CN110604758B

CN110604758B - 一种用于缓解化疗药物副作用的中药

Info

Publication number: CN110604758B
Application number: CN201910827314.1A
Authority: CN
Inventors: 胡学博; 胡胜; 胡翔东; 舒漾
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: CN110604758A

Abstract

本发明公开了一种用于缓解化疗药物副作用的中药，所述中药由菊花、甘草、金银花组成。该中药能提高顺铂对肿瘤细胞的毒性，降低肿瘤在体外的细胞活力，同时还能缓解化疗药物引起的体重骤降、急性肾损伤和食欲降低等副作用。

Description

一种用于缓解化疗药物副作用的中药

技术领域

本发明涉及一种用于缓解化疗药物副作用的中药。

背景技术

顺铂(Cisplatin,DDP)是一类广谱抗癌药物，是一种具有方形平面几何形状的金属铂配位化合物。顺铂在20世纪70年代被批准用于癌症治疗，并且其在肺癌治疗中一直都是最常见的疗法。嘌呤碱基与顺铂1,2-链内交联形成络合物是顺铂产生细胞毒性的关键原因(Beck and Brubaker 1973)。不仅如此，顺铂还会诱导促进细胞死亡的活性氧形成(Brozovic et al 2010)。顺铂在低氯离子浓度条件下的水解产物将抑制线粒体呼吸，从而破坏细胞重要的生理功能(Jennerwein and Andrews 1995)。顺铂还与一系列细胞内关键酶有密切关系(Tang 2010)。顺铂主要剂量限制性副作用是肾毒性(Sastry and Kellie2005)，顺铂肾毒性包括多种表现形式，其中最严重和最常见的表现是20％-30％的患者会产生急性肾损伤(Miller 2010)。顺铂引起的肾功能损伤通常在顺铂给药几天内出现，并伴随着血清肌苷酸和尿素氮浓度的提高、排尿量减少(非少尿)并且尿液中含有葡萄糖和少量蛋白质，这表明近端肾小管功能损伤，重复使用顺铂后也常出现低镁血症(Santoso et al2003)。细胞核DNA与顺铂结合极少，只有＜1％进入细胞内的顺铂会与核DNA结合，而大部分进入细胞的顺铂会与线粒体DNA或其他线粒体靶标结合(Burger et al 1997)。肾近端小管是肾脏中线粒体密度最高的部分，对顺铂也就具有特别的敏感性，从而首当其冲的受到顺铂的损伤(Cullen et al 2007；Edward and Zawada 1986)。

炎症是机体对组织功能障碍的非特异性反应，并被先天性和适应性免疫系统用于对抗致病性入侵者(Ashley et al 2012)。根据起因、机制、结果和强度的不同，炎症可以分为几种不同的类型，他们都与癌症的发生发展有紧密联系。由外界环境如病原物感染引起的炎症反应发生在肿瘤发展之前，是正常宿主防御的一部分，其目的是清除病原体。然而，致瘤病原体却会破坏宿主免疫系统，并建立轻度却慢性长期的持续炎症，其中大部分将促进诸如基因变异、血管生成和肿瘤生长等肿瘤发生发展的生理过程(Rakoff-Nahoum2009)。大多数实体恶性肿瘤都会引发机体内的炎症反应，从而形成一种原始的微环境(Mantovani et al 2008)。目前癌症治疗主要手段手术、化疗和放疗都会导致治疗性炎症。手术引发感染或应激类途径导致过度炎症，而化疗和放疗则是通过坏死途径杀死癌细胞，这也是一种促炎的细胞死亡形式(Vakkila and Lotze)。有证据表明，抑制治疗引起的炎症可能会改善前列腺癌的治疗，并会降低复发率(Ammirante et al 2010)。转移是肿瘤发展关键点，90％以上的癌症死亡是由于转移，炎症和癌症转移也有密切关系(Joyce andPollard 2008)。

中药在辅助化疗药物抗癌方面已经取得较大突破。近年来，耶鲁大学郑永齐教授团队对一个已有1800余年的传统配方黄芩汤进行了优化和研究后发现，该配方自身治疗癌症并无效果，但将其与伊立替康(CPT-11)联用后发现小鼠结肠癌肿瘤体积相较单独CPT-11组显著降低，而且显著缓解了由CPT-11引起的体重骤降及肠胃毒性，增加了小鼠存活率(Lam et al 2010)。此外，该方通过减少中性粒细胞或巨噬细胞的浸润、肠中的TNF-α表达和血浆中的促炎细胞因子浓度而在小鼠中表现出抗炎作用(Lam et al 2010)。

现如今人们已经更好的了解了癌症的分子病因，这为癌症预防和治疗中使用抗炎药物奠定了基础。特别是针对炎症微环境的药物，它具备一个巨大的优点：因为炎症免疫细胞是正常基因组，不同于癌症细胞基因组的高突变，所以不会产生耐药反应(Grivennikovet al 2010)。现在已经有几种抗炎药物作为预防癌症药物使用而且确实能够降低癌症发生率，也已经联合化疗从而减缓了癌症进程并降低了死亡率(Gupta and Dubois 2001)。这类药物包括环氧化酶抑制剂、阿司匹林和抗炎类固醇如地塞米松等(Gierach et al2008)。

所以，我们希望在前人研究和本实验室研究基础上，进一步探寻能够辅助化疗的最佳中药配方。

发明内容

本发明目的在于保护一种中药配方，该配方能够提升顺铂对肿瘤的细胞毒性，能够缓解由顺铂引起的体重降低、肾组织损伤、饮食下降、血常规血生化各指标失常、中性粒细胞浸润以及肝肾组织中MCP-1高表达等副作用。

本发明提供的中药由菊花、甘草、金银花组成，它们的重量比为1：4：1。

(1)在体外抗肿瘤细胞实验结果显示：本发明提供的中药能显著提高顺铂对A549、PC-9、LLC、H1299、MGC-803、MCF-7六种肿瘤细胞的毒性，降低肿瘤在体外的细胞活力，说明对顺铂的治疗具有辅助作用，并且活性高于单独使用一味或两味药材。

(2)本发明中药能增加化疗药物治疗后的采食量和体重，缓解化疗药物引起的体重骤降、食欲降低等副作用。肾脏H&E染色、血常规检测、血生化检测、肾脏免疫组化试验、肝肾组织炎症因子检测结果表明，本发明对顺铂引起的肾组织损伤有很好的保护作用；能够缓解由顺铂引起的一系列血细胞和肝肾关键酶的异常，使顺铂引起的血常规、血生化指标失常得到恢复；能够阻止由顺铂引起的中性粒细胞浸润肾组织；能够显著下调由顺铂引起的MCP-1大量表达，说明本发明能缓解化疗药物顺铂引起的急性损伤等副作用。

附图说明

图1：中药配方对顺铂引起的小鼠肾损伤肾组织H&E切片观察(200×)。图中，A：对照组；B：顺铂组；C：中药组；D：中药+顺铂组。

图2：免疫组化观察小鼠肾脏中性粒细胞浸润情况变化。A：对照组；B:单独顺铂组；C：单独中药组；D：联合组(200×)。

图3：中药配方对顺铂诱导的肝肾炎症因子MCP-1高表达的影响。图中，A是MCP-1蛋白标准曲线；B是小鼠肾脏MCP-1蛋白表达量；C是小鼠肝脏MCP-1蛋白表达量。所示为平均值±标准误，通过Graphpad Prism 6软件t检验，显著性水平P小于0.05表示为*，显著水平P在0.001和0.01之间为**，显著水平P小于0.001表示为***。

具体实施方式

实施例1：中药配方在顺铂治疗中的辅助作用

分别取菊花、甘草、金银花，加10倍水煎煮提取2次，每次1小时，收集滤液，减压浓缩后冻干成粉末，-20℃冻存。

临用前，将冻干粉末用无菌PBS配制成溶液，0.22μm无菌滤膜过滤后使用。以下试验中的中药配方，均为折算后的药材用量。

将A549、PC-9、LLC、H1299、MGC-803、MCF-7细胞用DMEM培养基培养后接入96孔板12h后，加入不同浓度顺铂，检测IC₅₀得表1。按表2加入各药物，其中未加入顺铂和中药的正常生长细胞为空白对照组。

标记后，放入CO₂细胞培养箱中继续培养。24h后，取出96孔细胞培养板，弃掉含药的培养基，无菌PBS清洗3次，然后加入新鲜的培养基90μL/孔。用移液枪添加PBS和培养基时应将枪头对准孔壁，缓慢加入，严禁直接冲洗底部细胞。每孔加入10μL配制好的MTT，然后放入CO₂细胞培养箱中继续培养。4h后，取出96孔细胞培养板，锡箔纸包好避光，3000r/min离心3min，弃上清，然后加入DMSO 100μL/孔，锡箔纸包好避光，轻微震荡混匀10min，准备上机检测。

酶标仪应提前10min开机预热，依次放入待检测的96孔细胞培养板，得到各孔在570、630nm处的吸光值OD570、OD630。数据处理：ODδ＝OD570-OD630，计算细胞活力＝[(正常ODδ-空白ODδ)-(给药ODδ-空白ODδ)]/(正常ODδ-空白ODδ)×100％。结果见表3。

表1顺铂对各细胞系的IC₅₀检测

表2药物成分及配比

	顺铂(μg/ml)	菊花(μg/ml)	甘草(μg/ml)	金银花(μg/ml)
					1	－	－	－	－
2	IC<sub>50</sub>	－	－	－
					3	IC<sub>50</sub>	100	－	－
4	IC<sub>50</sub>	－	100	－
					5	IC<sub>50</sub>	－	－	100
6	IC<sub>50</sub>	100	100	－
					7	IC<sub>50</sub>	100	－	100
8	IC<sub>50</sub>	－	100	100
					9	IC<sub>50</sub>	100	100	100
10	IC<sub>50</sub>	100	200	100
					11	IC<sub>50</sub>	100	400	100
12	IC<sub>50</sub>	100	400	200
					13	IC<sub>50</sub>	100	400	400

表3药物成分及添加量对肿瘤细胞活力的影响

从表3的结果可以看出，菊花、甘草、金银花联用能提高顺铂对肿瘤细胞的毒性，降低肿瘤的细胞活力，对顺铂的治疗具有辅助作用，并且当联合使用三种中药时具有最高的活性。

实施例2中药配方对顺铂引起的小鼠毒副作用的影响

小鼠随机分组，每组5只，相同饲养环境。设置对照组(Control)、单独顺铂组(顺铂20mg/kg)、单独中药配方组(菊花100mg/kg&甘草400mg/kg&金银花100mg/kg)、联合组(顺铂20mg/kg&菊花100mg/kg&甘草400mg/kg&金银花100mg/kg)。单独顺铂组于Day0腹腔注射顺铂溶液200μL(20mg/kg)一次，30分钟后生理盐水300μL灌胃处理一天一次，持续4天；单独中药配方组于第一天腹腔注射生理盐水200μL一次，30分钟后各配方300μL灌胃处理一天一次，持续4天；联合组于第一天腹腔注射顺铂溶液200μL(20mg/kg)一次，30分钟后各配方300μL灌胃处理一天一次，持续4天；对照组于第一天腹腔注射生理盐水200μL一次，30分钟后生理盐水300μL灌胃处理一天一次，持续4天。动物试验的预实验中，高剂量的菊花和金银花会使小鼠不耐受，因此最终选用低剂量菊花和金银花。所有药量均保证了小鼠的耐受力，所有实验组实验时间为4天。

(1)小鼠肾脏H&E染色

第五天脱颈处死小鼠剖取肾脏，经4％多聚甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色，在全景扫描仪扫描后观察并描述，截取病变部位。结果见图1。

H&E结果显示，对照组肾髓质皮质分界清晰，肾小球毛细血管结构清晰，肾小管上皮细胞结构正常，未见明显炎症反应。然而，顺铂将会引起广泛多见肾皮质中肾小管坏死(1号箭头)、肾小管管型扩张(2号箭头)，管腔内可见坏死脱落的上皮细胞碎片(3号箭头)，少见肾小管上皮细胞脂肪变性，上皮细胞胞质内可见圆形空泡(4号箭头)，而炎症反应不明显。单独中药配方组肾髓质皮质分界清晰，肾小球毛细血管结构清晰；肾小管上皮细胞结构正常，未见明显炎症反应。联合组同样是肾髓质皮质分界清晰，肾小球毛细血管结构清晰；肾小管上皮细胞结构正常，未见明显炎症反应。这说明中药配方对顺铂引起的肾组织损伤有很好的保护作用。

(2)血常规检测

提前制作抗凝血1.5mL EP管，即用7.5％的EDTA·2Na溶液浸润EP管，最后每管保留40μL的7.5％的EDTA·2Na溶液。第五天摘眼球取血，每只小鼠大约可以收集0.5～1mL的外周血，抗凝血1.5mL EP管收集外周血后编号，3000r/min离心5min，小心弃掉上清，下层红色细胞层用于血常规检查或者4℃保存，尽可能24小时内完成检测。结果见表4。

表4血常规分析结果

表4中所示为平均值±标准误(n＝5)，通过SPSS软件单因素ANOVA检验，与对照相比P小于0.001为###，p在0.001至0.01之间为##，p小于0.05为#。与顺铂组相比P小于0.001为***，p在0.001至0.01之间为**，p小于0.05为*。

从以上结果看出，中药配方能够使顺铂引起的指标失常得到恢复。

(3)血生化检测

第五天摘眼球取血，每只小鼠大约可以收集0.5～1mL的外周血，1.5mL离心管收集外周血后编号，3000r/min离心5min，取上清用于血生化检测或者4℃保存，尽可能24小时内完成检测。结果见表5。

表5血生化分析结果

表5中所示为平均值±标准误(n＝5)，通过SPSS软件单因素ANOVA检验，与对照相比P小于0.001为###，p在0.001至0.01之间为##，p小于0.05为#。与顺铂组相比比P小于0.001为***，p在0.001至0.01之间为**，p小于0.05为*。

(4)小鼠肾脏免疫组化

第五天脱颈处死小鼠,解剖小鼠取肾脏用组织固定液固定24h后交于谷歌生物有限公司完成后续免疫组化实验。结果见图2。

从图2中可以看出，与对照组和单独中药组相比，单独顺铂组肾脏内中性粒细胞大量聚集，而联合组的中性粒细胞聚集明显减少，说明中药配方能够阻止由顺铂引起的中性粒细胞浸润肾组织。

(5)小鼠肝肾组织炎症因子检测

1)第五天脱颈处死小鼠，解剖取小鼠肝脏和肾脏，使用解剖刀切取0.25g左右放入1.5mL离心管，加入10％的蛋白酶抑制剂的组织裂解液中，使用组织破碎仪得到匀浆，进行后续实验。

2)Beads和抗体的准备：将Beads超声1min，或者涡旋30sec使其充分混匀。计算Beads和抗体用量(按2μL检测3个血清样品计算)，然后用Labeling Buffer稀释(按每个血清样品加入60μL Beads和抗体稀释液的混合液计算)，预先混合所有Beads和抗体，并充分混匀。

3)标准品准备：用1mL Labeling Buffer溶解MCP-1标准品，颠倒多次使其充分混匀，静止10min，然后移入EP管中，标记为C7。再拿6个EP管，分别标记为C6/C5/C4/C3/C2/C1，每个管中加30μL Labeling Buffer，从C7中取出30μL进行2倍倍比稀释，单独取一管Labeling Buffer标记为C0。

4)将组织匀浆样品和标准品转入96孔尖底培养板中，每孔加入30μL组织匀浆样品和标准品，然后每孔加入预先混匀的Beads和抗体混合液60μL，终体积90μL；在加Beads和抗体混合液时应避免其沉降，96孔尖底培养板用锡箔纸避光，室温震荡孵育2h。

5)孵育结束后3000r/min离心5min，小心吸掉上清，每孔加入LabeLing buffer200μL后3000r/min离心5min，小心吸掉上清，重复该步骤一次，准备上机。

6)流式细胞仪上机检测，每个样品收集至少5000个细胞，激发波长576nm，吸收波长488nm，检测细胞平均荧光(Yellow)强度，细胞荧光(Yellow)强度的强弱代表了匀浆中MCP-1炎症因子表达量的高低。Guava流式细胞仪的操作方法参照使用说明书。

7)标准曲线制作，通过ELISACaLc软件，以标准品浓度为纵坐标，以相对应下的荧光值为横坐标，建立标准曲线。样品检测得到的荧光值，通过标准曲线可以换算得到相应的浓度。

8)以单独顺铂组为100％，计算中药配方联合顺铂处理组细胞相对于单独顺铂组的MCP-1蛋白的相对表达量的比值R，计算所得R<100％，则说明中药配方能够抑制由顺铂诱导的炎症因子高水平表达，根据R值评断中药配方辅助顺铂治疗的效果。

结果见图3。以上结果说明中药配方能够显著下调由顺铂引起的MCP-1大量表达。

Claims

1.一种中药在制备用于缓解顺铂副作用的药物中的用途，其特征在于：所述中药由菊花、甘草、金银花组成，所述菊花、甘草、金银花的重量比为1：4：1，

该中药能提高顺铂对肿瘤细胞的毒性，降低肿瘤的细胞活力；肾脏H＆E染色、血常规检测、血生化检测、肾脏免疫组化试验、肝肾组织炎症因子检测结果表明，该中药对顺铂引起的肾组织损伤有很好的保护作用；能够缓解由顺铂引起的一系列血细胞和肝肾关键酶的异常，使顺铂引起的血常规、血生化指标失常得到恢复；能够阻止由顺铂引起的中性粒细胞浸润肾组织；能够显著下调由顺铂引起的MCP-1大量表达，能缓解顺铂引起的急性损伤副作用。