CN110592247A - 一种番茄溃疡病的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种番茄溃疡病抗性的鉴定方法，该方法为：分离疑似番茄溃疡病菌，用特异性引物chpC‑1和chpC‑2进行PCR扩增，检测是否为番茄溃疡病菌，将感病番茄植株的总DNA用引物27F和1492R扩增得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列，构建系统进化树。本发明将番茄溃疡病病原菌的培养基培养鉴定、分子水平鉴定相结合，提高鉴定的准确性，通过番茄溃疡病的病株中的病原菌的分离，用特异性引物chpC‑1和chpC‑2检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌，筛选出检测出特异性条带对应的感病番茄植株，用引物27F和1492R对感病番茄植株的总DNA扩增，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列，通过构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性，避免因形态相似而导致错误鉴定。

Description

一种番茄溃疡病的鉴定方法
技术领域
本发明属于病原菌鉴定技术领域，具体涉及一种番茄溃疡病的鉴定方法。
背景技术
番茄溃疡病是一种种传维管束病害，其病原为密执安棒杆菌番茄溃疡病致病型Clavibacter michiganensis Subsp,Michiganensis(Smith)，番茄溃疡病是一种典型的种传细菌性病害和我国植物检疫对象,而目前的检测方法均存在一定的局限性。因此，迫切需要建立一套更为先进、快速、准确、灵敏的检测方法，能够为检验检疫系统，技术监督部门和番茄的种子、种苗健康检测领域提供快捷、准确的实用技术，为番茄种植业提供可靠的病害流行信息和恰当的防治方案，也为其他植物病原菌的检测和鉴定提供新的思路和研究基础，因此这项研究意义十分重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种番茄溃疡病的鉴定方法，该方法将番茄溃疡病病原菌的培养基培养鉴定与分子水平鉴定相结合，提高鉴定的准确性，通过番茄溃疡病的病株中的病原菌的分离，然后选用特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌，筛选出检测出特异性条带对应的感病番茄植株，用引物27F和引物1492R对感病番茄植株的总DNA进行扩增，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列，然后通过构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性，避免因形态相似而导致错误鉴定。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种番茄溃疡病的鉴定方法，该方法为：
S1、病原菌的分离：
取疑似番茄溃疡病的病株茎部1cm～2cm，置于灭菌的培养皿内，滴加3滴～5滴的无菌水，挤压茎部，流出的组织液用接种环蘸取后在523固体培养基上划线，密封后，在温度为28℃的条件下培养48h，挑出浅黄色的单菌落于523固体培养基上，密封后，在温度为28℃的条件下培养24h后，得到疑似番茄溃疡病菌；
所述523固体培养基的制备方法为：蔗糖10g、聚蛋白胨8g、酵母提取物4g、K2HPO42g、MgSO4·7H2O 0.3g，加水定容至1L；
S2、挑取S1中得到的疑似番茄溃疡病菌，溶于无菌水中，在温度为100℃的水浴条件下加热10min，得到PCR反应模板；
S3、使用番茄溃疡病菌的特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2对S2中得到的PCR反应模板进行PCR扩增，检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌；所述特异性引物chpC-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述特异性引物chpC-2的的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
S4、将S3中检测出番茄溃疡病菌特异性条带对应的感病番茄植株提取总DNA，用引物27F和引物1492R对感病番茄番茄植株的总DNA进行PCR扩增、纯化和测序后，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列；所述引物27F和引物1492R均为真细菌16S rDNA基因通用引物；所述引物27F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物1492R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
S5、将S4中得到的番茄溃疡病菌的16S rDNA序列构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性。
优选地，S2中所述PCR反应的模板中番茄溃疡病菌待测物和无菌水的用量比为1μL：9.5μL。
优选地，S3中所述PCR扩增的反应体系为：PCR反应模板1.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-11.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-1 1.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 5.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U，ddH2O补足至25μL；所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性1min，64℃退火90s，72℃延伸90s，72℃10min，共35个循环。
优选地，S4中所述PCR扩增的反应体系为：感病番茄植株的总DNA 2.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL、浓度为10μmol/L的引物27F 2.0μL、浓度为10μmol/L的引物1492R 2.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U、双蒸水补足至50.0μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，72℃7min，共30个循环。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明将番茄溃疡病病原菌的培养基培养鉴定与分子水平鉴定相结合，提高鉴定的准确性，通过番茄溃疡病的病株中的病原菌的分离，然后选用特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌，筛选出检测出特异性条带对应的感病番茄植株，用引物27F和引物1492R对感病番茄植株的总DNA进行扩增，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列，然后通过构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性，避免因形态相似而导致错误鉴定。分子生物学技术成为快速、准确鉴定微生物的方法。特异性PCR技术因其具有较高的特异性和灵敏度，是目前检测番茄溃疡病菌最常用的分子生物学方法。16SrDNA普遍存在于原核生物细胞内，其序列具有保守型和特异性相结合的特点，保守区为所有细菌共有，细菌间无差异，可变区在不同细菌间存在不同程度的差异，具有属或者种的差异。因此利用16SrDNA进行未知微生物的鉴定已得到广泛认可，成为微生物鉴定的一种有效手段随着分子生物学技术的快速发展。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的疑似番茄溃疡病菌的菌落图。
图2是本发明的特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2对PCR反应模板PCR扩增的电泳图。
图3是本发明的引物27F和引物1492R对感病番茄番茄植株的总DNA进行PCR扩增的电泳图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的番茄溃疡病的鉴定方法，该方法为：
S1、病原菌的分离：
取疑似番茄溃疡病的病株茎部1cm～2cm，置于灭菌的培养皿内，滴加3滴～5滴的无菌水，挤压茎部，流出的组织液用接种环蘸取后在523固体培养基上划线，密封后，在温度为28℃的条件下培养48h，挑出浅黄色的单菌落于523固体培养基上，密封后，在温度为28℃的条件下培养24h后，得到疑似番茄溃疡病菌；
所述523固体培养基的制备方法为：蔗糖10g、聚蛋白胨8g、酵母提取物4g、K2HPO42g、MgSO4·7H2O 0.3g，加水定容至1L；
所述疑似番茄溃疡病菌如图1所示，病原菌为浅黄色，在523培养基上菌落圆形，直径2-3mm，乳黄色略凸起，边缘整齐，不透明，表面光滑，粘稠状；
S2、挑取S1中得到的疑似番茄溃疡病菌，溶于无菌水中，在温度为100℃的水浴条件下加热10min，得到PCR反应模板；所述PCR反应的模板中番茄溃疡病菌待测物和无菌水的用量比为1μL：9.5μL；
S3、使用番茄溃疡病菌的特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2对S2中得到的PCR反应模板进行PCR扩增，检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌；所述特异性引物chpC-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述特异性引物chpC-2的的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述PCR扩增的反应体系为：PCR反应模板1.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-1 1.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-11.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 5.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U，ddH2O补足至25μL；所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性1min，64℃退火90s，72℃延伸90s，72℃10min，共35个循环；
图2中M为DL2000 DNA Marker从上到下条带大小依次为(bp)：2000、1000、750、500、250、100；泳道1为正对照(已检测携带番茄溃疡病的菌株)，泳道10为清水对照，泳道2-9为疑似番茄溃疡病菌的PCR反应模板样品；由图2可知，扩增后可见大小为465bp的扩增片段，表明发病植株携带的病原菌为密执安棒状杆菌(CMM)，番茄溃疡病是一种种传维管束病害，其病原为密执安棒杆菌番茄溃疡病致病型Clavibacter michiganensis Subsp,Michiganensis(Smith)；
S4、将S3中检测出番茄溃疡病菌特异性条带对应的感病番茄植株提取总DNA，用引物27F和引物1492R对感病番茄番茄植株的总DNA进行PCR扩增、纯化和测序后，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列；所述引物27F和引物1492R均为真细菌16S rDNA基因通用引物；所述引物27F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物1492R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述PCR扩增的反应体系为：感病番茄植株的总DNA 2.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL、浓度为10μmol/L的引物27F 2.0μL、浓度为10μmol/L的引物1492R 2.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U、双蒸水补足至50.0μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，72℃7min，共30个循环；
图3中M为DL2000 DNA Marker从上到下条带大小依次为(bp)：2000、1000、750、500、250、100；图中“+”为阳性对照(已检测出目的片段的番茄病株)；图中“-”为阴性对照(健康番茄总DNA)；泳道1为正对照(已检测携带番茄溃疡病的菌株)，泳道1-6为S3中检测出番茄溃疡病菌特异性条带对应的感病番茄植株提取总DNA样品；由图3可知，扩增后可见大小为1500bp的扩增片段，表明与预期目的片段一致，阴性对照无扩增条带出现；说明已成功提取了番茄溃疡病病菌的16S rDNA。
S5、将S4中得到的番茄溃疡病菌的16S rDNA序列构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性。
利用NCBI中BLAST(http://www.ncbi.nlnn.nih.gov/BLAST/)对经病原菌分离后得到的番茄溃疡病菌的16S rDNA序列进行分析比对，分别选取NCBI上已发表的CMM(密执安棒状杆菌)代表性分离物的序列，对所选顶的序列利用DNAStar中的MegAlign软件进行同源性比对，利用软件Mega 5.05的Clustal W法进行分多序列比对分析以及邻接(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度(bootstrap)进行1000次重复分析。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 包头市农牧业科学研究院
<120> 一种番茄溃疡病的鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213>
<400> 1
ccccatcgga acggtttatt gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>
<400> 2
gctctgctct gtgagacgat g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>
<400> 3
agagtttgat catggctcag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213>
<400> 4
tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (4)

1.一种番茄溃疡病的鉴定方法，其特征在于，该方法为：
S1、病原菌的分离：
取疑似番茄溃疡病的病株茎部1cm～2cm，置于灭菌的培养皿内，滴加3滴～5滴的无菌水，挤压茎部，流出的组织液用接种环蘸取后在523固体培养基上划线，密封后，在温度为28℃的条件下培养48h，挑出浅黄色的单菌落于523固体培养基上，密封后，在温度为28℃的条件下培养24h后，得到疑似番茄溃疡病菌；
S2、挑取S1中得到的疑似番茄溃疡病菌，溶于无菌水中，在温度为100℃的水浴条件下加热10min，得到PCR反应模板；
S3、使用番茄溃疡病菌的特异性引物chpC-1和特异性引物chpC-2对S2中得到的PCR反应模板进行PCR扩增，检测疑似番茄溃疡病菌是否为番茄溃疡病菌；所述特异性引物chpC-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述特异性引物chpC-2的的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
S4、将S3中检测出番茄溃疡病菌特异性条带对应的感病番茄植株提取总DNA，用引物27F和引物1492R对感病番茄番茄植株的总DNA进行PCR扩增、纯化和测序后，得到番茄溃疡病菌的16S rDNA序列；所述引物27F和引物1492R均为真细菌16S rDNA基因通用引物；所述引物27F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物1492R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
S5、将S4中得到的番茄溃疡病菌的16S rDNA序列构建系统进化树，根据番茄溃疡病菌的16S rDNA序列在系统中的位置，判断同源性。
2.根据权利要求1所述的一种番茄溃疡病的鉴定方法，其特征在于，S2中所述PCR反应的模板中番茄溃疡病菌待测物和无菌水的用量比为1μL：9.5μL。
3.根据权利要求1所述的一种番茄溃疡病的鉴定方法，其特征在于，S3中所述PCR扩增的反应体系为：PCR反应模板1.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-1 1.0μL、浓度为10μmol/L的特异性引物chpC-1 1.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 5.0μL、Taq DNA聚合酶2.5U，ddH2O补足至25μL；所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性1min，64℃退火90s，72℃延伸90s，72℃10min，共35个循环。
4.根据权利要求1所述的一种番茄溃疡病的鉴定方法，其特征在于，S4中所述PCR扩增的反应体系为：感病番茄植株的总DNA 2.0μL、10×PCR缓冲液5.0μL、浓度为2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL、浓度为10μmol/L的引物27F 2.0μL、浓度为10μmol/L的引物1492R 2.0μL、TaqDNA聚合酶2.5U、双蒸水补足至50.0μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，72℃7min，共30个循环。
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