CN110632051B - 一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，将微塑料悬浮液浓缩、过滤后加入偶联剂反应，染色，采用流式细胞仪计数并分选；所述染色剂为藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液。本发明将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白和其他染色剂进行复配，两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。
Description
技术领域
本发明涉及污染除了技术领域，具体涉及一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法。
背景技术
微塑料是海洋塑料垃圾中的一个重要类型，目前一般是指尺寸小于5mm的塑料，包括通过各种途径进入海洋的塑料工业使用的米粒大小的塑料颗粒原料( nurdles) 、大块塑料垃圾在海洋中经理化作用（海浪冲击、水解和光降解等）形成的塑料碎屑等、各种生活用品的添加物( 例如卫生用品、美容用品等) 和工业生产使用的抛光料等。为了从不同的海洋环境中鉴别和定量分析微型塑料，研究人员采取了许多不同的采样、测定和分析方法。传统水体采样预处理后一般将微塑料过滤到各类膜上，在显微镜下进行样品计数并用尖镊挑选样品，再用各类方法进行鉴定。实际操作过程中，不仅显微镜下人工计数环节费时费力，针对小于100um微塑料颗粒的挑选也非常困难，造成实际工作中小尺寸微塑料颗粒丰度计算及鉴定的极大误差。
流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的特异性荧光信号及非荧光散射信号的将细胞亚群从中分选出来。根据流式细胞仪的工作原理，我们可以将微塑料染上荧光染料后，比如尼罗红染料，用流式细胞仪对微塑料100um以下的颗粒进行自动计数和分选。
发明内容
本发明提供一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，通过将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白或/和其他染色剂进行复配，得到一种荧光性强的标记方法，复配时两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。
本发明提供一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，将微塑料悬浮液浓缩、过滤后加入偶联剂反应，染色，采用流式细胞仪计数并分选；所述染色剂为藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液。
作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为0.5-1wt%。
作为本发明进一步的改进，具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入偶联剂，反应1-2h；配置藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液，加入经前步处理的微塑料悬浊液中对微塑料颗粒进行染色；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
作为本发明进一步的改进，所述染色条件为采用超声波震荡仪将混合液震荡混匀后静置10min，离心，弃除上清液；所述超声波震荡仪的功率为1000-1200W；所述离心条件为离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液与微塑料悬浊液的体积比为1：（80-120）。
作为本发明进一步的改进，所述微塑料悬浊液的密度为2.2-2.7g/cm3，采用悬浮法密度计测定。
作为本发明进一步的改进，所述偶联剂为硅烷偶联剂，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.1-0.2wt%。
作为本发明进一步的改进，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液由藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液替换，所述藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液由以下方法制备：将其他染色剂配置成溶液，与藻蓝蛋白或藻红蛋白溶液等体积混合。
作为本发明进一步的改进，所述其他染色剂选自苯胺蓝、亮绿、甲基绿中的一种。
作为本发明进一步的改进，所述其他染色剂溶液中其他染色剂的质量分数为1-2wt%。
本发明具有如下有益效果：本发明采用偶联剂将微塑料颗粒进行改性，使其颗粒上接有许多羟基等活性基团，与染色剂混合染色时通过范德华力、氢键作用等可牢固连接，显色度强，便于荧光标记；
本发明采用藻蓝蛋白或藻红蛋白溶液对经过硅烷偶联剂改性的微塑料颗粒进行染色，所述染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白具有荧光时间长、荧光显色度高、天然易降解、安全无毒副作用的性能，更加方便微塑料颗粒的计数以及荧光标记；
本发明将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白和其他染色剂进行复配，两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中两种计数方法相对标准偏差图；
图2为本发明测出来1中两种计数方法计数结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入硅烷偶联剂KH550，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.1wt%，反应1h；配置1g藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液（所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为0.5wt%），加入经前步处理的80-120g微塑料悬浊液（密度为2.2g/cm3，采用悬浮法密度计测定）中对微塑料颗粒进行染色，染色条件为采用超声波震荡仪（功率为1000W）将混合液震荡混匀后静置10min，离心，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，弃除上清液；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
实施例2
一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入硅烷偶联剂KH550，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.2wt%，反应2h；配置1g藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液（所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为1wt%），加入经前步处理的80-120g微塑料悬浊液（密度为2.7g/cm3，采用悬浮法密度计测定）中对微塑料颗粒进行染色，染色条件为采用超声波震荡仪（功率为1200W）将混合液震荡混匀后静置10min，离心，离心转速为15000r/min，离心时间为20min，弃除上清液；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
实施例3
一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入硅烷偶联剂KH550，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.15wt%，反应1.5h；配置1g藻蓝蛋白或藻红蛋白与苯胺蓝的复合物溶液（藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为0.7wt%，苯胺蓝溶液中苯胺蓝的质量分数为1.5wt%），加入经前步处理的100g微塑料悬浊液（密度为2.5g/cm3，采用悬浮法密度计测定）中对微塑料颗粒进行染色，染色条件为采用超声波震荡仪（功率为1100W）将混合液震荡混匀后静置10min，离心，离心转速为12500r/min，离心时间为15min，弃除上清液；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
实施例4
一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入硅烷偶联剂KH550，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.15t%，反应1.5h；配置1g藻蓝蛋白或藻红蛋白与甲基绿的复合物溶液（藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白的质量分数为0.7wt%，甲基绿溶液中甲基绿的质量分数为1.5wt%），加入经前步处理的100g微塑料悬浊液（密度为2.5g/cm3，采用悬浮法密度计测定）中对微塑料颗粒进行染色，染色条件为采用超声波震荡仪（功率为1100W）将混合液震荡混匀后静置10min，离心，离心转速为12500r/min，离心时间为15min，弃除上清液；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
对比例1
采用荧光显微镜计数微塑料颗粒，吸取10μL待测样本在井形载玻片上，盖上盖玻片待检。打开荧光汞灯，将滤光片调节到450-480nm，蓝色滤光片档位，在400倍荧光模式下观察，定位边缘成苹果绿色（FITC染色特征）目标，并分别对微塑料颗粒计数。再根据取样体积与原样本体积比例换算出样本中微塑料颗粒的个数。
测试例1
将本发明实施例4和对比例1两种方法计数的结果进行对比，实施例4和对比例1的相对标准差结果见图1，计数结果见图2。
流式细胞仪计数方法可以解决荧光显微镜对高浓度样本不能直接计数的问题，本发明得出该方法的相对标准偏差与荧光显微镜方法的相对标准偏差更低，具有统计学意义，说明流式细胞仪计数方法可用于不同浓度的微塑料颗粒样本计数。
与现有技术相比，本发明采用偶联剂将微塑料颗粒进行改性，使其颗粒上接有许多羟基等活性基团，与染色剂混合染色时通过范德华力、氢键作用等可牢固连接，显色度强，便于荧光标记；
本发明采用藻蓝蛋白或藻红蛋白溶液对经过硅烷偶联剂改性的微塑料颗粒进行染色，所述染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白具有荧光时间长、荧光显色度高、天然易降解、安全无毒副作用的性能，更加方便微塑料颗粒的计数以及荧光标记；
本发明将染色剂藻蓝蛋白或藻红蛋白和其他染色剂进行复配，两者可以进行一定程度的结合，具有增强荧光显色度的效果，增强了其应用性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，其特征在于，将微塑料悬浮液浓缩、过滤后加入偶联剂反应，染色，采用流式细胞仪计数并分选；染色剂为藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液，
具体包括以下步骤：
S1. 样品制备：对微塑料悬浊液样品进行浓缩，用细胞滤膜过滤除去100μm以上不便于利用流式细胞仪的较大尺寸颗粒物，加入偶联剂，所述偶联剂为硅烷偶联剂，添加后溶液偶联剂的质量分数为0.1-0.2wt%，反应1-2h；配置藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液，加入经前步处理的微塑料悬浊液中对微塑料颗粒进行染色，所述染色条件为采用超声波震荡仪将混合液震荡混匀后静置10min，离心，弃除上清液；所述超声波震荡仪的功率为1000-1200W；所述离心条件为离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min；所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液为 藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液中藻蓝蛋白或藻红蛋白的质量分数为0.5-1wt%，其他染色剂溶液中其他染色剂的质量分数为1-2wt%；所述藻蓝蛋白或藻红蛋白与其他染色剂的复合物溶液由以下方法制备：将其他染色剂配置成溶液，与藻蓝蛋白或藻红蛋白溶液等体积混合；所述其他染色剂选自苯胺蓝、亮绿、甲基绿中的一种；
S2. 流式细胞仪检测：开机预热并例行检查后，排除管路中气泡；检测阴性对照除去空白，检测单阳管，根据仪器或实验要求选择适合流速，按设置顺序上样获取数据，数据分析。
2.根据权利要求1所述一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，其特征在于，所述藻蓝蛋白溶液或藻红蛋白溶液与微塑料悬浊液的体积比为1：（80-120）。
3.根据权利要求1所述一种用流式细胞仪计数并分选荧光标记微塑料颗粒的方法，其特征在于，所述微塑料悬浊液的密度为2.2-2.7g/cm3，采用悬浮法密度计测定。
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