CN110596062B - 基于变频激光的扫描成像系统及其方法 - Google Patents

基于变频激光的扫描成像系统及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于变频激光的扫描成像系统,包括：数字信号发生器(1)、激光器(2)、激光扫描装置(3)、显微镜模块(4)、共聚焦探测模块(5)和数字采集卡(6)。同时，本发明还公开了一种基于变频激光的扫描成像方法。本发明可提高荧光图像的空间分辨率，同时可获得成像样品的荧光寿命数据，为物质种类的分析提供时间维度的信号。

Description

基于变频激光的扫描成像系统及其方法
技术领域
本发明涉及一种扫描成像系统,尤其涉及一种基于变频激光的扫描成像系统及其方法，属于光学成像技术领域。
背景技术
近年来，光学成像工具在科学研究中的地位越来越突出。为了能够获得更高的分辨率，大量新颖的显微成像方法涌现出来。其中，激光共聚焦显微系统由于其良好的成像分辨率、三维成像能力以及突出的成像模式拓展能力，成为了科研工作者的首选。
在激光共聚焦显微系统中，分辨率的提高是一个重要的课题，当前，通过使用双光束耗散激发、空间频率调制激发等方式，均实现了激光共聚焦扫描的空间分辨率的提高，然而，即便是在多种创新性方法的提出，激光共聚焦显微镜的分辨率仍旧没有达到科研工作者的最终需求。人们对激光共聚焦显微镜的空间分辨率的追求没有止境。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提出一种基于变频激光的扫描成像方法及其系统，进一步提高激光共聚焦显微镜的空间分辨率。
为此，本发明采用如下技术方案：
一种基于变频激光的扫描成像系统,包括：数字信号发生器(1)、激光器(2)、激光扫描装置(3)、显微镜模块(4)、共聚焦探测模块(5)和数字采集卡(6)；
所述激光扫描装置(3)包括分别沿X轴和Y轴设置的两套扫描模块及一块反射镜，每一扫描模块均包括：扫描振镜(31)、扫描透镜(32)以及管透镜(33)；反射镜(34)设置在后一个管透镜的后方。
所述显微镜模块(4)，包括二向色镜(41)、显微物镜(42)和样品(43)；
所述数字信号发生器(1)中设置有三路模拟信号，以及一路数字脉冲信号(1a)，三路模拟信号分别为一路变频信号(1b)，两路锯齿波信号(1c，1d)；变频信号(1b)驱动激光器(2)，产生变频强度激光；两路锯齿波信号(1c，1d)作为X轴和Y轴的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜(31)；数字脉冲信号(1a)用于驱动数字采集卡(6)启动数据采集，实现同步探测；当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块(5)所探测，并转换为电信号被数字采集卡(6)同步采集。
进一步地，所述扫描振镜(31)在电信号驱动下，其镜面角度发生改变，进而改变入射激光的出射角度，所述扫描透镜的后焦点可与扫描振镜的镜面中点重合；所述管透镜的后焦点可与所述扫描透镜的前焦点重合，扫描透镜和管透镜共同将扫描振镜的中点共轭到下一个模块的入瞳处。
进一步地，所述扫描振镜(31)、扫描透镜(32)以及管透镜(33)的后焦点到前焦点的连线与光线传输方向重合。
进一步地，所述显微镜模块(4)包括二向色镜(41)、显微物镜(42)和样品(43)，激光通过激光扫描装置后，由二向色镜反射，到达显微物镜，显微物镜的入瞳与上一级的管透镜的前焦点重合，在两路锯齿波信号的驱动下，激光扫描装置实现激光角度的高速扫描，上述激光通过显微物镜后，聚焦在样品面上，其聚焦激光点实现二维网格点扫描，激发样品上M×N个离散区域的荧光信号，荧光信号反向通过显微物镜，进而透过二向色镜模块，进入共聚焦探测模块。
进一步地，所述共聚焦探测模块(5)，包括反射镜(51)、消色差透镜(52)、共聚焦小孔(53)、以及高速探测器(54)组成，通过二向色镜的荧光信号，经过消色差透镜后，聚焦于共聚焦小孔处，共聚焦小孔与消色差透镜的前焦点重合。荧光信号通过共聚焦小孔后，实现了空间滤波，并被紧贴着共聚焦小孔的高速探测器收集，高速探测器将光信号转换为电信号，输出到数字采集卡。
本发明的另一方面，提供一种基于变频激光的扫描成像方法，包括如下步骤：
S1：在数字信号发生器中，设置三路模拟信号，以及一路数字脉冲信号，三路模拟信号分别为一路变频信号，两路锯齿波信号；
变频信号驱动激光器，产生变频强度激光，变频信号定义为F(i)＝sin[ω(i)×i+ψ]，其中
Figure BDA0002210125110000031
其中
Figure BDA0002210125110000032
表示取整数，i和k是大于0的整数，Feq和coe是大于0的有理数，ψ是大于0的有理数；
两路锯齿波信号作为X轴和Y轴的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜，驱动X轴和Y轴的锯齿波信号分别定义为
Figure BDA0002210125110000033
和
Figure BDA0002210125110000034
其中A是大于0的有理数，表示扫描幅度，M是在x轴上横向扫描的像素点数目，N是在y轴上纵向扫描的像素点数目，i是大于0的整数，完整扫描一副二维图像的像素点数目为M×N，定义锯齿波信号的产生频率是Om Hz，Om是大于0的整数，完整扫描一副二维图像需要使用的时间是M×N/Om秒，数字脉冲信号用于驱动数字采集卡启动数据采集，实现同步探测；
S2：当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块所探测，并转换为电信号被数字采集卡同步采集，数字采集卡的采样频率为为Im Hz，Im为Om的P倍,Im和P均是大于0的整数，数字采集卡采集的光电信号定义为一维矩阵Dig，该矩阵的维度为M×N×P，定义pix＝(yj-1)×M+xi,则Dig[(pix-1)×P+1:pix×P]这P个元素表示第(xi,yj)个像素的荧光光强，xi为取值范围在1到M的整数，yj为取值范围在1到N的整数，对矩阵Dig进行暗区搜索，获取暗度较低的区域；
S3：对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，提取强度与相位信息，结合暗度较低区域开展差分膨胀；
S4：输出一副具有高精度空间图像，该空间图像同时包含了每一个像素点的荧光寿命信息。
进一步地，在步骤S2中，所述暗区搜索，是针对数字采集卡保存的数字信号Dig，先做分段积分，得到一个新的一维矩阵Dig_2，该矩阵的维度为M×N，矩阵元素的定义方式是
Figure BDA0002210125110000035
其中i的取值范围是1到M×N，设置阈值Threshold(Threshold为大于0的数字)，利用for循环，遍历Dig_2中的所有元素，将小于Threshold的元素对应的索引号记录到矩阵Dark中，并记录Dig_2中小于Threshold的元素数目，定义为Dark_num，Dark_num是大于0的整数，也是矩阵Dark的维度。
进一步地，在步骤S3中，所述傅里叶变换，是对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，获得一个新的矩阵Dig_FFT，Dig_FFT的数据维度与Dig相同，其转换方法为Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]＝FFT(Dig[(b-1)×P+1:b×P]),FFT为经典的快速离散傅里叶变换。
进一步地，在步骤S3中，所述强度与相位信息，是针对每一个像素内的数据提取强度信息与相位信息，对于第b个像素，将Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]这P个数值中的最大值作为该像素点的强度数据，保存到二维数组Amp[xi,yj]中，其中
Figure BDA0002210125110000041
xi＝b-yj×M，对于第b个像素，相位信息从Dig[(b-1)×P+1:b×P]中提取，使用for循环，遍历Dig[(b-1)×P+1:b×P]中所有的数字，索引值是1到P，记录第一个极值点的索引值Ipeak，如果该极值是最大值，则相位
Figure BDA0002210125110000042
如果该极值是最小值，则相位为，
Figure BDA0002210125110000043
其中
Figure BDA0002210125110000044
进一步地，在步骤S3中，所述差分膨胀，是在暗区搜索、傅里叶变换以及强度信息提取的基础上开展差分计算，新创建一个新的差分矩阵DiffA，该矩阵的维度为M×N，矩阵内的元素初始值均为0，提取矩阵Dark内的索引值，将每一个索引值转换为二维图像像素索引值，转换算式为
Figure BDA0002210125110000045
xi＝Dark[i]-yj×M，其中i是取值范围从1到Dark_num的整数，以暗区域像素Amp[xi,yj]为参考点，DiffA[xi,yj]＝Amp[xi,yj]，相邻的像素点依次与该参考点进行差分，DiffA[xi+1,yj]＝Amp[xi+1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj+1]＝Amp[xi,yj+1]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi-1,yj]＝Amp[xi-1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj-1]＝Amp[xi,yj-1]-DiffA[xi,yj]，在上述差分膨胀后，DiffA将增加4个非零元素，进一步使用上述4个非零元素作为参考点，重复上述差分过程，实现差分膨胀。
本发明的有益效果：
本发明通过使用变频信号驱动激光器，实现变频强度的激光器输出，结合激光扫描装置、显微镜模块、共聚焦探测模块、数字采集卡，完成样品处变频荧光信号的探测，针对变频荧光信号，在时间维度上进行处理，通过暗区搜索，寻找参考像素，进而通过傅里叶变换对数据进行分析，提取强度与相位信息，再通过与参考像素的差分，提高荧光图像的空间分辨率，同时因为采用了变频扫描，通过对荧光信号进行时域分析，可提取荧光相位与激光相位的相位差，该相位差反映了荧光样品的荧光寿命，有助于精细分析研究对象。由于该方法是在时间维度上提高空间分辨率，因此可以与其他的空间维度分辨率提高的方法兼容，此外，通过本发明提供的扫描成像方法，还可以获得成像样品的荧光寿命数据，为物质种类的分析提供时间维度的信号。
附图说明
图1为本发明实施例1的示意图；
图2为本发明中探测荧光数据的处理流程图；
图3为本发明中差分膨胀示意图；
图中，1为数字信号发生器，1a为一路数字脉冲信号，1b为一路变频信号，1c和1d各为一路锯齿波信号；2为激光器；3为激光扫描装置，31为扫描振镜，32为扫描透镜，33为管透镜，31a为第一扫描振镜，32a为第一扫，33a为第一管透镜，31b为第二扫描振镜，32b为第二扫描透镜，33b为第二管透镜，34为反射镜；4为显微镜模块，41为二向色镜、42为显微物镜，43为样品；5为聚焦探测模块，51为反射镜，52为消色差透镜，53为共聚焦小孔，54为高速探测器；6为数字采集卡。
具体实施方式
为了使公众能够更加清楚地理解本发明的技术实质和有益效果，申请人将在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本发明方案的限制，任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。
实施例1
如图1所示，本实施例公开一种基于变频激光的扫描成像系统，包括：数字信号发生器1、激光器2、激光扫描装置3、显微镜模块4、共聚焦探测模块5和数字采集卡6；其中：
激光扫描装置3包括两套扫描模块及一块反射镜，两套扫描模块分别为X轴扫描模块和Y轴扫描模块，每一扫描模块均包括扫描振镜31、扫描透镜32以及管透镜33；为了便于区分，在此将X轴扫描模块中的各组成部分分别命名为：第一扫描振镜31a，第一扫描透镜32a以及第一管透镜33a，将Y轴扫描模块中的各组成部分分别命名为：第二扫描振镜31b，第二扫描透镜32b以及第二管透镜33b；反射镜设置在第二管透镜33b的后方。
显微镜模块4包括二向色镜41、显微物镜42和样品43。
如图1所示，数字信号发生器1中设置有三路模拟信号，以及一路数字脉冲信号1a，三路模拟信号分别为一路变频信号1b，两路锯齿波信号1c和1d；变频信号1b驱动激光器2，产生变频强度激光；两路锯齿波信号1c和1d作为X轴和Y轴的扫描模块的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜，即第一扫描振镜31a和第二扫描振镜31b；数字脉冲信号1a用于驱动数字采集卡6启动数据采集，实现同步探测；当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块5所探测，并转换为电信号被数字采集卡6同步采集。
变频信号1b驱动激光器2，产生变频强度激光，变频信号定义为F(i)＝sin[ω(i)×i+ψ]，其中
Figure BDA0002210125110000061
其中
Figure BDA0002210125110000062
表示取整数，i和k是大于0的整数，Feq和coe是大于0的有理数，ψ是大于0的有理数，两路锯齿波信号作为X轴和Y轴的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜，驱动X轴和Y轴的锯齿波信号分别定义为
Figure BDA0002210125110000063
和
Figure BDA0002210125110000064
其中A是大于0的有理数，表示扫描幅度，M是在x轴上横向扫描的像素点数目，N是在y轴上纵向扫描的像素点数目，i是大于0的整数，完整扫描一副二维图像的像素点数目为M×N，定义锯齿波信号的产生频率是Om Hz，Om是大于0的整数，完整扫描一副二维图像需要使用的时间是M×N/Om秒，数字脉冲信号用于驱动数字采集卡启动数据采集，实现同步探测，当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块所探测，并转换为电信号被数字采集卡同步采集，数字采集卡的采样频率为为Im Hz，Im为Om的P倍,Im和P均是大于0的整数，数字采集卡采集的光电信号定义为一维矩阵Dig，该矩阵的维度为M×N×P，定义pix＝(yj-1)×M+xi,则Dig[(pix-1)×P+1:pix×P]这P个元素表示第(xi,yj)个像素的荧光光强，xi为取值范围在1到M的整数，yj为取值范围在1到N的整数，对矩阵Dig进行暗区搜索，获取暗度较低的区域，然后对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，提取强度与相位信息，结合暗度较低区域开展差分膨胀，最后可输出一副具有高精度空间图像，同时包含了每一个像素点的荧光寿命信息。
本实施例的激光扫描装置，扫描振镜(31a，31b)在电信号驱动下，其镜面角度发生改变，进而改变入射激光的出射角度，第一扫描透镜32a的后焦点与第一扫描振镜31a的镜面中点重合，用于实现激光平场扫描，第一管透镜33a的后焦点与第一扫描透镜32a的前焦点重合，用于实现激光的准直出射，第一扫描透镜32a和第一管透镜33a共同将第一扫描振镜31a的中点共轭到第二扫描振镜31b的镜面中心；第二扫描透镜32b的后焦点与第二扫描振镜31b的镜面中点重合，用于实现激光平场扫描，第二管透镜33b的后焦点与第二扫描透镜32b的前焦点重合，用于实现激光的准直出射，第二扫描透镜32b和第二管透镜33b共同将第二扫描振镜31b的中点共轭到显微物镜的入瞳处，反射镜34用于折叠光路，将激光反射到显微镜模块4中，本系统中单透镜的后焦点到前焦点的连线与光线传输方向重合。
所述显微镜模块4，其核心元件包括二向色镜41、显微物镜42和样品43，激光通过激光扫描装置3后，由二向色镜41反射，到达显微物镜42，显微物镜42的入瞳与上一级的管透镜(即第二管透镜33b)的前焦点重合，在两路锯齿波信号的驱动下，激光扫描装置3实现激光角度的高速扫描，上述激光通过显微物镜后，聚焦在样品面上，其聚焦激光点实现二维网格点扫描，激发样品上M×N个离散区域的荧光信号，荧光信号反向通过显微物镜，进而透过二向色镜模块，进入共聚焦探测模块；图1中,
Figure BDA0002210125110000071
示出了激光光线的路径，
Figure BDA0002210125110000081
示出了荧光光线的路径。
所述共聚焦探测模块5，包括反射镜51、消色差透镜52、共聚焦小孔53以及高速探测器54，通过二向色镜41的荧光信号，经过反射镜51反射后，通过消色差透镜52，聚焦于共聚焦小孔53处，共聚焦小孔53与消色差透镜52的前焦点重合。荧光信号通过共聚焦小孔53后，实现了空间滤波，并被紧贴着共聚焦小孔的高速探测器54收集，高速探测器将光信号转换为电信号，输出到数字采集卡。
所述暗区搜索，是针对数字采集卡保存的数字信号Dig，先做分段积分，得到一个新的一维矩阵Dig_2，该矩阵的维度为M×N，矩阵元素的定义方式是
Figure BDA0002210125110000082
其中i的取值范围是1到M×N，设置阈值Threshold(Threshold为大于0的数字)，利用for循环，遍历Dig_2中的所有元素，将小于Threshold的元素对应的索引号记录到矩阵Dark中，并记录Dig_2中小于Threshold的元素数目，定义为Dark_num，Dark_num是大于0的整数，也是矩阵Dark的维度。
所述傅里叶变换，是对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，获得一个新的矩阵Dig_FFT，Dig_FFT的数据维度与Dig相同，其转换方法为Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]＝FFT(Dig[(b-1)×P+1:b×P]),FFT为经典的快速离散傅里叶变换。
所述强度与相位信息，是针对每一个像素内的数据提取强度信息与相位信息，对于第b个像素，将Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]这P个数值中的最大值作为该像素点的强度数据，保存到二维数组Amp[xi,yj]中，其中
Figure BDA0002210125110000083
xi＝b-yj×M，对于第b个像素，相位信息从Dig[(b-1)×P+1:b×P]中提取，使用for循环，遍历Dig[(b-1)×P+1:b×P]中所有的数字，索引值是1到P，记录第一个极值点的索引值Ipeak，如果该极值是最大值，则相位
Figure BDA0002210125110000091
如果该极值是最小值，则相位为，
Figure BDA0002210125110000092
其中
Figure BDA0002210125110000093
所述差分膨胀，是在暗区搜索、傅里叶变换以及强度信息提取的基础上开展差分计算，新创建一个新的差分矩阵DiffA，该矩阵的维度为M×N，矩阵内的元素初始值均为0，提取矩阵Dark内的索引值，将每一个索引值转换为二维图像像素索引值，转换算式为
Figure BDA0002210125110000094
xi＝Dark[i]-yj×M，其中i是取值范围从1到Dark_num的整数，如图3所示，以暗区域像素Amp[xi,yj]为参考点，DiffA[xi,yj]＝Amp[xi,yj]，相邻的像素点依次与该参考点进行差分，DiffA[xi+1,yj]＝Amp[xi+1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj+1]＝Amp[xi,yj+1]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi-1,yj]＝Amp[xi-1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj-1]＝Amp[xi,yj-1]-DiffA[xi,yj]，在上述差分膨胀后，DiffA将增加4个非零元素，进一步使用上述4个非零元素作为参考点，重复上述差分过程，实现查封膨胀，对于像素点(xi+1,yj+1)，以DiffA[xi+1,yj]作为参考点，差分计算式为DiffA[xi+1,yj+1]＝Amp[xi+1,yj+1]-DiffA[xi+1,yj]，上述过程以此类推，最后完成全幅图像的差分计算。
实施例2
如图1-3所示，本实施例公开一种基于变频激光的扫描成像方法，采用了实施例1中所描述的基于变频激光的扫描成像系统，包含如下步骤：
S1：在数字信号发生器中，设置三路模拟信号，以及一路数字脉冲信号，三路模拟信号分别为一路变频信号，两路锯齿波信号；
变频信号驱动激光器，产生变频强度激光，变频信号定义为F(i)＝sin[ω(i)×i+ψ]，其中
Figure BDA0002210125110000095
其中
Figure BDA0002210125110000096
表示取整数，i和k是大于0的整数，Feq和coe是大于0的有理数，ψ是大于0的有理数；
两路锯齿波信号作为X轴和Y轴的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜，驱动X轴和Y轴的锯齿波信号分别定义为
Figure BDA0002210125110000097
和
Figure BDA0002210125110000098
其中A是大于0的有理数，表示扫描幅度，M是在x轴上横向扫描的像素点数目，N是在y轴上纵向扫描的像素点数目，i是大于0的整数，完整扫描一副二维图像的像素点数目为M×N，定义锯齿波信号的产生频率是Om Hz，Om是大于0的整数，完整扫描一副二维图像需要使用的时间是M×N/Om秒，数字脉冲信号用于驱动数字采集卡启动数据采集，实现同步探测；
S2：当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块所探测，并转换为电信号被数字采集卡同步采集，数字采集卡的采样频率为为Im Hz，Im为Om的P倍,Im和P均是大于0的整数，数字采集卡采集的光电信号定义为一维矩阵Dig，该矩阵的维度为M×N×P，定义pix＝(yj-1)×M+xi,则Dig[(pix-1)×P+1:pix×P]这P个元素表示第(xi,yj)个像素的荧光光强，xi为取值范围在1到M的整数，yj为取值范围在1到N的整数，对矩阵Dig进行暗区搜索，获取暗度较低的区域；
S3：对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，提取强度与相位信息，结合暗度较低区域开展差分膨胀；
S4：输出一副具有高精度空间图像，该空间图像同时包含了每一个像素点的荧光寿命信息。
作为一种具体的实施方式，在步骤S2中，所述暗区搜索，是针对数字采集卡保存的数字信号Dig，先做分段积分，得到一个新的一维矩阵Dig_2，该矩阵的维度为M×N，矩阵元素的定义方式是
Figure BDA0002210125110000101
其中i的取值范围是1到M×N，设置阈值Threshold(Threshold为大于0的数字)，利用for循环，遍历Dig_2中的所有元素，将小于Threshold的元素对应的索引号记录到矩阵Dark中，并记录Dig_2中小于Threshold的元素数目，定义为Dark_num，Dark_num是大于0的整数，也是矩阵Dark的维度。
作为一种具体的实施方式，在步骤S3中，所述傅里叶变换，是对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶转换，获得一个新的矩阵Dig_FFT，Dig_FFT的数据维度与Dig相同，其转换方法为Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]＝FFT(Dig[(b-1)×P+1:b×P]),FFT为经典的快速离散傅里叶变换。
作为一种具体的实施方式，在步骤S3中，所述强度与相位信息，是针对每一个像素内的数据提取强度信息与相位信息，对于第b个像素，将Dig_FFT[(b-1)×P+1:b×P]这P个数值中的最大值作为该像素点的强度数据，保存到二维数组Amp[xi,yj]中，其中
Figure BDA0002210125110000111
xi＝b-yj×M，对于第b个像素，相位信息从Dig[(b-1)×P+1:b×P]中提取，使用for循环，遍历Dig[(b-1)×P+1:b×P]中所有的数字，索引值是1到P，记录第一个极值点的索引值Ipeak，如果该极值是最大值，则相位
Figure BDA0002210125110000112
如果该极值是最小值，则相位为，
Figure BDA0002210125110000113
其中
Figure BDA0002210125110000114
作为一种具体的实施方式，在步骤S3中，所述差分膨胀，是在暗区搜索、傅里叶变换以及强度信息提取的基础上开展差分计算，新创建一个新的差分矩阵DiffA，该矩阵的维度为M×N，矩阵内的元素初始值均为0，提取矩阵Dark内的索引值，将每一个索引值转换为二维图像像素索引值，转换算式为
Figure BDA0002210125110000115
xi＝Dark[i]-yj×M，其中i是取值范围从1到Dark_num的整数，以暗区域像素Amp[xi,yj]为参考点，DiffA[xi,yj]＝Amp[xi,yj]，相邻的像素点依次与该参考点进行差分，DiffA[xi+1,yj]＝Amp[xi+1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj+1]＝Amp[xi,yj+1]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi-1,yj]＝Amp[xi-1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj-1]＝Amp[xi,yj-1]-DiffA[xi,yj]，在上述差分膨胀后，DiffA将增加4个非零元素，进一步使用上述4个非零元素作为参考点，重复上述差分过程，实现差分膨胀,如图3所示。

Claims (1)

1.一种基于变频激光的扫描成像方法，包括如下步骤：
S1：在数字信号发生器中，设置三路模拟信号，以及一路数字脉冲信号，三路模拟信号分别为一路变频信号，两路锯齿波信号；
变频信号驱动激光器，产生变频强度激光，变频信号定义为
Figure 884793DEST_PATH_IMAGE001
，其 中
Figure 834556DEST_PATH_IMAGE002
，其中
Figure 879873DEST_PATH_IMAGE003
表示取整数，i和k是大于0的整数，Feq和coe是大于0的 有理数，
Figure 540661DEST_PATH_IMAGE004
是大于0的有理数；
两路锯齿波信号作为X轴和Y轴的扫描信号，驱动激光扫描装置中的两个振镜，驱动X轴 和Y轴的锯齿波信号分别定义为
Figure 886192DEST_PATH_IMAGE005
和
Figure 974234DEST_PATH_IMAGE006
，其中A是大于0的有理数，表示扫描幅度， M是在x轴上横向扫描的像素点数目，N是在y轴上纵向扫描的像素点数目，i是大于0的整数， 完整扫描一副二维图像的像素点数目为M×N，定义锯齿波信号的产生频率是Om Hz，Om是大 于0的整数，完整扫描一副二维图像需要使用的时间是M×N/Om秒，数字脉冲信号用于驱动 数字采集卡启动数据采集，实现同步探测；
S2：当上述三路模拟信号发出后，系统处于变频激光扫描，样品也随之被激发出变频强度荧光，荧光信号被共聚焦探测模块所探测，并转换为电信号被数字采集卡同步采集，数字采集卡的采样频率为Im Hz，Im为Om的P倍,Im和P均是大于0的整数，数字采集卡采集的光电信号定义为一维矩阵Dig，该矩阵的维度为M×N×P，定义pix=(yj-1)×M+xi,则 Dig[(pix-1)×P+1: pix×P]这P个元素表示第（xi,yj）个像素的荧光光强，xi为取值范围在1到M的整数，yj为取值范围在1到N的整数，对矩阵Dig进行暗区搜索，获取暗度较低的区域；
S3：对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶变换，提取强度与相位信息，结合暗度较低区域开展差分膨胀；
S4：输出一副具有高精度空间图像，该空间图像同时包含了每一个像素点的荧光寿命信息；
在步骤S2中，所述暗区搜索，是针对数字采集卡保存的数字信号Dig，先做分段积分，得 到一个新的一维矩阵Dig_2，该矩阵的维度为M×N，矩阵元素的定义方式是
Figure 506846DEST_PATH_IMAGE007
，其中i的取值范围是1到M×N，设置阈值Threshold，Threshold 为大于0的数字，利用for循环，遍历Dig_2中的所有元素，将小于Threshold的元素对应的索 引号记录到矩阵Dark中，并记录Dig_2中小于Threshold的元素数目，定义为Dark_num， Dark_num是大于0的整数，也是矩阵Dark的维度；
在步骤S3中，所述傅里叶变换，是对矩阵Dig的每个像素内的荧光强度数据做傅里叶变换，获得一个新的矩阵Dig_FFT，Dig_FFT的数据维度与Dig相同，其转换方法为Dig_FFT[(b-1)×P+1: b×P]=FFT(Dig [(b-1)×P+1: b×P])，FFT为经典的快速离散傅里叶变换；
在步骤S3中，所述强度与相位信息，是针对每一个像素内的数据提取强度信息与相位 信息，对于第b个像素，将Dig_FFT[(b-1)×P+1: b×P]这P个数值中的最大值作为该像素点 的强度数据，保存到二维数组Amp[xi,yj]中，其中
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，
Figure 502484DEST_PATH_IMAGE009
，对于第b 个像素，相位信息从Dig [(b-1)×P+1: b×P]中提取，使用for循环，遍历Dig [(b-1)×P+ 1: b×P]中所有的数字，索引值是1到P，记录第一个极值点的索引值Ipeak，如果该极值是 最大值，则相位
Figure 436942DEST_PATH_IMAGE010
，如果该极值是最小值，则相位为，
Figure 695885DEST_PATH_IMAGE011
，其中
Figure 715793DEST_PATH_IMAGE012
；
在步骤S3中，所述差分膨胀，是在暗区搜索、傅里叶变换以及强度信息提取的基础上开 展差分计算，新创建一个新的差分矩阵DiffA，该矩阵的维度为M×N，矩阵内的元素初始值 均为0，提取矩阵Dark内的索引值，将每一个索引值转换为二维图像像素索引值，转换算式 为
Figure 718385DEST_PATH_IMAGE013
，
Figure DEST_PATH_IMAGE014
，其中i是取值范围从1到Dark_num的整数，以 暗区域像素Amp[xi,yj]为参考点，DiffA[xi,yj]= Amp[xi,yj]，相邻的像素点依次与该参 考点进行差分，DiffA[xi+1,yj]=Amp[xi+1,yj]-DiffA[xi,yj]，DiffA[xi,yj+1]= Amp [xi,yj+1]- DiffA[xi,yj]，DiffA[xi-1,yj]= Amp [xi-1,yj]- DiffA[xi,yj]，DiffA[xi, yj-1]= Amp [xi,yj-1]- DiffA[xi,yj]，在上述差分膨胀后，DiffA将增加4个非零元素，进 一步使用上述4个非零元素作为参考点，重复上述差分过程，实现差分膨胀。
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