CN110592099A

CN110592099A - 棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用

Info

Publication number: CN110592099A
Application number: CN201910896478.XA
Authority: CN
Inventors: 冯鸿杰; 周京龙; 朱荷琴; 冯自力; 魏锋; 赵丽红; 师勇强; 袁媛
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-22
Filing date: 2019-09-22
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-09-22
Also published as: CN110592099B

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用。本发明的棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的基因GhHMGB2的表达与棉花抗黄萎病呈正相关，可作为通过基因工程选育棉花抗病品种的候选基因。

Description

棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用。

背景技术

棉花黄萎病作为棉花第一大病害，素有棉花“癌症”之称，其流行爆发给世界棉花产业的稳定发展造成严重威胁。然而由于棉花黄萎病是一种土传病害，防治难度极大，目前尚无理想的防治措施。因此，通过基因育种工程选育抗病品种成为解决棉花黄萎病的重要技术手段。

病原菌与植物的侵染和抗侵染机制一直是研究热点，植物与病原物之间的PTI和ETI抗病机理，成为研究抗病育种的重要手段。在病原物胁迫下，植物体内激活一系列信号转导，以激发植物的抗性反应，以抵御病原菌的侵染。现有技术研究表明，植物中的蛋白质通过发生蛋白质修饰，涉及植物生长、发育和免疫等。

发明内容

本发明的目的在于提供棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用。

本发明的再一目的在于提供一种提高棉花黄萎病抗性的方法。

根据本发明具体实施方式的棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的CDS基因序列如SEQID NO.1所示：

ATGGACGGAGCCACATATAAGATTGTGAGAGAGAGAAGAAGCACAGAGGAAGCACAACAAAAGAAAGAGGATTCAAACATGAAAGGAGGTAAATCCAAGTCGGATGCCAAGAGCGCCAAGCTCTCCGTGAATAAGAAATCAATCACGAAAGCTGGAAAGAAATCGGGGAAGGCAGCTAAGGATCCAAACAAGCCAAAGAGGCCTGCTAGCGCCTTCTTCGTTTTCATGGAGGAGTTCCGCGAGCAATACAAGAAGGAGCACCCTAAAAACAAGTCCGTTGCTGCTGTTGGCAAAGCTGGTGGAGATAAATGGAAGAGCCTTTCTGAAGCTGAAAAGCGACCTTATGTTGATAAGGCAGAGAAACGAAAGGTCGAGTATGAAAAGAACATGAAAGCCTACAATAAGAGACAGGCTGAGGGTCCCCAAGAAGATGAGGAGGAATCTGAGAAGTCTGTATCTGAGGTGAATGATGAAGAAGAAGATGATGATGAAGGCAGTGGAGACGAGGAAGATGATGAGTAG

根据本发明具体实施方式的基因GhHMGB2编码的蛋白为高迁移率族蛋白(highmobility group B protein 2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

接种病原菌后，通过蛋白质修饰组检测，GhHMGB2的第148、151、153和166位的丝氨酸(Ser，S)发生了磷酸化修饰，第40位的赖氨酸(Lys，K)发生了乙酰化修饰，第105位的赖氨酸(Lys，K)发生了泛素化修饰。

根据本发明具体实施方式的提高植物黄萎病抗性的方法，包括在植物中过表达基因GhHMGB2的步骤，还可以通过使用茉莉酸甲酯和/或过氧化氢来促进基因GhHMGB2表达。

本发明的有益效果：

本发明提供一种与棉花抗黄萎病相关的高迁移率族蛋白编码基因GhHMGB2，棉花在接种病原菌后，其在棉花体内的部分位点发生了磷酸化、乙酰化和泛素化修饰，GhHMGB2在棉花体内表达上调。本发明的GhHMGB2基因在棉花抗黄萎病中具有重要的正调控作用，其可作为棉花抗黄萎病育种的重要候选基因。

附图说明

图1显示病原菌胁迫GhHMGB2在冀棉11号中的表达情况；

图2显示激素处理后GhHMGB2在中植棉2号中的表达情况；

图3显示激素处理后GhHMGB2在冀棉11号中的表达情况；

图4显示基因沉默后的白化现象及发病情况；

图5显示基因沉默后植株木质部的积累情况；

图6显示基因沉默后植株叶片胼胝质的积累情况；

图7显示基因沉默后植株叶片活性氧爆发情况；

图8显示病菌处理后植株中相关防御基因的相对表达量。

具体实施方式

实施例1病原菌和激素处理后棉花中GhHMGB2的表达

在蛭石沙土纸钵中种植冀棉11号，伤根后接种Vd080孢子悬浮液，不同时间段提取根部RNA。

用0.5mM的过氧化氢(H₂O₂)、0.1mM的水杨酸(SA)，0.15mM的茉莉酸甲酯(JA)和1mM的乙烯(ET)喷施到叶面滴水为止，不同时间段提取根部RNA。根据GhHMGB2的基因序列和CDS序列设计其荧光定量的引物为：

GhHMGB2-F:GCCAAGCTCTCCGTGAATAAG，

GhHMGB2-R:GTATTGCTCGCGGAACTCCT。

检测在病原菌和激素处理后，GhHMGB2的表达情况。

如图1所示，在接种病原菌初期，其表达受到抑制，但在抗病的关键时期，其表达量极大增加，表达量是对照的13202.7倍。可见，GhHMGB2在植物抗病中极为敏感，参与植物与病原物的互作过程。

如图2、3所示，在激素处理后，抗病品种的GhHMGB2对H₂O₂和JA敏感，感病品种的GhHMGB2对ET和H₂O₂敏感，表明GhHMGB2的表达受这几种激素的调控。

实施例2利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)研究GhHMGB2的功能

2.1棉花中GhHMGB2的沉默

根据VIGS引物设计原则设计GhHMGB2沉默载体的引物：

HMGB-VIGS-F:GCTCTAGATCCGTTGCTGCTGTTGG，

HMGB-VIGS-R:GGGGTACCATCTTCCTCGTCTCCACT。

以抗病品种中植棉2号的cDNA为模板扩增沉默片段并转化pYL-156载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序验证正确后，提取pYL-156-GhHMGB2质粒，并转化农杆菌GV3101感受态，菌落PCR验证正确后，扩大培养，以pYL-156空载为对照，以pYL-156-PDS为正对照(PDS基因被沉默后，叶片表现出白化现象)，与辅助质粒pYL-192为混合静置后，用无针头注射器注射中植棉2号棉花叶片。注射处理后暗培养24h，置于正常光照下22℃培养。

待正对照出现白化表型时，利用荧光定量PCR检测沉默植株中GhHMGB2的表达量，选取沉默效果较好的植株进行进一步试验。

2.2沉默植株的抗病性研究

选取沉默效果较好的植株，待一片真叶初现时，接种10mL大丽轮枝菌孢子液(浓度为2×10⁷CFU/mL)，置于25℃温室中正常光照生长。接菌后不同时间段取样提取沉默植株RNA用于检测防御相关基因的表达。在接菌3d时，检测棉花茎秆木质部和叶片胼胝质的积累，检测棉花叶片活性氧的爆发。15d时检测叶片细胞坏死情况。20d时，调查植株发病情况

表1棉花防御相关基因的RT-qPCR引物

如图4所示，统计病情后计算得沉默植株的病情指数为56.06±0.99，病株率为100％，而对照的病情指数为21.92±2.68，病株率为83.74±2.56％，沉默植株与对照之间的病情指数和病株率均存在极显著差异。

如图5所示，将棉花幼苗茎秆用间苯三酚染色，浓硫酸孵育后，在正视显微镜下观察到沉默植株的木质部的积累显著低于非沉默植株。

如图6所示，利用苯胺蓝染色棉花叶片，紫外激发光下可见沉默植株的胼胝质的积累量低于对照。

如图7所示，活性氧爆发的研究同样显示在沉默植物的叶片中褐色沉淀更少，说明活性氧爆发更弱。利用苯胺蓝染色棉花叶片，在沉默植株中可以观察到的更多的细胞坏死。

接种病菌后的不同时间段沉默植株中的防御酶基因或防御酶代谢基因，如图8所示，如苯丙氨酸解氨酶(GhPAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(GhC4H1)、过氧化物酶(GhPOD)和多酚氧化酶(GhPPO)在沉默植株中的表达量，在接种病原菌后具有不同程度的降低。棉花中过敏反应的标识基因GhHSR203J和GhHIN1，GhHSR203J在整个检测时期的表达水平均低于对照，表明GhHMGB2的沉默导致了活性氧的减少。GhPR3是乙烯(ET)信号通路的标识基因，在沉默植株中的表达均显著低于对照，表明ET在GhHMGB2抗病中起正调控作用。GhPR1是水杨酸信号通路的标识基因，沉默植株中的表达量高于对照，可能水杨酸在GhHMGB2的抗病调控中起负调控。GhNOA1是一氧化氮通路基因，在沉默植株中的表达量均显著低于对照，表明GhHMGB2与一氧化氮通路相关。

实施例3考察拟南芥中过表达GhHMGB2基因

以中植棉2号cDNA为模板，克隆GhHMGB2的CDS序列，从而构建pCAMBIA2300-GhHMGB2的过表达载体，通过花盘转化技术，使拟南芥过表达DEK蛋白，通过连续3代抗性筛选及分子验证，获得阳性转基因苗。

栽培转基因拟南芥和野生型拟南芥，接种大丽轮枝菌病原菌，待发病后评价病情，结果显示，转基因拟南芥的病情指数为25.23±0.82，病株率为19.36±0.75％；野生型拟南芥的病情指数为58.78±1.18，病株率为22.32±1.91％，转基因拟南芥表现出明显的抗黄萎病性。

本发明的GhHMGB2基因在棉花抗黄萎病中具有重要的正调控作用，可作为棉花抗黄萎病育种的重要候选基因。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 棉花(Malvaceae Gossypium)

<400> 1

atggacggag ccacatataa gattgtgaga gagagaagaa gcacagagga agcacaacaa 60

aagaaagagg attcaaacat gaaaggaggt aaatccaagt cggatgccaa gagcgccaag 120

ctctccgtga ataagaaatc aatcacgaaa gctggaaaga aatcggggaa ggcagctaag 180

gatccaaaca agccaaagag gcctgctagc gccttcttcg ttttcatgga ggagttccgc 240

gagcaataca agaaggagca ccctaaaaac aagtccgttg ctgctgttgg caaagctggt 300

ggagataaat ggaagagcct ttctgaagct gaaaagcgac cttatgttga taaggcagag 360

aaacgaaagg tcgagtatga aaagaacatg aaagcctaca ataagagaca ggctgagggt 420

ccccaagaag atgaggagga atctgagaag tctgtatctg aggtgaatga tgaagaagaa 480

gatgatgatg aaggcagtgg agacgaggaa gatgatgagt ag 522

<210> 2

<211> 173

<212> PRT

<213> 棉花(Malvaceae Gossypium)

<400> 2

Met Asp Gly Ala Thr Tyr Lys Ile Val Arg Glu Arg Arg Ser Thr Glu

1 5 10 15

Glu Ala Gln Gln Lys Lys Glu Asp Ser Asn Met Lys Gly Gly Lys Ser

20 25 30

Lys Ser Asp Ala Lys Ser Ala Lys Leu Ser Val Asn Lys Lys Ser Ile

35 40 45

Thr Lys Ala Gly Lys Lys Ser Gly Lys Ala Ala Lys Asp Pro Asn Lys

50 55 60

Pro Lys Arg Pro Ala Ser Ala Phe Phe Val Phe Met Glu Glu Phe Arg

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Lys Lys Glu His Pro Lys Asn Lys Ser Val Ala Ala Val

85 90 95

Gly Lys Ala Gly Gly Asp Lys Trp Lys Ser Leu Ser Glu Ala Glu Lys

100 105 110

Arg Pro Tyr Val Asp Lys Ala Glu Lys Arg Lys Val Glu Tyr Glu Lys

115 120 125

Asn Met Lys Ala Tyr Asn Lys Arg Gln Ala Glu Gly Pro Gln Glu Asp

130 135 140

Glu Glu Glu Ser Glu Lys Ser Val Ser Glu Val Asn Asp Glu Glu Glu

145 150 155 160

Asp Asp Asp Glu Gly Ser Gly Asp Glu Glu Asp Asp Glu

165 170

Claims

1.棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2的应用，其中，基因GhHMGB2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2在防治棉花黄萎病方面的应用，其中，基因GhHMGB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.棉花抗黄萎病相关基因GhHMGB2在提高棉花对黄萎病抗性方面的应用，其中，基因GhHMGB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述棉花为黄萎病抗病品种棉花。

5.提高植物黄萎病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达基因GhHMGB2的步骤，基因GhHMGB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的提高植物黄萎病抗性的方法，其特征在于，所述方法还包括使用茉莉酸甲酯和/或过氧化氢促进基因GhHMGB2表达的步骤。