CN110583539A

CN110583539A - 一种高效生产尼罗罗非鱼高繁殖率yy转化雌鱼的方法

Info

Publication number: CN110583539A
Application number: CN201911024646.2A
Authority: CN
Inventors: 王德寿; 柳兴永; 李明辉; 陆宝悦; 蒋小龙; 石红娟
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110583539B

Abstract

本发明涉及一种高效生产尼罗罗非鱼高繁殖率YY转化雌鱼的方法，先将XY转化雌鱼与XY的雄鱼或YY超雄鱼交配，其后代在授精后5天开始同时用雌激素和雄激素合成酶抑制剂浸浴至授精后10天幼鱼开口；然后在幼鱼开口后投喂高剂量激素添加饲料进行雌性化处理3个月，用Y染色体特异分子标记筛选出性染色体基因型为YY的转化雌鱼正常饲料饲养到6月龄；接着在6～7月龄用低剂量激素添加饲料处理YY转化雌鱼，正常饲养到性成熟；最后筛选出可育YY转化雌鱼。可育YY转化雌鱼和YY超雄鱼交配建立YY维持系并实现遗传全雄鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，减少激素的使用，在罗非鱼入侵泛滥的地区可以大量投放YY超雄鱼进行生物防治。

Description

一种高效生产尼罗罗非鱼高繁殖率YY转化雌鱼的方法

技术领域

本发明属于罗非鱼养殖技术领域，涉及一种高效生产尼罗罗非鱼高繁殖率YY转化雌鱼的方法。

背景技术

罗非鱼又称非洲鲫鱼，原产于非洲大陆、中东及大西洋沿岸咸淡水水域中，属硬骨鱼纲鲈形目丽鱼科，是热带鱼类，具有繁殖力强、生长快、食性广、饲料要求低、耐低氧、适应性和抗病力强等优点；是联合国粮农组织推荐的重要水产养殖品种之一。近几十年来，随着世界各国相继引入罗非鱼，其已成为世界性的主要养殖鱼类品种。目前，罗非鱼养殖品种有尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、奥利亚罗非鱼等，由于尼罗罗非鱼生长性能良好，成为世界范围内主要的罗非鱼养殖品种。中国是罗非鱼第一大生产国和出口国。近两年来，中国的罗非鱼年养殖产量达180万吨左右。

罗非鱼性周期短，繁殖快，雄性比雌性生长快50％。为了避免养殖中罗非鱼过度繁殖，获得生长快、个体大、规格整齐、产量高的商品鱼，需要进行单雄性罗非鱼生产。目前在生产上获得单雄性罗非鱼的方法主要有三种：

一、性反转方法，即用雄性激素处理鱼苗来获得全雄鱼，该方法简便易行，被广泛的应用于养殖场，但激素对人体免疫系统有危害以及破坏养殖水域的生态环境，不符合无公害健康养殖的要求；

二、种间杂交方法，如尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂，该方法无污染，商品鱼性能好，但需要亲本很纯，获得雄性率一般仅为90-95％，仍有相当数量的雌鱼，还存在一定程度的杂交障碍，繁殖周期长，繁苗量偏少；

三、三系配套法，又称遗传雄性罗非鱼技术(Genetically Male Tilapia,GMT)，由于尼罗罗非鱼为XY的性别决定系统，其YY超雄鱼与XX雌鱼杂交后代雄性率为100％，申请人前期开发了尼罗罗非鱼稳定的分子标记并克隆和分离了其位于LG23上的性别决定基因amhy(Sun et al.,2014；Li et al.,2015)。因此，尼罗罗非鱼是三系配套生产遗传全雄罗非鱼的好品系；其技术路线如下：将性反转和交配组合相结合，用原系(XX♀，XY♂)、转化系(XY♀，YY♀)和雄性纯合系(YY♂)配套来生产遗传全雄罗非鱼。具体方法如下：将性别未分化的幼鱼苗进行雌性化处理，用罗非鱼性别特异分子标记鉴定转化雌鱼(XY♀)；将转化雌鱼(XY♀)与原系雄鱼(XY♂)交配，用尼罗罗非鱼性别特异分子标记筛选鉴定YY超雄鱼；将原系雄鱼(XY♂)或YY超雄鱼与转化雌鱼(XY♀)交配并进行雌性化处理，用罗非鱼性别特异分子标记筛选鉴定YY转化雌鱼；将YY转化雌鱼与YY超雄鱼交配，获得全YY超雄鱼，建立YY维持系；将YY超雄鱼与原系雌鱼(XX♀)交配，生产XY遗传全雄鱼。上述三系制种程序是一种最理想，科学的方法，但目前该程序中YY超雄鱼难于单独使用雌激素诱导成转化雌鱼，并且多数成功诱导的YY转化雌鱼也不能正常繁殖，严重阻碍了GMT的推广应用。

因此，三系配套法的关键在于，如何获得高繁殖率的YY转化雌鱼。有报道用WY和YY两系配套生产全雄超雄鱼的方法(杨永铨等，2012)，但WY是杂交鱼，况且WY是否都是雌鱼、其育性如何、能否维持尼罗罗非鱼的优良性状是一个很大的问题，因此，未见在生产上广泛应用。

申请人前期的专利CN103409420A中提到用雌激素诱导YY转化雌鱼，但仅仅在胚胎发育的早期用雌激素难于诱导YY超雄鱼发生性转化，性转化率很低。此外，这种方法获得的YY转化雌鱼育性很低甚至不育，不能进行规模化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效生产尼罗罗非鱼高繁殖率YY转化雌鱼的方法。可育YY转化雌鱼和YY超雄鱼交配建立YY维持系，YY超雄鱼与XX雌鱼交配生产XY雄鱼，实现遗传全雄鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，减少激素的使用。在罗非鱼入侵泛滥的地区，可以大量投放YY超雄鱼进行生物防治。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、尼罗罗非鱼可育YY转化雌鱼的生产方法，包括步骤：

(1)先将XY转化雌鱼与XY雄鱼或YY超雄鱼交配，其后代在授精后5天(此时间节点为尼罗罗非鱼性别决定的关键时期，如果过了该时期添加激素难于诱导超雄鱼性转化为雌鱼)开始同时用雌激素和雄激素合成酶抑制剂同时浸浴至授精后10天幼鱼开口(单独用雌激素浸浴性转化率很低)；

(2)然后在幼鱼开口后投喂高剂量激素添加饲料(同时添加雌激素和雄激素合成酶抑制剂能显著增加性转化率)进行雌性化处理3个月，筛选出性染色体基因型为YY的转化雌鱼，用正常饲料饲养到6月龄；

(3)接着在6～7月龄用低剂量激素添加饲料处理YY转化雌鱼(该步骤尤为重要，如果此时间节点不用低剂量的激素添加饲料处理，YY转化雌鱼可育率很低，甚至不育)，然后正常饲料饲养到性成熟；

(4)最后筛选出可育YY转化雌鱼。

作为优选的技术方案之一，XY转化雌鱼的生产方法如下：将尼罗罗非鱼XX雌鱼与XY雄鱼的交配后代投喂添加雌激素的饲料进行雌性化处理，采用申请人前期专利CN103409420A中所述尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼。

作为优选的技术方案之一，所述雌激素为雌二醇(E2)，所述雄激素合成酶抑制剂为曲洛司坦(Trilostane，Tr)。

作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1)中，利用溶解有激素的水溶液进行浸浴，开始浸浴的时间为授精后5天，其中E2和Tr的浓度均为50μg/L。

作为进一步优选的技术方案之一，步骤(2)中，所述高剂量激素添加饲料中E2和Tr的含量均为200μg/g饲料。

作为进一步优选的技术方案之一，步骤(3)中，所述低剂量激素添加饲料中E2和Tr的含量均为50μg/g饲料。经过不同浓度的激素处理结果表明经25μg/g处理的YY雌鱼可育率跟未经过激素处理没有显著差异(25％)，50μg/g能显著提高YY雌鱼的可育率(85％)，100μg/g处理的YY雌鱼可育率(86％)与50μg/g相比并没有显著提高。

作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，通过育性实验，即能不能正常产卵授精，筛选出可育YY转化雌鱼。

2、上述生产方法在YY超雄鱼高效生产、建立YY维持系中的应用。

3、利用上述生产方法实现YY超雄鱼高效生产的方法，具体方法是：

(5)先利用YY超雄鱼与上述生产方法获得的可育YY转化雌鱼交配，获得全YY超雄鱼；

(6)然后将YY超雄鱼后代根据上述步骤(1)～(3)进行同样的雌性化处理，获得可育YY转化雌鱼；

(7)重复步骤(5)和(6)，通过YY超雄鱼与可育YY转化雌鱼交配高效生产全YY超雄鱼、建立YY维持系。

4、上述生产方法在遗传全雄鱼苗规模化生产中的应用。

5、利用上述生产方法实现遗传全雄鱼苗规模化生产的方法，具体方法是：

(7)重复步骤(5)和(6)，通过YY超雄鱼与可育YY转化雌鱼交配生产全YY超雄鱼；

(8)将YY超雄鱼与XX雌鱼交配，规模化生产XY遗传全雄商品鱼。

本发明的有益效果在于：

本发明实现YY♀与YY♂交配快速高效生产YY超雄鱼，建立YY维持系。进而通过YY超雄鱼与正常XX雌鱼交配，实现XY遗传全雄鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，减少激素的使用。具体如下：

1、本发明所述技术方法能够显著提高YY转化雌鱼的生产效率；

2、显著提高YY转化雌鱼的育性；

3、YY♀与YY♂交配快速高效生产YY超雄鱼，建立YY维持系；

4、YY超雄鱼与XX雌鱼交配批量生产遗传全雄尼罗罗非鱼鱼苗(雄性率100％)；

5、尼罗罗非鱼全雄鱼生长性能良好，规格均一，显著提高商品鱼养殖效益；能够在水产养殖中广泛推广应用；

6、显著减少罗非鱼苗种场和养殖场的雄激素使用；避免雄激素的残留影响消费者健康和生态环境，符合绿色健康养殖的标准。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为XY鱼在不同的激素含量和处理时间下性逆转率的统计图。

图2为单独添加雌激素(E2)诱导YY超雄鱼性转化率比较。

图3为同时用雌激素(E2)和雄激素合成酶抑制剂(Tr)诱导YY超雄鱼性转化率。

图4为可育YY雌鱼的创制技术路线图。

图5为YY雌鱼产卵量及受精率比较。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明涉及的E2和Tr，均购自Sigma-Aldrich。

实施例：

一种遗传全雄鱼鱼苗规模化生产的方法，包括以下步骤：

A.将尼罗罗非鱼XY转化雌鱼与XY雄鱼或YY超雄鱼的交配后代于授精后5～10天用雌二醇(50μg/L)和雄激素合成酶抑制剂(50μg/L)浸浴，受精后10天开始投喂添加有雌激素和雄激素合成酶抑制剂的饲料(E2 200μg/g+Tr 200μg/g)直到3月龄。采用尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为YY的转化雌鱼；正常饲料饲养到6月龄。从6月龄到7月龄用添加有低剂量雌激素和雄激素合成酶抑制剂的饲料进行投喂(E250μg/g+Tr 50μg/g)，然后正常饲料饲养到性成熟(10月龄)。

参考图1为XY鱼在不同的激素含量和处理时间下性逆转率的统计图，在投喂的雌激素浓度为100μg/g时，处理90天XY鱼性逆转率仅为8％左右；雌激素浓度为150μg/g时，处理90天性逆转率为80％左右；雌激素浓度为200μg/g时，处理20、30、45、60、90天性逆转率分别为31.0％、62.0％、80.0％、94.3％和100％；故后续试验选择200μg/g为最适激素浓度，处理时间为90天。

参考图2，从授精(图2A)后5天开始用雌激素E2(200μg/g饲料)处理XY和YY雄鱼，处理30天(图2B)和45天(图2C)分别有62％和80％的XY雄鱼性转化为雌鱼，而YY雄鱼的性转化率分别为5％和12％；E2处理60天(图2D)有95％的XY雄鱼性转化为雌鱼，而仅有20％的YY超雄鱼性转化为雌鱼；处理90天(图2E)XY雄鱼的性转化率为100％，YY超雄鱼的性转化率为31％左右。

参考图3，单独用雄激素合成酶抑制剂(Tr，200μg/g饲料)不能诱导YY超雄鱼性转换，同时用雌激素(E2，200μg/g饲料)和雄激素合成酶抑制剂(Tr，200μg/g饲料)处理能够显著提高YY超雄鱼的性转化率(89.0％，处理3个月)。

B.通过育性实验(能不能正常产卵授精)筛选出可育YY雌鱼(可育率85％)。

C.将YY超雄鱼与可育YY转化雌鱼交配，获得全YY超雄鱼。

D.将YY超雄鱼后代进行雌性化处理，获得可育YY转化雌鱼，建立YY维持系。

图4为可育YY雌鱼的创制技术路线以及规模化生产遗传全雄商品鱼示意图，其中，A为可育YY转化雌鱼的激素处理及饲养技术路线；B为可育YY雌鱼与YY超雄鱼交配产生全YY超雄鱼后代，建立YY维持系的遗传性别分子标记鉴定图(XX，XY和YY为对照)；C为YY超雄鱼与XX雌鱼交配生产XY遗传全雄鱼的示意图。

图5为XX(XX-WT)雌鱼，XY(XY-E2-F)和YY(YY-E2-F)转化雌鱼产卵量及受精率比较，其中，A为XX雌鱼，XY转化雌鱼和YY转化雌鱼产卵量统计，结果表明三者产卵量没有显著性差异；B为XX雌鱼，XY转化雌鱼和YY转化雌鱼受精率统计，XX雌鱼受精率为83％左右，XY转化雌鱼受精率为80％左右，YY转化雌鱼受精率为78％左右，统计结果表明三者授精率没有显著性差异。说明本发明生产的YY转化雌鱼能够正常繁殖。

E.重复步骤C和D，通过YY超雄鱼与YY转化雌鱼交配生产YY超雄鱼。

F.在采用上述方法保证持续获得YY超雄鱼，建立YY维持系后，将YY超雄鱼与尼罗罗非鱼XX雌鱼交配，可大量生产XY遗传全雄商品鱼。

目前申请人已用上述方法成功获得批量可育YY雌鱼和大规模的YY超雄鱼，有巨大的商业化潜力。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.尼罗罗非鱼高繁殖率YY转化雌鱼的生产方法，其特征在于，包括步骤：

(1)先将XY转化雌鱼与XY的雄鱼或与YY超雄鱼交配，其后代在授精后5天开始同时用雌激素和雄激素合成酶抑制剂浸浴至授精后10天幼鱼开口；

(2)然后在幼鱼开口后投喂高剂量激素添加饲料进行雌性化处理3个月，用Y染色体特异分子标记筛选出性染色体基因型为YY的转化雌鱼进行正常饲料饲养到6月龄；

(3)接着在6～7月龄用低剂量激素添加饲料处理YY转化雌鱼，正常饲料饲养到性成熟；

(4)最后筛选出可育YY转化雌鱼。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，XY转化雌鱼的生产方法如下：将尼罗罗非鱼XX雌鱼与XY雄鱼的交配后代从授精后10天投喂添加雌激素的饲料进行雌性化处理一个月，然后投喂正常饲料饲养到性成熟，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述雌激素为雌二醇，所述雄激素合成酶抑制剂为曲洛司坦。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，通过育性实验，即能不能正常产卵授精，筛选出可育YY转化雌鱼。

5.权利要求1～4中任一项所述生产方法在YY超雄鱼高效生产中的应用。

6.利用权利要求1～4中任一项所述生产方法实现YY超雄鱼高效生产的方法，其特征在于，具体方法是：

(5)先利用YY超雄鱼与权利要求1～4中任一项所述生产方法获得的可育YY转化雌鱼交配，获得全YY超雄鱼；

(6)然后将YY超雄鱼后代根据权利要求1所述的生产方法进行处理，获得可育YY转化雌鱼；

(7)重复步骤(5)和(6)，通过YY超雄鱼与可育YY转化雌鱼交配生产全YY超雄鱼，建立YY维持系。

7.权利要求1～4中任一项所述生产方法在遗传全雄鱼苗规模化生产中的应用。

8.利用权利要求1～4中任一项所述生产方法实现遗传全雄鱼苗规模化生产的方法，具体方法是：

(7)重复步骤(5)和(6)，通过YY超雄鱼与可育YY转化雌鱼交配生产全YY超雄鱼，建立YY维持系；

(8)将全YY超雄鱼与尼罗罗非鱼XX雌鱼交配，规模化生产遗传全雄商品鱼。