CN110612443B - 一种用于观察由物体反向散射的辐射的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

一种用于观察物体(3)、特别是生物物体的装置和方法。装置具有适于照射样本(2)的光源(10)。在照射的作用下，物体(3)发射传播到屏幕(20)的反向散射的辐射(14)，屏幕的表面积大于100cm。反向散射的辐射(14)在屏幕(20)上的投射形成代表反向散射的辐射(14)的图像，由术语衍射图表示。使用图像传感器(30)来获取代表在屏幕(20)上形成的衍射图的图像。装置还包括反射元件(13)和连接支持件(17)，反射元件设置在屏幕(20)和物体(3)之间，适于沿垂直于样本平面(XY)的入射轴(Z)反射入射光束(12)的一部分，反射元件与屏幕(20)的第一面(20i)刚性地固定；连接支持件(17)在反射元件(13)和屏幕(20)之间延伸，连接支持件(17)用于将反射元件(13)与到屏幕(20)固定，且反射元件(13)和/或连接支持件(17)被配置为吸收在物体(3)和屏幕(20)之间传播的反向散射的辐射(14)的至少50％。

Description

一种用于观察由物体反向散射的辐射的方法和装置
技术领域
本发明的技术领域是基于由物体反向散射的辐射的图像来观察和识别物体，尤其是生物物体，特别是细菌菌落。
背景技术
微生物(特别是细菌)识别针对各种领域是需要的。例如，在诊断领域中，细菌的识别允许了解引起感染的病原体的性质，并且允许优化患者的治疗。另外，细菌识别是流行病学或抗医院感染的基本技术。除健康领域之外，应用还可以包括但不限制于卫生、安全和食品加工领域。
目前存在允许进行这种识别的各种有效仪器。所使用的方法特别是质谱法、拉曼光谱法、比色测试、菌落形态学分析或核酸扩增技术。使用光谱技术(质谱法或拉曼光谱法)的方法需要昂贵的器件和合格的操作者。比色方法更简单，但是通常更慢。关于核酸扩增，需要在满足精确的操作条件时连续执行许多步骤。
专利US74665560描述了一种基于利用微生物对入射激光束的散射和衍射来表征微生物的方法。微生物设置在激光光源和图像传感器之间。在激光束照射的作用下，获得出现衍射图案的图像，该图案构成观察到的微生物的特征。专利US8787633描述了一种用于相同目的的方法。这些文献描述了一种用于识别细菌的方法，所述方法似乎很有希望，但是如果设置有细菌的培养基是不透明的、有色的或散射的，该方法就变得不适用。特别地，这些方法使用以所谓的透射配置形成的图像，其中样本设置在光源和图像传感器之间。如果要获得可利用的图像，则样本必须足够透明。因此，该方法与包含有色培养基的样本不相容，例如包含羊血液中的哥伦比亚琼脂的、已知为哥伦比亚血琼脂(Columbia Blood Ship，COS)的培养基。所述方法也不适用于例如胱氨酸乳糖电解质缺乏(cystine lactoseelectrolyte deficient，CLED)琼脂的散射基质，或例如巧克力琼脂的不透明基质。然而，这种培养基频繁地用于临床诊断。
专利申请WO2016/097063通过提出一种用于观察微生物的方法部分地解决了该问题，在该方法中图像不是以透射配置形成的，而是以反向散射配置形成的。样本由激光束照射。反向散射的辐射通过收集光学器件聚焦在图像传感器上。文献WO2016/054408描述了一种类似的配置，反向散射的辐射由CMOS图像传感器收集，CMOS图像传感器的有效表面积可以达到17.28cm2。
在Huisung Kim等人的出版物中也描述了以反向散射配置操作的装置，即“eflected scatterometry for non invasive interrogation of bacterialcolonies”，International society for optical engineering,SPIE,vol.21,N°10,october 2016(“用于非侵入性询问细菌菌落的反射散射法”，国际光学工程学会SPIE，vol.21，no.10,2016年10月)。在该配置中，平坦屏幕设置在样本和图像传感器之间。所述屏幕允许背面投设由样本反向散射的辐射。样本由激光束照射，激光束在到达样本之前由反射板反射。反射板的面积为25cm2。US5241369中也描述了半透明屏幕的使用。
发明人已经实施了WO2016/097063中描述的方法，并且已经发现了下面描述的某些限制。
本发明的目的是通过提出一种以反向散射的配置观察和表征微生物的方法来克服这些限制。本发明特别适用于不透明样本，同时自然保持适用于透明样本。该方法允许观察和表征各种成长阶段的微生物菌落，无论是小菌落还是大菌落。另一个优点是该方法易于实现且稳定，并且不需要昂贵的仪器。而且，实施的方法是非破坏性的。该方法可以在菌落的培养基中应用于菌落，而不需要取样。最后，分析是很快的，大约花费一秒。
发明内容
本发明首先涉及一种用于观察存在于样本中的物体的装置，包括：
-保持器，其能够容纳样本；
-光源，其能够发射光束以便照射物体，所述光束称为入射光束；
-图像传感器，其用于获取代表在入射光束照射的作用下由物体反向散射的辐射的图像；
该装置的特征在于，其包括：
-屏幕，其面向保持器延伸，以便当入射光束照射物体时暴露于由该物体反向散射的辐射，从而在屏幕上形成代表反向散射的辐射的图像，称为衍射图；
-该屏幕包括暴露于反向散射的辐射的第一面；
-图像传感器被配置为获取在屏幕上形成的衍射图的图像。
光源尤其可以是激光源。该装置可以包括准直光学器件，使得由光源发射的光束是准直的。该装置可以包括光束扩展光学器件，以便将光束的直径调节到被分析物体的尺寸和形态。
所述物体可以是微生物菌落，例如细菌菌落，在这种情况下，屏幕允许获得其尺寸足够大以表征在成长的足够进展阶段下的菌落的衍射图。
根据一个实施例，屏幕的第一面的面积大于100cm2。
该装置可以包括反射元件，反射元件设置在屏幕和物体之间，所述反射元件能够沿垂直于或基本垂直于样本平面的入射轴反射入射光束的一部分，反射元件牢固地固定到屏幕的第一面。这使得可以避免由支撑反射元件的臂对屏幕上形成的衍射图的干扰，其中所述臂横向于反向散射的辐射延伸。
该装置可以包括以下特征中单独的或技术上可行的组合的任一项：
-屏幕包括第二面，使得在第一面上形成的衍射图出现在第二面上；屏幕在图像传感器和保持器之间延伸，使得图像传感器通过聚焦光学器件耦合到第二面。屏幕用作背光屏幕，将投射到第一面上的衍射图透射到第二面。
-反射元件和屏幕之间的距离小于2cm。
-反射元件的面积小于4cm2或小于2cm2或小于1cm2。
-该装置包括在反射元件和屏幕之间延伸的接合介质，该接合介质使得反射元件固定到屏幕，该装置使得反射元件和/或接合介质被配置为吸收在物体和屏幕之间传播的反向散射的辐射的至少20％、或甚至至少30％、或甚至至少50％。
-屏幕是半透明的。
-屏幕包括用于在第一面和第二面之间传送光的光导，例如光纤。屏幕可以包括在第一面和第二面之间延伸的多个光纤。
-屏幕是图像传感器的光敏部分，光敏部分允许将反向散射的辐射转换成电荷载流子。
-屏幕将少于90％的反向散射的辐射从第一面透射到第二面。
-屏幕相对于保持器是可移动的，保持器和屏幕之间的距离是可以调整的。
-入射光束在反射元件和物体之间围绕称为入射轴的轴传播，该装置包括称为环形反射器的部件，环形反射器在样本和屏幕之间围绕入射轴延伸，环形反射器能够将反向散射的辐射(14)中的一部分反射到屏幕(20)。
-屏幕是弯曲的，尤其是朝向样本(或物体)弯曲。
本发明的另一个主题是一种观察存在于样本中的物体的方法，该样本面向包括第一面的屏幕延伸，该方法包括以下步骤：
a)使用由光源发射的入射光束照射物体，入射光束传播到物体；
b)使屏幕的第一面暴露于由样本在照射的作用下反向散射的光辐射，以便在所述第一面上形成代表所述反向散射的辐射的图像，称为衍射图；
c)利用图像传感器获取在屏幕上形成的衍射图的图像。
根据一个实施例，该装置包括设置在屏幕和物体之间的反射元件，反射元件将由光源发射的全部或部分入射光束导向物体。反射元件尤其可以连接到屏幕的第一面。
该方法可以包括以下特征中单独的或技术上可行的组合的任一项：
-反射元件的面积小于5cm2或小于2cm2或小于1cm2。
-屏幕是弯曲的，且尤其是朝向样本弯曲。
-屏幕是半透明的。
-屏幕包括在第一面和第二面之间延伸的至少一个光导，特别是光纤。
-屏幕的一面被构造成形成透镜。
-屏幕透射少于95％或90％的反向散射的辐射。
-屏幕包括第二面，屏幕在图像传感器和样本之间延伸，使得图像传感器通过聚焦光学器件光学地耦合到第二面，该屏幕使得在第一面上形成的衍射图出现在第二面上。
-在步骤c)之后，该方法包括根据图像传感器获取的图像调整样本与屏幕之间的距离的步骤，在调整所述距离后重复步骤a)至c)。
-该方法包括基于由图像传感器获取的图像或基于结果图像表征物体的步骤d)。图像的表征可以包括：
·确定图像的特征；
·使用所述特征和通过对标准样本实施该方法的步骤a)至c)而建立的校准特征来识别物体。
-物体包括微生物。物体尤其可以包括形成菌落的多个微生物。物体可以是细菌菌落。
-该方法利用本申请描述的装置来实施。
根据通过非限制性示例给出并在下面列出的附图中示出的、本发明的具体实施例的以下描述，其它优点和特征将变得更加清楚明显。
附图说明
图1A示出了根据现有技术的用于观察微生物的装置。
图1B和1C分别示出了从两个不同的物体发出的反向散射的辐射的空间分布。
图2A和2B示出了本发明的第一实施例。图2C示出了能够在第一、第二或第三实施例中实施的屏幕的示例。图2D是图2A的细节。图2E和2F示出了在屏幕和样本之间的距离变化。图2G是用于使激光束成形的光学系统的示例。
图3A和3B分别示出了第二实施例和第三实施例。图3C和3D示出了适用于所有实施例的变体。图3E示出了其中屏幕是弯曲的变体。
图4A和4B示出了根据装置的两种不同布置的细菌菌落的衍射图。
图5A、5B和5C示出了用于移动所观察的细菌菌落以使其相对于入射光束和相对于屏幕居中的方法。图5A是稍微偏离中心的衍射图。图5B是对图5A中所示的衍射图应用滤波器得到的结果。图5C示出了再居中之后的图5A的衍射图。
图6示出了所谓的高动态范围的一个实施例，其中结合了各种图像。
图7A、7B、7C、7D、7E和7F示出了各种细菌菌落的衍射图。
图8A和8B示出了细菌菌落的显微镜图和衍射图。图8C和8D示出了另一细菌菌落的显微镜图和衍射图。
图9A、9B和9C是在各种培养基上形成的细菌菌落的衍射图。
图9D示出了不同于形成的所观察的细菌菌落，在细菌层上形成的细菌菌落的衍射图。
图10示出了对应于给定细菌菌落的衍射图随时间的变化。
图11A示出了结合平坦屏幕和弯曲屏幕的实验装置。
图11B是使用图11A中示意性示出的装置观察到的细菌菌落的图像。
具体实施方式
图1A示出了例如专利申请WO2016/097063中描述的一种用于观察微生物的装置。激光光源10发射直线偏振光束102，直线偏振光束102传播到待表征的物体3，例如设置在培养基4的表面上的细菌菌落。在到达细菌菌落3之前，偏振光束102通过半涂银镜103偏离，以便在称为入射方向的方向上传播，该入射方向基本上垂直于培养基4的表面。光束102在到达细菌菌落3之前穿过四分之一波片104。光束102与细菌菌落3相互作用，这导致形成反向散射的辐射14，反向散射的辐射在与入射方向基本相反的方向上传播。反向散射的辐射14由光束102与菌落3的多次相互作用形成，结合了菌落中衍射和弹性散射的影响。在被光学系统107朝向图像传感器30聚焦之前，反向散射的辐射14穿过四分之一波片104，然后穿过半涂银镜103。在图像传感器上形成的图像(称为衍射图)代表反向散射的辐射14。该衍射图可以被认为是细菌菌落的表征，以允许识别形成菌落的细菌。代表现有技术的该装置已由发明人实施。发明人已经表明该装置不能够令人满意地观察某些细菌菌落。
特别地，反向散射的辐射14以根据观察到的微生物的类型而变化的角度范围发射。某些细菌菌落(例如葡萄球菌菌落)通过逐渐形成外表面3s而成长，所述外表面3s具有由环境介质7(例如空气)界定的接近半球的形状。这种情况在图1B中示出。在这种类型的配置中，反向散射的辐射14是发散的，并形成覆盖高角度范围Ω的锥体15。高被理解为包括大于65°或甚至85°的角度。这特别是由于在反向散射的辐射穿过表面3s以便在环境介质7中折射时，反向散射的辐射的折射所引起的。相比，如图1C所示，其他细菌菌落通过逐渐形成平坦表面3s而成长，该平坦表面的曲率半径大。因此，反向散射的辐射14在环境介质7中折射并且在该环境介质7中以会聚光束传播，形成具有顶角Ω的锥体15。肠杆菌型的细菌形成具有这种形态的菌落。因此，根据所观察的微生物的类型以及其成长阶段，菌落的形态变化，影响反向散射的辐射14的空间分布。WO2016/097063中描述的装置的一个局限是视野小且固定，不适于形状类似图1B所示示例的形状的细菌菌落。发明人已经定义了一种考虑了反向散射的辐射14的空间分布的可变性的观察装置。更具体地，根据本发明的装置具有可以适应所观察的微生物的视野。特别地，发明人已经确定，对于产生空间分布在图1B中示出的反向散射的辐射的微生物，可能需要非常大的视野。
图2A示出了根据本发明的装置1的第一实施例。在这种情况下，这是优选实施例。该装置包括能够发射称为入射光束的光束12的光源10，所述光束12传播到包括待表征的物体3的样本2。光源10优选在时间上和空间上是相干的。光源10优选为激光源。根据一个变体，光源可以是发光二极管或白光光源。因此，光源优选是空间相干的、充分的点状物。这可以通过将光源10与空间滤波器(例如光阑或光纤)相关联来获得。光源10还可以与带通滤波器相关联，以便获得足够窄的发射光谱带Δλ，优选地窄于50nm或甚至10nm。
由光源发射并朝向物体3传播的入射光束12优选地是平行光束，可以有利地调整该平行光束的直径。入射光束12的直径优选为100μm到10mm。直径的调整使得可以适应待表征的物体3的大小。因此，当物体3是细菌菌落时，这允许将入射光束12的大小调整为菌落的形态，菌落的形态取决于细菌的类型和成长阶段。成形光学系统11可以设置在光源10和物体3之间。成形光学系统11可以允许调整入射光束12的直径。还可以允许标准化地增加入射光束12中的能量的空间分布，使得光束中的光强度更均匀。
待表征的物体3可以是微生物或形成菌落的一组微生物。微生物可以是细菌、酵母、真菌或微藻。待表征的物体还可以是形成例如簇的一组细胞。待表征的物体可以通过设置在培养基中或培养基的表面上与培养基4进行接触。培养基4被限制在外围件5中。培养基4和/或外围件5可以是不透明或半透明的。特别地，培养基4和外围件5不是必须为透明的，必须为透明是关于现有技术描述的基于传输配置的方法的条件。由外围件5、培养基4和物体3形成的组件形成样本2，该样本搁置在保持器6上。在所示的示例中，保持器是能够沿称为入射轴的轴Z平移移动的平面台。本发明特别适用于包含不透明培养基4的样本。当培养基4不是足够不透明时，外围件5优选是不透明的，并且优选是吸收性的，以便最小化寄生反射。外围件5可以包括盖，前提是该盖是透明的。当外围件5是透明的时，优选设置在不透明或半透明的保持器6上。这种保持器防止了寄生反射。
该装置包括反射元件13，例如镜子，该镜子能够沿着入射轴Z引导由光源发射的入射光束12，所述入射轴Z基本上垂直于待观察的物体3的表面3s或基本上垂直于XY平面，XY平面称为样本平面，样本2的培养基4在该平面中延伸。基本上垂直是指在角度公差内的垂直，角度公差优选小于±30°，或优选小于±20°。因此，在角度公差内入射光束12以基本上等于90°的入射角到达物体3。在所示的示例中，入射光束包括光源10和反射元件13之间的第一分量121和反射元件13和物体3之间的第二分量122。到达物体的入射光束12优选地在样本的XY平面中相对于物体3居中。
在入射光束12照射的作用下，物体3发射沿着或围绕中心反向传播轴-Z传播的反向散射的辐射14，中心反向传播轴-Z平行于入射轴Z并且与入射轴Z的方向相反。通常，术语反向散射的辐射表示沿着包括与入射轴Z相反的分量的传播轴传播的辐射。反向散射的辐射14由入射光束12的光子与物体3的相互作用产生，物体3具有比环境介质7的折射率更高的折射率，入射光束通过环境介质7传播，环境介质7通常是空气。由于入射角，大部分入射光束12传播到物体3中，从而形成折射的入射光束。在物体3中折射的入射光束12在物体中经历了一个或更多个弹性散射，并且可以产生衍射波。如参考图1B和1C所述的，反向散射的辐射14从物体发出并穿过表面3s传播。反向散射的辐射在环境介质7中被折射，然后围绕反向传播轴-Z传播到屏幕20，在屏幕20上反向散射的辐射形成代表反向散射的辐射的图像I20，称为衍射图。反向传播轴-Z与入射轴Z同轴，入射光束沿着入射轴到达物体。在盎格鲁-撒克逊文献中，本文的衍射图通常被称为“散射图”、或“散射图案”，也可以翻译为术语散点图。注意到在物体3和屏幕20之间没有设置聚焦或成像的光学器件。
反射元件13的面积应尽可能小，以便不干扰从物体3发出的反向散射的辐射14。反射元件的面积优选小于5cm2，更优选小于2cm2，或甚至小于1cm2。反射元件13的面积优选地适合于由光源10发射的光束的直径。
当物体被光束12照射时，屏幕20能够收集由物体3反向散射的辐射14。术语屏幕表示其第一面201收集反向散射的辐射14的元件，反向散射的辐射14被投射到所述第一面201上。因此，衍射图I20形成在屏幕20的第一面201上。在样本的XY平面上，屏幕20具有至少50cm2的面积，但其面积优选大于100cm2，或甚至大于200cm2，例如400cm2，即边长为20cm的正方形。
该装置包括图像传感器30，以便获取在屏幕上形成的衍射图I20的图像I30。图像传感器30尤其可以是包括以矩阵排列的像素的矩阵传感器，每个像素形成一个基本光电检测器。图像传感器30例如是CCD或CMOS的传感器。图像传感器30连接到例如微处理器的处理器40，处理器40包括存储器42，图像处理指令存储在存储器42中，这些指令允许分析由图像传感器30获取的图像以表征物体3。处理器40还可以允许保持器6相对于屏幕20的移动，如下所述。监视器44允许观察所获取的图像。
在图2A所示的实施例中，为了允许将衍射图投射到屏幕20上，屏幕20不是完全透明的：屏幕20通过吸收和/或散射与散射辐射14相互作用。优选地，屏幕透射高达80％、或甚至90％或95％的反向散射的辐射，未透射的部分被吸收或散射。发明人相信，大约75％的透射率是最佳的。透射率是指由屏幕透射的辐射强度与入射到屏幕上的辐射强度之间的比。屏幕的透射率优选小于95％、或甚至小于90％或80％。不透明度被定义为与透射率相反。屏幕20包括优选地平行于第一面201延伸的第二面202。屏幕20被配置成使得投射到第一面201上的图像(在这种情况下是衍射图)也通过透射和/或散射出现在第二面202上。由于屏幕20插入在散射辐射源(在这种情况下是物体3)和图像传感器30之间，因此屏幕20充当背光屏幕或背投屏幕。屏幕20可以是半透明的，术语半透明表示不透明的(即透过其不能够清楚地辨别元件)、但允许光通过的材料。屏幕20例如是透写纸基板、包括散射元件的基板(例如微珠)、或者甚至织物或粗糙玻璃片。当屏幕包括微珠时，微珠可以是由聚碳酸酯制成的微珠。适于这种应用的以织物形式的背投屏幕例如由Multivision公司参考“retro gris”或“retro crème”销售。当屏幕20是透写纸片时，屏幕20可以包括Bendtsen粗糙度为100至300ml/mm的粗糙表面，Bendtsen粗糙度根据标准NF 8791-2确定。在第一面201上形成的衍射图出现在第二面202上，如图2B中所示。
该装置包括聚焦光学器件25，聚焦光学器件25允许聚焦在屏幕20的第二面202上形成的衍射图I20，使得由图像传感器获取的图像I30对应于该衍射图。优选地，图像传感器30平行于屏幕20延伸，并且聚焦光学器件25包括与反向传播轴-Z(或与入射轴Z)同轴的光轴。因此，由图像传感器形成的图像与在屏幕上形成的衍射图I20相对应，而没有变形。
根据一个变体，屏幕20包括结构化光学部件，其限定例如菲涅尔(Fresnel)透镜。菲涅尔透镜包括同心环形结构，同心环形结构布置成以短焦距聚焦大直径的图像。公司DNP销售用于反向散射应用的屏幕，基于屏幕的一侧或两侧上的结构化光学透镜。这些屏幕被称为“光学背投屏幕”。这样的屏幕允许增加由图像传感器收集的信号量。
根据一个变体，屏幕20包括在第一面201和第二面202之间延伸的多个光导，以便于将衍射图从第一面201传送到第二面202。它可以是包括在第一面201和第二面202之间彼此相邻延伸的光纤阵列的光纤面板。在XY平面中，这种屏幕的尺寸可以达到几百cm2，例如32.5cm x 32.5cm。每个光纤的直径为5μm到25μm，数值孔径为0.92到1。这种面板例如由Schott公司销售。
图2C示出了由两层形成的屏幕：限定屏幕的第一面201的下层21和限定屏幕的第二面202的上层22。例如由于下层21由玻璃或塑料制成的粗糙片组成，粗糙表面对应于第一面201，因此下层21可以是散射的。上层22可以形成由玻璃制成的透明片或菲涅尔透镜，用作保护层。
图2D示出了反射元件13，以及入射辐射12和反向散射的辐射14的细节。入射辐射12包括第一分量121，所述第一分量在光源10和反射元件13之间传播。入射辐射包括第二分量122，所述第二分量从反射元件13传播到物体3。还示出了从物体3发出的、以具有顶角Ω的锥体15形式的反向散射的辐射14。反向散射的辐射包括第一分量，第一分量表示为141，称为“反射分量”，其基本上与入射光束12从样本表面的镜面反射相对应，第一分量加入0级衍射。反向散射的辐射包括围绕第一分量141延伸的第二分量142，第二分量包括可用于表征物体3的信息。反射元件13的尺寸根据由光源发射的光束121的直径确定。这例如是边长为10至15mm的棱镜，其相对于来自光源10的光束121的取向倾斜45°。优选地，反射元件13牢牢地固定到屏幕20。这使得可以防止用于保持反射元件的臂B需要延伸到反向散射的辐射14传播的锥体15中，这将导致在屏幕20上形成的衍射图的劣化。反射元件13和屏幕20之间的距离δ优选大于1mm。例如小于1mm的太小的距离δ可能引起由光源发射并传播到反射元件13的激光束121与屏幕20的相互影响。优选地，距离δ小于10mm或20mm，或甚至30mm，以便不妨碍样本2在屏幕20的方向上平移，如下所述的。反射元件13优选地经过抗反射处理。反射元件13可以包括不透明的后表面16，以便阻挡非反射的辐射的传播。这使得可以避免光泄漏。反射元件可以通过接合介质17与屏幕20连接。优选地，接合介质17在反射元件和屏幕之间延伸，平行于到达样本的入射光束12的轴Z，同时有利地与到达样本的入射光束12同轴。
优选地，与专利申请WO2016/097063中描述的装置不同，朝向屏幕20传播的反向散射的辐射14被反射元件13或接合介质17阻挡。这阻挡了反向散射的辐射的第一分量141(反射分量)朝向屏幕的透射。然而，如前所述，反射分量141基本上表示入射光束12从物体3的镜面反射；第一分量不包括或包括很少的对于表征所观察的物体3有用的信息。而且，该第一分量通常是强烈的。该第一分量不投射到屏幕20允许抑制对衍射图的强烈且无信息的贡献。这提高了衍射图的动态范围。反射分量141的遮蔽在衍射图上以暗盘的形式出现，暗盘是反射元件13或接合介质17的阴影。该阴影由图2B中所示的衍射图上的黑色箭头表示。优选地，反射元件13和/或接合介质17吸收由物体发射的反向散射的辐射14的至少30％、有利地至少50％、或甚至80％或90％。调整反射元件和接合介质的尺寸，使得它们仅遮蔽反向散射的辐射的反射分量141，而不遮蔽包含有用信息的分量142。
样本2和屏幕20之间的距离d有利地是可变的，如图2E和2F中所示。特别地，如上所述，反向散射的辐射14的空间分布可以变化，反向散射的辐射14可以采用相对开放性的锥体15的形式，发散地或会聚地从物体延伸。因此，样本的保持器6可以安装在平移台上，该平移台允许平行于入射轴Z的平移。图2E和2F分别示出了位于距离屏幕20第一距离d＝d1和第二距离d＝d2处的样本2，其中d1>d2。保持器6的移动可以由处理器40控制。距离的变化范围通常为3cm至20cm，或甚至30cm。距离根据在屏幕20上形成的衍射图来确定，使得衍射图在最大可能的区域上延伸，同时保持与图像传感器30的视野相兼容，图像传感器的视野取决于图像传感器30和聚焦光学系统25的尺寸。
距离可以手动调整，或者通过实施基于界定衍射图的轮廓识别的算法来进行。这种算法可以例如使用Canny过滤器。当检测到该轮廓时，调整距离使得在屏幕20上的衍射图的面积超过预定阈值。距离d的调整使得可以考虑由于不同类型的待表征物体引起的反向散射的辐射的可变性。根据一个实施例，当已经确定最佳距离时，允许最大化投射到屏幕上的衍射图的面积，获取衍射图的图像。然后增加距离，以便验证在先前观察到的衍射图(即对应于最佳距离)外部没有反向散射的辐射。
优选地，保持器6还在样本的XY平面中移动。这允许入射光束12在物体3上居中。这允许执行分析而无论样本2中的物体3的位置如何。可以根据衍射图的对称性标准来调整这种居中。特别地，当入射光束在物体上居中时，屏幕上呈现的衍射图具有旋转对称性。对称性可以例如通过衍射图轮廓的形状来量化。
根据第二实施例，如图3A所示，屏幕20由大尺寸的图像传感器形成，该图像传感器的敏感面积大于100cm2或更大。根据该实施例，屏幕20还用作图像传感器30。图像传感器可以是例如用于医疗X射线成像装置中的传感器，其然后与闪烁体材料耦合，以确保X射线辐射和传感器可检测的可见辐射之间的转换。这种类型的传感器对可见辐射敏感，同时具有可以很大的面积。屏幕20与图像传感器30的光敏部分相对应，在光敏部分中，入射的可见光子被转换成电荷载流子。
在文献WO2014/006214中给出了制造这种由硅制成的传感器的示例，所述传感器的检测面积大于100cm2或200cm2。像素的区域可以为50μm到200μm。透明的小厚度的保护板，通常厚度为几毫米，可以抵靠屏幕20设置。相对于第一实施例，这样的实施例可以允许灵敏度的显着提高，但是成本更高。
根据第二实施例，如图3B所示，屏幕20不是背投屏幕，而是前投屏幕，样本2和图像传感器30面向屏幕20的同一面设置。在该实施例中，反向散射的辐射14在屏幕的第一面201上形成衍射图。图像传感器30使用光学系统25光学地耦合到第一面201。图像传感器30获取投射到第一面上的衍射图的图像。然而，在该实施例中，图像传感器相对于屏幕偏离中心。在该实施例中，不能移除在屏幕20上形成的衍射图的反射分量141。另外，该实施例不允许屏幕20和入射光束12都居中在待表征的物体3上。
反向散射的辐射14的空间分布可以根据所观察的物体而显着变化。在一些情况下，该空间分布在入射轴Z的两侧上在非常高的角度范围内延伸。当物体(在这种情况下是细菌菌落)具有弯曲形态时特别是这种情况，例如在葡萄球菌的细菌菌落上观察到的这种形态。在这种情况下，屏幕20的大小必须较大以便获得完整的衍射图，特别是考虑到大的反向散射角(通常大于65°)。术语“反向散射角”是指从物体发出的反向散射的辐射14与入射轴Z之间的角度。如前所述，还可以调整屏幕20与物体3之间的距离。这尤其允许获得其直径对应于预定模板的衍射图，例如15到20cm的直径。图3C描述了允许保持屏幕20的合理大小的同时允许考虑以大的反向散射角从物体发出的反向散射的辐射14的变体。根据该变体，平行于入射轴Z延伸的环形反射器18围绕物体3的全部或部分设置在物体3和屏幕20之间。环形反射器18允许将一部分反向散射的辐射14朝向屏幕20反射。环形反射器18可以是与入射轴Z同轴的管状反射器。图3C示出了圆柱形环形反射器。该圆柱形环形反射器的高度和直径分别可以为6cm和17.5cm。该圆柱形环形反射器可以是圆柱体，该圆柱体的内壁18i是反射的。例如，薄金属层(例如铝)可以沉积在内壁18i上。环形反射器18还可以是锥形的，如图3D所示。这种锥形反射器可以具有等于19cm的小直径、等于20cm的大直径和3cm的高度。内壁相对于Z轴的倾斜角度例如是13°。内壁18i的角度尺寸可以确定为，使得具有最大反向散射角的反向散射的辐射14在到达屏幕20之前仅经历一次反射。优选地，环形反射器18的至少一个直径大于外围件5的直径的2倍。
可以在环形反射器18和屏幕20之间提供空间，以允许入射光束12在光源10和反射元件13之间传播。
图3E示出了其中屏幕20不是平坦的并且具有朝向样本2弯曲的弯曲形状的变体。这还有助于屏幕收集以大的反向散射角反向散射的辐射。屏幕20的曲率可以是规则的或不是规则的。屏幕20可以例如描述全部或部分的半球。屏幕20可以具有圆顶形状。屏幕还可以描述具有平坦面的弯曲。
朝向样本弯曲是指屏幕描述了其中心位于样本和屏幕之间的弯曲，或者更一般地，其中心位于由屏幕界定并且包括样本的半空间中。因此，屏幕具有凹形形状，以便限定位于屏幕和样本之间的空间，该空间使得对于所述空间中的任意两个点，连接所述点的线段包括在空间中。例如可以使用由Draper Inc销售的具有Cine25色调和HC涂层的圆顶形1/4"定制真空成形的丙烯酸IRUS屏幕。优选地，反射元件在屏幕20的顶点处设置在屏幕的第一面201附近。
无论实施例如何，根据本领域技术人员已知的原理，成形光学系统11可以与光源10相关联，以便形成准直入射光束12。图2G示出了成形光学系统的示例。成形光学系统包括一系列常规的光学部件：消色差透镜110、50μm直径的针孔111、会聚透镜112和光束扩展器113。成形光学系统11可以可选地包括“平顶”型光束转换器114以及光束减薄器115。光束扩展器113允许调整激光束的大小，使得激光束的大小接近待观察物体的大小。扩展器113可以由一组具有可变焦距的两个透镜构成，可由处理器40编程。光束转换器114允许调整光束中的强度分布。
在图像传感器20上获得的图像可以允许表征物体3。表征可以是识别。为此，确定图像的特征，并将该特征与在标准物体上建立的校准特征进行比较。这些特征还可以基于所述校准特征进行分类。专利申请WO2014184390描述了一种基于正交泽尼克(Zernike)多项式的图像投射对细菌菌落进行分类的方法。可以设想其他分类算法，例如主成分分析算法。这种分类的目的是将图像的空间信息减少为一组坐标，在此基础上获得微生物的识别。
因为该方法不具有破坏性，因此可以产生相同细菌菌落在不同培养阶段的多个图像，以便了解菌落成长的特性或其抵抗抗生素或抗菌剂的能力。在这种情况下，物体的表征代表了该物体成长的趋势。
该方法还可以允许对样本表面上存在的物体的数量进行计数。
实验性试验
现在将描述使用第一实施例进行的实验性试验。使用的主要部件如下：
-光源10：由激光部件提供的、LCGFP-D-532-10C-F激光源。
-成形光学系统11：消色差透镜Thorlabs AC254-030-A-ML-A280TM-A；针孔Thorlabs-P50S，会聚透镜Thorlabs A280TM-A。
-样本外围件：直径为90mm的Pétri培养皿-Biomérieux。
-半透明屏幕：L80P3-12 Luminit聚碳酸酯-扩散器或透写纸。
-聚焦光学系统：LM5JC10M–Kowa。
-相机：UI-1492ME–IDS或AVGT3300–Allied Vision。
-反光元件：倾斜45°的镜子。
将组件设置在黑暗中。
在这些试验中，观察各种类型的细菌菌落。在每次操作期间，由操作者在视觉上将入射激光束12居中在菌落上。每个获取的图像的曝光时间为0.6ms到1500ms。通过结合由图像传感器获取的不同图像来获得一些图像。
图4A和4B示出了哥伦比亚血琼脂(Columbia Blood Ship，COS)培养基上的大肠杆菌细菌菌落的衍射图。所使用的屏幕是一张透写纸。反射元件13由平行于屏幕20延伸的横向臂B支撑(图4A)，或者由固定到屏幕的保持器6支撑(图4B)，如图2D所示。在图4A中，可以观察到平行于屏幕20延伸的横向臂B阻碍了反向散射的辐射14，这在衍射图中产生了暗直的阴影。还可以观察到衍射图包括明亮的中心区域，使图像传感器的像素饱和，其与先前描述的反射分量141相对应。在图4B中，可以观察到由保持器6的阴影形成的中心圆形暗点，该暗点由箭头标记。该阴影遮蔽了反射分量141。因此，优化了图像的动态范围，并且衍射图的外围区域142看起来更清楚。这些图像证明了结合图2D描述的反射元件13的布置。
图5A至5C示出了使物体3相对于入射光束12和相对于屏幕居中的方法。图5A是在COS培养基上的埃希氏杆菌属型的细菌菌落的衍射图的图像，所使用的屏幕是一张透写纸。通过应用Canny滤波器检测边缘，获得了图5B。衍射图的直径估计为8.2cm。确定衍射图的中心，并且移动样本使得衍射图的中心位于由图像传感器获取的图像的中心处(图5C)。这允许菌落与入射光束12以及与图像传感器的光轴对准。
图6是通过获取相同衍射图的11个图像获得的称为高动态范围的图像，曝光时间在8ms和495ms之间变化。实施了高动态范围(HDR)算法以使所获取的图像结合并形成图6的图像。该图像示出了在COS培养基上的表皮葡萄球菌的细菌菌落，屏幕是一张透写纸。
图7A至7F是通过观察在先前描述的COS琼脂上成长的细菌菌落而获得的衍射图图像的示例。每个衍射图的尺寸为20cm2 x 20cm2。用于获得这些衍射图的屏幕是一张透写纸。现在列出每个图的参数：
-图7A：沃氏葡萄球菌-激光束的直径：900μm；
-图7B：腐生葡萄球菌-激光束的直径：900μm；
-图7C：表皮葡萄球菌-激光束的直径：900μm；
-图7D：大肠杆菌-激光束的直径：1800μm；
-图7E：恶臭假单胞菌-激光束的直径：2800μm；
-图7F：阴沟肠杆菌-激光束的直径：2800μm。
图8A至8D示出了对各种尺寸的菌落的观察。图8A示出了直径为760μm的表皮葡萄球菌的微菌落的显微镜观察。图8B示出了该微菌落的衍射图。图8C示出了直径为1160μm的大肠杆菌的微菌落的显微镜观察。图8D示出了该微菌落的衍射图。
图9A至9C示出了在各种琼脂上获得的衍射图：
-图9A示出了在Polyvitex巧克力琼脂(PVX)上的腐生葡萄球菌的衍射图；
-图9B示出了在Mueller Hinton琼脂上的恶臭假单胞菌的衍射图；
-图9C示出了在胰酶大豆琼脂(TSA)上的大肠杆菌的衍射图。
这些图示出了本发明与各种培养基4的相容性，无论它们是不透明的(COS、PVX)还是透明的(TSA)。
图9D示出了在由恶臭假单胞菌层形成的表面上成长的腐生葡萄球菌的菌落的衍射图。该结果表明，本发明允许在原位无破坏性地观察菌落，而无需取样。
本发明的观察方法是非破坏性的，并且可以直接应用于培养基中的菌落。这允许观察菌落成长的历程。图10示出了在COS培养基上的同一表皮葡萄球菌菌落的衍射图随时间的变化。该图中的每个图像是菌落的衍射图，两个连续图像之间的时间间隔为1h。第一个图像(左上)对应于16小时的培养时间，最后一个图像(右下)对应于24小时的培养时间。培养时间在每个图像的右上角标注。
图11A示出了在试验过程中使用的实验装置，以将利用平坦屏幕获得的图像与利用圆顶形屏幕获得的图像进行比较，如结合图3E所述的。屏幕20包括弯曲部分20a和平坦部分20b。弯曲部分20a是抛光玻璃半球的一部分。平坦部分20b由一张透写纸形成。使用恶臭假单胞菌细菌菌落在TSA琼脂上进行试验。所获得的衍射图在图11B中示出。可以观察到衍射图超出了平坦透写纸，但包含在圆顶中。
为了识别目的或计数目的，本发明可实施为支持各种类型的检查，例如无菌试验、抗生素敏感性试验、抗菌或噬菌体敏感性试验以及抗菌物质的筛选。本发明还可以应用于观察和表征其他类型的微生物，例如酵母、真菌或微藻。

Claims (29)

1.一种用于观察存在于样本(2)中的物体(3)的装置，包括：
-保持器(6)，其能够容纳样本(2)，所述保持器限定了称为样本平面的平面(XY)，当样本设置在保持器上时，所述样本在所述平面中延伸；
-光源(10)，其能够发射光束(12)以便照射物体，所述光束称为入射光束；
-图像传感器(30)，其用于获取代表在入射光束(12)照射的作用下由物体反向散射的辐射(14)的图像；
-屏幕(20)，其面向保持器(6)延伸，以便当入射光束照射物体时暴露于由物体反向散射的辐射，从而在屏幕上形成代表所述反向散射的辐射的图像(I20)，称为衍射图；
-所述屏幕包括暴露于反向散射的辐射的第一面(201)，所述第一面的面积大于100cm2；
-所述图像传感器(30)配置为获取在屏幕上形成的衍射图的图像(I30)，
所述装置的特征在于，包括：
反射元件(13)，所述反射元件设置在屏幕(20)和物体(3)之间，并且能够沿垂直于样本平面(XY)的入射轴(Z)反射入射光束(12)的一部分，所述反射元件牢固地固定到屏幕的第一面(201)；
在反射元件(13)和屏幕(20)之间延伸的接合介质(17)，所述接合介质使得反射元件(13)固定到屏幕(20)，所述装置使得反射元件(13)和/或接合介质(17)配置为吸收在物体(3)和屏幕(20)之间传播的反向散射的辐射(14)的至少50％。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述屏幕(20)是弯曲的。
3.根据权利要求1所述的装置，其中：
-所述屏幕(20)包括第二面(202)，使得在第一面(201)上形成的衍射图出现在第二面上；
-所述屏幕在图像传感器(30)和保持器(6)之间延伸，使得图像传感器(30)通过聚焦光学器件(25)耦合到第二面(202)。
4.根据权利要求1所述的装置，其中，反射元件(13)和屏幕(20)之间的距离(δ)小于2cm。
5.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反射元件的面积小于4cm2。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，所述屏幕(20)是半透明的。
7.根据权利要求3所述的装置，其中，所述屏幕(20)包括用于在第一面(201)和第二面(202)之间传送光的光导。
8.根据权利要求7所述的装置，其中，所述屏幕包括在第一面和第二面之间延伸的多个光纤。
9.根据权利要求1所述的装置，其中，所述屏幕(20)是图像传感器(30)的光敏部分。
10.根据权利要求3所述的装置，其中，所述屏幕在第一面和第二面之间透射少于90％的反向散射的辐射(14)。
11.根据权利要求3所述的装置，其中，所述屏幕(20)能够相对于保持器(6)移动，保持器与屏幕之间的距离(d)是可调整的。
12.根据权利要求1所述的装置，其中，所述入射光束(12)沿称为入射轴的轴在反射元件(13)和物体(3)之间传播，所述装置包括称为环形反射器(18)的部件，所述环形反射器(18)在样本(2)和屏幕(20)之间围绕入射轴延伸，所述环形反射器能够将反向散射的辐射(14)的一部分反射到屏幕(20)。
13.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反射元件的面积小于2cm2。
14.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反射元件的面积小于1cm2。
15.一种用于观察存在于样本(2)中的物体(3)的方法，所述样本面向包括第一面(201)的屏幕(20)延伸，所述方法包括以下步骤：
a)使用由光源(10)发射的入射光束(12)照射物体(3)，入射光束(12)传播到设置在屏幕和物体之间的反射元件(13)，反射元件将全部或部分入射光束导向物体，反射元件连接到屏幕的第一面(201)；
b)使屏幕的第一面(201)暴露于由样本在照射的作用下反向散射的光辐射，以便在所述第一面上形成代表所述反向散射的光辐射(14)的图像，称为衍射图，所述第一面(201)的面积大于100cm2；
c)利用图像传感器(30)获取在屏幕上形成的衍射图的图像；
所述方法的特征在于，入射光束(12)沿入射轴从反射元件(13)传播到物体(3)，并且其中，沿入射轴朝向屏幕传播的反向散射的光辐射在到达屏幕之前被吸收，以便在屏幕上形成的衍射图中形成阴影。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述反射元件(13)的面积小于5cm2。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述屏幕(20)是弯曲的。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，反射元件和屏幕之间的距离(δ)小于1cm。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述屏幕(20)包括第二面(202)，所述屏幕在图像传感器(30)和样本(2)之间延伸，使得图像传感器通过聚焦光学器件(25)光学地耦合到第二面，所述屏幕使得在第一面(201)上形成的衍射图出现在第二面(202)上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中：
-所述屏幕(20)是半透明的；
-或者所述屏幕包括在第一面和第二面之间延伸的至少一个光导；
-或者所述屏幕的所述面之一被构造以形成透镜。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述屏幕将少于90％的反向散射的光辐射从第一面透射到第二面。
22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述屏幕是图像传感器的光敏部分。
23.根据权利要求15所述的方法，在步骤c)之后，所述方法包括根据图像传感器(30)获取的图像调整样本(2)与屏幕(20)之间的距离(d)的步骤，在调整所述距离后重复步骤a)至c)。
24.根据权利要求15所述的方法，包括基于由图像传感器获取的图像表征物体(3)的步骤d)。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，步骤d)包括：
-确定图像的特征；
-使用所述特征和通过对标准样本实施所述方法的步骤a)至c)而建立的校准特征来识别物体。
26.根据权利要求15所述的方法，其中，所述物体包括微生物。
27.根据权利要求15所述的方法，其中，所述反射元件(13)的面积小于2cm2。
28.根据权利要求15所述的方法，其中，所述反射元件(13)的面积小于1cm2。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述屏幕包括在第一面和第二面之间延伸的至少一个光纤。
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