CN110612121A

CN110612121A - 用于脊索瘤治疗的抗-egfr/高亲和力nk组合物和方法

Info

Publication number: CN110612121A
Application number: CN201880030921.9A
Authority: CN
Inventors: P·索恩-希翁格; J·李
Original assignee: Conkwest Inc
Current assignee: Conkwest Inc; ImmunityBio Inc
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2019-12-24
Also published as: CA3128202A1; WO2018209208A1; CA3060044A1; KR20200015469A; AU2018265534A1; EP3621647A1; US20200155599A1; US20220273722A1

Abstract

通过共同施用抗‑EGFR抗体和高亲和力NK细胞(haNK)来治疗患者的脊索瘤。最优选地，抗体与CD16受体的高亲和力变体非共价结合或在输注haNK细胞之前施用以因此靶向脊索瘤细胞而由haNK细胞实现细胞毒性细胞杀伤。

Description

用于脊索瘤治疗的抗-EGFR/高亲和力NK组合物和方法

本申请要求2017年5月11日提交的序列号为62/504,689的共同待决美国临时申请的优先权。

技术领域

本发明的领域为用于疾病治疗的经修饰免疫活性(competent)细胞，尤其是涉及用于脊索瘤治疗的高亲和力自然杀伤(haNK)细胞和抗-EGFR组合物。

背景技术

背景描述包括可对理解本发明有用的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或者明确或隐含地引用的任何出版物为现有技术。

本文所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度如同每一个个体的出版物或专利申请被明确地且个体地指明以引用方式并入一样。当在并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用，而参考文献中该术语的定义不适用。

脊索瘤是一种罕见的骨肿瘤并被认为是源自残余脊索。占原发性脊柱肿瘤的20％(占所有恶性骨肿瘤的1-4％)，在美国每年诊断出约300例新病例，美国大约有2400例活着的脊索瘤患者。从诊断时间开始的中位总生存期估计为6-7年。手术后进行放射疗法是通常的“护理标准”，但肿瘤的解剖位置和大小常会阻止边缘清晰的根治性切除。因此，复发是常见的并且已报道有多达40％的病例发生了转移。由于其在很大程度上耐受标准的细胞毒性化学疗法，故美国食品药品监督管理局尚未批准任何药物用于脊索瘤治疗，因此产生了对新型的脊索瘤治疗方式的迫切需要。

最近，已基于脊索瘤的各种分子特征提出了新的治疗方案。例如，已提出miRNA来下调EGFR，如PLoS One(2014)；9(3):e91546中所述。在一项试验中，对IFG-1R和EGFR的联合抑制显示出持久的响应(Front Oncol(2016)；6:98)，而EGFR的各种小分子抑制剂如厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、沙普替尼或阿法替尼在J Pathol(2016)；239:320-334中基于体外数据被描述为潜在的治疗剂。

在其他实例中，采用了使用阿维鲁单抗(抗-PD-L1抗体)靶向脊索瘤细胞上表达的PD-L1的免疫治疗方法，如Oncotarget(2016)；7(23):33498-511中所述。尽管概念上完美，但仍存在各种困难。除了别的之外，PD-L1还在各种非脊索瘤细胞上表达并因此可能出现脱靶ADCC。而且，即使在使用IFN-γ刺激和正常供体NK细胞的体外条件下，阿维鲁单抗介导的ADCC也相对较低(所有靶向脊索瘤细胞中约25-35％裂解)。在更进一步的已知方法中，体外用低剂量电离放射照射脊索瘤细胞系以增加EGFR表达并然后暴露于西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)。随后暴露于正常供体NK细胞表明存在一些ADCC(参见Abstract FASEB Journal,Vol.31,No.1Suppl；Abstract No.934.12:Exploiting Immunogenic Modulation inChordoma:Sublethal Radiation Increases EGFR Expression and Sensitizes TumorCells to Cetuximab)。然而，放射往往不能很好地耐受，而在无放射的情况下ADCC活性不尽人意。因此，大多数更新近的治疗脊索瘤的尝试都没有成功或者没有导致监管机构批准方案。

因此，尽管本领域已知用于脊索瘤的各种治疗方法和组合物，但它们全部或几乎全部都有着一个或多个缺点。因此，仍然需要用于治疗脊索瘤的改进的组合物和方法。

发明内容

本发明的主题涉及治疗脊索瘤的组合物、试剂盒和方法，其包括与抗-EGFR抗体共同施用haNK细胞以因此触发ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)并增强基于EGFR的治疗。最值得指出的是，治疗效果不是通过干扰EGFR信号传导而是经由NK细胞(尤其是高亲和力NK细胞)介导的细胞毒性细胞杀伤来获得的。因此，合适的抗-EGFR抗体可以是激动性的或拮抗性的，或者可不响应于结合而引起信号传导变化，并且优选的NK细胞将具有对IgG上的Fc部分具有结合亲和力的CD16变体，该亲和力高于野生型CD16(例如，158FF)的亲和力。

因此，在本发明主题的一个方面，发明人设想了一种治疗脊索瘤的方法，其包括以有效治疗脊索瘤的剂量向有需要的患者共同施用抗-EGFR抗体和高亲和力NK(haNK)细胞的步骤。最优选地，设想抗-EGFR抗体为对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体，和/或抗-EGFR抗体为IgG1以因此触发ADCC。因此，从不同的角度来看，设想抗-EGFR抗体可为人源化的非人抗-EGFR抗体，最优选为西妥昔单抗。

关于施用，通常设想抗-EGFR抗体以100mg/m²和1,000mg/m²之间的剂量施用，优选与haNK细胞同时施用。因此，抗-EGFR抗体也可与在haNK细胞的表面上表达的高亲和力CD16结合。设想的haNK细胞优选以5×10⁵个细胞/kg和5×10⁸个细胞/kg之间的剂量施用，进一步优选haNK细胞为NK92衍生物和/或(典型地在细胞内)表达重组IL2。而且，通常优选haNK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达和/或haNK细胞经基因工程化以表达CD16 158V变体。

在需要的情况下，设想的方法可还包括向患者施用进一步的癌症治疗的步骤，最典型的是免疫疗法(例如，施用表达患者特异性和肿瘤特异性新表位的重组酵母或重组病毒，或施用表达鼠短尾突变体表型的重组酵母或重组病毒)和/或化学疗法(例如，施用伊立替康、吉西他滨、卡培他滨、5-FU、FOLFIRI、FOLFOX和/或奥沙利铂)。而且，合适的进一步的癌症治疗也可包括放射疗法。

因此，发明人还设想了包含将与CD16的高亲和力变体偶联的抗-EGFR抗体的药物组合物，其中所述CD16高亲和力变体在经基因工程化的NK细胞的表面上表达。关于抗体和经基因工程化的细胞，适用与上述相同的考虑。另外，通常优选药物组合物被配制用于输注并包含1×10⁶个细胞和5×10⁹个细胞之间。

因此，发明人还设想了包含抗-EGFR抗体和多个高亲和力NK(haNK)细胞的药物试剂盒。同样，关于抗体和经基因工程化的细胞，适用与上述相同的考虑。鉴于上文，应因此认识到，发明人还设想使用高亲和力NK(haNK)细胞来增强脊索瘤的治疗，其中所述治疗包括抗-EGFR抗体的施用。

通过以下对优选实施方式的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更显而易见，在附图中，相同的附图标记表示相同的组分。

附图说明

图1A为基于抗-EGFR和haNK细胞的治疗的示意图。

图1B为列出在人供体细胞中和经基因工程化的haNK细胞中等位基因变体的频率和对CD16 Fc受体的结合亲和力的表。

图2描绘了CD16多态性基因型NK细胞和haNK细胞的选定表型的各种曲线图。

图3为描绘在所选脊索瘤细胞系中EGFR表达的示例性结果的曲线图。

图4为相对于同种型对照抗体，由西妥昔单抗介导的ADCC活性的体外测定的示例性结果的图示。

图5为使用表达FcgRIIIa(CD16)-158FF、VF或VV等位基因的FCGR3A(CD16基因)-基因型正常供体NK细胞时由西妥昔单抗介导的ADCC活性的体外测定的示例性结果的图示。

图6为示例性结果的图示，其中西妥昔单抗在选定的脊索瘤细胞系中在两个不同的时间点经由ADCC增加了haNK细胞裂解，表明多个细胞被haNK细胞杀伤。

图7为西妥昔单抗对所选NK细胞的CD16相对于haNK细胞的亲和力的示例性结果的图示。

图8为如本文设想的诱导期的示例性治疗方案。

图9为如本文设想的维持期的示例性治疗方案。

具体实施方式

发明人现已发现，使用haNK细胞与抗-EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)的组合来因此在患者中诱导ADCC应答/NK细胞毒性细胞杀伤，可有效地治疗脊索瘤，并具有理想的治疗效果，如图1A中示例性地描绘。这样的治疗可在放射疗法和/或化学疗法之前和/或与放射疗法和/或化学疗法同时实施，和/或可与免疫疗法一起采用，这将在下文更详细地讨论。

应指出，本文设想的抗体不被用作EGFR信号传导抑制剂，而是用作天然杀伤细胞、最优选高亲和力NK细胞(haNK)的靶标特异性信标以促进NK细胞的CD16受体与结合抗体的Fc部分的结合并从而经由ADCC/NK细胞毒性细胞杀伤来根除肿瘤细胞。关于高亲和力细胞，应理解，高亲和力可能归因于CD16基因座处患者的特异突变(其可能是杂合的或纯合的且发生频率相对较低)，更典型地可能归因于NK细胞的基因工程化以表达来自重组核酸的高亲和力变体(例如，F158V)。因此，典型地优选的是包括抗-EGFR抗体和高亲和力NK细胞的联合施用的治疗。这样的施用可依次进行，其中在第一步中施用抗体并在第二后续步骤中(例如，在施用抗体后24小时内)输注NK细胞，或者同时进行，此时抗-EGFR抗体将与高亲和力NK细胞的CD16受体结合。

因此，在一个优选的实例中，发明人现在设想，通过共同施用抗-EGFR抗体与表达高亲和力CD16变体的基因修饰NK细胞(并且其中NK细胞最优选还在细胞内表达IL-2)，可显著改善用抗-EGFR抗体的脊索瘤治疗。值得指出的是，由于CD16变体对抗体恒定区的高亲和力，故使用抗-EGFR抗体对肿瘤细胞的EGFR的结合特异性将实现NK细胞的紧密结合和激活。因此，应指出，设想的治疗将有利地补偿大部分人(至少70％)中存在的最常见的低亲和力的CD16变体。图1B描绘了CD16的等位基因频率。从一个不同的角度来看，即使患者具有低亲和力CD16(158F/F)表型，基因修饰NK细胞的使用也会让患者中ADCC增加。另一方面，还设想患者也可能被鉴定为具有高亲和力CD16(158V/V)表型。这样的患者则可在没有haNK细胞或有较低总剂量的haNK细胞的情况下接受抗-EGFR抗体(例如，每次输注10⁴-10⁶个细胞之间或10⁵-10⁷个细胞之间)。

关于合适的抗-EGFR抗体，设想这样的抗体可能在来源、序列和血清型方面差别很大。然而，通常优选抗-EGFR抗体具有恒定区(F_C)，该恒定区以高亲和力与CD16变体结合。因此，并最典型地，恒定区为人IgG₁的恒定区而CD16变体为158V/V变体。然而，应理解，可针对特定抗体和/或基因修饰NK细胞的特定子集专门定制合适的CD16变体和恒定区变体。如将易于理解的，可使用本领域已知的许多方式来鉴定高亲和力对(CD16变体/恒定区变体)，特别优选的方式包括经由噬菌体展示、RNA展示、使用CD16变体作为诱饵及恒定区文库作为猎物(或反过来)的双杂交文库筛选等的亲和力成熟。同样，可使已知的高亲和力抗体经受CDR嫁接(该CDR对EGFR具有特异性)以因此获得高亲和力抗-EGFR抗体。

而且，应认识到，虽然尤其优选市售的EGFR抗体例如西妥昔单抗和帕尼单抗，但其他设想的抗-EGFR抗体包括对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体，尤其是为人源化的非人抗-EGFR抗体的IgG₁型抗体。本领域已知许多市售的抗-EGFR抗体(例如，来自ABCAM、Millipore、Biolegend等)，并认为它们都适用于本文。另外，合适的抗-EGFR抗体还可包括与CD16结合结构域(或结构域变体)偶联(优选作为嵌合蛋白共价地偶联)的EGFR结合片段。

例如，合适的抗-EGFR抗体包括临床批准的西妥昔单抗和帕尼单抗，以及人和非人抗体例如ab52894、ab131498、ab231、ab32562、ab32077或ab76153(均可自美国Abcam商购获得)以及AY13(美国Biolegend)和06-847(美国Millipore)。这些抗体可直接使用或以人源化形式使用，或者可将CDR区嫁接到人IgG上。同样，适合嫁接的CDR可见于US584409和WO2011/156617中。

关于合适的NK细胞，通常设想NK细胞可以是来自患者的自体NK细胞，并且这样的自体NK细胞可从全血分离或者使用本领域已知的方法从前体或干细胞培养。而且，应理解，NK细胞不必是自体的，而是也可以是同种异体或异源的NK细胞。更进一步地，设想NK细胞可以是HLA匹配的NK细胞，其可以是原代细胞、从上游干细胞或祖细胞分化的NK细胞、或培养的NK细胞。然而，在本发明主题的特别优选的方面，NK细胞经基因工程化以取得一种或多种所需的性状，并且特别优选的NK细胞为NK92细胞或NK92细胞的衍生物。因此，合适的NK细胞也将是持续生长(“永生化的”)细胞。例如，在本发明主题的一个特别优选的方面，经基因工程化的NK细胞为表达IL-2(典型地以细胞内保留的、非分泌的方式)并被修饰以具有至少一种抑制性受体(KIR)的减少或消除表达的NK92衍生物，其使得这样的细胞被持续性激活(经由缺乏或减少抑制)。

例如，合适的NK细胞可具有一种或多种经修饰的KIR，所述KIR被突变以减少或消除与MHC I类分子的相互作用。当然，应指出，也可使一种或多种KIR缺失或可抑制表达(例如，经由miRNA、siRNA等)。最典型的是使不止一种KIR突变、缺失或沉默，并且尤其设想的KIR包括具有两个或三个结构域、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，修饰、沉默或缺失的KIR将包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3和KIR3DS1。可使用本领域熟知的方案来制备这样的经修饰的细胞。或者，这样的细胞也可以以aNK细胞(“激活的自然杀伤细胞”)从NantKwest(请参阅URL www.nantkwest.com)商购获得。

在本发明主题的一个特别优选的方面，NK细胞为经基因工程化的NK92衍生物，其被修饰以表达高亲和力Fcγ受体(CD16)。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的(参见例如Blood 2009113:3716-3725)，并认为所有产生和表达的方式都适用于本文。当使用对患者的肿瘤细胞具有特异性的抗体时，这样的受体的表达据信将有利地增加肿瘤细胞的特异性靶向和细胞毒性细胞杀伤。从不同的角度来看，设想的抗-EGFR抗体将提供针对脊索瘤细胞的出色靶向特异性，而这样的经基因工程化的NK92衍生物对抗体具有高亲和力，其中所述抗体已与关联(cognate)抗原结合并已进一步显著提高抗体结合情况下的细胞毒性杀伤能力。当然，应理解，这样的靶向抗体是可商购获得的并可与细胞结合使用(例如，与Fcγ受体结合)。同样，这样的经基因工程化的NK92衍生细胞也可以haNK细胞(“高亲和力自然杀伤细胞”)从NantKwest商购获得。

在其他设想的实施方式中，将在输注之前照射NK细胞以防止连续的细胞分裂。虽然不限于本发明的主题，但典型的是照射细胞，这将废除细胞分裂，但是仍允许代谢活性和NK细胞功能(尤其是细胞毒性细胞杀伤)。因此，对于NK细胞合适的放射剂量将在50cGy和2,000cGy之间。此外，这样的放射典型地为β或γ放射，然而，本文也明确设想其他方式如电子束照射。

最典型地，抗-EGFR抗体和高亲和力NK(haNK)细胞都使用本领域已知的抗体和NK细胞两者的施用剂量和途径施用给患者。因此，施用抗-EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)的合适剂量典型地在100mg/m²和1,000mg/m²之间，或100mg/m²和300mg/m²之间，或300mg/m²和600mg/m²之间，或600mg/m²和900mg/m²之间，或甚至更高。优选在约1分钟至120分钟之间、更典型地在约10分钟至60分钟之间的时间内静脉内施用。同样，优选以适合于细胞输注的剂量施用haNK细胞。因此，合适的剂量典型地在5×10⁵个细胞/kg和5×10⁸个细胞/kg之间、最典型地在5×10⁶个细胞/kg和5×10⁷个细胞/kg之间的范围内。优选在约1分钟至120分钟之间、更典型地在约10分钟至60分钟之间的时间内静脉内施用。

在本发明主题的其他设想的方面，抗-EGFR抗体和haNK细胞的施用优选是同时期的使得抗-EGFR抗体和haNK细胞两者以可测量的量同时存在于患者的血液中。因此，抗-EGFR抗体和haNK细胞的共同施用可同时进行，或者在彼此的10分钟内或30分钟内或2小时内进行。而且，还应理解，在施用时和/或施用过程中，抗-EGFR抗体可经由CD16变体与haNK细胞非共价结合。

基于EGFR在脊索瘤发病机制中的作用的临床前证据及超过70％的脊索瘤标本表达EGFR的免疫组织化学观察，先前已在脊索瘤中进行了若干针对EGFR的临床试验。然而，由于这些试验不是随机或良好对照的，故关于EGFR抑制在脊索瘤中的治疗益处尚未达成共识。在两个单独的病例报告中，EGFR MAb西妥昔单抗和吉非替尼(EGFR的酪氨酸激酶抑制剂)的组合获得了部分影像学确定的响应。在这里，并如下文更详细地示出，发明人证实，西妥昔单抗在与haNK细胞组合时显著地增加了基于NK细胞的裂解，尤其是经由ADCC的裂解。

一些先前的临床研究还已表明，NK细胞的FcgRIIIa多态性与对IgG₁ MAb疗法的响应相关。值得指出的是，采用曲妥珠单抗疗法，具有FCGR2A-131HH和/或FCGR3A-158VV基因型的转移性乳腺癌患者的客观响应率和无进展生存期明显优于两种基因型都没有的患者。类似地，在一项针对49例滤泡性淋巴瘤患者的研究中，FCGR3A-158VV患者对利妥昔单抗具有提高的响应。在接受西妥昔单抗治疗的转移性结直肠癌患者中进行的三项回顾性研究报告VV是最有益的FCGR3A-158基因型。

虽然可在体外模型中观察到ADCC诱导，但是临床转化常常会遇到各种障碍。首先，向肿瘤组织募集足够数量的具有功能活性的NK细胞在技术上具有挑战性，因为它们常常仅占淋巴细胞的10％，并且在癌症诱导的免疫抑制环境中常常功能失调。而且，转移性/晚期脊索瘤的一线治疗(即，化学疗法和放射疗法)也很可能减少淋巴细胞的数量和活性。已独立地开发了过继性NK细胞疗法来为患者供给足够数量的功能性NK细胞。从一名50岁的进行性非霍奇金淋巴瘤男性患者中产生了用于过继性转移疗法的细胞毒性NK-92细胞系。已使用经照射的NK-92细胞在不同的恶性肿瘤中进行了四个I期试验。输注耐受良好，并且在血液恶性肿瘤、黑色素瘤、肺癌和肾癌患者中都观察到临床响应。然而，由于NK-92细胞不表达FcgRIIIa受体，故它们不能介导ADCC。相反，现已创建了表达高亲和力CD16a、V158FcγRIIIa受体的基因工程化细胞并也可商购获得(例如，以haNK细胞自NantKwest(9920Jefferson Blvd.,Culver City,CA 90232)商购获得)。

由于仅大约14％的人群对高亲和力FcgRIIIa受体(FCGR3A-158VV)是纯合的，故发明人设想向携带低亲和力或中等亲和力FcgRIIIa受体基因型的患者中输注haNK细胞以最大化MAb疗效。除了别的之外，并如下文更详细地示出，发明人注意到，haNK细胞比来自携带FCGR3A-158FF的健康供体的NK细胞对西妥昔单抗的亲和力高2.8倍。与其对西妥昔单抗的高结合能力一致，haNK细胞还在脊索瘤细胞中经由西妥昔单抗显著诱导ADCC。而且，由于已证实可安全地向癌症患者施用10⁹至10¹⁰个经照射的NK-92细胞，故发明人设想了经照射haNK细胞的过继性转移水平，即使在其内源NK细胞表达VV表型的患者中(但可能以较低的总剂量，如以向具有158FF表型的患者施用的剂量的80％或更低、或70％或更低、或50％或更低、或40％或更低)。

已显示NK-92细胞表达大量的激活受体如NKp30、NKp46和NKG2D。NKG2D和DNAM-1是对癌症的免疫应答中牵涉的最好地表征的激活NK细胞受体。两种受体均识别其在肿瘤细胞上表达的配体并诱导靶细胞裂解。如下面更详细地示出的，与正常NK细胞相比，haNK细胞具有NKG2D和DNAM-1的更高表达，表明了识别和裂解肿瘤细胞的更高能力。值得指出的是，在没有西妥昔单抗的情况下，来自正常(158FF表型)供体的NK细胞在没有西妥昔单抗的情况下以极低的水平裂解脊索瘤细胞(数据未显示)。相反，即使没有西妥昔单抗，haNK细胞也诱导脊索瘤细胞的基本上更高的裂解。

因此，设想过继性转移的经照射haNK细胞将为所有脊索瘤患者提供足够数量的功能性NK细胞并可因此在功能上将FCGR3A-158FF载体“转化”为VV载体。因此，应理解，西妥昔单抗加经照射的haNK细胞介导的免疫疗法可能对脊索瘤患者具有潜在的临床益处。而且，应认识到，虽然将西妥昔单抗描述为合适的靶标，但也认为许多另外的或替代的靶标适合与本文提出的教导结合使用。例如，合适的靶标包括优选在脊索瘤细胞的细胞表面处选择性地或特异性地表达的受体和激酶，特别是包括MET、PDGFR和ERBB2。而且，在脊索瘤细胞具有在一种或多种蛋白质中导致新表位的突变的情况下，设想可制备将与新表位结合的抗体，其中所述新表位可见于或呈现于细胞的表面上。

当然，应理解，可与设想的治疗一起使用另外的治疗干预措施或以另外的治疗干预措施补充设想的治疗。例如，合适的治疗包括使用药剂如伊立替康、吉西他滨、卡培他滨、5-FU、FOLFIRI、FOLFOX和/或奥沙利铂的放射和/或化学疗法。在其他设想的方面，设想的治疗还可包括免疫调节剂例如IL15、IL15超激动剂、干扰素-γ以增加PD-L1表达和/或靶向检查点受体和/或其配体的检查点抑制剂(例如，PD-L1抗体(阿维鲁单抗))。

另外，设想免疫疗法也可基于对鼠短尾突变体表型的免疫应答的产生。例如，可使用包括编码鼠短尾突变体表型(或其一部分)的核酸片段的重组病毒(尤其是腺病毒)进行免疫疗法。受感染细胞，例如树突状细胞，将然后表达和加工重组蛋白以以MHC-I和/或MHC-II复合物的形式呈递。在其他方面，可对热杀伤的重组酵母进行基因修饰以表达具有潜在抗肿瘤活性的鼠短尾突变体表型。皮下施用后，表达鼠短尾突变体表型的酵母疫苗随后被树突状细胞识别、加工并由树突状细胞表面上的I类和II类MHC分子呈递，这被认为将引发靶向CD4+和CD8+T-淋巴细胞介导的免疫应答。

实施例

体外实施例

细胞培养和试剂：脊索瘤细胞系JHC7和UM-Chor1自脊索瘤基金会(ChordomaFoundation)(北卡罗来纳州达勒姆)(Durham,NC)获得。脊索瘤细胞系U-CH2(CRL-3218TM)和MUG-Chor1( CRL-3219TM)自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯)(Manassas,VA)获得。所有细胞系传代少于6个月并如先前所述维持(Oncotarget，2016年5月9日)。将haNK细胞在补充有5％热灭活人AB血清(Omega Scientific,Tarzana,CA)的无酚红且无庆大霉素的X-Vivo-10培养基(Lonza,Walkersville,MD)中以5×10⁵/ml的浓度培养。在所有实验之前以10Gy照射haNK细胞24小时。来自健康志愿者捐献者的外周血单核细胞(PBMC)自NIH临床中心血库(NIHClinical Center Blood Bank)(NCT00001846)获得。

流式细胞术：使用的抗人单克隆抗体如下：PE-EGFR(BD Biosciences,San Jose,CA)、FITC-CD16 clone 3G8(BD Biosciences)、APC-CD56(BioLegend,San Diego,CA)、PE-CD226(DNAM-1)(BD Biosciences)、PerCP-Cy5.5-NKG2D(BD Biosciences)、PE-Cy7-perforin(eBioscience,San Diego,CA)。在FACSCalibur流式细胞仪或FACSVerse(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)上采集样品并使用FlowJo软件(TreeStar,Inc.,Ashland,OR)进行分析。所有分析样品的同种型对照染色均<5％。

抗体依赖性细胞的细胞毒性测定：如本领域已知并作指定的修改来进行ADCC测定。根据制造商的方案使用人NK细胞分离(阴性选择)试剂盒130-092-657(MiltenyiBiotec,San Diego,CA)从正常供体PBMC分离NK效应细胞，产生>80％的纯度，并让在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中静置过夜。收获肿瘤细胞并用¹¹¹In标记。在96孔圆底培养板中以2,000个细胞/孔接种细胞作为靶标并与10μg/mL西妥昔单抗(Lilly,Indianapolis,IN)或无应答利妥昔单抗(Biogen,Cambridge,MA)作为对照同种型抗体一起在室温下孵育30分钟。加入NK细胞或haNK细胞作为效应细胞。研究中使用了多种效应子:靶细胞比率。4小时或20小时后，收获上清液并使用WIZARD2自动伽玛计数器(Automatic Gamma Counter)(PerkinElmer,Waltham,MA)分析¹¹¹In的存在。通过在无效应细胞的情况下孵育靶细胞来确定自发释放，并通过与0.05％Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)一起孵育来确定完全裂解。取三个平行样进行实验。使用下式确定特异性ADCC裂解：裂解百分数＝[(实验cpm–自发cpm)/(完全cpm–自发cpm)]×100。为了验证NK细胞上的CD16(FcgRIII)参与由西妥昔单抗介导的ADCC裂解，使用CD16 MAb来阻断CD16。将NK细胞与2μg/mL CD16 MAb(clone B73.1；eBioscience)一起孵育并将haNK细胞与50μg/mL CD16 MAb一起孵育2小时，然后添加到靶细胞。

CD16(FcgRIIIa)基因分型：使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从健康供体的PBMC提取DNA，并在-80℃下保存直至使用。使用等位基因特异性微滴式数字聚合酶链式反应(PCR)采用针对CD16的TaqMan阵列(rs396991；LifeTechnologies,Waltham,MA)确定CD16在氨基酸第158位处的多态性，其为缬氨酸(V)相对于苯丙氨酸(F)。制备主反应混合物，并添加1μL基因分型DNA。PCR反应在Bio-Rad T100热循环仪(Bio-Rad,Hercules,CA)上进行40个循环，95℃下10分钟，94℃下30秒钟，和60℃下1分钟。在Bio-Rad QX200液滴读取器上读取板。使用Bio-Rad QuantaSoft v.1.5软件分析数据。

统计分析：使用Prism 6.0f软件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)，通过具有2-尾分布的配对学生t检验确定ADCC测定所获得数据的分布中的显著差异并报告为P值。

CD16a多态性基因型NK细胞和haNK细胞的表型：来自一些个体的NK细胞可以是用于癌症疗法的有效细胞毒性效应子。然而，从患者获得足够数量的功能活性NK细胞可能存在技术挑战。作为替代方案，已产生了若干细胞毒性NK细胞系，包括NK-92。这些被命名为haNK的NK-92细胞最近已经过工程化以内源性地表达IL-2和高亲和力(ha)CD16 V158 FcγRIIIa受体(haNK细胞，可自NantKwest,9920Jefferson Blvd.,Culver City,CA 90232商购获得)。发明人比较了CD16a多态性基因型正常供体NK细胞和haNK细胞的表型(CD56、DNAM-1、NKG2D、穿孔素和CD16)。

虽然表达给定标志物的细胞的百分数仅有微小差异，但如图2的小图中所示，通过平均荧光强度(MFI)确定的表达水平却观察到实质性差异。与NK VV供体相比，haNK细胞的CD56的MFI高20倍(图2，小图A)，DNAM-1的表达高2.9倍(图2，小图B)，NKG2D的表达高1.8倍(图2，小图C)。值得指出的是，NK细胞和haNK细胞之间在穿孔素表达方面没有差异(图2，小图D)，并且与FF供体和haNK细胞相比，VV供体中CD16的平均MFI高1.5倍(图2，小图E)。

先前已显示脊索瘤细胞系表达EGFR，并且发明人采用四种人脊索瘤细胞系：JHC7、UM-Chor1、U-CH2和MUG-Chor1定性地证实和扩展了这一发现，图3中示出了示例性结果(插图数字指示阳性细胞％和平均荧光强度(MFI))。可以看出，如通过流式细胞术所测定，四种脊索瘤细胞系表达13％至80％之间的EGFR，但EGFR的绝对表达水平可随组织培养密度和培养时间来调节。

发明人还进行了体外测定以采用来自健康供体的NK细胞作为效应子来确定脊索瘤细胞系中西妥昔单抗介导的ADCC。如图4小图A中所示，西妥昔单抗相对于同种型对照抗体在JHC7细胞(13.7倍；P<0.01)、UM-Chor1细胞(10.5倍；P<0.01)、U-CH2细胞(83.5倍；P<0.01)和MUG-Chorl细胞(59倍；P<0.01)中显著增加了NK细胞裂解。值得指出的是，单独使用西妥昔单抗(无NK细胞)未介导脊索瘤细胞的裂解(数据未示出)。当NK效应细胞上的CD16(FcgRIII)与识别靶细胞的抗体的Fc部分相互作用时，就会发生经由ADCC的NK细胞裂解。如图4小图B中所示，在所分析的JHC7和UM-Chor1细胞系两者中，添加CD16中和抗体都抑制了西妥昔单抗增强的NK细胞裂解，这表明西妥昔单抗诱导的NK细胞裂解受ADCC介导。更具体地，图4中小图A描绘了使用正常供体NK细胞以20:1的效应子:靶标(E∶T)比率对四种脊索瘤细胞系进行ADCC测定的结果。将指示的组与西妥昔单抗一起孵育。小图B描绘了使用正常供体NK细胞以20:1的E:T比率用两种脊索瘤细胞系进行ADCC测定的结果。将指示的组与西妥昔单抗和抗-CD16抗体一起孵育。通过学生t检验进行统计分析，*＝P<0.05，误差棒表示三个平行样测量值的平均±S.D。该实验重复至少两次，结果相似。

然后，发明人使用表达FcgRIIIa-158 FF、VF或VV等位基因的FCGR3A基因型正常供体NK细胞对西妥昔单抗介导的ADCC活性进行了体外测定。使用对照同种型抗体，无论NK表型如何，NK细胞均以非常低的水平杀伤UM-Chor1细胞，如从图5小图A中针对所有等位基因类型的条形图可见。然而，在所有NK细胞表型中，西妥昔单抗均在不同程度上增加了NK细胞裂解：通过来自表达FcgRIIIa-158FF的三种供体的NK细胞，西妥昔单抗诱导的裂解分别为24％、17％和15％。值得指出的是，通过使用三种VF供体的NK细胞，西妥昔单抗诱导的ADCC裂解分别为34％、49％和32％，而使用来自三种VV供体的NK细胞，裂解分别为51％、66％和59％。如从小图B可见，由来自三种FF(19％)供体、三种VF(38％)供体、三种VV(59％)供体的NK细胞诱导的西妥昔单抗介导ADCC裂解的平均值存在显著正相关(R²＝0.85)。放到一起看，这些结果表明，表达FcgRIIIa-158 V同种异型(也同haNK细胞表达的一样)的NK细胞在脊索瘤细胞中表现出显著增强的西妥昔单抗介导ADCC。

为了检查haNK细胞对于脊索瘤的西妥昔单抗疗法的潜在效用，发明人使用haNK细胞作为效应子对西妥昔单抗介导的ADCC进行了体外测定(图6A)。haNK细胞与同种型对照一起的裂解为JHC7细胞的11.8％和UM-Chor1细胞的2.6％。与同种型对照相比，在JHC7(1.7倍；P<0.01)和UM-Chor1细胞(2.6倍；P<0.01)两者中，西妥昔单抗都显著增强了haNK-细胞裂解。CD16中和抗体的添加在JHC7和UM-Chor1细胞系两者中都抑制了西妥昔单抗增强的haNK-细胞裂解(数据未示出)。由于NK细胞已在先前证实为是“连环杀手”(一个NK细胞可裂解多达五个靶细胞)，故还进行了20-小时¹¹¹In释放测定(图6B)。使用两种脊索瘤细胞系、使用haNK细胞作为效应细胞以20:1的E:T比率进行ADCC测定，对于A，持续4小时，对于B，持续20小时。将指示的组与西妥昔单抗和/或抗-CD16抗体一起孵育。通过学生t检验进行统计分析，*＝P<0.05，误差棒表示三个平行样测量值的平均±S.D。该实验重复至少两次，结果相似。

这里，与小图A中的4小时数据相比，两种脊索瘤细胞系的裂解在20小时后都明显更高。这些结果表明haNK细胞经由西妥昔单抗在脊索瘤细胞中诱导了持久的ADCC。为了确定相对亲和力，发明人比较了西妥昔单抗抑制FITC缀合CD16 MAb与CD16多态性基因型正常供体NK细胞和haNK细胞结合的能力(图7A)。明显地，使用220μg/mL西妥昔单抗实现了CD16Ab与来自四种FF供体的NK细胞的结合的50％抑制。与FF供体相比，低4.5倍(49.2μg/mL)和低2.8倍(80μg/mL)的西妥昔单抗浓度分别显示出CD16 Ab与来自VV供体的正常NK细胞和haNK细胞的结合的50％抑制(图7B)。这些结果表明，表达FcgRIIIa-158 VV的NK细胞和haNK细胞两者都比表达FcgRIIIa-158 FF的NK细胞以更高的亲和力结合西妥昔单抗。更具体地，将来自四种FF和两种VV正常供体的NK细胞和haNK细胞(NantKwest,9920Jefferson Blvd.,Culver City,CA 90232)与不同浓度的西妥昔单抗一起孵育，随后与FITC缀合CD16 Ab一起孵育。如上所述计算CD16 MAb结合的抑制百分数。小图A描绘了每个供体显示的CD16 MAb结合的抑制百分数。图B描绘了CD16 MAb结合的抑制百分数的平均值。

体内实施例

鉴于上述情况，设想了许多体内(通常在人中)治疗方案，其优选地还包括另外的治疗方案或方式，这些治疗方案或方式将使用hanK细胞和西妥昔单抗(或其他靶向抗体)补充靶向免疫疗法。

例如，一种设想的治疗将分两期施用，即诱导期和维持期，这将在下文更详细地描述。优选地，患者将接受长达1年的诱导治疗。在诱导期具有完全响应(CR)、1年时具有正在进行的稳定疾病(SD)或正在进行的部分响应(PR)的患者将进入维持期，并且患者将在维持期保持至多1年。

根据实体瘤响应评估标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)1.1版通过靶标和非靶标病变的计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)将在筛查时评估肿瘤，并在第一年中或直到完全响应将每8周评估一次肿瘤响应，和在第二年中或在完全响应之后每12周评估一次肿瘤响应。对于所有患者，将对在各个时间点(例如，治疗前、治疗开始后8周及可能的延长治疗期间(取决于响应))采集的样品进行探索性肿瘤分子谱分析。在第一年中或直到完全响应每6周并在第二年中或完全响应之后每8周在常规抽血过程中采集单独的血液管子以进行免疫学和ctDNA/ctRNA分析。

设想的示例性治疗方案将包括疫苗组分、低剂量节律化疗(LDMC)、西妥昔单抗、NK细胞疗法、低剂量放射疗法、IL-15超激动剂和检查点抑制剂的组合以因此使免疫原性细胞死亡(ICD)最大化及增强和保持针对癌细胞的固有和适应性免疫应答。更具体地，治疗设计为通过以下方式中断免疫编辑的逃逸期：(a)减轻肿瘤微环境(TME)中的潜在免疫抑制，优选通过LDMC来降低将导致TME中免疫抑制的Treg、MDSC和M2巨噬细胞的密度；(b)诱导和协调ICD信号，优选经由LDMC和低剂量放射疗法来增加肿瘤细胞的抗原性。将使用西妥昔单抗和阿维鲁单抗来增强ADCC和细胞毒性T-细胞活性；(c)调理(conditioning)树突状细胞和T细胞，优选通过癌症疫苗和IL-15超激动剂来增强肿瘤特异性细胞毒性T-细胞应答；(d)增强固有免疫应答，优选将使用NK细胞疗法(例如，与西妥昔单抗联合使用)来增强先天免疫系统，并将使用IL-15超激动剂来增强内源性和引入的NK细胞的活性。(e)少分次-剂量放射疗法来上调肿瘤细胞NK配体以增强NK细胞的肿瘤细胞毒性；和保持免疫应答。将使用检查点抑制剂来促进长期的抗癌免疫应答。

为此，示例性治疗中包括的合适药剂汇总于表1中。因此，应认识到，通过组合同时靶向允许肿瘤生长的不同但互补机制的药剂，治疗方案旨在最大化抗癌活性并延长对治疗的响应的持续时间。而且，治疗通常分2期施用：诱导期和维持期。诱导期的目的在于刺激针对肿瘤细胞的免疫应答和减轻TME中的免疫抑制。维持期的目的在于保持针对肿瘤细胞的正在进行的免疫系统活性，从而产生持久的治疗响应。

表1

阿多柔比星盐酸盐(HCl)：阿多柔比星HCl是抗癌药剂多柔比星的白蛋白结合前药。由于肿瘤内脉管系统的通透性增强，故血浆白蛋白将优先积聚在实体瘤中。阿多柔比星HCl通过与多柔比星分子缀合的硫醇反应性马来酰亚胺基团来结合循环白蛋白；与白蛋白结合导致实体瘤中阿多柔比星HCl前药的靶向和积聚。已推定阿多柔比星通过多种机制起作用，包括嵌入DNA、抑制拓扑异构酶II、诱导凋亡、抑制RNA合成和/或与细胞膜相互作用。阿多柔比星HCl的化学名称为N-[(E)-[1-[(2S,4S)-4-[(2R,4S,5S,6S)-4-氨基-5-羟基-6-甲基噁烷-2-基]氧-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-6,11-二氧-3,4-二氢-1H-并四苯-2-基]-2-羟基亚乙基]氨基]-6-(2,5-二氧吡咯-1-基)己酰胺盐酸盐。阿多柔比星由BaxterOncology制造。

ALT-803(重组人超激动剂白细胞介素-15(IL-15)复合物[也称为IL 15N72D:IL-15RαSu/IgG1 Fc复合物])：ALT-803是一种基于IL-15的免疫刺激蛋白复合物，其由与二聚人IL-15受体α(IL-15Rα)sushi结构域/人IgG1 Fc融合蛋白以高度亲和性相关的人IL-15变体的两个蛋白质亚基组成。IL-15变体是包含成熟人IL-15细胞因子序列的114个氨基酸的多肽，在螺旋C的72位(N72D)处具有天冬酰胺至天冬氨酸的置换。人IL-15Rαsushi结构域/人IgG1 Fc融合蛋白包含与含Fc结构域(232个氨基酸)的人IgG1 CH2-CH3区域连接的人IL-15受体α亚基(IL-15Rα)(成熟的人IL-15Rα蛋白质的氨基酸1-65)的Sushi结构域。除N72D置换外，所有蛋白质序列均是人类的。ALT-803由Altor Biosciences制造。

ETBX-051(Ad5[E1-,E2b-]-鼠短尾突变体表型疫苗)：ETBX-051是一种基于Ad5的载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因区域及插入经修饰的hBrachyury基因进行了修饰。经修饰的hBrachyury基因含有设计以增加细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)抗肿瘤免疫应答的激动剂表位。ETBX-051由Etubics制造。

ETBX-061(Ad5[E1-,E2b-]-黏液素1[MUC1]疫苗)：ETBX-061是一种基于Ad5的载体，其已通过去除E1、E2b和E3基因区域及插入经修饰的人MUC1基因进行了修饰。经修饰的MUC1基因含有设计以增加CTL抗肿瘤免疫应答的激动剂表位。ETBX-061由Etubics制造。

GI-6301(鼠短尾突变体表型酵母疫苗)：GI-6301是表达hBrachyury肿瘤蛋白的基于热杀伤酿酒酵母的疫苗。鼠短尾突变体表型抗原为全长蛋白质，具有附加到hBrachyury序列以促进抗原在载体内的积聚的N-端MADEAP(Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Pro)基序及用于通过蛋白质印迹法进行分析的C-端六组氨酸表位标签。hBrachyury蛋白质的表达受铜诱导CUP1启动子的控制。GI-6301由GlobeImmune制造。

haNK^TM,NK-92[CD16.158V,ER IL-2]，输注用悬浮液(输注用haNK^TM)：NK-92[CD16.158V，ER IL-2](高亲和力激活自然杀伤细胞系，[输注用haNK^TM])为人同种异体NK细胞系，其已经工程化以产生内源性细胞内保留的IL-2并表达CD16这种高亲和力(158V)Fcγ受体(FcγRIIIa/CD16a)。从表型上看，haNK细胞系为CD56+、CD3-和CD16+。

通过用含有IL-2和CD16受体的高亲和力变体的双顺反子质粒载体转染母体激活的NK(aNK)细胞系(NK-92)，开发了haNK细胞系。该质粒含有氨苄青霉素抗性盒，并且用于表达转基因的启动子为具有SV40聚腺苷酸化序列的延伸因子1α。该质粒是在无传染性海绵状脑病的生产条件下制备的并含有一些CD16和IL-2的人源序列，它们都不具有任何转化性质。由于CD16受体的高亲和力变体的插入，输注用haNK^TM具有增强的CD16-靶向ADCC能力。haNK细胞由NantKwest制造。

阿维鲁单抗(可自Pfizer以用于静脉[IV]用途的注射液商购获得)：阿维鲁单抗是针对人免疫抑制性PD-L1蛋白质的人IgG1λ单克隆抗体并具有潜在的免疫检查点抑制和抗肿瘤活性。阿维鲁单抗具有147kDa的分子量。通过抑制PD-L1相互作用，阿维鲁单抗被认为能够激活T细胞和适应性免疫系统。通过保留天然Fc-区，阿维鲁单抗被认为参与固有免疫系统并诱导ADCC。

西妥昔单抗(可自Eli Lilly以用于IV输注的注射液商购获得)：西妥昔单抗是一种重组人/小鼠嵌合单克隆抗体，其与人EGFR的胞外结构域特异性结合。西妥昔单抗由具有人IgG1重链和kappa轻链恒定区的鼠抗-EGFR抗体的Fv区组成，分子量大约为152kDa。西妥昔单抗是在哺乳动物(鼠骨髓瘤)细胞培养物中产生的。西妥昔单抗是一种无菌、透明、无色的液体，pH为7.0至7.4，其可含有少量易见的白色非晶西妥昔单抗颗粒。西妥昔单抗以2mg/mL的浓度在100mg(50mL)或200mg(100mL)一次性小瓶中供给。西妥昔单抗在不含防腐剂的溶液中配制，该溶液含有8.48mg/mL的氯化钠、1.88mg/mL的磷酸氢二钠七水合物、0.41mg/mL的磷酸二氢钠一水合物和USP注射用水。

环磷酰胺(可以用于口服的环磷酰胺胶囊或以环磷酰胺USP片剂商购获得)：环磷酰胺是一种合成的抗肿瘤药物，与氮芥类化学相关。环磷酰胺的化学名称为2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧杂氮杂磷杂苯2-氧化物一水合物，分子式为C7H15Cl2N2O2P·H2O，分子量为279.1。每个用于口服的胶囊含有25mg或50mg环磷酰胺(无水，USP)。

立体定向身体放射疗法(Stereotactic body radiation therapy)(SBRT)：SBRT已成为常规分级外部射束放射的安全且有效的替代方案。SBRT是高度保形的外部射束放射技术，能够精确地以有限的份数(fraction)提供消融剂量的放射。临床前数据表明，每份相对较大的剂量(6-8Gy)可诱导对肿瘤抗原的免疫应答。用SBRT治疗观察到的剂量急剧下降允许在有限的放射暴露于相邻关键结构的情况下实现高的每份剂量。

最典型地，患者将在每个可行的肿瘤部位(最多5个部位)接受4份放射，剂量至多为每份8Gy。如果无法达到危险器官(OAR)剂量限制，则主治医师可酌情将剂量降低至每份6Gy。对于前2个治疗周期，每21天施用两次放射治疗。在开始治疗之前为每个病变制定一份单独的治疗计划。给定份与份之间的时间长度，如果份与份之间发生显著的肿瘤消退(如影像学或临床检查所指出)，则放射肿瘤医生可酌情进行重复的CT模拟和对治疗计划的调整。只应对治疗计划进行更改以排除明显不受肿瘤累及且可能因肿瘤消退而落入GTV中的正常组织或关键结构。

放射剂量规定为使95％的PTV接受处方剂量或更大剂量，但如果主治医师认为为了避免危及临界正常结构而适宜的话，降低到低至80％的覆盖率将被认为是可接受的；在这样的情况下，应将接受低于处方剂量的95％的区域限制在PTV的外围和GTV的外部。SBRT有望实现高度的剂量异质性。因此，预期会有一个中心“热点”，处方剂量应在PTV内最大剂量的60 90％之内。放射剂量计算将使用组织异质性校正进行

虽然不限于本发明的主题，但将按表2中列出的示例性剂量来施用设想的药剂和放射。当然，应理解，患者和疾病的特定因素(例如，性别、体重、疾病响应或进展、不良反应等)可能会导致特定剂量和时间表的变化。

表2

用于诱导期的典型治疗方案示于图8中，用于维持期的典型治疗方案示于图9中。

例如，设想了用于诱导期的示例性治疗方案，其持续约8周(最小)至约1年(最大)。治疗将包括重复的3周周期，最长治疗期为2年，如下所示：

第1天和第8天，每3周：阿多柔比星HCl(80mg/m2，IV，用时大约30分钟)。

第1-5天，每3周：环磷酰胺(25mg，经口[PO]，一天两次[BID])。

第5天(±1天)，每3周，持续3个周期，其后每9周：基于Ad5的疫苗：ETBX-051(鼠短尾突变体表型)和ETBX-061(MUC1)，(1×10¹¹个病毒颗粒[VP]/疫苗/皮下剂量[SC])。

第8天，每3周：阿维鲁单抗(10mg/kg，IV，用时大约1小时)。

第8-12天，每3周：环磷酰胺(25mg，经口[PO]，每天)。

第8天和第15天，每3周：SBRT(不超过8Gy，确切剂量待由放射肿瘤医生确定；仅用于前2个周期)。

第9天，每3周：ALT-803(10μg/kg，SC，至少在haNK输注前30分钟)；haNK(2×10⁹个细胞/剂量，IV)；西妥昔单抗(250mg/m²，IV)。

第11天，每3周：haNK(2×10⁹个细胞/剂量，IV)。

第11天，每3周，持续3个周期，其后每9周：基于酵母的疫苗：GI-6301(鼠短尾突变体表型)(80酵母单位[YU]/剂量，SC)。

第16天，每3周：ALT-803(10μg/kg，SC，至少在haNK输注前30分钟)；haNK(2×10⁹个细胞/剂量，IV)；西妥昔单抗(250mg/m²，IV)。

第18天，每3周：haNK(2×10⁹个细胞/剂量，IV)。

在诱导期最后一次治疗完成后可能持续至多1年的维持期的示例性治疗方案将包括如下重复周期：

第1天，每3周：阿维鲁单抗(10mg/kg，IV，用时大约1小时)；西妥昔单抗(250mg/m²，IV)；ALT-803(10μg/kg，SC)(至少在haNK输注前30分钟)；haNK(2×10⁹个细胞/剂量，IV)。

第1天，每9周：基于Ad5的疫苗：ETBX-051(鼠短尾突变体表型)和ETBX-061(MUC1)(1×10¹¹VP/疫苗/剂量，SC)；基于酵母的疫苗：GI-6301(鼠短尾突变体表型)(80YU/剂量，SC)，大约在施用基于Ad-5的疫苗后2小时。

对于肿瘤响应评价，设想在筛查时(治疗前至多28天)通过CT和/或MRI成像评价患者的肿瘤负荷。施用首次治疗后，每8周或12周(取决于治疗时间，如前所述)(±7天)进行一次后续的肿瘤响应评价。继续进行成像直至记录了PD或受试者完成研究随访为止。最初观察到根据RECIST 1.1版的疾病进展时，在初始PD评估后4-6周将进行成像评估以排除肿瘤假性进展的可能性。对于表现出响应(PR或CR)的患者，在初始响应后4-6周进行确认性成像评估。评价可包括胸部、腹部、骨盆(任选，除非做基线时存在已知的骨盆疾病)和大脑(仅根据症状/发现进行临床验证)的CT和/或MRI扫描。

在治疗之前，通过位置清楚地识别要跟踪响应的肿瘤病变并选择和归类为靶标或非靶标病变。靶标病变包括可使用CT、PET-CT或MRI以≤5mm的切片厚度在至少1个维度上准确测量为≥10mm的那些病变。短轴直径≥15mm的恶性淋巴结可被视为靶标病变。于基线处将识别每个器官最多2个靶标病变，总共可识别5个靶标病变。这些病变应代表所有受累器官并应根据其尺寸(最长直径的那些)及其对于准确重复测量的合适性进行选择。计算所有靶标病变的最长病变直径(LLD)之和并将其报告为基线和LLD。对于识别为靶标病变的恶性淋巴结，LLD之和的计算中使用短轴直径。所有其他病变(或疾病部位)应识别为非靶标病变(包括骨病变)。

所有基线后响应评估均应对基线处识别的相同病变进行。在整个研究过程中应使用与基线处用来识别/评价病变的评估相同的方式(例如，CT或MRI)，除非出于受试者安全而需要改变(例如，对造影剂发生过敏反应)。

对于肿瘤分子谱分析，设想相对于来自全血的非肿瘤细胞进行来自组织的肿瘤细胞的基因组测序以识别可能有助于疾病进展和/或对治疗作出响应的肿瘤特异性基因组变异。进行RNA测序以提供表达数据并给出与DNA突变的相关性。进行定量蛋白质组学分析以确定特定蛋白质的绝对量，确认与疾病进展和/或响应相关的基因表达，并确定响应的截断值。

肿瘤分子谱分析优选通过下一代测序和基于质谱的定量蛋白质组学在FFPE肿瘤组织和全血(受试者匹配的针对肿瘤组织的正常对照)上进行。开始治疗后8周还从活检采集肿瘤组织。此外，如果要进行另外的肿瘤活检，则也对那些样品进行进一步的肿瘤分子谱分析。

例如，根据组织标本试剂盒和血液标本试剂盒(Tissue Specimen Kit and BloodSpecimen Kit)中包含的说明卡片采集和装运肿瘤组织和全血样品。FFPE肿瘤组织标本通常被用于提取肿瘤DNA、肿瘤RNA和肿瘤蛋白质。全血样品通常被用于提取受试者正常DNA。肿瘤组织和全血将在CLIA认证和CAP认可的临床实验室(例如，NantOmics,LLC.；ResearchDx,LLC.；和Expression Pathology,Inc.dba OncoPlex Diagnostics)中进行处理。

免疫学分析：在诱导期每6周和维持期每8周在常规抽血过程中及在治疗结束时采集用于免疫学分析的全血。如果将在筛查时进行肿瘤活检，则可在活检之前采集用于免疫学分析的血液样品。将血液样本储存在实验室中以待测定。通过标准免疫测定法评价免疫应答。评估治疗诱导的免疫变化与受试者结果之间的相关性。

循环肿瘤DNA和RNA测定：治疗过程中肿瘤会演化并会出现耐药性细胞，这些是难以检测的并可能导致肿瘤对初始治疗产生抗性。基于血液的ctDNA和ctRNA测试可追踪耐药性肿瘤细胞的出现并可为患者找出新的药物靶标和治疗选择。为此，在筛查期间对参加研究的受试者、在诱导期每6周和维持期每8周在常规抽血过程中及在治疗结束时采集用于ctDNA/ctRNA分析的全血。如果将在筛查时进行肿瘤活检，则必须在活检之前采集用于ctDNA和ctRNA分析的血液样品。通过qPCR和可能地其他方法(例如，DNA/RNA测序)测量ctDNA和ctRNA中与肿瘤和免疫相关的特定分析物的表达水平并分析与受试者结果的相关性。

如本文的描述和附随的整个权利要求书中所用，“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”的含义包括复数指代，上下文另有明确规定除外。而且，如本文的描述中所用，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，上下文另有明确规定除外。此外，并且上下文另有规定除外，术语“偶联到”旨在包括直接偶联(其中彼此偶联的两个要素彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的要素位于所述两个要素之间)两者。因此，术语“偶联到”和“与……偶联”同义地使用。上下文指出相反除外，本文给出的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为包括商业上的实用值。类似地，所有值列表都应视为包括中间值，上下文指出相反除外。

对于本领域技术人员显而易见的是，除已经描述的修改外，还可进行很多更多的修改而不偏离本文的发明构思。因此，除了附随的权利要求的范围外，本发明主题不受限制。而且，在解释说明书和权利要求书两者时，应以与上下文一致的尽可能最广泛的方式解释所有术语。特别地，术语“包括”和“包含”应解释为以非排他性的方式提及要素、组分或步骤，表示所提及的要素、组分或步骤可与未明确地提及的其他要素、组分或步骤一起存在、采用或组合。在说明书权利要求书提及选自A、B、C……和N中的至少之一时，该文本应解释为需要来自该组的仅一个要素，而非A加N或B加N等。

Claims

1.一种治疗脊索瘤的方法，所述方法包括：

以有效治疗所述脊索瘤的剂量向有需要的患者共同施用抗-EGFR抗体和高亲和力NK(haNK)细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为IgG₁。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为西妥昔单抗。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体以100mg/m²和1,000mg/m²之间的剂量施用。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体与所述haNK细胞同时共同施用。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体与在所述haNK细胞的表面上表达的高亲和力CD16变体结合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述haNK细胞以5×10⁵个细胞/kg和5×10⁸个细胞/kg之间的剂量施用。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述haNK细胞为NK92衍生物。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述haNK细胞还表达重组IL2。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述haNK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用之前以至少500cGy的放射剂量照射所述haNK细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用进一步的癌症治疗的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括免疫疗法。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用表达患者特异性和肿瘤特异性新表位的重组酵母或重组病毒。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用表达鼠短尾突变体表型的重组酵母或重组病毒。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括化学疗法。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述化学疗法包括施用阿多柔比星、环磷酰胺、伊立替康、吉西他滨、卡培他滨、5-FU、FOLFIRI、FOLFOX和奥沙利铂中的至少一种。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括放射疗法。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为IgG₁。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体为西妥昔单抗。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体以100mg/m²和1,000mg/m²之间的剂量施用。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体与所述haNK细胞同时共同施用。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-EGFR抗体与在所述haNK细胞的表面上表达的高亲和力CD16结合。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述haNK细胞以5×10⁵个细胞/kg和5×10⁸个细胞/kg之间的剂量施用。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述haNK细胞为NK92衍生物。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述haNK细胞还表达重组IL2。

31.根据权利要求1所述的方法，其中所述haNK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

32.根据权利要求1所述的方法，其中在施用之前以至少500cGy的放射剂量照射所述haNK细胞。

33.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用进一步的癌症治疗的步骤。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括免疫疗法。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用表达患者特异性和肿瘤特异性新表位的重组酵母或重组病毒。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用表达鼠短尾突变体表型的重组酵母或重组病毒。

37.根据权利要求33所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括化学疗法。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述化学疗法包括施用伊立替康、吉西他滨、卡培他滨、5-FU、FOLFIRI、FOLFOX和奥沙利铂中的至少一种。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述进一步的癌症治疗包括放射疗法。

40.一种药物组合物，所述药物组合物包含抗-EGFR抗体和经基因工程化的NK细胞，其中CD16的高亲和力变体在所述经基因工程化的NK细胞的表面上表达，并且其中所述抗-EGFR抗体任选地与所述经基因工程化的NK细胞的所述CD16的高亲和力变体结合。

41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为单克隆抗体。

42.根据权利要求40-41中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体为IgG₁。

43.根据权利要求40-42中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

44.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为西妥昔单抗。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞为NK 92衍生物。

46.根据权利要求40-45中任一项所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞还表达重组IL2。

47.根据权利要求40-46中任一项所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

48.根据权利要求40-47中任一项所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞为已接受至少500cGy的放射剂量的经照射细胞。

49.根据权利要求40-48中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于输注并包含1×10⁶个细胞和5×10⁹个细胞之间。

50.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为单克隆抗体。

51.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为IgG₁。

52.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

53.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述抗体为西妥昔单抗。

54.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞为NK 92衍生物。

55.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞还表达重组IL2。

56.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

57.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述经基因工程化的NK细胞为已接受至少500cGy的放射剂量的经照射细胞。

58.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于输注并包含1×10⁶个细胞和5×10⁹个细胞之间。

59.抗-EGFR抗体和多个高亲和力NK(haNK)细胞用于治疗脊索瘤的用途。

60.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体。

61.根据权利要求59-60中任一项所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为IgG₁。

62.根据权利要求59-61中任一项所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

63.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为西妥昔单抗。

64.根据权利要求59-63中任一项所述的用途，其中所述haNK细胞为NK92衍生细胞。

65.根据权利要求59-64中任一项所述的用途，其中所述haNK细胞还表达重组IL2。

66.根据权利要求59-65中任一项所述的用途，其中所述haNK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

67.根据权利要求59-66中任一项所述的用途，其中所述haNK细胞为已接受至少500cGy的放射剂量的经照射细胞。

68.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为对人EGFR具有结合特异性的单克隆抗体。

69.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为IgG₁。

70.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为人源化的非人抗-EGFR抗体。

71.根据权利要求59所述的用途，其中所述抗-EGFR抗体为西妥昔单抗。

72.根据权利要求59所述的用途，其中所述haNK细胞为NK92衍生细胞。

73.根据权利要求59所述的用途，其中所述haNK细胞还表达重组IL2。

74.根据权利要求59所述的用途，其中所述haNK细胞经基因工程化以具有至少一种抑制性受体的减少表达。

75.根据权利要求59所述的用途，其中所述haNK细胞为已接受至少500cGy的放射剂量的经照射细胞。