分子可以是治疗性蛋白质。

特别优选的目标分子是抗体或抗体片段；例如如果本发明的光转换多肽是蛋白A、蛋白G或蛋白L的光转换形式时。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体片段可以是例如纳米抗体、Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、单个结构域抗体或分离的互补决定区(CDR)。优选地，所述抗体片段是Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段或单结构域抗体。抗体或抗体片段可以源自人或其它物种，例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、山羊、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、山羊、牛、马、骆驼、骆马或猴子。优先考虑所述抗体或抗体片段是人源化的或完全是人的。该抗体也可以是嵌合和/或双特异性抗体。该抗体可以是例如曲妥珠单抗。

在本文中，术语“多肽”、“肽”、“寡肽”和“蛋白质”可互换使用，并且涉及包含至少一个氨基酸链的分子，其中氨基酸残基通过肽(酰胺)键连接。本文中的术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”还包括具有修饰的分子，例如磷酸化、泛素化、类泛素化(sumolyation)、酰胺化、乙酰化、酰化、脂肪酸的共价连接(例如，C6-C18)、蛋白质例如白蛋白的连接、糖基化、生物素化、PEG化、添加乙酰氨基甲基(Acm)基团、ADP-核糖基化、烷基化、氨基甲酰化、羧乙基化、酯化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、药物或毒素的共价连接、标志物(例如荧光或放射性标志物)的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价结合、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、二硫键的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰基化、氧化、蛋白酶解加工、异戊烯化、外消旋化、硒酰化或硫酸化。

在本文中，术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”也包含“肽类似物”(也称为“肽拟似物”或“肽模拟物”)。肽类似物/肽拟似物复制生物活性肽的骨架结构和理化性质。通常，肽类似物在结构上与模板肽类似，即具有生物学或药理学活性并包含天然存在的氨基酸的肽，但具有一个或多个任选地被诸如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH₂SO-、-CH(OH)CH₂-、-COCH₂-等的键代替的肽键。此类肽类似物可以通过本领域众所周知的方法制备。

如本文所用，术语“氨基酸”或“残基”包括由核酸序列编码的天然存在的氨基酸以及其它氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸、非核酸序列编码的氨基酸、合成氨基酸、非蛋白质氨基酸等)的L-和D-异构体两者。天然氨基酸的例子是丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。天然存在的非遗传编码的氨基酸和合成氨基酸包括，例如硒代胱氨酸、3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸、4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸，2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸(Aib)、4-氨基丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸(Nie)、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、L-高精氨酸(Harg)、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2,4,-二氨基丁酸、对氨基苯丙氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸、2,3-二氨基丁酸等。其它非天然氨基酸是β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、3β-取代的丙氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸和N-甲基氨基酸。

根据本发明，术语“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且包括DNA，例如cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、通过限制性消化制备的DNA片段、例如通过自动DNA合成或通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增制备的合成DNA，以及RNA。应当理解，本文所用的术语“RNA”包括所有形式的RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、muRNA、病毒RNA、合成RNA等。术语“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”涵盖单链和双链核酸分子。还包括本领域已知的核酸模拟分子，例如DNA或RNA的合成或半合成衍生物以及混合的聚合物。根据本发明的此类核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、氨基磷酸酯核酸、2'-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)。

本文中，术语“小分子”是指分子量为2000道尔顿或以下，优选为900道尔顿或以下，更优选为500道尔顿或以下的任何分子。本文中，小分子可以是有机或无机的，优选有机的。进一步优选地是，小分子可以跨细胞膜扩散，从而可以到达细胞内的作用位点。另外，本文定义的小分子可以具有口服生物利用度。

术语“复合物”在生物化学领域是众所周知的，并且涉及由分子组成的实体，其中的组分保持其大部分化学特性。例如，典型的复合物是抗体/抗原复合物、受体/激素复合物、受体/细胞因子复合物、酶/底物复合物、金属/螯合物复合物、链霉亲和素/生物素复合物或Strep-Tactin/Strep-标签复合物。

根据本发明，如果目标分子是免疫球蛋白(即抗体)或其片段，则其可以简单地通过使用蛋白A、蛋白G或蛋白L的光转换形式进行分离和/或纯化。但是，也可以通过将目标分子与亲和标签融合来实现目标分子与光转换多肽的结合。例如，目标分子可以与Strep-标签、Strep-标签II和/或myc-标签融合。

本发明的另一方面涉及包含如本文所定义的光转换多肽的亲和基质。例如，本发明的亲和色谱基质可以通过将本文提供的光转换多肽与常规亲和色谱基质(例如NHS-活化的琼脂糖4B)偶联来制备。例如，每mL溶胀的凝胶可以应用0.1至50mg，优选0.5至40mg，更优选1至25mg，甚至更优选2.5至10mg，且最优选约5mg或约10mg的光转换多肽。常规亲和色谱基质的制备是本领域公知的，并且例如在Schmidt&Skerra 1994J.Chromatogr.A 676:337-345中所述。

本发明的另一方面涉及包含本发明的亲和基质的亲和色谱柱。在该亲和色谱柱中，基质可以包含在透光的管或容器中；和/或包含在含有至少一根光纤的管或容器中。因此，光可以穿过透光管或容器的壁或通过至少一根光纤来到达基质。透光的管或容器可以由玻璃或塑料制成。本发明的亲和色谱柱可以例如通过在玻璃毛细管(例如0.7mm内径)中装填色谱基质(例如20μL)的紫外线可透过的柱来制备，所述毛细管任选地在一端或两端配备有烧结玻璃或塑料基底。另外，本发明的亲和色谱柱可以通过将紫外线可透过的柱包装在较大的玻璃或塑料管中而制得，所述玻璃或塑料管具有例如5mm至50mm(例如7mm或约10mm或约25mm)的内径。

本文提供的包含本发明的光转换多肽的亲和色谱柱可以形成亲和色谱设备的一部分。因此，本发明的另一方面涉及一种亲和色谱设备，其包括(i)本发明的亲和色谱柱；

(ii)光源；

(iii)外壳；和

(iv)电子接口。

另外，所述亲和色谱设备包括在商业色谱系统中常见的元件，例如可控泵、管道、以及任选地包括UV检测器(或例如光散射检测器或折射率检测器)和流分收集器。

该亲和色谱设备可以被配置用于实验室规模或用于自动化高通量分离和/或纯化所需的目标分子。例如，这种自动化的高通量方法对于分离重组产生的生物药物候选物或治疗性蛋白质特别重要。而且，还包括出于研究或生物医学应用的目的而分离生物分子，特别是蛋白质、核酸、碳水化合物和活细胞。

本文提供的亲和色谱设备的光源使得能够用所需波长的光照射光转换多肽。例如，光源可以包括一个、两个或更多个发光二极管、一个或多个LED、一个或多个荧光灯管和/或一个或多个激光器，或由其组成。光源发出的光的波长可以电子化控制。在本发明的亲和色谱设备的上下文中涵盖由光源发射的光的波长是可转换的。例如，可以通过相同的或第二组LED、荧光管和/或激光器而容易地改变波长。

本发明的一个方面涉及本文提供的亲和色谱设备，其中由一个、两个或更多个光源发射的光的波长可从可见光(具有约400至530nm，例如400至500nm，优选405至470nm，更优选410至450nm，最优选约430nm)转换至紫外光(具有300至390nm，优选310至370nm，更优选320至350nm，且最优选约330nm；或可选地为约365nm)，反之亦然。

例如，本发明的亲和色谱方法可以如下进行。首先，可以用运行缓冲液例如PBS或TBS(100mM Tris–HCl pH 8.0,100mM NaCl)平衡该柱，一次在紫外线照射下(例如300至390nm，例如约365nm)(任选地，为了洗脱先前应用中残留的结合配体)，再一次在可见光(例如400至500nm或>500nm或日光照射以引发反式构型)下。然后，可以将包含目标分子的液相(例如细胞提取物或培养物上清液)施加到柱上，并且可以用运行缓冲液洗涤该柱。样品(即液相)的施加和洗涤步骤优选在可见光(例如400-500nm或＞500nm或日光，以引发反式构型)照射下进行。优选通过用紫外光(例如300至390nm，例如约365nm，以引发顺式构型)照射来引发所结合的目标分子的洗脱。为此，可以在施加紫外线的同时在一定时间段内(例如0到60分钟)停止缓冲液流动；然后可以用运行缓冲液洗脱目标分子。或者，可以在连续的紫外线照射下用运行缓冲液洗脱目标分子。

在本发明的另一方面，亲和色谱法可以如下进行。首先，可以用运行缓冲液(例如PBS或TBS)平衡该柱，在可见光(例如400至500nm或>500nm或日光)照射下一次(任选地，从先前的应用中洗脱剩余的结合配体)，在UV照射下(例如300至390nm，例如约365nm，以引发顺式构型)一次。然后，可以将包含目标分子(例如细胞提取物或培养物上清液)的液相施加到柱上，并且可以用运行缓冲液洗涤该柱。样品(即液相)的施加和洗涤步骤可以在用紫外光(例如300至390nm，例如约365nm)照射下进行。所结合目标分子的洗脱可以通过用可见光(例如400至500nm或>500nm或日光，以引发反式构型)照射来引发。为此，在施加可见光的同时，缓冲液流动可以停止一定的时间段(例如0至60分钟)；然后可以用运行缓冲液(在可见光或黑暗处)洗脱目标分子。或者，可用运行缓冲液洗脱目标分子。在这方面，洗脱可以在可见光连续照射下进行；或者洗脱可以在可见光照射下开始(以引发反式构型)，然后在黑暗中进行洗脱。

如本文上下文在所附实施例中所述，使用本文提供的用于亲和色谱的光转换多肽具有多种优点，因为它降低了成本和时间，同时提高了所分离的目标分子的纯度。

但是，本发明的光转换多肽也有其它应用领域。例如，所述光转换多肽可用于分析测试中，例如用于ELISA中，或与包被了光转换多肽的(顺)磁珠或塑料颗粒有关。另外，本发明的光转换多肽可用于表面等离子体共振(SPR)测定中，以测试目的化合物(例如新设计的药物)对其靶标的结合特性(或反之亦然)。因此，可以使用包含所述光转换多肽(例如在基质内)的SPR芯片。当使用紫外光使目的化合物和/或靶标解吸附时，这种SPR芯片可以使用多次，并且再生时间短。

本文引用的所有出版物，包括所有科学和专利文献，通过引用整体并入本文。

参考以下非限制性的附图和实施例进一步描述本发明。

附图说明：

图1：光控亲和色谱纯化蛋白质的原理。

亲和柱包含带有固定的光转换结合蛋白(亲和分子)的色谱基质。将蛋白质溶液(例如细胞提取物)加到色谱柱上，一旦目标蛋白质(例如带有亲和标签，例如Strep-标签II(Strep-tag II))与亲和基质结合，污染的蛋白质和生物分子(可能包括宿主细胞和/或任何类型的缓冲液成分)都被洗涤掉了。通过在365nm处用温和的紫外线照射，亲和基质中结合蛋白的构象会发生改变，失去对目标蛋白和/或亲和标签的结合活性，从而实现即时洗脱(在恒定缓冲液流动下)。为了随后色谱柱的再生，可施加>530nm的绿光，从而将亲和基质弛豫至基态。

图2：基于偶氮-苯的光转换的非天然氨基酸4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸,别名4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸的合成。

(A)通过Boc-或Fmoc-保护的中间体制备4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf；7)，也说明了由不同波长的光引发的从反式向顺式构型的可逆的异构化。(B)4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(7)在D₂O中的¹H-NMR光谱。(C)4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(7)在D₂O中的¹³C-NMR光谱。

图3：基于偶氮-苯的光转换的非天然氨基酸3’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸，别名4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸的合成

(A)制备4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)，也说明了由不同波长的光引发的从反式向顺式构型的可逆的异构化。(B)4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)在D₂O中的¹H-NMR光谱。(C)4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)在D₂O中的¹³C-NMR光谱。

图4：交替的在365nm(UV)和530nm(绿色)LED光照射循环导致的Caf的可逆光转换(异构化)。

(A)水中非天然氨基酸Caf的紫外光谱(实线：反式异构体；虚线：顺式异构体)。(B)历经3个循环的在约340nm处的吸光度变化(π→π*跃迁)可见的反式和顺式构型之间的可逆光转换。335nm处的高吸收表明反式构型，而335nm处的低吸收表明Caf的顺式构型，参见图(A)。(C-D)7的HPLC色谱图，照射前在λ＝286nm处的吸光度(C)、紫外光照射后(D)和绿光照射后(E)的吸光度。图(C)中的色谱图显示了基本上纯的反式异构体；图(D)中的色谱图显示主要为顺式异构体，反式异构体为次要种类。图(E)中的色谱图显示主要为反式异构体，而顺式异构体为次要种类。

图5：SAm1^Caf变体的结构和序列概述。

(A)链霉亲和素突变体1(SAm1,Strep-Tactin)和带有突出显示的残基V44、W108和W120(PDB条目1KL3)的Strep-标签II之间的复合物的晶体结构。研究了用Caf取代的所有位置在非天然氨基酸Caf的顺式构型中干扰Strep-标签II结合(降低亲和力)但在其(反式)基态下保持结合的潜力。在为引入Caf作为光响应元件而研究的这些位置中，V44和W120不太优选。(B)SAm1的核酸和氨基酸序列，突出显示Caf引入的位置(在琥珀终止密码子的翻译/抑制中)。

图6：SAm1^Caf108的表达、纯化和重折叠

(A)pSBX8.CafRS#30d53(SEQ ID NO:55)的质粒图谱。(B)在108位携带Caf的重组核心链霉亲和素突变体SAm1的纯化和重折叠。在制备重组蛋白期间，来自不同阶段的样品显示了用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE(15％)凝胶。泳道：1，诱导基因表达前的总大肠杆菌(E.coli)蛋白；2，诱导后12h的总细胞蛋白；3，包涵体复性和CEX纯化后的蛋白溶液；4，与3相同的样品，但是在SDS-PAGE之前没有热处理。在这些条件下，核心链霉亲和素四聚体保持完整(Bayer等人，1990Methods Enzymol.184:80-89)。因此，确认了重组突变体链霉亲和素在最终制备物中的正确折叠状态，而重折叠后(泳道4)仍然存在少量的单体(可能是非功能性的)链霉亲和素。泳道5显示与泳道4相同的样品，但浓度较低。

图7：在ELISA中PhoA/Strep-标签II融合蛋白与链霉亲和素突变体/变体(用光转换的氨基酸修饰)的可逆结合。

(A)ELISA设置，用于筛选响应于紫外线的对Strep-标签II肽具有可逆结合活性的链霉亲和素突变体。(B)从SAm1及其变体Caf44、Caf108、Caf120筛选纯化的PhoA/Strep-标签II的光诱导解吸附。所有测试的链霉亲和素突变体均对PhoA/Strep-标签II融合蛋白表现出良好的亲和力，从而产生与SAm1相当的可见光照射信号。相反，链霉亲和素变体SAm1^Caf108在365nm的紫外线照射后，观察到残留酶活性的明显降低。这表明在光诱导的将Caf转换为顺式构型后，链霉亲和素变体SAm1^Caf108对带有Strep-标签II的PhoA的亲和力降低。

图8：光诱导的PhoA/Strep-标签II从功能化的亲和基质中解吸附。

(A)在含有20μL琼脂糖和固定化SAm1^Caf108的色谱柱上观察到的流动曲线。如所指示用绿色LED光(530nm)或温和的紫外光(365nm)照射。(B)通过SDS-PAGE分析从SAm1^Caf108柱收集的每个流份(10μL)的样品。泳道：M，分子量标准；L，加载的样品；FT，流穿液；W，洗涤；E1-E3，洗脱流份。(C)来自SAm1柱的样品的15％SDS-PAGE。(D)通过PhoA酶测定法对收集的流份中的PhoA/Strep-标签II融合蛋白(加载样品、流穿液、洗涤、洗脱1-3)定量。与未修饰的链霉亲和素突变蛋白(SAm1)相反，包含SAm1^Caf108的亲和柱显示了结合的PhoA/Strep-标签II融合蛋白的光依赖性的洗脱。

图9：ProtL^Caf变体的结构和序列概述。

(A)曲妥珠单抗Fab片段和蛋白L的B1结构域之间的复合物的晶体结构，其带有Caf337以及突变残基Asn361和Ser365，显示为棒状(UniProt登录号Q51918；这对应于PDB条目4HKZ中的29、53和57位)。位置337适合于用Caf取代，目的是依靠光响应性的非天然氨基酸的顺式或反式构型实现对免疫球蛋白的不同亲和力。(B)ProtL^Caf-ABD融合蛋白的核酸和氨基酸序列，突出显示用于Caf引入的337位(以琥珀终止密码子的翻译/抑制)。与SEQ IDNO：20相比，添加甲硫氨酸(带下划线的)作为起始密码子。

图10：ProtL^Caf337-ABD融合蛋白的表达和纯化

用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE(15％)凝胶显示了重组蛋白制备过程中不同阶段的样品。泳道：1，诱导基因表达前的总大肠杆菌(E.coli)蛋白；2，诱导后12h的总细胞蛋白；3，全细胞提取物的不溶部分；4，全细胞提取物的可溶性上清液；5，从HSA亲和色谱中洗脱的流份；图6，CEX纯化后的ProtL^Caf337-ABD。

图11：ELISA中免疫球蛋白与ProtL^Caf-ABD融合蛋白(用光转换的氨基酸修饰)的可逆结合。

(A)用于筛选ProtL^Caf变体的图解ELISA设置，所述变体具有响应于紫外线的对免疫球蛋白的可逆结合活性。(B)从蛋白L结构域B1及其变体Caf337(二者都与ABD融合并吸附到HSA包被的微量滴定板上)上经光诱导解吸附的与碱性磷酸酶(AP)偶联的小鼠抗-6xHis抗体(免疫球蛋白)的示例性测定。在其基态中，所测试的Caf337变体尽管与未修饰的蛋白L结构域(左侧，空心圈)相比显示更低的信号，但仍显示对于所述IgG的高亲和力(右侧，空心圈)。相反，在用365nm的紫外光照射后，仅有ProtL^Caf337变体观察到结合的Ig-AP偶联物的剩余活性明显下降(实心圈)，表明Caf顺式异构体的光诱导的形成导致光转换的蛋白L结构域与免疫球蛋白(Ig)之间的特异性解离。

误差棒表示三次重复测量的标准偏差。对处于其基态的ProtL^Caf337的ELISA数据的曲线拟合(Voss&Skerra 1997Protein Eng 10：975-82)显示，与抗-6xHis抗体形成的复合物的解离常数约为140nM，对应于高亲和力。紫外线照射后观察到的信号强度太低，以至于无法推算解离常数，表明所述光转换多肽的亲和力大大降低(因此，这些数据以直线拟合)。

实施例举例说明了本发明。

实施例1：4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf)的合成

以前报道过4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf；7)(本文也称为4’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)的制备(Nakayama等人，2005Bioconjug.Chem.16：1360-1366)。但是，本文提供了如图2A所示的合成Caf的更方便的方法。将市售的Fmoc-或Boc-保护的4-氨基-L-苯丙氨酸(3和4)与4-亚硝基苯甲酸(2)反应，所述4-亚硝基苯甲酸(2)是从4-氨基苯甲酸(1)通过用臭氧(2KHSO₅+KHSO₄+K₂SO₄)氧化制备。所得重氮中间体5用哌啶脱保护，而可选的中间体6用HCl的二噁烷溶液脱保护，在这两种情况下都得到所需要的氨基酸7。

步骤1：合成4-亚硝基苯甲酸(2)

化合物2根据已出版的方法制备(Priewisch&Ruck-Braun 2005J.Org.Chem.70：2350-2352)。将4-氨基苯甲酸(15g,109mmol)悬浮在180ml二氯甲烷中。将在675ml H₂O中的臭氧溶液(134.5g,219mmol)加入，并将混合物在室温搅拌1.5小时。将沉淀滤出，用H₂O彻底清洗，空气中干燥，然后用P₂O₅干燥。获得4-亚硝基苯甲酸(2)，为黄色固体(16g,106mmol)，含有少量4-硝基苯甲酸，将其不经纯化而进一步使用。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝13.50(s,1H,COOH),8.29–8.22(m,2H,芳环),8.05–8.00(m,2H,芳环)。

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ＝166.19(CO),165.00(C芳环),136.53(C芳环),131.02(2x C芳环),120.62(2x C芳环)。

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内，10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝14.43min。

步骤2a：合成N-Fmoc-4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(5)

按照类似于已出版的方法(Priewisch&Ruck-Braun 2005J.Org.Chem.70：2350-2352)制备化合物5。将4-亚硝基苯甲酸(2)(3g,19.9mmol)在超声下悬浮在320ml DMSO/AcOH 1:1(v/v)中，随后加入Fmoc-Phe(4-NH₂)-OH(3)(4g,9.94mmol；Iris Biotech，Marktredwitz，德国)。将该混合物在室温下搅拌2天。然后加入700ml H₂O，并将所得沉淀过滤，用H₂O洗涤，空气中干燥，然后用P₂O₅干燥。得到所需产物5，为褐色固体，不经纯化而进一步使用。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝13.16(s,2H,2x COOH),8.17–8.13(m,2H,芳环),7.97–7.90(m,2H,芳环),7.88–7.81(m,5H,芳环,NH),7.68–7.58(m,2H,芳环),7.56–7.48(m,2H,芳环),7.42–7.33(m,2H,芳环),7.33–7.23(m,2H,芳环),4.30(ddd,J＝10.6,8.5,4.5Hz,1H,C^αH),4.25–4.19(m,2H,Fmoc-CH₂),4.19–4.12(m,1H,Fmoc-CH),3.23(dd,J＝13.9,4.4Hz,1H,C^βH),3.01(dd,J＝13.8,10.7Hz,1H,C^βH)。

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ＝173.14(CO),166.75(CO),155.99(CO),154.37(C芳环),150.69(C芳环),143.78(C芳环),143.73(C芳环),142.83(C芳环),140.71(C芳环),140.69(C芳环),132.71(C芳环),131.03(2xC芳环),130.66(2xC芳环),130.35(2xC芳环),127.61(2xC芳环),127.05(2xC芳环),122.79(2xC芳环),122.47(2xC芳环),120.09(2xC芳环),65.64(Fmoc-CH₂),55.19(C^α),46.61(Fmoc-CH),36.42(C^β)。

MS分析：计算值[M-H⁺]^-＝534.16706；实测值[M-H⁺]^-＝534.15320.

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝21.16min。

步骤2b：合成N-Boc-4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(6)

化合物6按照已出版的方法制备(Bose等人，2006J.Am.Chem.Soc.128：388-389)。Boc-Phe(4-NH₂)-OH(4)(1g,3.6mmol；Bachem,Bubendorf，瑞士)被溶于50ml AcOH中，在加入4-亚硝基苯甲酸(2)(0.8g,5.4mmol)后，将混合物搅拌24小时。减压除去溶剂，剩余物质溶于100ml 1M HCl(水溶液)和100ml乙酸乙酯。水相用50ml乙酸乙酯萃取。合并的有机相用盐水洗涤，用MgSO₄干燥。在蒸发溶剂后，得到6，为棕色固体(638mg,1.54mmol,43％)，其不经纯化而进一步使用。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ＝8.14(d,J＝8.3Hz,2H,芳环),7.94(d,J＝8.4Hz,2H,芳环),7.85(d,J＝7.9Hz,2H,芳环),7.49(d,J＝8.1Hz,2H,芳环),7.11(d,J＝8.4Hz,1H,NH),4.22–4.13(m,1H,C^αH),3.15(dd,J＝13.9,4.6Hz,1H,C^βH),2.95(dd,J＝13.8,10.2Hz,1H,C^βH),1.31(s,9H,C(CH₃)₃)。

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝18.33min。

步骤3a：合成4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(7)(Fmoc脱除)

将化合物5(5g,9,34mmol)溶于40ml DMF，然后逐滴加入10ml哌啶，将混合物在室温搅拌30分钟。加入450ml 0.5M NaHCO₃(水溶液)引起无色沉淀形成，其经过滤除去。将滤液通过加入6M HCl(水溶液)酸化为pH 1–2。滤出沉淀，在空气中干燥，然后用P₂O₅干燥。得到化合物7，为棕色固体(2.42g,7.72mmol,历经两个步骤为98％)，其不经进一步纯化而用于实施例3和6所述的生物物理和生物化学实验。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝7.86–7.80(m,2H,芳环),7.59–7.53(m,2H,芳环),7.53–7.47(m,2H,芳环),7.24–7.18(m,2H,芳环),3.42(dd,J＝7.5,5.6Hz,1H,C^αH),2.90(dd,J＝13.5,5.6Hz,1H,C^βH),2.73(dd,J＝13.4,7.6Hz,1H,C^βH)。

¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ＝181.94(CO),174.43(CO),153.16(C芳环),150.42(C芳环),142.79(C芳环),138.45(C芳环),130.23(2xC芳环),129.81(2x C芳环),122.55(2x C芳环),121.93(2x C芳环),57.28(C^α),40.80(C^β)。

MS分析：计算值[M-H⁺]^-＝312.09898；实测值[M-H⁺]^-＝312.09380.

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝10.7min。

步骤3b：合成4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(7)(Boc脱除)

将化合物6(638mg,1.5mmol)溶于20ml约2M HCl的二噁烷溶液中，室温下搅拌过夜。滤出沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥。得到化合物7，为棕色固体(236mg,0.67mmol,44％)，其不经进一步纯化而用于实施例3和6所述的生物物理和生物化学实验。分析数据与步骤3a所述的一致。

实施例2：合成4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)

4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)(本文也称为3’-羧基苯基偶氮苯丙氨酸)按照图3A所示的3个步骤合成。将Fmoc-保护的4-氨基苯丙氨酸(3)与3-亚硝基苯甲酸(9)反应，3-亚硝基苯甲酸(9)是从3-氨基苯甲酸(8)通过臭氧氧化制备。中间体10用哌啶脱保护，得到4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)。

步骤1：合成3-亚硝基苯甲酸(9)

化合物9按照已出版的方法制备(Priewisch&Ruck-Braun 2005J.Org.Chem.70：2350-2352)。将3-氨基苯甲酸(8)(5g,36.5mmol)悬浮于100ml DCM中。在加入臭氧(44.9g,73mmol)在400ml H₂O中的溶液后，将混合物在室温搅拌1小时。滤出沉淀，用H₂O彻底洗涤，用P₂O₅干燥。得到3-亚硝基苯甲酸(9)，为棕色固体(4.1g,27mmol,76％)，并含有少量3-硝基苯甲酸，其不经纯化而进一步使用。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝13.52(s,1H,COOH),8.41–8.35(m,1H,芳环),8.35–8.33(m,1H,芳环),8.19–8.11(m,1H,芳环),7.91–7.84(m,1H,芳环)。

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ＝166.08,165.19,136.26,132.45,130.47,124.25,120.98.

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝14.05min。

步骤2：合成N-Fmoc-4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(10)

按照类似于已出版的方法(Priewisch&Ruck-Braun 2005J.Org.Chem.70：2350-2352)制备化合物10。将3-亚硝基苯甲酸(9)(378mg,2.5mmol)在超声下悬浮于40ml DMSO/AcOH 1:1中，随后加入Fmoc-Phe(4-NH₂)-OH(3)(500mg,1.24mmol)。将混合物在室温搅拌2天，然后加入200ml H₂O。过滤所得沉淀，用H₂O洗涤，用P₂O₅干燥，得到Fmoc-保护的氨基酸10，为棕色固体，不经纯化而进一步使用。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝13.15(s,2H,2x COOH),8.38–8.33(m,1H,芳环),8.11(dd,J＝7.8,1.8Hz,2H,芳环),7.93–7.79(m,5H,芳环,NH),7.77–7.69(m,1H,芳环),7.63(t,2H,芳环),7.54–7.48(m,2H,芳环),7.43–7.33(m,2H,芳环),7.33–7.22(m,2H,芳环),4.28(ddd,J＝10.8,8.5,4.5Hz,1H,C^αH),4.24–4.10(m,3H,Fmoc-CH,CH₂),3.26–3.17(m,1H,C^βH),3.00(dd,J＝13.8,10.7Hz,1H,C^βH)。

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ＝173.11(CO),166.72(CO),155.96(C芳环),151.94(CO),150.55(C芳环),143.77(2x C芳环),143.71(2x C芳环),142.51(C芳环),140.67(C芳环),136.26(C芳环),132.15(C芳环),130.48(C芳环),130.30(2x C芳环),129.95(C芳环),127.59(C芳环),127.04(2x C芳环),125.23(C芳环),125.18(C芳环),122.67(2x C芳环),122.22(C芳环),120.08(2x C芳环),65.62(Fmoc-CH2),55.18(Fmoc-CH),46.57(Cα),36.36(C^β)。

MS分析：计算值[M-H⁺]-＝534.16706；实测值[M-H⁺]-＝534.15493.

分析型HPLC：柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck KgaA,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝21.6min。

步骤3：合成4-[(3-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(11)

将Fmoc-保护的氨基酸10(650mg,1.21mmol)溶于12ml DMF。在逐滴加入3ml哌啶后，将混合物在室温搅拌30分钟。加入35ml 0.5M NaOH导致无色沉淀形成，将其通过过滤去除。滤液用6M HCl(水溶液)酸化为pH 1–2。所得沉淀通过过滤取出，空气干燥，随后用P₂O₅干燥。得到氨基酸11，为棕色固体(361mg,1.15mmol,历经两个步骤为83％)，其不经进一步纯化而用于实施例3所述的生物物理实验。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝8.14–8.08(m,1H,芳环),7.94–7.89(m,1H,芳环),7.76–7.70(m,1H,芳环),7.67–7.60(m,2H,芳环),7.55–7.47(m,1H,芳环),7.34–7.27(m,2H,芳环),3.48(dd,J＝7.4,5.6Hz,1H,C^αH),2.97(dd,J＝13.5,5.6Hz,1H,C^βH₂),2.81(dd,J＝13.5,7.5Hz,1H,C^βH₂)。

¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ＝182.01(CO),174.34(CO),151.76(C芳环),150.50(C芳环),142.60(C芳环),137.59(C芳环),131.49(C芳环),130.28(2x C芳环),129.26(C芳环),123.84(C芳环),123.29(C芳环),122.52(2x C芳环),57.32(Cα),40.78(C^β)。

MS分析:计算值[M-H⁺]-＝312.09898；实测值[M-H⁺]-＝312.09760.

分析型HPLC:柱Purospher RP-8e 250x3 mm(Merck,Darmstadt，德国)，梯度：在30分钟内10–100％ACN的水溶液+0.1％TFA，流速0.6ml/min；t_R＝11.3min。

实施例3：4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf)的光诱导的异构化

通过光谱学进行分析

偶氮苯的紫外-可见光吸收光谱显示两个特征性吸收带，对应于π→π*和n→π*电子跃迁，它们在振幅和最大吸收的精确位置(λ)上对于顺式和反式构型不同。π→π*电子跃迁通常在约340nm的近紫外区域(Sension等人，1993J.Chem.Phys.98:6291-6315)，而n→π*电子跃迁通常位于约420nm的可见光(VIS)区域，这是由于存在氮原子的孤电子对所致(Naegele等人，1997Chem.Phys.Lett.272:489-495)。为了检查所合成的非天然氨基酸Caf(7)是否能够对紫外光诱导的光控转换有响应，将该化合物经受交替的照射循环。在典型的实验中，将0.5ml的30μM水溶液放入光程为1cm的石英比色皿中。然后，样品使用353nm的紫外LED(NS355L-5RLO；Nitride Semiconductors，日本德岛)或者使用发射波长为520nm的绿色LED(LL-504PGC2E-G5-2CC；Lucky Light Electronics，中国香港)从顶部照射30分钟。用电脑控制的光度计(Ultrospec 2100pro，Amersham Biosciences)监测对应于反式/顺式异构化的约340nm处π→π*带的强度变化(图4A)。仔细检查发现，在3个循环中在约340nm的吸光度具有可重现的变化，这与所述偶氮化合物的反式(在340nm处的高吸光度)和顺式(在340nm处的低吸光度)构型之间可逆的光转换一致(图4B)。

通过HPLC分析

将500μl的Caf(7)的60μM水溶液置于1.5ml HPLC小瓶中(螺丝小瓶N9，琥珀色玻璃，11.6x32 mm；Macherey Nagel，Düren，德国)，并用紫外LED(λ＝353nm，NS355L-5RLO；Nitride Semiconductors，日本德岛)直接从顶部照射30分钟。照射前后，取出20μl溶液样品，并在Purospher RP-8e 250x3 mm柱(Merck)上进行HPLC分析，10分钟内施加在50mMNH₄OAc缓冲液pH8中的10–12％乙腈(ACN)的浓度梯度(流速0.6ml/min)。另一样品用绿色LED灯(λ＝520nm，LL-504PGC2E-G5-2CC，Lucky Light Electronics，中国香港)照射后，以相同的方式分析。图4显示了在λ＝286nm处的吸光度的相应色谱图(反式-(7)和顺式-(7)在该波长处的摩尔消光系数相同，可直接比较峰积分)。色谱图显示，(7)的顺式和反式异构体可以通过HPLC进行分离(顺式-(7)t_R＝3.6min，反式-(7)t_R＝4.6min)。在基态照射之前，仅产生能量上有利的反式-(7)(图4C)。紫外光(365nm)照射导致顺式-(7)的比例增加，此处高达86％(图4D)。其可以通过用绿光(λ＝520nm)照射而逆转，从而通过光化学再异构化恢复基态(图4E)。但是，应该考虑到，在HPLC分析期间，顺式-(7)异构化为反式-(7)也发生，因此，用紫外线照射后，顺式-(7)的比例实际上可能高于HPLC色谱图所显示的比例。

因此，如果将本发明的光转换多肽用于亲和色谱方法，并且反式构型对应于高亲和力状态，而顺式构型对应于低亲和力构象，则目标分子的最高结合度和最高洗脱度分别在430nm和330nm处发生。然而，常规光源通常提供具有大约530nm(可见光)和365nm(紫外光)波长的光。因此，根据本发明，也可以使用提供这些波长(即约530nm和/或约365nm)的光。

实施例4：对4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf)特异性的PylRS变体的选择

含有光可切换的非天然氨基酸如4-[(4-羧基苯基)偶氮]-L-苯丙氨酸(Caf)的蛋白质的生物合成打开了通向用于生物物理、结构或生化研究以及生物技术和生物制药应用的新的光控生物分子试剂的道路。为了开发用于在大肠杆菌产生的重组蛋白中共翻译的位点特异性的掺入Caf的抑制物tRNA和氨基-酰基tRNA合成酶(aaRS)的正交对，使用了来自产甲烷的古细菌巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri(Mb))(James等人，2001J.Biol.Chem.276：34252-34258)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)及其同源的tRNA^Pyl，其特异性识别并抑制琥珀终止密码子(Fekner&Chan2011Curr.Opin.Chem.Biol.15:387-91)。

为了选择特异于非天然氨基酸底物Caf的突变aaRS，将编码aaRS和所述同源tRNA二者的以前描述过的单质粒系统(Kuhn等人，2010J.Mol.Biol.404:70-87)改造用于PylRS。修饰的质粒pSBX8.101d58(SEQ ID NO：23)编码来自Mb的PylRS和同源抑制物tRNA^Pyl(图5A)。克隆在同一质粒上的带有琥珀终止密码子的氯霉素抗性报告基因(cat^UAG112；SEQ IDNO:24)用于选择高度活跃的aaRS变体(赋予Cam耐药性)，带有另一个琥珀终止密码子的荧光报告基因(eGFP^UAG39；SEQ ID NO:25)用于与荧光活化细胞分选系统(FACS)结合使用，以筛选具有所需氨基酸特异性的变体。通过在存在或不存在外源氨基酸的情况下分别在添加有Cam的LB琼脂平板上应用阳性和阴性FACS与死/活选择相结合的交替循环，选择对Caf掺入具有高度特异性的突变aaRS(称为CafRS)。

已经描述了突变Tyr349F增强了Mb PylRS对非天然氨基酸的体内抑制活性(Yanagisawa等人，2008Chem.Biol.15:1187-1197)，因此，该位置在所有文库中都固定为Phe。使用QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent，Waldbronn，德国)将突变用一对合适的PCR引物(SEQ ID NO：27和28)导入PylRS野生型基因(SEQ ID NO：26)，产生变体PylRS#1(SEQID NO：29)。

为了进化对非天然氨基酸Caf特异性的突变体合成酶，通过完全随机化活性位点中的五个位置(M309，Asn311，Cys313，Met315和Trp382)，使用NNS简并引物以两步装配PCR方法，生成了基于PylRS#1的第一合成酶文库(CafRS#0-R5)。使用Q5 DNA聚合酶PCR试剂盒(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)以PylRS#1基因(SEQ ID NO：29)为模板进行定点饱和诱变。首先，制备两个重叠的PCR片段，每个片段使用一对正向和反向引物(正向引物1：SEQ ID NO：30；正向引物2：SEQ ID NO：31；反向引物1：SEQ ID NO：32；反向引物2：SEQ IDNO：33)。所有引物均由MWG Eurofins(Ebersberg，德国)提供。

在包含1x Q5缓冲液、200μM每种dNTP和0.5U Q5 DNA聚合酶的50μL反应混合物中，在相同条件下进行两个随机化反应。将混合物在98℃下变性10s，在64℃下退火30s，然后在72℃下进行线性聚合酶反应30s。35个循环后，在37℃下用DpnI酶消化2小时以除去细菌模板。通过琼脂糖凝胶纯化，使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化两个扩增的DNA片段，并在第二个PCR反应中进行组装。为此，将200ng的两个片段混合在50μL Q5 DNA聚合酶反应混合物中，该混合物包含1x Q5缓冲液，200μM每种dNTP和0.5U Q5 DNA聚合酶。将混合物在98℃下变性10s，在64℃下退火30s，然后在72℃下进行线性聚合酶反应30s。经过10个循环后，加入侧翼引物(SEQ ID NOs：30和34)，然后进行30个热循环，分别在98℃下10s，64℃下30s和72℃下30s，最后在72℃下孵育保持5分钟。

使用Qiagen凝胶提取试剂盒经琼脂糖凝胶纯化PCR产物后，通过应用上述热循环，在100μL Q5 DNA聚合酶反应混合物中使用引物SEQ ID NO：30和34进行再扩增。在前面的组装步骤中使用的侧翼引物(SEQ ID NOs：30和34)中的一对互不兼容的IIS型限制性酶切位点(BsaI)使中央编码区能单向插入pSBX8.101d58(SEQ ID NO：23)中。应用Qiagen PCR纯化试剂盒后，在靶区域带有随机突变的所得DNA片段用BsaI双重切割，再次使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化并克隆到质粒pSBX8.101d58上。电感受态的大肠杆菌NEB10beta细胞(NewEngland Biolabs)的转化(Dower等人，1988Nucleic Acids Res。16：6127-6145)产生了3x10⁹个转化株的文库(根据样品比例的菌落数)，将它们接种在补充有100mg/L氨苄青霉素的10个方形LB琼脂平板(114cm²)上。

将菌落从平板上刮下并且每个再悬浮于5毫升LB培养基(Sambrook和Russell2001分子克隆：实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约，NY)，然后合并并用新鲜培养基调节至1L的体积。在30摄氏度下振摇温育30分钟后，从该混合的培养物中通过Qiagen质粒Midi试剂盒制备质粒DNA，并随后用于电感受态大肠杆菌BL21(Studier&Moffatt1986J.Mol.Biol.189:113-130)的转化。通过DNA测序证实克隆在pSBX8.101d58上的PylRS#1基因中靶位置的随机化。

在用上面制备的CafRS#0-R5文库转化电感受态的大肠杆菌BL21(Dower等人，1988Nucleic Acids Res.16：6127-6145)之后，立即在50mL LB培养基中稀释4mL转染的细胞悬液，所述LB培养基补充有磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄、72mM K₂HPO₄)和1mM Caf(100mM储备液在300mM NaOH中)。在37℃下孵育2小时后，离心沉淀细胞，并用10mL不含添加物的新鲜LB培养基洗涤。在另一个离心步骤后，将细胞重悬于2mL LB培养基中，并在四块补充有100mg/L氨苄青霉素、60mg/L氯霉素和1mM Caf的LB琼脂平板上(114cm²)铺板。从平板上刮取在37℃孵育48小时后获得的菌落，分别重悬于5mL LB培养基中，然后合并并稀释到含有100mg/L氨苄青霉素的1L LB培养基中，并在37℃下于3L摇瓶中生长至OD₅₅₀＝0.4。从该培养物中，将一式三份的2mL培养物转移到塑料试管中，并且平行地添加或不添加1mM Caf，所述Caf是以新鲜溶解在300mM NaOH中的100mM溶液形式。细菌在37℃摇动下生长30分钟，然后通过加入200ng/mL的以2mg/mL溶于DMF中的脱水四环素(aTc；Acros Organics，Geel，比利时)诱导eGFP的表达，然后在37℃继续振摇9-12小时。将1mL每种培养物在1.5mL Eppendorf管中离心3分钟，并用1mL过滤灭菌的PBS(4mM KH₂PO₄、16mM Na₂HPO₄、115mM NaCl)反复抽吸，将细菌沉淀小心地重悬。根据该程序洗涤两次后，细菌最终重悬于相同体积的PBS中。

在FACSAria仪器(BD Biosciences，Heidelberg，德国)上进行流式细胞荧光分析和细菌细胞分选，该仪器使用经过过滤灭菌的PBS作为鞘液进行操作，使用488nm激光激发和502nm长通滤光片与530/30带通滤光片，用于特异性检测eGFP荧光。通过适当的FSC/SSC门选择完整的细菌细胞后，动态设置每个群体的最终分选门，以选择在存在Caf时具有最高eGFP信号强度的占总细胞1％至5％比例的那些细胞用于“阳性选择”循环。对于“阴性选择”，将具有与未诱导细菌相当的低eGFP信号的细胞进行分选。细菌直接收集在补充有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中。为了进行再扩增，将分选的细胞接种在含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂上，并在37℃下孵育过夜。如上所述，将菌落的菌苔集体重悬于LB培养基中。将该稠密的细菌细胞悬液的2mL等分试样用于接种100mL新鲜制备的、补充有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基，以直接用于下一个选择循环。

为了富集具有高保真度的CafRS变体并消除那些接受任何天然氨基酸的变体，首先执行了两个连续的阴性FACS选择步骤。以阳性(即添加1mM Caf)和阴性选择(即在不存在Caf的情况下)进行五个交替的FACS选择轮次后，荧光反应清楚地出现，表明Caf特异性地结合到报告蛋白eGFP中。在最终的阳性选择循环后，将细菌接种在LB琼脂上并通过QiagenPlasmid Midi Kit从回收的细胞中制备质粒DNA。在转化钙感受态大肠杆菌BL21细胞后，在矩形塑料培养皿(Nunc，Langenselbold，德国)中在添加100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂上接种，所得细菌群体在96孔微培养板中进行单个克隆分析，如以前所详述，使用机器人平台进行(Reichert等人，2015Protein Eng.Des.Sel.28:553-565)。在该试验中，繁殖了190个随机选择的菌落，并分别分析了eGFP荧光。

在37℃孵育过夜后，将菌落自动挑出并用于接种到在96孔圆底微滴定板(Sarstedt,Nürnbrecht，德国)中的添加100mg/L氨苄青霉素的100μL TB培养基中(Sambrook和Russell 2001分子克隆：实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约，NY)。微滴定板用可透气的Breathseal 80/140mm膜(Greiner Bio-One,Frickenhausen,德国)密封并使用具有25mm振幅的轨道振荡Minitron培养箱(Infors,Eisenbach，德国)在300rpm振荡下在37℃孵育过夜至稳定期。随后，将新鲜的1mL含有100mg/L氨苄青霉素的TB培养基接种到Masterblock 2mL V-形深孔微滴定板(Greiner Bio-One)中，每个含有20μL预培养物，在37℃孵育约2小时，以达到用Synergy 2SLFA微孔板读板器(BioTek Instruments,BadFriedrichshall，德国)监测为OD₅₅₀≈0.5。该接种步骤使用两个相同的96深孔板一式两份进行，一个添加1mM Caf，另一个不含非天然氨基酸。在继续振摇30分钟后，将细胞用200ng/mL aTc诱导(通过添加20μL来自10μg/mL在LB培养基中的储备液)。细菌在37℃继续生长12小时；然后，将培养物离心(3857xg；15min)，并通过在机器人平台上反复抽吸而重悬浮于1mL PBS中。重复一次在PBS中的洗涤。最后，使用Maxisorb黑色96孔测定板(Nunc)测定细胞混悬液中的100μL等分试样的eGFP^Caf39荧光度，在395nm激发，在510nm检测发射，在495nm截断。每个孔的荧光读数标准化为在96孔Mikrotest板F(Sarstedt)中以1:5稀释(20μL等分试样加80μL PBS)的相同细胞混悬液的OD₅₅₀。将含有仅携带空pSBX8.100d骨架(不编码eGFP)的细胞的两个孔的标准化背景荧光取平均数，并从所有其他荧光读数中扣除。每个克隆的最终数据测定为荧光比率aaRS^+Caf/aaRS-^Caf。

在效能和保真度方面最佳的克隆称为CafRS#7(SEQ ID NO:35)，已经显示了平均eGFP荧光的某些增加，这表明更多的位置需要随机化。CafRS#7序列分析表明相对于PylRS#1的三个氨基酸取代(Met309Gln、Asn311Ser和Cys313Gly)。

使用CafRS#7(SEQ ID NO:35)作为用于具有六个完全随机化位置(Ala267、Leu270、Tyr271、Leu274、Ile285和Ile287)的第二个聚焦于aaRS的文库(CafRS#7-R6；SEQID NO:36)的起始点。使用两组简并NNS-引物产生两个PCR片段并组装。第一个PCR片段使用正向引物(SEQ ID NO:30)和NNS反向引物(SEQ ID NO:37)产生，以引入对目标残基的变异，生成所述基因的上游部分。第二个PCR片段使用另一个NNS-简并正向引物(SEQ ID NO:38)和反向引物(SEQ ID NO:34)产生，具有与第一个PCR产物的3’末端的正向引物的重叠部分,提供了所述基因的下游部分。这些PCR片段根据上述的实验程序使用CafRS#7基因作为模板而生成。在琼脂糖凝胶纯化后，在组装PCR反应中每个片段使用200ng，采用针对所述基因的5'末端(SEQ ID NO:30)和3’末端(SEQ ID NO:34)且含有BsaI限制性酶切位点的引物。将文库克隆到pSBX8.101.d58上，产生1x 10¹⁰个转化子，将其在LB琼脂板上对有活力的菌落进行最初的死亡/存活选择，所述LB琼脂板添加有100mg/mL氨苄青霉素和30mg/mL氯霉素以及1mM Caf，随后使用FACS进行2次阴性选择轮次。在五次交替的FACS选择(三次阳性和两次阴性)后，将细菌细胞回收到添加有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，随后以如上所述的96孔微量培养方式进行189个菌落的单个克隆分析。突变的aaRS基因盒的序列分析显示，具有最高的特异性荧光比率的克隆称为CafRS#29(SEQ ID NO:39)，其与CafRS#7相比携带4个额外的氨基酸取代(Ala267Thr、Leu274Ala、Ile285Asn、Ile287Ser)。

从马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)(Mz)的PylRS(PBD条目2ZCE)的晶体结构和两个在先的文库筛选结果判断，位于入口处的两个残基(Gln309和Ser311)(其已在第一个文库中被关注)和位于活性位点的背后部分的三个残基(Ala274、Asn285和Ser287)(其已在第二个文库中被关注)，似乎是用于构建第三个CafRS文库的有希望的候选物。使用简并的NNS引物，通过组装PCR再次产生基于CafRS#29的文库CafRS#29-R5(SEQ IDNO:40)。

使用一组正向和反向引物产生三个PCR片段并装配。第一个PCR片段使用正向引物(SEQ ID NO:30)和NNS-简并的反向引物(SEQ ID NO:41)产生，得到所述基因的随机化的上游部分。第二个PCR片段提供所述基因的中间部分，其使用具有与第一个PCR片段的3’末端和第三个PCR片段的5’末端的重叠部分的一组两个NNS-引物(SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:42)产生。第三个PCR片段提供所述基因的下游部分，其使用NNS正向引物(SEQ ID NO:31)和反向引物(SEQ ID NO:34)产生。这些PCR片段根据上述的实验程序使用CafRS#29基因作为模板而生成和组装。所述基因文库用限制性酶BsaI消化，凝胶纯化，与使用BsaI后消化的pSBX8.101d58载体连接，得到CafRS#29-R5文库(SEQ ID NO:40)。随后将10μg连接产物电转化到大肠杆菌NEB10beta细胞中。电转化的细胞进行回收，接种在含有100mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，得到1x 10¹⁰个独立的转化子。按照从第一个和第二个CafRS-文库中进行选择的所述方法从CafRS#20-R5文库中选择。最终选择的突变合成酶CafRS#30(SEQ ID NO:43)携带与野生型Mb PylRS相比的总共7个氨基酸取代(Ala276Thr、Leu274Ser、Ile285Ser、Ille287Val、Asn311Val、Met315Gly和Tyr349Phe)。

实施例5：SAm1^Caf突变体的产生

作为概念的证明，链霉亲和素突变体1SAm1(也称为“Strep-Tactin”)(Voss&Skerra 1997Protein Eng.10:975-82)(SEQ ID NOs:7和8)在位置V44、W108或W120处用Caf修饰。为此，使用质粒pSAm1(SEQ ID NO:44)作为模板与QuikChange定点诱变试剂盒以及合适的一对正向和反向PCR引物一起进行定点诱变，将琥珀终止密码子(TAG)在每个这些序列位置引入编码区中：SEQ ID NO:45和46得到SAm1^UAG44(SEQ ID NO:47)，SEQ ID NO:48和49得到SAm1^UAG108(SEQ ID NOs:1和2)，SEQ ID NO:50和51得到SAm1^UAG120(SEQ ID NO:52)(图5B)。在转化钙感受态的大肠杆菌XL1-蓝细胞、质粒制备(质粒小量提取试剂盒,Qiagen)并测序(Mix2Seq,MWG Eurofins,Ebersberg，德国)后，将SAm1变异体通过XbaI和HindIII亚克隆到载体pSBX8.CafRS#30d58(SEQ ID NO:53)上，分别得到pSBX8.CafRS#30d47(V44TAG；SEQ IDNO:54)、pSBX8.CafRS#30d53(W108TAG；SEQ ID NO:55)和pSBX8.CafRS#30d51(W120TAG；SEQID NO:56)。

如果侧链采用顺式构型(即在340或365nm照射后)、但保留反式构型的结合活性，则用Caf取代的所有位置均意图干扰与Strep-标签II的结合(图5A)。位置Val44位于包括位置44-53的柔性环区域的N-末端侧。Caf异构化可能改变环构象。位置Trp108位于生物素结合袋的底部，因此，顺式Caf可能与相邻的侧链发生碰撞。位置Trp120位于结合位点的顶部，该位点从相邻的四聚体亚基延伸，从而在Caf异构化为顺式状态后改变整体几何形状。

实施例6：SAm1变体的表达和纯化

SAm1(SEQ ID NOs:7和8)和SAm1^Caf变体均在大肠杆菌(E.coli)中作为细胞质包涵体产生，溶解，重折叠，通过阴离子交换色谱(AEX)纯化并通过SDS-PAGE分析。

用编码SAm1^Caf108的质粒pSBX8.CafRS#30d53(SEQ ID NOs:1和2)(图6A)转化的大肠杆菌(E.coli)BL21的单个菌落用于接种补充了100mg/L氨苄青霉素的50mL LB培养基。在30℃下孵育过夜后，将20mL培养物转移至带挡板的摇瓶中的2L LB培养基中，再次补充100mg/L氨苄青霉素以及磷酸盐缓冲液(17mM KH₂PO₄,72mM K₂HPO₄)和1mM Caf(来自300mMNaOH中的100mM储备溶液)。将培养物在37℃下孵育至OD₅₅₀＝0.5。然后，用200ng/mL aTc诱导SAm1^Caf108基因表达(在tet^p/o的控制下；Skerra 1994基因151：131-135)，并在37℃继续生长12h。CafRS基因在大肠杆菌(E.coli)proS启动子和proM终止子的控制下。通过离心(10,000xg,20min,4℃)收获细胞，并用100mL 100mM硼酸钠pH9.0、150mM NaCl洗涤两次，以除去沉淀的Caf。将细菌重悬于3mL/mg湿重的冷的100mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1mMEDTA中，并使用法国压力均质器(SLM Aminco,Urbana,IL,USA)进行3次破碎。将匀浆离心(20.000g,30min,4℃)以沉淀链霉亲和素包涵体。用50mM Tris-HCl pH 8.0、2M尿素，2％v/v Triton X-100(3mL/g细胞湿重)洗涤蛋白质沉淀两次以除去杂质后，再用50mM Tris-HCl的洗涤步骤以耗尽残留的Triton X-100。将包涵体溶于8M pH 2.5的尿素(3mL/g细胞湿重)中。离心(20.000g,30min,4℃)后，将澄清的上清液进行重折叠，其通过快速稀释来完成。使用巴斯德移液器将未折叠的蛋白质逐滴移入25倍体积的在4℃的50mM Tris-HCl pH 8.0中。将混合物在4℃下孵育过夜，通过离心(10.000xg,20min,4℃)进行澄清，并在6mLResource Q柱(GE Healthcare,Freiburg，德国)上通过AEX纯化，所述的柱用20mM Tris-HCl pH8.0进行平衡。以纯净状态以0-500mM NaCl的线性盐浓度梯度在～80mM NaCl中洗脱蛋白质流份，通过SDS-PAGE(Fling&Gregerson 1986Anal.Biochem.155:83-88)分析，使用考马斯亮蓝R-250染色(图6B)。

实施例7：碱性磷酸酶/Strep-标签II融合蛋白的制备

使用质粒pASK75-PhoA-strepII(SEQ ID NO：57)转化的大肠杆菌(E.coli)JM83进行的PhoA/Strep-标签II融合蛋白的制备性蛋白表达在补充有100mg/mL氨苄青霉素的2LLB培养基中完成，基本上按照Voss&Skerra 1997Protein Eng.10:975-982所述。将培养物在22℃生长至OD₅₅₀＝0.5，然后通过添加200ng/mL aTc诱导phoA基因表达。在22℃下继续孵育4小时。通过离心收集细胞，将其重悬于含有100μg/mL溶菌酶的20mL冰冷却的周质分离缓冲液(0.5M蔗糖，2mg/mL硫酸多粘菌素B和100mM Tris-HCl，pH 8.0)中，并在冰上孵育30分钟。由于酶活性位点中存在金属离子，因此在2mg/mL硫酸多粘菌素B代替EDTA的情况下进行周质蛋白制备。通过重复离心除去原生质球(Skerra&Schmidt 2000Methods Enzymol.326:271-304)，并回收上清液作为周质细胞部分。经链霉亲和素亲和色谱法，按照公开的方法(Schmidt&Skerra 2007Nat.Protoc.2:1528-1535)使用StrepTactin琼脂糖(IBA,德国)和D-脱硫生物素洗脱，从周质细胞部分中纯化PhoA/Strep-标签II融合蛋白。为避免金属离子在PhoA的活性位点丢失，色谱缓冲液(150mM NaCl,100mM Tris-HClpH 8.0)中去除了EDTA。最后，将PhoA/Strep-标签II融合蛋白在2L缓冲液(1mM ZnSO₄,5mMMgCl₂,100mM Tris-HCl,pH 8.0)中透析两次，以去除D-脱硫生物素，然后进行ELISA测定或固定在色谱基质上的Caf修饰的链霉亲和素变体的结合实验。

实施例8：在ELISA中检测PhoA/Strep-标签II融合蛋白的可逆结合

首先使用纯化的PhoA/Strep-标签II融合酶作为模型配体在ELISA(酶联免疫吸附测定)中测试了在某些位置携带光转换氨基酸Caf的链霉亲和素突变体的光诱导可逆性结合(图7)。

ELISA在室温下于96孔微量滴定板(Nunc,Langenselbold，德国)中进行。每个孔用100μL的浓度为1mg/mL的在PBS(4mM KH₂PO₄,16mM Na₂HPO₄,115mM NaCl)中的生物素化的牛血清白蛋白(BSA)包被过夜(图7A)。使用20x摩尔过量的生物素NHS酯进行2mL BSA(在PBS中为10mg/mL)的生物素化。在室温孵育2小时后，通过加入2mL 100mM NaCl、100mM Tris-HClpH 8.0猝灭反应，并使用用相同缓冲液平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化。将各孔用PBS中的3％w/v BSA、0.5％v/v Tween封闭2.5小时，并用PBS-Tween洗涤3次。将100μL的SAm1或其Caf变异体以在PBS中的100μg/mL的浓度施用，以便通过预吸附的生物素-BSA的复合物形成来实现固定。孵育1小时后，将各孔用PBS-Tween洗涤3次。然后，将100μL的在1mMZnSO₄、5mM MgCl₂、100mM Tris-HCl pH 8.0中的PhoA/Strep-标签II应用于各孔。孵育1小时后，除去液体，并将各孔用PBS-Tween洗涤两次，并用PBS洗涤两次。在每个清洗步骤之间，微量滴定板用365nm波长的紫外线(紫外手持灯，NU-6KL，Wiesloch，德国；图7A的下图)以2mm的距离照射或用可见光(日光；图7A的上图)照射5分钟，而缓冲液更换则在黑暗中进行。最后，向每个孔中加入在1mM ZnSO₄、5mM MgCl₂、1M Tris-HCl,pH 8.0中的100μL 0.5mg/mL磷酸对硝基苯基酯，并使用Synergy 2SLFA微孔板读数器检测410nm处光吸收变化作为剩余的酶促PhoA活性。

结果显示，所有测试的链霉亲和素突变体均显示出对PhoA/Strep-标签II融合蛋白的良好亲和力，从而产生了与SAm1获得的可见光照射样品相当的信号(图7B)。相反，链霉亲和素变体SAm1^Caf108在365nm的紫外线照射后，观察到残留酶活性的明显降低。在这些情况下，SAm1以及突变体SAm1^Caf44和SAm1^Caf120均未显示降低或显示很少的信号降低。因此，链霉亲和素突变体SAm1^Caf108显示了带有亲和标签的靶蛋白的光诱导(光转换)的可逆性结合。

实施例9：光可控制的亲和基质的测试

将在载体pSBX8CAFRS#30的相应衍生物上编码的纯化的SAm1或其Caf变体(参见实施例4和5)与NHS活化的琼脂糖4B(Pharmacia，斯德哥尔摩，瑞典)以每mL溶胀凝胶5mg蛋白质进行偶联，如文献所述(Schmidt&Skerra 1994J.Chromatogr.A 676:337-345)。为此，按照制造商的建议，将NHS活化的CH-琼脂糖4B溶胀并在冰冷却的1mM HCl中洗涤。沥干上清液，将凝胶与2倍体积的2.5mg/mL的链霉亲和素变体的溶液混合两次，所述溶液已经用100mM NaHCO₃ pH 8.0,500mM NaCl透析过。在室温下轻轻摇动2小时后，将上清液轻轻倒出，将凝胶与5体积的100mM Tris-HCl pH 8.0混合，以封闭残留的活化基团，然后在4℃振摇过夜。

将紫外线可透过的柱以装有20μL来自上述的色谱基质的玻璃毛细管(内径0.7mm)安装，分别用于Sam1^Caf44、SAm1^Caf108、SAm1^Caf120和SAm1。首先，使用注射泵(kdScientific,Holliston,MA,USA)用2mL运行缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0,100mM NaCl)以12mL/h的恒定流速平衡该柱两次，一次在365nm的紫外线照射下(UV手提灯，NU-6KL，BendaWiesloch，德国)，一次用发射波长>530nm的LED发光台(FG-08,NipponGenetics,Düren，德国)照射下进行(图8A)。然后施加25μL在100mM Tris-HCl pH 8.0,100mM NaCl中的0.1mg/mL浓度的纯化的PhoA/Strep-标签II融合蛋白，并将该柱用2mL运行缓冲液洗涤，未结合的蛋白质收集在流穿液中。使用LED光台在可见光照射下进行样品施加和洗涤步骤。随后，通过使用紫外线手持灯在365nm紫外线下照射来引发结合蛋白的洗脱。首先，在应用紫外线的同时停止缓冲液流动10分钟。然后将流速再次设置为12mL/h，并收集三个洗脱流份(每个25μL)。在基于SAm1^Caf108的色谱基质洗脱流份中，对应于PhoA/Strep-标签II融合蛋白的考马斯染色凝胶上可见的蛋白条带表明该蛋白已通过在365nm的照射进行了特异性洗脱(图8B)。对于链霉亲和素(图8C)或其变体SAm1^Caf44和SAm1^Caf120(数据未显示)，未观察到条带。

为了提高洗脱流份中亲和纯化蛋白的检测限，检测了PhoA酶的活性。因此，将10μL的每种流分(上样、流穿、洗涤和洗脱流份1-3)加到96孔板(Nunc)的单个孔中。加入90μL在1mM ZnSO₄,5mM MgCl₂,1M Tris-HCl,pH 8.0中的0.5mg/mL磷酸对硝基苯基酯。在室温下孵育30分钟后，使用Synergy 2SLFA酶标仪通过测量410nm处随时间的吸光度来确定酶活性。与SDS-PAGE分析一致，基于SAm1^Caf108的色谱基质的洗脱流份显示在UV辐射下洗脱的最高蛋白质浓度(酶活性)(图8D)。

实施例10：ProtL^Caf-ABD变体的生成

蛋白L是一种表面蛋白，最初在大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)(以前已知为大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus))的细胞壁中发现，其对许多哺乳动物物种的主要是免疫球蛋白(Ig)具有高度亲和力和特异性，因此已用于抗体纯化(Rodrigo等人,2015Antibodies 4:259-277)。尽管其它IgG结合蛋白例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和G组链球菌的蛋白A和蛋白G结合于Ig的Fc区，但蛋白L结合于κ轻链可变区而不会干扰抗原结合位点。天然的蛋白L(UniProt登录号Q51918)主要包含以下结构域(类似于Kaster等人，1992J.Biol.Chem.267:12820-12825)：信号肽(1-26)；三个与G蛋白相关的白蛋白结合结构域(77-116；129-177；190-238)；四个同源B1结构域(254-317；326-389；399-436；474-538)；两个C重复序列(610-660；668-722)和跨膜区域(969-991)。

为了工程化用于纯化抗体以及片段或相关格式(例如抗体融合蛋白、双特异性抗体等)的光转换亲和基质，设计了包含单个结构域而不具有非必需结构域的重组蛋白L。经密码子优化的蛋白L结构域B1(本文称为ProtL；SEQ ID NO：20)通过短的接头序列与衍生自蛋白G的人白蛋白结合结构域(ABD；SEQ ID NO:59)融合。L-ABD融合蛋白(ProtL-ABD；SEQID NO:61)在337、347、360、364、368或369位的任一位置用Caf修饰(参见UniProt登记号Q51918中的编号方案)。位置337、347、360、364、368和369分别对应于SEQ ID NO：61的位置13、23、36、40、44和45。

为此，使用质粒pASK75-ProtL-ABD(SEQ ID NO:62)作为模板在QuikChange定点诱变试剂盒以及合适的一对正向和反向PCR引物的帮助下进行定点诱变，将琥珀终止密码子(TAG)引入(通过替换原始氨基酸密码子)这些序列位置的编码区中：SEQ ID NO:63和66用于ProtL^UAG337-ABD(SEQ ID NO:67)、SEQ ID NO:68和69用于ProtL^UAG347-ABD(SEQ ID NO:72)、SEQ ID NO:73和74用于ProtL^UAG360-ABD(SEQ ID NO:75)、SEQ ID NO:76和77用于ProtL^UAG364-ABD(SEQ ID NO:78)、SEQ ID NO:79和80用于ProtL^UAG368-ABD(SEQ ID NO:81)、SEQ ID NO:82和83用于ProtL^UAG369-ABD(SEQ ID NO:84)(图9)。

在转化钙感受态的大肠杆菌XL1-蓝(Bullock等人,1987Biotechniques5:376-378)细胞、质粒制备并测序后，将未修饰的ProtL-ABD和ProtL^UAG-ABD变体经XbaI和HindIII限制位点亚克隆到载体pSBX8.CafRS#30d58(SEQ ID NO:53)上，分别得到质粒pSBX8.CafRS#30d70(无琥珀终止密码子)、pSBX8.CafRS#30d71(337TAG)、pSBX8.CafRS#30d72(347TAG)、pSBX8.CafRS#30d73(360TAG)、pSBX8.CafRS#30d74(364TAG)、pSBX8.CafRS#30d75(368TAG)和pSBX8.CafRS#30d76(369TAG)。

如果侧链采用顺式构型(即在340或365nm照射后)、但保留反式构型的结合活性，则用Caf取代的位置337和347意在干扰Ig结合。如果侧链采用反式构型(即在>420nm照射后)、但保留顺式构型的结合活性，则用Caf取代的位置360、364、368和369意在干扰Ig结合。异构化后，Caf侧链可能与蛋白L中的相邻侧链发生碰撞(从而改变其结合位点的构象)和/或与Ig配体(从而改变蛋白/蛋白界面的几何结构)中的相邻侧链发生碰撞，从而干扰结合。

为了给大的Caf侧链提供足够的空间而在蛋白L的结合界面内不发生空间重叠(尤其是在伸展的反式构型中)，并保留IgG结合活性，可在适当时将其它氨基酸交换引入突变的ProtL-ABD中。例如，使用QuikChange定点诱变试剂盒以及正向和反向引物SEQ ID NO：70和73将突变Tyr361Ala引入ProtL^Caf347-ABD的编码区。使用引物SEQ ID NO：65和68将两个其它突变Tyr361Asn和Leu365Ser同时引入ProtL^Caf337-ABD。这些位置361和365分别对应于SEQID NO：61和86的位置37和41。

实施例11：ProtL^Caf-ABD变体的表达和纯化

ProtL(SEQ ID NO:60)和ProtL^Caf变体(SEQ ID NOs:69、74、77、80、83和86)作为ABD融合蛋白在大肠杆菌(E.coli)的细胞质中产生，并通过人血清白蛋白(HSA)亲和色谱和阴离子交换色谱(AEX)。

例如，用编码ProtL^Caf337-ABD(SEQ ID NO:85)的质粒pSBX8.CafRS#30d71转化的大肠杆菌MG1655的单个菌落(Guyer等人,1981Cold Spring Harb Symp Quant Biol 45:135-40)被用于接种补充有100mg/L氨苄青霉素的50mL LB培养基。在30℃下孵育过夜后，将20mL培养物转移至带挡板的摇瓶中的补充有100mg/L氨苄青霉素以及磷酸盐缓冲液(17mMKH₂PO₄,72mM K₂HPO₄)和1mM Caf(来自100mM的在300mM NaOH中的储备液)的2L LB培养基中。将培养物在搅拌下于37℃孵育至OD₅₅₀＝0.5。然后，用200ng/mL aTc诱导ProtL^Caf337-ABD基因表达(在tet^p/o的控制下)，并在37℃继续生长12-16h。CafRS基因在大肠杆菌proS启动子与proM终止子的组成型控制之下。通过离心(10,000xg,20min,4℃)收获细胞，将其重悬于3mL/g湿重的冷的50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、5mM EDTA中，并用FrenchPressure均化器破碎。离心(20.000g,30min,4℃)该匀浆以沉淀细胞碎片，并将澄清的上清液用HSA亲和柱进行亲和色谱分析。

根据已出版的方法(Schmidt&Skerra 1994J.Chromatogr.A 676:337-345)，使用NHS活化的琼脂糖4B(GE Healthcare,Freiburg，德国)制备HSA亲和基质。为此，首先按照制造商的建议将NHS活化的CH-琼脂糖4B溶胀并在冰冷却的1mM HCl中洗涤。排干上清液，并将凝胶与2倍体积的在水稻(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)中产生的重组HSA的5mg/mL在1100mM NaHCO₃ pH 8.0,500mM NaCl中的溶液混合。在室温下轻轻摇动2小时后，将上清液倒出，并将凝胶与5体积的100mM Tris-HCl pH 8.0混合，然后在4℃摇动过夜以封闭残留的活化基团。将HSA亲和基质装入连接到净化器色谱系统的2ml色谱柱外壳中。

用运行缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,100mM NaCl)平衡HSA色谱柱后，将含有ProtL^Caf337-ABD的来自大肠杆菌(E.coli)的澄清的上清液上样至色谱柱。然后，用五倍体积(10mL)的运行缓冲液洗涤色谱柱，并用150mM甘氨酸-HCl pH 2.8,100mM NaCl洗脱结合的蛋白质。将峰流份收集到中和缓冲液(每ml流份为100μl的1M Tris-HCl pH 9.0)中，使流份的最终pH值大约变为中性。将合并的流份立即在4℃下于20mM Tris-HCl pH 8.0中透析过夜。ProtL^Caf337-ABD在1mL Resource Q柱(GE Healthcare)上用AEX进一步纯化，该柱用20mMTris-HCl pH 8.0平衡。以0–200mM NaCl的线性盐浓度梯度在～100mM NaCl下洗脱纯状态的蛋白质流份，经SDS-PAGE(Fling&Gregerson 1986Anal.Biochem.155:83-88)通过用考马斯亮蓝R-250染色进行肉眼观察(图10)。以相同的方式制备其它Caf变体以及未修饰的ProtL-ABD融合蛋白。

实施例12：在ELISA中检测ProtL^Caf-ABD融合蛋白的可逆性结合

使用小鼠抗6xHis抗体碱性磷酸酶(AP)缀合物(Arigo Biolaboratories,新竹市,台湾)作为模型Ig配体(图11A)，在ELISA中检测了在某些位置携带光转换氨基酸Caf的ProtL^Caf-ABD突变体的光诱导的可逆性结合。ELISA是在室温下于96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc,Langenselbold，德国)中进行。

为此，首先在室温下将每个孔以10μg/ml的浓度用50μl的水稻产生的重组HSA(Sigma-Aldrich)在PBS(4mM KH₂PO₄,16mM Na₂HPO₄,115mM NaCl)中的溶液包被1小时。然后，将各孔用在ddH₂O中以1:10稀释的200ml Roti-Block(Carl Roth,Karlsruhe，德国)封闭1小时，并用含0.1％v/v Tween 20(PBS/T)的PBS洗涤3次。之后，将来自实施例11的纯化的ProtL^Caf-ABD融合蛋白以在PBS/T中的稀释系列应用，并孵育1小时以实现ABD部分和预吸附的HSA之间的复合物形成。然后将各孔用PBS/T洗涤3次，并与50μl上述小鼠抗6xHis Ig-AP缀合物在PBS/T中的1:1000稀释液一起孵育。

1小时后，将微量滴定板避开日光，并以365nm波长的紫外线(NU-6KL紫外线手灯)在2mm距离照射5分钟。所有后续洗涤步骤均在黑暗中进行。将微量滴定板用PBS/T洗涤两次，再用PBS洗涤两次，然后使用磷酸对硝基苯基酯(0.5mg/mL在5mM MgCl₂,1M Tris-HClpH 8.0中)作为生色底物进行酶活性检测，以定量剩余的结合的磷酸酶报告酶。在25℃下5分钟后，使用SpectraMax 250微量滴定板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)测量405nm的吸光度。

结果，用可见光照射的ProtL^Caf337变体(SEQ ID NO:86)显示出对IgG的亲和力，尽管其信号比没有Caf的ProtL观察到的信号略低(图11B)。相反，对于ProtL^Caf337变体，在365nm的紫外线下照射后，观察到酶活性明显下降，而未修饰的ProtL-ABD融合蛋白在不同光照条件下未发现结合活性的任何变化。在这些情况下，ProtL^Caf347、ProtL^Caf360、ProtL^Caf364、ProtL^Caf368和ProtL^Caf369突变体的信号下降要小得多。因此，ProtL^Caf337显示了光转换的IgG可逆性结合。

这些实验表明，携带固定的在多肽序列适当位置引入非天然氨基酸Caf的结合蛋白(工程化的链霉亲和素或蛋白L)的色谱基质，可用于在亲和色谱的常规条件下可逆性结合和光驱动的洗脱目标蛋白(其带有或没有亲和标签)，而无需应用竞争性配体或缓冲液更换。

本发明涉及以下核苷酸和氨基酸序列：

SEQ ID NO:1:包含Caf的Strep-Tactin的核酸序列。Caf的密码子以粗体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:2:包含Caf的Strep-Tactin的氨基酸序列。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:1)下方显示了包含Caf的Strep-Tactin的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:3:包含Caf的核心链霉亲和素的核酸序列。Caf的密码子以粗体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:4:包含Caf的核心链霉亲和素的氨基酸序列。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:3)下方显示了包含Caf的核心链霉亲和素的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:5:包含Caf的未经加工的链霉亲和素(即，前链霉亲和素)的核酸序列。Caf的密码子以粗体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:6:包含Caf的未经加工的链霉亲和素(即，前链霉亲和素)的氨基酸序列。引导链霉亲和素分泌的信号序列带下划线。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:5)下方显示了包含Caf的未加工的链霉亲和素(即前链霉亲和素)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。指导链霉亲和素分泌的信号序列带下划线。Caf的位置以粗体显示并带有下划线。核心链霉亲和素的序列以Glu²⁵开始，以Ser¹⁶³结束。

SEQ ID NO:7:链霉亲和素的核酸序列

SEQ ID NO：8：Strep-Tactin的氨基酸序列。Trp96以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:7)下方显示链霉亲和素的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。Trp的位置以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:9:核心链霉亲和素的核酸序列。

SEQ ID NO:10:核心链霉亲和素的氨基酸序列(残基2-127对应于UniProt数据库条目P22629中的残基38-163；残基1是起始甲硫氨酸)。Trp96以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:9)下方显示核心链霉亲和素的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。Trp96的位置以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:11:未加工的链霉亲和素(前链霉亲和素)的核酸序列。

SEQ ID NO:12:前链霉亲和素的氨基酸序列。Trp132以粗体显示并带有下划线。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:11)下方显示前链霉亲和素的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。Trp132的位置以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:13:Strep-标签的氨基酸序列

SEQ ID NO:14:Strep-标签II的氨基酸序列

SEQ ID NO:15：myc-标签的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目P01106中的残基410-419)。

SEQ ID NO:16:蛋白A的结构域Z的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目P38507中的残基212-269)。Caf引入的合适位置Phe5、Gln9、Phe13、Tyr14、Glu25、Gln26、Arg27、Asn28、Ala29、Phe30、Ile31、Gln32、Lys35、Asp36、Asp37、Gln40、Asn43、Leu45、Glu47、Leu51、Ast52以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:17：蛋白G的结构域C1的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目P19909中的残基303–357)。Caf引入的合适位置Lys3、Ile5、Thr10、Thr16、Val28、Tyr32、Asp35以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:18蛋白G的结构域C2的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目P19909中的残基373–427)。Caf引入的合适位置Lys3、Val5、Thr10、Thr16、Val28、Tyr32、Asp35以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:19蛋白G的结构域C3的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目P19909中的残基443-497)。Caf引入的合适位置Lys3、Val5、Thr10、Thr16、Ala28、Tyr32、Asp35以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:20蛋白L的结构域B1的氨基酸序列(对应于UniProt数据库条目Q51918中的残基326–389)。Caf引入的合适位置Thr5(330)、Asn9(334)、Ile11(336)、Phe12(337)、Lys16(341)、Phe 22(347)、Phe26(351)、Lys32(357)、Ala35(360)、Leu39(364)、Glu43(368)、Asn44(369)Tyr47(372)以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:21抗myc-标签单克隆抗体克隆9E10的重链的氨基酸序列(对应于GenBank数据库条目CAN87018中的残基20–470)。Caf引入的合适位置是对应于GenBank数据库条目CAN87018的Tyr76、Phe121、Tyr122、Tyr123、Tyr124、Tyr128、Tyr129和Tyr130的残基，其以黑体显示并带有下划线。更具体地是，由于以下序列以GenBank数据库条目CAN87018的残基20开始，对应于GenBank数据库条目CAN87018的Tyr76、Phe121、Tyr122、Tyr123、Tyr124、Tyr128、Tyr129和Tyr130的位置分别是以下序列中的Tyr57、Phe102、Tyr103、Tyr104、Tyr105、Tyr109、Tyr110和Tyr111位置。

SEQ ID NO:22抗myc-标签单克隆抗体克隆9E10的轻链的氨基酸序列(对应于GenBank数据库条目CAN87019的残基21–238)。

SEQ ID NO:23:pSBX8.101d58的核酸序列

SEQ ID NO:24:cat^UAG119的核酸序列

SEQ ID NO:25:eGFP^UAG39的核酸序列

SEQ ID NO:26:野生型PylRS的核酸序列

SEQ ID NO:27:

SEQ ID NO:28:

SEQ ID NO:29:PylRS#1(Y349F)的核酸序列

SEQ ID NO:30:

GAGCTTAACCCGGTCTCAGTTAGATCG

SEQ ID NO:31:

GGTAGCGGTTGTACCCGTG

SEQ ID NO:32:

GGGTACAACCGCTACCSNNCTGSNNAAASNNCACSNNTGTAAATTCTTCCAGGTGTT

SEQ ID NO:33:

CTTTCAGCAGACGTTCGAGACCAAAACCTGCACCAATSNNGGGTTTATCAATACCCCATTC

SEQ ID NO:34:

CTTTCAGCAGACGTTCGAGAC

SEQ ID NO:35:CafRS#7的核酸序列

SEQ ID NO:36:CafRS#7-R6的核酸序列

SEQ ID NO:37:

SEQ ID NO:38:

SEQ ID NO:39:CafRS#29的核酸序列

SEQ ID NO:40:CafRS#29-R5的核酸序列

SEQ ID NO:41:

CAGAATACGATCCAGTTTCCGSNNGTAGTTATACAGTGTCGG

SEQ ID NO:42:

GGGTACAACCGCTACCCATCTGGCCAAASNNCACSNNTGTAAATTCTTCCAGGTGTT

SEQ ID NO:43:CafRS#30的核酸序列

SEQ ID NO:44:pSAm1的核酸序列

SEQ ID NO:45:

GCAGACGGaGCCCTGACCGGtACCTACTAGacggcgcgtGSEQ ID NO:46:

CacgcgccgtCTAGTAGGTaCCGGTCAGGGCtCCGTCTGCSEQ ID NO:47:SAm1^UAG44的核酸序列

SEQ ID NO:48:

GATCAACACCCAGTAGCTGCTGACCTCC

SEQ ID NO:49:

GGAGGTCAGCAGCTACTGGGTGTTGATC

SEQ ID NO:50:

GAGGCCAACGCCTAGAAGTCCACGCTGG

SEQ ID NO:51:

CCAGCGTGGACTTCTAGGCGTTGGCCTC

SEQ ID NO:52:SAm1^UAG120的核酸序列

SEQ ID NO:53:pSBX8.CafRS#30.d58的核酸序列

SEQ ID NO:54:pSBX8.CafRS#30.d47的核酸序列

SEQ ID NO:55:pSBX8.CafRS#30.d53的核酸序列

SEQ ID NO:56:pSBX8.CafRS#30.d51的核酸序列

SEQ ID NO:57:pASK75-PhoA-strepII的核酸序列

SEQ ID NO:58:人白蛋白结合域(ABD)的核酸序列

SEQ ID NO:59:人白蛋白结合域(ABD)的核酸序列

SEQ ID NO:60:ProtL-ABD融合蛋白的核酸序列

SEQ ID NO:61:ProtL-ABD融合蛋白的氨基酸序列。添加甲硫氨酸(带下划线)作为起始密码子。

在下文中，出于说明的目的，在相应的核酸序列(SEQ ID NO:60)下方显示ProtL-ABD的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)。蛋白L结构域B1的序列开始于Lys³²⁶，结束于Gly³⁸⁹(UniProt Q51918)

第337、347、360、364、368和369的位置以黑体显示并带有下划线。

SEQ ID NO:62:pASK75-ProtL-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:63:AJR_ProtL_PHE337TAG_fw的核酸序列

CATTAAAGTTAATCTGATTTAGGCCGATGGTAAAAC

SEQ ID NO:64:AJR_ProtL_PHE337TAG_rv的核酸序列

GTTTTACCATCGGCCTAAATCAGATTAACTTTAATG

SEQ ID NO:65:AJR_ProtL_Y361N_L365S_fw的核酸序列

CAAAAGCCTATGCCAACGCCGATCTGAGCGCAAAAGAAAATGGTG

SEQ ID NO:66:AJR_ProtL_Y361N_L365S_rv的核酸序列

CACCATTTTCTTTTGCGCTCAGATCGGCGTTGGCATAGGCTTTTG

SEQ ID NO:67:ProtL^UAG337-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:68:AJR_ProtL_PHE347TAG_fw的核酸序列

CAGACCGCAGAATAGAAAGGCACCTTTG

SEQ ID NO:69:AJR_ProtL_PHE347TAG_rv的核酸序列

CAAAGGTGCCTTTCTATTCTGCGGTCTG

SEQ ID NO:70:AJR_ProtL_TYR361ALA_fw的核酸序列

CCGCAAAAGCCTATGCCGCGGCCGATCTGCTGGC

SEQ ID NO:71:AJR_ProtL_TYR361ALA_rv的核酸序列

GCCAGCAGATCGGCCGCGGCATAGGCTTTTGCGG

SEQ ID NO:72:ProtL^UAG347-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:73:AJR_ProtL_ALA360TAG_fw的核酸序列

CCGCAAAAGCCTATTAGTATGCCGATCTGC

SEQ ID NO:74:AJR_ProtL_ALA360TAG_rv的核酸序列

GCAGATCGGCATACTAATAGGCTTTTGCGG

SEQ ID NO:75:ProtL^UAG360-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:76:AJR_ProtL_LEU364TAG_fw的核酸序列

CTATGCCTATGCCGATTAGCTGGCAAAAGAAAATGG

SEQ ID NO:77:AJR_ProtL_LEU364TAG_rv的核酸序列

CCATTTTCTTTTGCCAGCTAATCGGCATAGGCATAG

SEQ ID NO:78:ProtL^UAG364-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:79:AJR_ProtL_GLU368TAG_fw的核酸序列

GATCTGCTGGCAAAATAGAATGGTGAATATACCG

SEQ ID NO:80:AJR_ProtL_GLU368TAG_rv的核酸序列

CGGTATATTCACCATTCTATTTTGCCAGCAGATC

SEQ ID NO:81:ProtL^UAG368-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:82:AJR_ProtL_ASN369TAG_fw的核酸序列

CTGCTGGCAAAAGAATAGGGTGAATATACCGC

SEQ ID NO:83:AJR_ProtL_ASN369TAG_rv的核酸序列

GCGGTATATTCACCCTATTCTTTTGCCAGCAG

SEQ ID NO:84:ProtL^UAG369-ABD的核酸序列

SEQ ID NO:85:pSBX8.CafRS#30d71的核酸序列

SEQ ID NO:86:ProtL^UAG337-ABD的氨基酸序列。Caf的位置以黑体显示并带有下划线。

Claims (53)

1.包含光响应性元件的多肽，

其中可以通过用特定波长的光对所述多肽进行照射来转换光响应性元件的构型，

并且其中所述构型的转换改变了多肽与配体的结合活性。

2.如权利要求1所述包含光响应元件的多肽用于分离和/或纯化目标分子的用途。

3.如权利要求1所述包含光响应元件的多肽或如权利要求2所述的用途，其中所述包含光响应元件的多肽是固相的一部分。

4.分离和/或纯化目标分子的方法，该方法包括以下步骤：

(i)使包含目标分子的液相与权利要求1或3所述的包含光响应元件的光转换多肽接触，

其中所述包含光响应元件的多肽是固相的一部分，

且其中光响应元件处于第一构型，以使该多肽对目标分子具有高亲和力；和

(ii)使用将光响应元件改变为第二构型的波长照射所述的包含光响应元件的多肽，使得该多肽对目标分子具有与步骤(i)的亲和力相比降低的亲和力，并洗脱目标分子。

5.如权利要求1或3所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2所述的用途、或权利要求4所述的方法，其中所述包含光响应元件的多肽是包含光响应元件的链霉亲和素或其变体或突变蛋白。

6.如权利要求1、3和5中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5中任一项所述的用途、或权利要求4或5所述的方法，其中所述包含光响应元件的多肽包括以下序列或由其构成：

(i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；

(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

(iv)SEQ ID NO:86的氨基酸序列；

(v)SEQ ID NO:20的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:20的12位的残基被光响应元件代替；

(vi)SEQ ID NO:61的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:61的13位的残基被光响应元件代替；

或

(vii)具有与(i)-(vi)中任何一个氨基酸序列至少80％的同一性的氨基酸序列，

其中所述多肽包含光响应元件，其中所述光响应元件的构型可以通过用特定波长的光照射所述多肽来转换，并且其中所述构型的转换改变了所述多肽与配体的结合活性。

7.如权利要求1、3、5和6中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3、5和6中任一项所述的用途、或权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述光响应元件的一种构型向另一种构型的转换改变了多肽的配体结合口袋或位点的构象或形状。

8.如权利要求1、3和5-7中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-7中任一项所述的用途、或权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述光响应元件在多肽的配体结合口袋或位点中或附近。

9.如权利要求1、3和5-8中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-8中任一项所述的用途、或权利要求4-8中任一项所述的方法，其中所述光响应元件参与配体与多肽的结合。

10.如权利要求1、3和5-9中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-9中任一项所述的用途、或权利要求4-9中任一项所述的方法，其中光响应元件是

(i)在SEQ ID NO：2、4、8和10中任一个的氨基酸位置96处；

(ii)在SEQ ID NO：6和12中任何一个的位置132处；

(iii)在SEQ ID NO:20的位置12处；

(iv)在SEQ ID NO:61和86中任一个的位置13处；

(v)在具有与SEQ ID NO:2、4、8或10中任一项的氨基酸序列至少80％的同一性的氨基酸序列中，分别在与SEQ ID NO：2、4、8或10的氨基酸位置96处同源的氨基酸位置上；

(vi)在具有与SEQ ID NO:6或12中任一项的氨基酸序列至少80％的同一性的氨基酸序列中，分别在与SEQ ID NO：6或12的氨基酸位置132处同源的氨基酸位置上；

(vii)在具有与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80％的同一性的氨基酸序列中，在与SEQ ID NO：20的氨基酸位置12处同源的氨基酸位置上；

(viii)在具有与SEQ ID NO:61和86中任一项的氨基酸序列至少80％的同一性的氨基酸序列中，在与SEQ ID NO：61的氨基酸位置13处同源的氨基酸位置上。

11.如权利要求1、3和5-10中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-10中任一项所述的用途、或权利要求4-10中任一项所述的方法，其中包含光响应元件的第一构型的多肽与包含光响应元件的第二构型的多肽相比对配体具有更高的亲和力。

12.如权利要求1、3和5-11中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-11中任一项所述的用途、或权利要求4-11中任一项所述的方法，其中包含光响应元件的第一构型的多肽对配体具有高亲和力，而包含光响应元件的第二构型的多肽对所述配体具有低亲和力。

13.如权利要求1、3和5-12中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-12中任一项所述的用途、或权利要求4-12中任一项所述的方法，其中光响应元件包含偶氮基团。

14.如权利要求1、3和5-13中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-13中任一项所述的用途、或权利要求4-13中任一项所述的方法，其中光响应元件包含光转换的氨基酸侧链。

15.如权利要求1、3和5-14中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-14中任一项所述的用途、或权利要求4-14中任一项所述的方法，其中光响应元件包含非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸的两个异构体能够用特定波长的光来转换。

16.如权利要求1、3和5-15中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-15中任一项所述的用途、或权利要求4-15中任一项所述的方法，其中所述光响应元件包含

(i)3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或其衍生物；或

(ii)4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或其衍生物。

17.如权利要求1、3和5-16中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-16中任一项所述的用途、或权利要求4-16中任一项所述的方法，其中所述异构体是反式异构体和顺式异构体。

18.如权利要求1、3和5-17中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-17中任一项所述的用途、或权利要求4-17中任一项所述的方法，其中包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的反式异构体的多肽与包含3'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸或4'-羧基苯基偶氮苯丙氨酸的顺式异构体的多肽相比与配体的亲和力增加。

19.如权利要求1、3和5-18中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-18中任一项所述的用途、或权利要求4-18中任一项所述的方法，其中在具有405-470nm的可见光下，至少70％的多肽包含光响应元件的反式异构体。

20.如权利要求1、3和5-19中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-19中任一项所述的用途、或权利要求4-19中任一项所述的方法，其中在具有310-370nm的紫外(UV)光下，至少85％的多肽包含光响应元件的顺式异构体。

21.如权利要求3和5-20中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求3和5-20中任一项所述的用途、或权利要求4-20中任一项所述的方法，其中所述固相是亲水性的。

22.如权利要求3和5-21中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求3和5-21中任一项所述的用途、或权利要求4-21中任一项所述的方法，其中所述固相是基质、水凝胶、珠子、磁珠、芯片、玻璃表面、塑料表面、金表面、银表面或平板。

23.如权利要求22所述的包含光响应元件的多肽、权利要求22所述的用途、或权利要求22所述的方法，其中所述基质、水凝胶、珠子、芯片、玻璃表面、塑料表面或平板是透光的。

24.如权利要求22或23所述的包含光响应元件的多肽、权利要求22或23所述的用途、或权利要求22或23所述的方法，其中所述基质、水凝胶或珠子是亲和色谱柱的固相。

25.如权利要求22-24中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求22-24中任一项所述的用途、或权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述基质是N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化的CH-琼脂糖。

26.如权利要求22所述的包含光响应元件的多肽、权利要求22所述的用途、或权利要求22所述的方法，其中所述平板是微量滴定孔板。

27.如权利要求1、3和5-26中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-26中任一项所述的用途、或权利要求4-26中任一项所述的方法，其中所述多肽共价或非共价连接于固相。

28.如权利要求3和5-27中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求3和5-27中任一项所述的用途、或权利要求4-27中任一项所述的方法，其中固相至少在300nm至500nm，优选330nm至450nm的波长范围内是耐光的。

29.如权利要求1、3和5-28中任一项所述的包含光响应元件的多肽、权利要求2、3和5-28中任一项所述的用途、或权利要求4-28中任一项所述的方法，其中所述配体是选自以下的分子：肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段、免疫球蛋白或其片段、酶、激素、细胞因子、复合物、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞、生物大分子、生物分子和小分子。

30.如权利要求29所述的包含光响应元件的多肽、权利要求29所述的用途、或权利要求29所述的方法，其中所述肽配体包含以下或由以下组成：

(i)SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或

(iii)具有与SEQ ID NO:13或14至少80％同一性且具有与链霉亲和素或其突变体或变体的亲和力的氨基酸序列。

31.如权利要求30所述的包含光响应元件的多肽、权利要求30所述的用途、或权利要求30所述的方法，其中所述链霉亲和素突变体是具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质的四聚体。

32.如权利要求4-31中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前和/或过程中，用400-500nm的可见光照射所述多肽。

33.如权利要求4-32中任一项所述的方法，其中该方法还包括步骤：

(i’)用适当的缓冲液洗涤固相。

34.如权利要求33的方法，其中在步骤(i’)期间用具有400-500nm的可见光照射多肽。

35.如权利要求4-34中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)期间用具有300-390nm的紫外光照射多肽。

36.如权利要求4-35中任一项所述的方法，其中该方法还包括步骤：

(iii)将包含光响应元件的多肽再生为对目标分子具有亲和力的第一构象。

37.如权利要求36所述的方法，其中在步骤(iii)期间通过用400-500nm的可见光照射所述多肽来再生光响应元件。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中在步骤(iii)期间用适当的缓冲液洗涤固相。

39.如权利要求2、3和5-31中任一项所述的用途、或权利要求4-38中任一项所述的方法，其中所述目标分子是选自以下的分子：肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，免疫球蛋白或其片段、酶、激素、细胞因子、复合物、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质体、纳米颗粒、细胞、生物大分子、生物分子和小分子。

40.如权利要求2、3、5-31和39中任一项所述的用途、或权利要求4-39中任一项所述的方法，其中所述目标分子是天然蛋白质或重组产生的蛋白质。

41.如权利要求2、3、5-31、39和40中任一项所述的用途、或权利要求4-40中任一项所述的方法，其中所述目标分子是治疗性蛋白质。

42.如权利要求39所述的用途、或权利要求39所述的方法，其中所述抗体片段是Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段或单结构域抗体。

43.如权利要求4-42中任一项所述的方法，其中包含目标分子的液相是细胞提取物或培养物上清液。

44.如权利要求43中所述的方法，其中所述细胞提取物是胞质或全细胞提取物。

45.包含如权利要求1、3和5-31中任一项所述的包含光响应元件的多肽的亲和基质。

46.包含如权利要求45所述的亲和基质的亲和色谱柱。

47.如权利要求46所述的亲和色谱柱，其中所述基质是包含在透光管或容器中；和/或在包含至少一根光纤的管或容器中。

48.如权利要求47所述的亲和色谱柱，其中所述透光管或容器是由玻璃或塑料制成。

49.亲和色谱设备，其包括

(i)如权利要求46-48中任一项所述的亲和色谱柱；

(ii)光源；

(iii)外壳；和

(iv)电子接口。

50.如权利要求49所述的亲和色谱设备，其中所述光源包括一个、两个或更多个发光二极管、LED、荧光管和/或激光器或由其组成。

51.如权利要求49或50中所述的亲和色谱设备，其中光源发出的光的波长是电子控制的。

52.如权利要求49-51中任一项所述的亲和色谱设备，其中光源发射的光的波长是可转换的。

53.如权利要求49-52中任一项所述的亲和色谱设备，其中由一个、两个或更多个光源发射的光的波长可从具有400-500nm的可见光转换至具有300-390nm的紫外光，且反之亦然。