CN110582274A - 包含免疫抑制因子控制的多域囊泡、其制备方法和包含多域囊泡的免疫调节组合物 - Google Patents

包含免疫抑制因子控制的多域囊泡、其制备方法和包含多域囊泡的免疫调节组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含免疫抑制因子控制物质的多域囊泡、所述多域囊泡的制备方法和包含所述多域囊泡的免疫调节组合物。根据本发明的一个方面，所述多域囊泡包括：彼此接触并连接的至少两个脂质体；以及围绕所述至少两个脂质体的多域囊泡外壁。所述多域囊泡由油相和水相形成，其中所述油相包含第一免疫调节物质和流体油；所述油相形成所述脂质体的膜，以及所述多域囊泡外壁；所述水相包含第二免疫调节物质；所述水相是所述脂质体的所述膜的内部水相，以及所述脂质体的所述膜的外部水相；所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质；以及所述流体油改进了彼此接触和连接的所述至少两个脂质体的结构稳定性。

Description

包含免疫抑制因子控制的多域囊泡、其制备方法和包含多域 囊泡的免疫调节组合物
技术领域
本发明涉及包含免疫抑制因子控制的多域囊泡，所述多域囊泡的制备方法以及包含所述多域囊泡的免疫调节组合物。
背景技术
当前，正在使用封装各种药物的脂质体物质。然而，在使用这种单一脂质体物质的技术中，低的负载效率和体内不稳定性是主要的缺点。
最近，为了活化免疫细胞，负载了免疫刺激物质的各种脂质体和乳剂物质(例如，来自GSK的ASO1、ASO2和AS15和来自诺华公司的MF59)已被用作预防或治疗各种传染病和癌症的免疫刺激物质。基于单一脂质体的物质是用于预防传染病的疫苗组合物，目前处于临床试验阶段，但是由于抗原和免疫刺激物质的持续时间短，因此存在的缺点是必须定期间隔额外注射这种物质2至3次。
为了克服这些缺点，MIT的Darrell Irvine小组最近开发了一种具有多层脂质体结构的免疫刺激癌症疫苗(Nature Materials,10,243-251,2011)。该癌症疫苗是解决低封装效率和稳定性问题(所述问题是单一脂质体物质的基本缺点)的尝试，通过将抗原和免疫刺激物质负载到具有多层结构的脂质体内，然后在每个脂质层中使用多价金属离子或化学链接剂来创建化学交联结构。。
然而，由于具有多层结构的脂质体的形式非常不均匀，并且用于制备具有特定结构的多层结构的制备方法是任意的，因此在整个制备过程中，存在以下缺点：无法获得具有均匀特性的疫苗组合物，并且由于使用化学交联键，因此存在对人体产生毒性的限制。
此外，加利福尼亚大学的Kim Shin-Il的研究团队[Biochimica Biophysica Acta1983 Mar.9 728(3)339-348]、Mantripragada的研究团队在2002年[Progress of LipidsResearch 41(2002)392-406]、Wafa的研究团队在2007年[International Journal ofPharmaceutics 331(2007)182-185]等已经公开了相关技术中一种称为多囊泡脂质体的药物载体作为类似形式。多囊泡脂质体由选自中性脂质、胆固醇和三油精的物质的混合物组成。
在相关技术的多囊泡脂质体中，微囊泡维持微囊泡簇的原理是，单个脂质体的脂质膜之间的三油精物质固定双膜，从而即使在要接触的脂质膜的曲线的快速变化下也不会遭到破坏和分散。这些多囊泡脂质体目前被开发为载有作为疼痛控制剂的布比卡因的药物，并且可以商品名商购。
但是，这样制备的多囊泡脂质体具有非常低的结构稳定化效率，因此存在在制备过程(例如，离心、温度变化等)中微簇崩塌而导致大小或形状不均匀的问题。另外，已经研究出迄今为止尚未发现已引入免疫刺激或免疫抑制控制药物的多囊泡脂质体形式。同时，与免疫刺激技术一起开发一种能够在免疫功能的调节中调节体内免疫抑制的技术是重要的。特别地，为了解决抗癌免疫疗法的低治疗效率和副作用，迫切需要开发一种能够克服癌症微环境中的免疫抑制现象的技术。
使用体内免疫系统治疗癌症的抗癌免疫疗法方法具有的优点是，与现有的化学疗法或放射疗法方法相比，副作用可以最小化。在这些抗癌免疫疗法技术中，已经积极研究了以下方法：一种细胞治疗剂方法，其在体外活化诸如T细胞(包括CAR-T)、树突状细胞和自然杀伤细胞等治疗性免疫细胞，然后将该治疗性免疫细胞直接注入体内；一种抗癌疫苗方法，其通过向体内注射癌抗原和免疫刺激物质以直接活化存在于体内的免疫细胞来增强抗癌功效；等等。然而，这些细胞治疗剂或抗癌疫苗通常用于与血液癌症相关的疾病，并且具有的缺点是，大多数细胞治疗剂或抗癌疫苗对实体癌的治疗功效非常低。
这些原因之一是由于微环境因素抑制了实体癌周围的免疫功能。实际上，降低免疫细胞功能的细胞(骨髓来源的基质细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))，或导致免疫抑制的细胞因子、代谢产物等在肿瘤微环境中活跃地发挥作用，从而迅速降低了免疫刺激物质和治疗性免疫细胞的活性。因此，迫切需要开发一种新的治疗平台技术，该技术能够控制实体癌微环境中的免疫抑制因子，以便提高针对实体癌的治疗效率。
最近，在世界范围内积极进行了关于开发能够控制肿瘤微环境中的各种免疫抑制因子的药物的研究。然而，这些药物在注射入体内或递送到肿瘤部位以外的组织时容易被各种体内生理环境和酶降解，因此具有引起各种不良副作用的缺点。
为了克服这些缺点，在实际的临床领域中，已经尝试通过反复高剂量重复给药来增强免疫治疗效果，但是各种药物毒性和副作用导致治疗效果降低。
因此，迫切需要开发一种抗癌免疫治疗剂，其能够通过释放一种能够控制免疫抑制环境因子的药物来有效靶向免疫抑制因子并将药物引起的副作用最小化，所述免疫抑制环境因子通过在实体癌微环境中的缓释释放来抑制实体癌周围的免疫治疗剂的治疗功能；以及用于使用所述抗癌免疫治疗剂来改进抗癌疗法的治疗效果的技术。
发明内容
【技术问题】
本发明提供了一种包含免疫抑制因子控制物质的多域囊泡、所述多域囊泡的制备方法以及包含所述多域囊泡的免疫调节组合物。
然而，本申请要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员从以下描述中可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
根据本发明的一个方面，可以提供一种多域囊泡，其包括：彼此接触并连接的至少两个脂质体，以及围绕所述至少两个脂质体的多域囊泡外壁。所述多域囊泡由油相和水相形成，其中：所述油相包含第一免疫调节物质和流体油；所述油相形成脂质体的膜，以及所述多域囊泡外壁；所述水相包含第二免疫调节物质；所述水相是所述脂质体的所述膜的内部水相，以及所述脂质体的所述膜的外部水相；所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质；并且所述流体油改进了彼此接触和连接的所述至少两个脂质体的结构稳定性。
根据本发明的另一方面，可以提供一种包含所述多域囊泡和抗原的免疫调节物质。
根据本发明的又一方面，可以提供一种用于制备多域囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：通过将第一免疫调节物质和流体油溶解在溶剂中来制备油相溶液；通过将包含第二免疫调节物质的第一水溶液相分散在所述油相溶液中来制备油包水(W/O)乳液；以及将所述油包水乳液与第二水溶液混合并蒸发所述溶剂，其中所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质。
【有益效果】
本发明可以提供具有微型胶囊形态的免疫调节性多域囊泡，其中包括免疫抑制因子控制物质作为基本成分的多个脂质体在形成各自的结构域的同时相互连接，并且通过引入的流体油组分连接的多个脂质体的结构稳定性得到改进。
此外，根据本发明的免疫调节组合物克服了用作多种药物组合物的单一脂质体物质的包封效率低和有效持续时间短的缺点，并且具有可以增加免疫调节作用的有效持续时间的优点。
此外，根据本发明的用于制备多域囊泡的方法的优点在于，可以通过引入诸如角鲨烯之类的流体油代替为了保持相关领域中的多脂质体的结构稳定性而引入的三油精来改进在多域囊泡的制备过程中的稳定性和储存稳定性，流体油的引入使得不溶于一般有机溶剂的代表性的难溶性免疫调节物质易于溶解，因此，可以制备包含各种难溶性免疫调节物质的多域囊泡。
另外，根据本发明的多域囊泡可以通过调节多域囊泡的表面电荷来提高具有相反电荷特性的抗原和免疫调节物质的包封效率和有效持续时间，并且各种阴离子或负电荷的免疫调节物质和生物物质，例如DNA和RNA，可以通过包含用于构成多域囊泡的阳离子脂质而被有效地负载到多域囊泡。
此外，由于负载在多域囊泡的外壁上和内部的抗原和/或免疫调节物质被释放，同时从多域囊泡的外壁到内膜缓慢发生崩解，因此具有如下优点：抗原和免疫调节物质的有效持续时间可以增加。
同时，根据本发明的多域囊泡可以通过将具有亲脂性的各种免疫调节物质负载到脂质体的膜和/或多域囊泡的外壁上来增加免疫调节物质的有效持续时间，可以通过在脂质体内部负载具有亲水性的各种免疫调节物质来增加免疫调节物质的有效持续时间，并且可以通过在脂质体内部负载具有亲水性的各种免疫调节物质，同时将亲脂性免疫调节物质负载到脂质体的膜和/或囊泡的外壁上来增加免疫调节物质的有效持续时间。
此外，根据本发明的多域囊泡可以使表面活性剂能够被涂覆在多域囊泡的外部，从而将多域囊稳定地分散在水溶液中。
附图说明
图1是示出本发明的实施方案中的免疫功能调节性多域囊泡(imMDV)的结构的示意图。
图2(a)至(d)是示出在本发明的一实施方案中的包含角鲨烯的多域囊泡的尺寸分布的光学显微镜图像(a)和曲线图(c)，以及示出不包含角鲨烯的多域囊泡的尺寸分布的光学显微镜图像(b)和曲线图(d)(比例尺：20μm)。
图3(a)至(c)是在本发明的一实施方案中的包含角鲨烯的多域囊泡的光学显微镜图像，以及图3(d)至(f)是在本发明的一实施方案中不包含角鲨烯的多域囊泡的光学显微镜图像(比例尺：4μm)。
图4(a)至(d)是在本发明的一实施方案中的多域囊泡的稳定性分析结果：包含角鲨烯的多域囊泡在离心前(a)和离心后(c)的显微镜图像，以及不包含角鲨烯的多域囊泡在离心前(b)和离心后(d)的显微镜图像。
图5是在本发明的一实施方案中的包含基于角鲨烯的MPLA(imMDV(MPLA))的多域囊泡的光学显微镜图像。
图6示出了在本发明的一实施方案中当用imMDV(SQ)处理BMDC时分泌的细胞因子的表达水平(a：TNF-α和b：IL-6)。
图7示出了在本发明的一实施方案中当用imMDV(MPLA)处理BMDC时分泌的细胞因子的表达水平(a：TNF-α，b：IL-6，以及c：IL-12p70)。
图8是示出在本发明的一实施方案中根据在负载有蛋白质抗原(OVA)的多域囊泡中是否包含角鲨烯的卵清蛋白(OVA)的释放行为的图。
图9示出了在本发明的一实施方案中负载有咪喹莫特(酸和碱基结构)作为免疫刺激物质的免疫调节性多域囊泡(a：imMDV(R837-HCl)样品，b：mMDV(R837-碱))样品，以及c：imMDV[R837-HCl:R837-碱(1：1)样品]。
图10示出了在本发明的实施方案中在负载有咪喹莫特的用于调节免疫的多域囊泡(imMDV(R837-HCl))中R837随时间变化的释放行为。
图11示出了在本发明的一实施方案中，当用负载有不同浓度的咪喹莫特的多域囊泡(imMDV(R837-HCl))处理BMDC时分泌的IL-6细胞因子的表达水平。
图12a是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后1周)的图(imMDV(R837-HCl)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图12b是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后1周)的图(imMDV(R837-碱)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图12c是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后1周)的图(imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图13a是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后3周)的图(imMDV(R837-HCl)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图13b是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后3周)的图(imMDV(R837-碱)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图13c是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后3周)的图(imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图14a是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对OVA癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后5周)的图(imMDV(R837-HCl)样品,1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV)。
图14b是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对OVA癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后5周)的图(imMDV(R837-碱)样品,1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV)。
图14c是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对OVA癌抗原的体液免疫作用(IgG，注射后5周)的图(imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品,1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV)。
图15a是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，在第5周对小鼠加强免疫后1周)的图(imMDV(R837-HCl)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图15b是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，在第5周对小鼠加强免疫后1周)的图(imMDV(R837-碱)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图15c是示出了在本发明的一实施方案中，相对于负载有咪喹莫特的多域囊泡，针对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用(IgG，在第5周对小鼠加强免疫后1周)的图(imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品/1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:OVA+imMDV样品)。
图16是在本发明的一实施方式中，在imMDV(R837-HCl)+OVA样品免疫后，针对免疫加强的小鼠和未免疫加强的小鼠体内的卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV(R837-HCl)+OVA)。
图17是在本发明的一实施方式中，在imMDV(R837-碱)+OVA样品免疫后，针对免疫加强的小鼠和未免疫加强的小鼠体内的卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV(R837-碱)+OVA)。
图18是在本发明的一实施方式中，在imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品]+OVA样品免疫后，针对在第5周免疫加强的小鼠和未免疫加强的小鼠体内的卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品]。
图19是在本发明的一实施方案中，如在第5周对imMDV(R837-HCl)+OVA样品免疫并加强免疫后1、2和6周持续显示的，针对卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV(R837-HCl)+OVA样品)。
图20是在本发明的一实施方案中，如在第5周对imMDV(R837-HCl)+OVA样品免疫并加强免疫后1、2和6周持续显示的，针对卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV(R837-碱)+OVA样品)。
图21是在本发明的一实施方案中，如在第5周对imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品]+OVA样品免疫并加强免疫后1、2和6周持续显示的，针对卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫作用(IgG)的图(1:PBS,2:OVA,3:OVA+R837-HCl，以及4:imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品)。
图22是在本发明的一实施方案中，当用油(DMSO(R837)+OVA)形式的佐剂使imMDV(R837-HCl)+OVA样品免疫时，如第1至4周显示的，针对卵清蛋白(OVA)癌症抗原的体液免疫效果(IgG)的一组比较数据(1:OVA,2:imMDV(R837-HCl)+OVA,3:DMSO(R837)+OVA，以及4:DMSO)。
图23是在本发明的一实施方案中在小鼠中两种疫苗[imMDV(R837-HCl)+OVA和DMSO(R837)+OVA]免疫后显示的炎症反应作用的比较。
图24是示出了在本发明的一实施方案中免疫调节物质对血凝素(HA)病毒抗原的体液免疫作用(肌内注射后两周)的图。
图25是示出了在本发明的一实施方案中免疫调节物质对血凝素(HA)病毒抗原的体液免疫作用(肌内注射后四周)的图。
图26是示出了在本发明的一实施方案中免疫调节物质对卵清蛋白(OVA)癌抗原的体液免疫作用的图。
图27是示出了在本发明的一实施方案中免疫调节物质对卵清蛋白(OVA)癌抗原的细胞免疫诱导作用的图。
图28示出了在本发明的一实施方案中的多域囊泡imMDV(SQ-Gem)、imMDV(OA-Gem)和imMDV(Gem)样品的光学显微镜图像。
图29是证实以下的图：在本发明的实施方案中，在包含角鲨烯的多域囊泡中缓慢释放所负载的吉西他滨，而在不包含角鲨烯的多域囊泡大多数所负载的药物在24小时内释放。
图30是证实以下的图：在本发明的一实施方案中，当使用油酸植物油代替诸如角鲨烯等动物油时，所负载的吉西他滨的持续释放行为在24至72小时内呈现高耸形状(plateau shape)，然后在72小时后呈现线性行为。
图31是示出了本发明的实施例4-2中的imMDV(紫杉醇)及其药物释放行为的图。
图32示出了本发明的实施例4-2中的imMDV(阿霉素)。
图33示出了本发明的实施例4-2中的imMDV(甲氨蝶呤)。
图34示出了本发明的实施例4-2中的imMDV(奥沙利铂)。
图35示出了本发明的实施例4-3中的imMDV(MK-2206)。
图36示出了本发明的实施例4-4中的imMDV(PF-04691502)。
图37示出了本发明的实施例4-5中的imMDV(氮杂胞苷)。
图38是示出了本发明的实施例4-5中的imMDV(瑞米司他)及其药物释放行为的图。
图39是示出了本发明的实施例4-5中的imMDV(潘诺司他)及其药物释放行为的图。
图40示出了本发明的实施例4-5中的imMDV(OTX015(iBET))。
图41示出了本发明的实施例4-6中的imMDV(BLZ945)。
图42示出了本发明的实施例4-7中的imMDV(塞来昔布)。
图43示出了本发明的实施例5中的imMDV(GEM/R837)。
图44示出了本发明的实施例5中的imMDV(BLZ945/R837)。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明的示例，以使得本申请所属领域的技术人员可以参考附图容易地实施本申请。然而，本申请可以以各种不同的形式来实现，并且不限于在此描述的实施方案。另外，为了清楚地阐释本申请，在附图中省略了与该阐释无关的部分，并且在整个说明书中将类似的附图标记添加至类似的部分。
在本申请的整个说明书中，当一个部件“连接”到另一部件时，这不仅包括它们“直接彼此连接”的情况，而且包括它们“电连接彼此”而其间还有另一个元件的情况。
在本申请的整个说明书中，当一个构件设置在另一构件“上”时，这不仅包括使所述一个构件与另一构件接触的情况，而且包括在这两个构件之间存在又一构件的情况。
在本申请的整个说明书中，当一个部分“包括”一个构成要素时，除非另外具体说明，否则这并不意味着排除另一构成要素，而是意味着可以进一步包括另一构成要素。在本申请的整个说明书中，程度的术语，例如“约”或“基本上”，在相应的数值中使用，或当以所描述的含义表示固有制造和物质容许误差时，用于表示接近于该数值，并且用于防止不道德的侵权者非法使用所公开的内容，包括为帮助理解本发明所示出的准确或绝对的数值。在本申请的整个说明书中，诸如“(执行或进行)的步骤”或“的步骤”之类的术语并不意味着“用于的步骤”。
在本申请的整个说明书中，包括在马库什类型表达中的术语“其组合”意指选自由马库什类型表达中描述的组成元素组成的组中的至少一种的混合物或组合，并且意在包括选自构成元素的组中的至少一种。
在本申请的整个说明书中，描述“A和/或B”意指“A或B，或A和B”。
在下文中，将参考附图详细描述本发明的实施方案和示例。然而，本申请可以不限于该实施方案和示例以及附图。
根据本发明的一个方面，可以提供一种多域囊泡，其包括：彼此接触并连接的至少两个脂质体，以及围绕所述至少两个脂质体的多域囊泡外壁。所述多域囊泡由油相和水相形成，其中所述油相包含第一免疫调节物质和流体油；所述油相所述油相形成所述脂质体的膜，以及所述多域囊泡外壁；所述水相包含第二免疫调节物质；所述水相是所述脂质体的所述膜的内部水相，以及所述脂质体的所述膜的外部水相；所述第一免疫调节物质是脂溶性免疫刺激物质；所述第二免疫调节物质是水溶性免疫刺激物质以及所述流体油改进了彼此接触和连接的所述至少两个脂质体的结构稳定性。
图1是示出了根据本发明的一实施方案的免疫调节性多域囊泡(imMDV)的结构的截面图。如图1所示，多域囊泡可以包括包含脂溶性免疫刺激物质的多域囊泡的外壁，并且可以具有大小为约1μm至约100μm的胶囊结构，其使至少两个脂质体在围绕至少两个脂质体的多域囊泡的外壁内形成每个域。
与相关技术中的单个脂质体和单个乳剂相比，包含至少两个脂质体的多域囊泡可以具有改进的免疫细胞活化物质的持续时间、免疫细胞活化功效、包封效率或生理稳定性。
在本发明的一实施方案中，如图1所示，脂质体膜的内部是指内部水相，脂质体膜的外部是指外部水相，并且内部水相和外部水相均意指“第一水相”。作为脂质体膜外部的外部水相是指脂质体膜与多域囊泡的外壁之间的空间。此外，可以将多域囊泡分散在溶剂中，在这种情况下，其中分散有多域囊泡的分散相，即，多域囊泡的外部称为“第二水相”。
在本发明的一实施方案中，多域囊泡可以具有在以下范围内的尺寸：约1μm至约100μm、约1μm至约80μm、约1μm至约60μm、约1μm至约40μm、约1μm至约20μm、约1μm至约10μm、约10μm至约100μm、约10μm至约80μm、约10μm至约60μm、约10μm至约40μm、约10μm至约20μm、约20μm至约100μm、约20μm至约80μm、约20μm至约60μm、约20μm至约40μm、约40μm至约100μm、约40μm至约80μm、约40μm至约60μm、约60μm至约100μm、约60μm至约80μm,or约80μm至约100μm。
在本发明的一实施方案中，与单脂质体或单乳剂相比，多域囊泡可以使负载在囊泡中的抗原和/或免疫调节物质能够具有延长的释放时间，因为从构成囊泡外侧的外壁到包含至少两个脂质体的内膜缓慢地发生崩解，因此，可以在长时间内调节体内免疫细胞的功能。
在本发明的一实施方案中，至少两个脂质体可以包括其外壳彼此接触的脂质体。例如，多域囊泡的脂质体可以具有多域囊泡的改进的结构稳定性和缓释效果，因为在外壳之间形成了界面接触，因此，该脂质体与外壳彼此分开的多种脂质体相比不容易破裂。
在本发明的一实施方案中，流体油可以用作由每个脂质体组成的结构域之间的胶，从而改进了多域囊泡的稳定性。例如，通过将流体油引入域囊泡的外壁上并使脂质体的外壁彼此接触，可以使多域囊泡具有改进的稳定性，因此，缓释效果和结构稳定性可以得到增强。
在本发明的一实施方案中，脂溶性免疫刺激物质可以通过流体油容易地负载到多域囊泡中。例如，咪喹莫特(R837)等作为难溶于一般有机溶剂的难溶性物质却容易被流体油溶解，使得难溶性物质可与多域囊泡中的流体油一起被负载到脂质体之间的空间中。
在本发明的一实施方案中，流体油可以用作帮助免疫细胞活化的佐剂，并且可以选自例如动物油、植物油、生育酚、矿物油、蓖麻油及其组合。
在本发明的一实施方案中，动物油可以包括鱼油。
在本发明的一实施方案中，鱼油可以不受限制地使用，只要它是可代谢的油即可，并且可以包括例如鱼肝油、鲨鱼肝油、鲸鱼油等。鲨鱼肝油含有角鲨烯(一种称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯的分子)和不饱和萜烯，并且还可以包括饱和模拟角鲨烷。包括角鲨烯或角鲨烷的鱼油可容易地从商业供应来源获得，或者可以通过本领域已知的方法获得。
在本发明的一实施方案中，动物来源的油可以包括猪油、树脂(脂)油、牛脂等。
在本发明的一实施方案中，植物来源的油可以是来源于坚果、种子、谷物等的油，并且可以包括例如花生油、大豆油、椰子油、橄榄油等。
在本发明的一实施方案中，生育酚可以是含有维生素E的生育酚。尽管存在多种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)，但是通常可以使用α-生育酚，例如，可以使用DL-α-生育酚。
在本发明的一实施方案中，通过将流体油引入多域囊泡中，可以容易地溶解免疫调节物质，并且可以增强多域囊泡的结构稳定性。例如，当将角鲨烯或油酸用作流体油时，亲脂性或难溶性免疫调节物质可以容易地溶解，并且可以通过角鲨烯和油酸本身的免疫活化作用而与免疫调节物质发挥协同作用，并且可以增加多域囊泡的结构稳定性，但是流体油不限于此。
在本发明的一实施方案中，脂溶性和水溶性免疫刺激物质可以是在压力下在癌细胞中表达的免疫调节物质，例如热休克蛋白，或者可以是诱导T细胞活化的物质。
在本发明的一实施方案中，脂溶性和水溶性免疫刺激物质可以包括选自以下的至少一种物质：toll样受体激动剂、皂苷、抗病毒肽、炎性体诱导剂、NOD配体、胞质DNA传感器(CDS)配体、干扰素基因刺激物(STING)配体及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以指能够通过生成作为直接配体或间接配体的内源性或外源性配体来经由TLT信号传导途径引起信号传导反应的组分。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以是天然的toll样受体激动剂或合成的toll样受体激动剂。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以是一种能够经由TLR-1引起信号传导反应的激动剂，并且可以包括选自例如由以下项组成的组的至少一种物质：三酰基脂肽(LP)；酚溶性调节素；结核分枝杆菌脂肽；来自S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH的细菌脂肽；来自伯氏疏螺旋体的细菌脂肽；模拟OspA脂肽的乙酰化氨基末端的三盐酸(Pam3Cys)脂肽；及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-2激动剂，并且可以包括例如Pam3Cys-Lip，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样激动剂可以包括TLR-3激动剂，并且可以包括例如聚(I:C)、聚(ICLC)、聚(IC12U)、安普利近等作为聚(I:C)系列，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样激动剂可以包括TLR-4激动剂，并且可以包括选自例如弗氏志贺氏菌外膜蛋白制剂、AGP、CRX-527、MPLA、PHAD、3D-PHAD、GLA及其组合的至少一种物质，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-5激动剂，并且可以包括例如鞭毛蛋白或其片段，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-7激动剂或TLR-8激动剂，并且可以包括选自例如由以下项组成的组的至少一种物质：咪喹莫特、R837、雷西莫特，或咪唑并喹啉分子，例如R848；VTX-2337；CRX642；与磷脂基团或磷酸脂基团共价键合的咪唑并喹啉分子；及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-9激动剂，并且可以包括例如免疫刺激寡核苷酸，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，免疫刺激寡核苷酸可以包括至少一个CpG基序，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，皂苷可以选自QS21、Quil A、QS7、QS17、β-七叶素、洋地黄皂苷及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，抗病毒肽可以包括KLK，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，炎性体诱导物可以是海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(TDB)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，NOD配体可以是NOD2激动剂合成的穆拉米三肽(M-TriLYS)或N-糖基化的穆拉米二肽(NOD2激动剂)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，CDS配体可以是聚(dA:dT)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，STING配体可以是cGAMP、di-AMP或di-GMP，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，免疫调节物质可以包括一种或两种或更多种toll样受体激动剂的组合，并且可以包括双重TLR2和TLR7激动剂(CL401)或双重TLR2和NOD2激动剂(CL429)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，包括在多域囊泡中的免疫调节物质可以选自例如由以下项组成的组：Pam3Cys-Lip、聚(I:C)、CRX-527、MPLA、鞭毛蛋白、咪喹莫特、雷西莫特、CpG、QS21、M-MurNAc-Ala-D-isoGln-Lys(M-TriLys)、海藻糖-6,6-山嵛酸酯(TDB)、8837、聚(dA:dT)、cGAMP及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，脂溶性免疫刺激物质可以包括选自例如由以下项组成的组的物质：阳离子脂质、MPLA、AGP、CRX-527、PHAD、3D-PHAD、GLA、脂质肽、Pam3Cys、Pam3Cys-Lip、DDA、咪喹莫特(碱形式)、雷西莫特(碱形式)、VTX-2337、CRX642、皂苷(QS21)、TDB、CL401、CL429及其组合。
在本发明的一实施方案中，亲水性免疫刺激物质可以包括选自例如由以下项组成的组的物质：CpG、咪喹莫特(HCl形式)、雷西莫特(HCl形式)、聚(I:C)、STING、鞭毛蛋白、皂苷、KLK肽、NOD激动剂肽、聚(dA:dT)及其组合。例如，即使通过末端基团的化学键合基团，亲水性物质也可以缀合至多域囊泡的外壁，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，通过阳离子脂质，诱导与阴离子细胞膜的静电吸引力，使得可以进一步改进免疫调节物质的细胞内递送效率。
根据本发明的一实施方案，各种阴离子和/或带负电荷的免疫调节物质和生物物质，例如DNA和RNA可以通过包括阳离子脂质而被有效地负载到多域囊泡中以构成多域囊泡。例如，可以将基于DNA或RNA氨基酸的阴离子或带负电荷的生物物质和/或免疫调节物质加载到多域囊泡的外壁或内部脂质体的膜上，这通过静电键表现出阳离子特性，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，阳离子脂质可以包括选自由以下项组成的组的物质：3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇)、二甲基二十八烷基铵(DDA)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EPC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、脂质1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)及其组合，但不限于此。
根据本发明的一实施方案，将表面活性剂涂覆在多域囊泡的外部，使得多域囊泡可以稳定地分散在水溶液中。
将表面活性剂涂覆在多域囊泡的外部，从而使多域囊泡能够分散在水溶液中，例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物；辛醇(例如Triton X-100或叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；作为磷脂(磷脂成分)，磷脂酰胆碱(卵磷脂)磷脂酰乙醇苯胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂；壬基酚乙氧基化物，例如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙二醇单月桂基醚(Brij 30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯，可以单独使用或与至少两种表面活性剂组合使用。例如，这些表面活性剂的混合物(例如吐温80/Span 85混合物)可以用作表面活性剂。也可以使用聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和辛氧酚的组合。另一种有用的组合可以包括月桂醇聚醚9、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛醇。表面活性剂可以按基于整个多域囊泡的总重量的0.001至20wt％的量使用，并且可以按例如0.01至1wt％、0.001至0.1wt％、0.005至0.02wt％；0.1至20wt％、0.1至10wt％、0.1至1wt％，或约0.5wt％的重量使用。
根据本发明的另一方面，提供了一种免疫调节物质，其包括抗原和根据本发明所述的多域囊泡。
在本发明的一实施方案中，抗原可以选自蛋白质、基因、细胞、病毒及其组合，但不限于此。例如，蛋白质可以包括卵清蛋白、重组蛋白质、亚基和分裂的蛋白质抗原，细胞可以包括例如树突状细胞和T细胞，并且病毒可以包括例如流感、肝炎B病毒(HBV)、甲肝病毒(HAV)和人乳头瘤病毒(HPV)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，抗原可以选自减毒的活的完整的人体微生物、惰性的微生物、破裂的微生物、病原体的蛋白质、重组蛋白质、糖蛋白质、肽、多糖、脂多糖、脂肽、多核苷酸、细胞、病毒及其组合，但不限于此。例如，抗原可以包括流感来源的抗原或癌细胞来源的抗原，但不限于此。例如，用于皮内给药的免疫调节物质可以包括至少一种抗原以诱导多种体内免疫反应，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，癌细胞可以使用癌细胞系获得，或者可以从体内存在的癌细胞组织(肿瘤组织)中分离得到。此外，可以通过将抗癌药物或放射线施加到实际的癌组织上以诱导产生与细胞内应激有关的蛋白质，然后溶解癌细胞来产生癌症，但是该方法不限于此。
在本发明的一实施方案中，癌细胞可以包括肺、结肠、中枢神经系统、皮肤、卵巢、肾脏、胸、胃或大肠的癌细胞，但不限于此。
根据本发明的又一方面，提供一种用于制备多域囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：通过将第一免疫调节物质和流体油溶解在溶剂中来制备油相溶液；通过将包含第二免疫调节物质的第一水相分散在所述油相溶液中来制备油包水(W/O)乳液；以及将所述油包水乳液与第二水溶液混合并蒸发所述溶剂，其中所述第一免疫调节物质是脂溶性免疫刺激物质，以及所述第二免疫调节物质是水溶性免疫刺激物质。
在本发明的一实施方案中，与单脂质体或单乳剂相比，多域囊泡可以使负载在囊泡中的抗原和/或免疫调节物质能够具有延长的释放时间，因为从构成囊泡外侧的外壁到包含至少两个脂质体的内膜缓慢地发生崩解，因此，可以在长时间内调节体内免疫细胞的功能。
在本发明的一实施方案中，至少两个脂质体可以包括其外壳彼此接触的脂质体。例如，多域囊泡的脂质体可以具有多域囊泡的改进的结构稳定性和缓释效果，因为在外壳之间形成了界面接触，因此，该脂质体与外壳彼此分开的多种脂质体相比不容易破裂。
在本发明的一实施方案中，流体油可以用作由每个脂质体组成的结构域之间的胶，从而其特征在于改进了多域囊泡的稳定性。例如，通过将流体油引入域囊泡的外壁上并使脂质体的外壁彼此接触，可以使多域囊泡具有改进的稳定性，因此，缓释效果和结构稳定性可以得到增强。
在本发明的一实施方案中，脂溶性免疫刺激物质可以通过流体油容易地负载到多域囊泡中。例如，咪喹莫特(R837)等作为难溶于一般有机溶剂的难溶性物质却容易被流体油溶解，使得难溶性物质可与多域囊泡中的流体油一起被负载到脂质体之间的空间中。
在本发明的一实施方案中，流体油可以用作帮助免疫细胞活化的佐剂，并且可以选自例如动物油、植物油、生育酚、矿物油、蓖麻油及其组合。
在本发明的一实施方案中，动物油可以包括鱼油。
在本发明的一实施方案中，鱼油可以不受限制地使用，只要它是可代谢的油即可，并且可以包括例如鱼肝油、鲨鱼肝油、鲸鱼油等。鲨鱼肝油含有角鲨烯(一种称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-四二十碳六烯的分子)和不饱和萜烯，并且还可以包括饱和模拟角鲨烷。包括角鲨烯或角鲨烷的鱼油可容易地从商业供应来源获得，或者可以通过本领域已知的方法获得。
在本发明的一实施方案中，动物来源的油可以包括猪油、树脂(脂)油、牛脂等。
在本发明的一实施方案中，植物来源的油可以是来源于坚果、种子、谷物等的油，并且可以包括例如花生油、大豆油、椰子油、橄榄油等。
在本发明的一实施方案中，生育酚可以是含有维生素E的生育酚。尽管存在多种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)，但是通常可以使用α-生育酚，例如，可以使用DL-α-生育酚。
在本发明的一实施方案中，通过将流体油引入多域囊泡中，可以容易地溶解免疫调节物质，并且可以增强多域囊泡的结构稳定性。例如，当将角鲨烯或油酸用作流体油时，亲脂性或难溶性免疫调节物质可以容易地溶解，并且可以通过角鲨烯和油酸本身的免疫活化作用而与免疫调节物质发挥协同作用，并且可以增加多域囊泡的结构稳定性，但是流体油不限于此。
在本发明的一实施方案中，脂溶性和水溶性免疫刺激物质可以是在压力下在癌细胞中表达的免疫调节物质，例如热休克蛋白，或者可以是诱导T细胞活化的物质。
在本发明的一实施方案中，脂溶性和水溶性免疫刺激物质可以包括选自以下的至少一种物质：toll样受体激动剂、皂苷、抗病毒肽、炎性体诱导剂、NOD配体、胞质DNA传感器(CDS)配体、干扰素基因刺激物(STING)配体及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以指能够通过生成作为直接配体或间接配体的内源性或外源性配体来经由TLT信号传导途径引起信号传导反应的组分。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以是天然的toll样受体激动剂或合成的toll样受体激动剂。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以是一种能够经由TLR-1引起信号传导反应的激动剂，并且可以包括选自例如由以下项组成的组的至少一种物质：三酰基脂肽(LP)；酚溶性调节素；结核分枝杆菌脂肽；来自S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH的细菌脂肽；来自伯氏疏螺旋体的细菌脂肽；模拟OspA脂肽的乙酰化氨基末端的三盐酸(Pam3Cys)脂肽；及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-2激动剂，并且可以包括例如Pam3Cys-Lip，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样激动剂可以包括TLR-3激动剂，并且可以包括例如聚(I:C)、聚(ICLC)、聚(IC12U)、安普利近等作为聚(I:C)系列，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样激动剂可以包括TLR-4激动剂，并且可以包括选自例如弗氏志贺氏菌外膜蛋白制剂、AGP、CRX-527、MPLA、PHAD、3D-PHAD、GLA及其组合的至少一种物质，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-5激动剂，并且可以包括例如鞭毛蛋白或其片段，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-7激动剂或TLR-8激动剂，并且可以包括选自例如由以下项组成的组的至少一种物质：咪喹莫特、R837、雷西莫特，或咪唑并喹啉分子，例如R848；VTX-2337；CRX642；与磷脂基团或磷酸脂基团共价键合的咪唑并喹啉分子；及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，toll样受体激动剂可以包括TLR-9激动剂，并且可以包括例如免疫刺激寡核苷酸，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，免疫刺激寡核苷酸可以包括至少一个CpG基序，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，皂苷可以选自QS21、Quil A、QS7、QS17、β-七叶素、洋地黄皂苷及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，抗病毒肽可以包括KLK，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，炎性体诱导物可以是海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(TDB)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，NOD配体可以是NOD2激动剂合成的穆拉米三肽(M-TriLYS)或N-糖基化的穆拉米二肽(NOD2激动剂)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，CDS配体可以是聚(dA:dT)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，STING配体可以是cGAMP、di-AMP或di-GMP，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，免疫调节物质可以包括一种或两种或更多种toll样受体激动剂的组合，并且可以包括双重TLR2和TLR7激动剂(CL401)或双重TLR2和NOD2激动剂(CL429)，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，包括在多域囊泡中的免疫调节物质可以选自例如由以下项组成的组：Pam3Cys-Lip、聚(I:C)、CRX-527、MPLA、鞭毛蛋白、咪喹莫特、雷西莫特、CpG、QS21、M-MurNAc-Ala-D-isoGln-Lys(M-TriLys)、海藻糖-6,6-山嵛酸酯(TDB)、8837、聚(dA:dT)、cGAMP及其组合，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，脂溶性免疫刺激物质可以包括选自例如由以下项组成的组的物质：阳离子脂质、MPLA、AGP、CRX-527、PHAD、3D-PHAD、GLA、脂质肽、Pam3Cys、Pam3Cys-Lip、DDA、咪喹莫特(碱形式)、雷西莫特(碱形式)、VTX-2337、CRX642、皂苷(QS21)、TDB、CL401、CL429及其组合。
在本发明的一实施方案中，亲水性免疫调节物质可以包括选自例如由以下项组成的组的物质：CpG、咪喹莫特(HCl形式)、雷西莫特(HCl形式)、聚(I:C)、STING、鞭毛蛋白、皂苷、KLK肽、NOD激动剂肽、聚(dA:dT)及其组合。例如，即使通过末端基团的化学键合基团，亲水性物质也可以缀合至多域囊泡的外壁，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，通过阳离子脂质诱导与阴离子细胞膜的静电吸引力，使得可以进一步改进免疫调节物质的细胞内递送效率。
根据本发明的一实施方案，通过包括阳离子脂质，各种阴离子或带负电荷的免疫调节物质和生物物质，例如DNA和RNA可以被有效地负载到多域囊泡中以构成多域囊泡。例如，可以将基于DNA或RNA氨基酸的阴离子或带负电荷的生物物质和/或免疫调节物质加载到多域囊泡的外壁或内部脂质体的膜上，这通过静电键表现出阳离子特性，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，阳离子脂质可以包括选自由以下项组成的组的物质：3β-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇)、二甲基二十八烷基铵(DDA)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EPC)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、脂质1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)及其组合，但不限于此。
根据本发明的一实施方案，将表面活性剂涂覆在多域囊泡的外部，使得多域囊泡可以稳定地分散在水溶液中。
将表面活性剂涂覆在多域囊泡的外部，从而使多域囊泡能够分散在水溶液中，例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物；辛醇(例如Triton X-100或叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；作为磷脂(磷脂成分)，磷脂酰胆碱(卵磷脂)磷脂酰乙醇苯胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂；壬基酚乙氧基化物，例如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙二醇单月桂基醚(Brij 30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯，可以单独使用或与至少两种表面活性剂组合使用。
例如，这些表面活性剂的混合物(例如吐温80/Span 85混合物)可以用作表面活性剂。也可以使用聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和辛氧酚的组合。另一种有用的组合可以包括月桂醇聚醚9、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛醇。表面活性剂可以按基于整个多域囊泡的总重量的0.001至20wt％的量使用，并且可以按例如0.01至1wt％、0.001至0.1wt％、0.005至0.02wt％；0.1至20wt％、0.1至10wt％、0.1至1wt％，或约0.5wt％的重量使用。
根据本发明的另一方面，可以提供多域囊泡，其包括：彼此接触并连接的至少两个脂质体，以及围绕所述至少两个脂质体的多域囊泡外壁。所述多域囊泡由油相和水相形成，其中：所述油相包含第一免疫调节物质和流体油；所述油相形成脂质体的膜，以及所述多域囊泡外壁；所述水相包含第二免疫调节物质；所述水相是所述脂质体的所述膜的内部水相，以及所述脂质体的所述膜的外部水相；所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质；并且所述流体油改进了彼此接触和连接的所述至少两个脂质体的结构稳定性。
第一免疫调节物质和第二免疫调节物质可以进一步包括上述免疫刺激物质。即，第一免疫调节物质和第二免疫调节物质可以包括免疫抑制因子控制物质以及免疫刺激物质。
此外，根据本发明的又一方面，可以提供一种包含所述多域囊泡和抗原的免疫调节物质。
此外，可以提供一种用于制备多域囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：通过将第一免疫调节物质和流体油溶解在溶剂中来制备油相溶液；通过将包含第二免疫调节物质的第一水相分散在所述油相溶液中来制备油包水(W/O)乳液；以及将所述油包水乳液与第二水溶液混合并蒸发所述溶剂，其中所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质。
在本发明中，基于多域囊泡的实体癌微环境控制组合物是一种新形式的用于调节癌症微环境的免疫调节组合物，并且其特征在于包括能够控制除了上述提到的活化体内免疫细胞的物质外在实体癌微环境中还出现的免疫抑制细胞和免疫抑制物质的功能的药物(免疫抑制因子控制物质)。
根据本发明的一实施方案，可以制备具有微型胶囊形态的免疫调节性多域囊泡，其中包含能够控制免疫抑制因子(即免疫抑制细胞和免疫抑制物质)功能的免疫抑制因子控制物质作为基本成分的多个脂质体在形成各自的结构域的同时彼此连接，并且通过引入的流体油成分连接的多个脂质体的结构稳定性得到改进。另外，根据本发明的一实施方案，可以制备基于新的多域囊泡的抗癌治疗剂组合物，其可以克服用作各种药物组合物的单个脂质体物质的包封效率低和有效持续时间短的缺点，并且增加了免疫功能调节作用的有效持续时间。
根据本发明的一实施方案的多域囊泡的优点在于，由于负载在囊泡的外壁和内部的能够控制免疫抑制细胞和免疫抑制物质的功能的免疫抑制因子控制物质被释放，同时从囊泡的外壁到内膜缓慢发生崩解，可以增加免疫机制调节物质的有效持续时间。
另外，根据本发明的一实施方案的多域囊泡可以通过将能够控制各种免疫抑制细胞和具有亲脂性的免疫抑制物质的功能的免疫因子控制物质负载到脂质体的膜和/或多域囊泡的外壁上来增加免疫刺激物质的有效持续时间。
根据本发明的一实施方案的多域囊泡可以通过在脂质体中负载能够控制各种免疫抑制细胞和具有亲脂性的免疫抑制物质的功能的免疫因子控制物质来增加免疫抑制因子控制物质的有效持续时间。
根据本发明一实施方案的多域囊泡可以通过在脂质体内部负载具有亲水性的各种免疫抑制因子控制物质，同时将亲脂性免疫抑制因子控制物质负载到脂质体的膜和/或囊泡的外壁上，增加能够控制免疫抑制细胞和免疫抑制物质功能的免疫抑制因子控制物质的有效持续时间。
在本发明的一示例中，能够控制骨髓来源的抑制细胞(MDSC)功能的药物(即免疫抑制因子控制物质)的示例包括他达拉非、西地那非、L-AME、硝基阿司匹林、塞来昔布、NOHA、甲基巴多索隆、D,L-1-甲基色氨酸、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、17-DMAG、肽-Fc融合蛋白、ATRA、维生素A、维生素D3、维生素E、GR1抗体、唑来膦酸、舒尼替尼、阿昔替尼、Decetaxel、Sorafenib、葫芦素B、JSI-124、抗IL-17抗体、抗聚糖抗体、抗VEGF抗体、贝伐单抗、安妥环素、他喹莫德、伊马替尼和环磷酰胺，但不限于此。
在本发明的一示例中，PI3K抑制剂包括PX-866、Wortmannin、PI-103、Pictilisib、GDC-0980、PF-04691502、BEZ235、XL765、XL147、BAY80-6946、GSK-2126458、Buparlisib、BYL719、AZD8186、GSK-2636771、CH5132799、INK-1117等。
在本发明的一示例中，PI3Kδ抑制剂物质包括AMG-319、依德利西布、TRG-1202、INCB050465、IPI-145、杜维利西布、阿卡利西布、TG-1202、RV1729、RP-6530、GDC-0032等。
在本发明的一示例中，PI3Kγ抑制剂物质包括IPI-549、IPI-145等。
在本发明的一示例中，能够控制调节性T细胞(Treg)功能的药物(即免疫抑制因子控制物质)的示例包括抗CD25抗体(达克珠单抗)、巴西单抗、LMB-2、地尼白介素(Denileukin diftitox)(Ontak)、二价IL-2融合毒素、抗TGF-β抗体、夫苏木单抗(fresolimumab)、TGF-βR激酶抑制剂、LY2157299、可溶性TGF-βR I/II、伊匹木单抗、曲美母单抗(Tremelimumab)、派姆单抗、纳武单抗(Nivolumab)、TIM-3抗体、LAG-3抗体、抗CD39抗体、抗73抗体、A(2A)R抑制剂、塞来昔布、吲哚美辛、双氯芬酸、布洛芬、TNFR2抗体、抗GITR抗体、贝伐单抗、抗OX40(CD134)抗体、可溶性GITR配体、趋化因子受体阻滞剂(CCR4、5、6、10)、环磷酰胺、舒尼替尼、氟达拉滨、PI3Kp110(δ)抑制剂、CliniMAC、Mogamulizumab、芬戈莫德、miRNA调节剂(miR-155、miR-146a、miR-181a)、5-氮杂-2-脱氧胞苷、紫杉醇、伊马替尼、索拉非尼、环孢菌素A、他克莫司、达沙替尼(Dasatinib)、聚-G-寡核苷酸、TLR8配体、吉西他滨和5-氟尿嘧啶，但不限于此。
在本发明的一示例中，能够调节肿瘤相关巨噬细胞(TAM)功能的药物(即免疫抑制因子控制物质)是能够抑制巨噬细胞募集的药物，并且包括CCL2/CCR2抑制剂(Yondeli，RS102895)、M-CSF或M-CSFR抑制剂(抗M-CSF抗体、JNJ-28312141、GW2580)、化学引诱剂(CCL5、CXCL-12、VEGF)及其受体抑制剂、HIF抑制剂等，但不限于此。
此外，能够抑制TAM存活的药物(即免疫抑制因子控制物质)包括能够诱导双膦酸盐、氯膦酸盐、达沙替尼、抗FRβ抗体、弗氏志贺氏菌、Legumain和CD1d表达的药物，但不限于此。
此外，能够改进M1巨噬细胞特性的药物(即免疫抑制因子控制物质)包括作为NF-kB激动剂的TLR激动剂、抗CD40抗体、噻唑烷二酮、他克喹莫德、抗IL-10R抗体、抗IL-10抗体、寡核苷酸(抗IL-10R抗IL-10)、作为STAT1激动剂的干扰素、能够诱导M1途径的SHIP、GM-CSF、IL-12、胸腺素α1d等，但不限于此。
此外，能够抑制帮助基于M2巨噬细胞的癌细胞生长的机制的药物(即免疫抑制因子控制物质)包括舒尼替尼，索拉非尼，WP1066，椰油酸，齐墩果酸，它们是STAT3抑制剂，STAT6抑制剂，M2途径(c-Myc、PPAR-α/γ、PI3K、KLF4、HIF、Ets2、DcR3和mTOR)抑制剂，HRG，CuNG，MDXAA，Silibinin和PPZ，但不限于此。
此外，能够在肿瘤微环境中控制巨噬细胞功能的靶miRNA包括miR-155、miR-511-3p和miR-26a。
此外，能够通过靶向肿瘤微环境中的巨噬细胞来增强抗癌功效的靶药物包括紫杉醇、多西他赛、5-氟尿嘧啶、阿仑膦酸酯、阿霉素、辛伐他汀、羟尿姜黄素、两性霉素B、环丙沙星、利福布汀、利福平、依法韦伦、顺铂、茶碱、假单胞菌外毒素A、唑来膦酸、曲贝汀、西妥昔单抗(抗IL-6抗体)、达沙替尼、CpG-ODN、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、GM-CSF、IL-12、胸腺素α-1、舒尼替尼、5,6-二甲基黄嘌呤酮4-乙酸、水飞蓟素、CCL2-CCR2抑制剂(PF-04136309、曲贝替定、Carlumab)、CSF1-CSF1R信号传导阻滞剂(BLZ945、PLX3397、艾马妥珠单抗(RG7155)、AMG-820、IMC-CS4、GW3580和PLX6134)和toll样受体7的配体(咪喹莫特、852A)、NF-kB抑制剂(N-乙酰基-1-半胱氨酸、维生素C、硼替佐米、阿司匹林、水杨酸酯、吲哚甲酰胺衍生物、喹唑啉类似物、沙利度胺、前列腺素代谢物)、HIF-1抑制剂(2ME2、17-AAG、喜树碱、托泊替康、灰侧耳菌素、1-甲基丙基、2-咪唑基二硫化物和YC-1)、CXCR4激动剂(AMD3100、AMD1498)、ALX40-4C、T22、T140、CGP64222和KRH-1636，但不限于此。
本发明的示例可以提供基于多域囊泡的组合物，所述多域囊泡包含免疫抑制环境因子抑制剂(转化生长因子β(TGF-β)抑制剂、硝基阿司匹林、环加氧酶-2(COX2)抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂和抗白介素10(IL-10))药物。
在本发明的一示例中，TGF-β抑制剂包括SB-505124、LY-364974等，但不限于此。
在本发明的一示例中，硝基阿司匹林包括NCX 4040等，但不限于此。
在本发明的一示例中，COX-2抑制剂包括塞来昔布等，但不限于此。
在本发明的一示例中，IDO抑制剂包括吲哚莫德、NLG919等，但不限于此。
在本发明的一示例中，PDE-5抑制剂包括他达拉非(Cialis)等，但不限于此。
在本发明的一实施方案中，多域囊泡包含的实体癌微环境免疫抑制因子控制物质可以由至少两种上述药物的组合组成。
在本发明的一实施方案中，实体癌微环境免疫抑制因子控制物质可以是包括能够改进治疗功效的多域囊泡的免疫调节物质，其中天然杀伤细胞和T细胞具有发现并直接杀死存在于体内的癌细胞并有效地在体内生存的治疗能力。
通过在实体癌微环境中直接结合的T细胞活化方法，本发明的一示例可以提供一种基于多域囊泡的组合物，所述多域囊泡包括用以来抑制免疫检查点(PD-1、PDL-1CTLA-4、LAG-3、TIM-3和CEACAM1)的抗体。
在本发明的一示例中，抗CTLA-4抗体包括依匹莫单抗等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗PD1-抗体包括纳武单抗等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗PDL1抗体包括阿妥珠单抗等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗LAG-3抗体包括BMS-986016等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗TIM-3抗体包括TSR-022等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗CEACAM1抗体包括CM-24等，但不限于此。
通过在实体癌微环境中直接结合的T细胞活化方法，本发明的一示例提供一种基于包含共活化因子(OX40、CD137、CD27和CD40)等的多域囊泡的组合物。
在本发明的一示例中，抗OX40包括RG7888等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗CD137包括Urelumab等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗CD27包括Varlilumab等，但不限于此。
在本发明的一示例中，抗CD40包括BMS-986090等，但不限于此。
通过在实体癌微环境中直接结合的T细胞活化方法，本发明的一示例提供了一种基于多域囊泡的组合物，所述多域囊泡包含能够抑制免疫抑制诱导因子(Treg、MDSC、TAM、IDO和PD-L1)的药物。
本发明的一示例可以提供基于多域囊泡的组合物，所述多域囊泡包括通过用化学疗法诱导免疫原性细胞死亡来增加免疫细胞的功效的抗癌剂。
本发明的一示例提供了一种基于多域囊泡的组合物，所述多域囊泡包含能够通过表观遗传机制杀死癌细胞或控制肿瘤微环境的药物。
在本发明中，作为表观遗传机制的示例，DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)物质包括选自5-氮杂胞苷、5-氮杂-2-脱氧胞苷、地西他滨、SGI-110、泽布拉林、CP-4200、克拉屈滨、氟达拉滨、氯法拉滨、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因、肼屈嗪、双硫仑、RG108、纳那霉素A、染料木素、雌马酚(Equol)、姜黄素、EGCG、白藜芦醇、小白菊内酯(Parthenolide)等的一种，但不限于此。
在本发明中，作为表观遗传学机制的示例，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)物质包括选自伏立诺他、阿贝司他汀、Suberoylanilide、异羟肟酸、贝利司他、帕比司他(Panobinostat)、罗米地辛、丙戊酸、恩替诺特(Entinostat)、Givinostat、Resminostat、Quisinostat、Pracinostat、达诺司他、Pyroxamide、CHR-3996、CBHA、曲古抑素A、奥沙坦汀、MC1568、Tubacin、PCI-30451、Tacedinaline、Mocetinostat、西达本胺(Chidamide)、BML-210、M344、丁酸、丁酸钠、Trapoxin A、Apicidin、烟酰胺、Splitomicin、EX-527、二氢香豆素、Tenovin-D3、AGK2、AEM1、AEM2、Cambinol、Sirtinol、Salrmide、Tenovin-6、TMP-269、Psammaplin A、Nexturastat A、RGFP966等的一种，但不限于此。
在下文中，将通过本发明的实施例更详细地描述本发明，但是列举以下实施例以帮助理解本发明，并且本发明的内容不限于以下实施例。
实施例1.包括免疫调节物质的多域囊泡的制备和表征
在本发明的实施例中，如下制备了多域囊泡。
1-1.基于角鲨烯的多域囊泡(imMDV(SQ))的制备和表征
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，将形成的双重乳液分散在二氯甲烷溶液中。使用真空蒸发器除去二氯甲烷，并通过将温度升至37℃除去残余的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。另外，除了不包含角鲨烯以外，以与该实施例相同的方式制备对照物。
使用光学显微镜和动态光散射(DLS，大冢电子有限公司)观察如上所述的多域囊泡的结构，结果，与不包括角鲨烯的对照物相比，包括角鲨烯的多域囊泡具有均匀的尺寸，甚至在与分散相的界面处也显示出清晰的边界[图2(a)和2(b)]。相反，可以看出，在不包括角鲨烯的对照物中，维持了不规则的尺寸和形状[图2(c)和2(d)]。
另外，图3(a)至(c)是包括角鲨烯的多域囊泡的光学显微镜图像，而图3(d)至(f)是不包括角鲨烯的多域囊泡的光学显微镜图像。如图3所示，可以看出，通过将罗丹明荧光染料溶于油相溶液中，可以清楚地观察到多域囊泡的结构，并且包括角鲨烯的多域囊泡显示出清晰的边界点并且分散在水相中。
当进行去除杂质的过程以分析制备后的稳定性或进行离心(约2,500rpm)以根据尺寸对多域囊泡进行分类时，可以确认包括角鲨烯的多域囊泡的结构[图4(a)和4(c)]形成稳定的结构，同时在离心前后形状改变最小，但是不包括角鲨烯的对照物中的大多数结构被破坏[图4(b)和4(d)]。
1-2.包括基于角鲨烯的MPLA的多域囊泡(imMDV-1:imMDV(MPLA))的制备和表征
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、单磷酰脂质A[MPLA，10mg，Avanti PolarLipids，美国]、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，将形成的双重乳液分散在二氯甲烷溶液中。使用真空蒸发器除去二氯甲烷，并通过将温度升至37℃除去残余的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。图5是包括基于角鲨烯的MPLA的多域囊泡(imMDV-1:imMDV(MPLA))的光学图像。
评价制备的多域囊泡的免疫细胞活化作用
使用ELISA实验方法根据促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-12)的分泌量分析了实施例1-1和1-2中制备的imMDV(SQ)和imMDV(MPLA)样品对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和骨髓来源的巨噬细胞(BMM)的活化的影响。
在图6中，确认了在处理imMDV(SQ)时，TNF-α和IL-6的分泌与处理浓度成比例地增加，并且进一步在图7中，可以确认即使在处理imMDV(MPLA)时，TNF-α、L-6和IL-12的分泌也与处理的多域囊泡的浓度成比例地增加。
包括基于角鲨烯的抗原(卵清蛋白)的多域囊泡(imMDV)的制备和释放行为的表征
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在包括卵清蛋白(5mg，Sigma-Aldrich，美国)的1mL的内部水相(5％蔗糖)中。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，将形成的双重乳液分散在二氯甲烷溶液中。使用真空蒸发器除去二氯甲烷，并通过将温度升至37℃除去残余的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。另外，除了不包括角鲨烯以外，以与该实施例相同的方式制备对照物。
由于确认了包括卵清蛋白抗原和角鲨烯(imMDV(SQ-OVA))的多域囊泡和仅包含卵清蛋白抗原(imMDV(OVA))的多域囊泡的释放行为，可以确认由于卵清蛋白抗原的缓释行为，卵清蛋白抗原从包括角鲨烯的多域囊泡中缓慢释放[图8]。
1-3.包括基于角鲨烯的DDA的多域囊泡(imMDV-2)的制备
将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、DDA(10mg，Avanti Polar Lipids，美国)、角鲨烯(12mg)和三油酸甘油酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。之后，在用离心机沉降油相溶液之后除去上清液，获得脂质体。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-4.包括基于角鲨烯的MPLA/TDB的多域囊泡(imMDV-3)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、MPLA(10mg)、角鲨烯(12mg)、TDB(10mg，AvantiPolar Lipids，美国)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-5.包括基于角鲨烯的MPLA/DDA的多域囊泡(imMDV-4)的制备
将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、MPLA(10mg)、DDA(10mg)、角鲨烯(12mg)和三油酸甘油酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-6.包括基于角鲨烯的MPLA/QS21的多域囊泡(imMDV-5)的制备
通过DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、MPLA(10mg)、QS21(10mg，Desert King，美国)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-7.包括基于角鲨烯的CpG的多域囊泡(imMDV-6)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖，1mg CpG，Bioneer，韩国)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-8.包括基于角鲨烯的聚(I:C)的多域囊泡(imMDV-7)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相[5％蔗糖、1mg聚(I:C)(Sigma-Aldrich，美国)]中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-9.包括基于角鲨烯的雷西莫特的多域囊泡(imMDV-8)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖，5mg雷西莫特(Sigma-Aldrich，美国))中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-10.包括基于角鲨烯的咪喹莫特的多域囊泡(imMDV-9)的制备和免疫应答诱导 作用的确认
通过将DOPC(10mg)，胆固醇(8mg)，角鲨烯(12mg)，油酸(2mg，Sigma-Aldrich，美国)，咪喹莫特(碱形式，Sigma-Aldrich，美国)(5mg)和三油酸甘油酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。通过如下所述的方法，由碱形式的咪喹莫特制备要溶解在水溶液中的HCl形式的咪喹莫特。将400g咪喹莫特溶解于2000ml蒸馏水和900ml正丁醇(或1-丁醇)的混合溶液中。在搅拌的同时，同时向其中进一步添加150ml的37％HCl溶液。在60至65℃的范围内搅拌溶液直至咪喹莫特完全溶解后，将溶液冷却至20至25℃，然后保持约30分钟。当剩余的溶液在室温下在干燥器中干燥时，可获得HCl咪喹莫特。在imMDV的制备过程中将如此制备的HCl-咪喹莫特溶解在内部水相中之后，通过将所得溶液进行相同的过程来制备imMDV。图9示出了多域囊泡的光学显微镜图像，在所述多域囊泡中负载了HCl形式的咪喹莫特，负载了碱形式的咪喹莫特，以及同时负载了这两种形式的咪喹莫特。在获得的多域囊泡中，使用侵袭实验(transwell)于37℃分析咪喹莫特在(imMDV(R837-HCl))中的释放行为。使用UV-Vis光谱仪对释放的药物量进行定量(图10)。如图10所示，在8天内释放了约70％的负载药物。此外，当用imMDV(R837-HCl)样品处理骨髓来源的树突状细胞(BMDC)时，使用ELISA实验方法分析了与Th1免疫反应相关的典型促炎细胞因子IL-6的分泌量。如图11所示，确认了IL-6的分泌与处理浓度成比例地增加，并且可以看出，通过确认展示了与用作对照物的R837-HCl的行为类似的行为，封装在多域囊泡中的R837-HCl被释放以活化免疫细胞。
通过小鼠实验(C57BL/6，6至7周大的雌性)验证实施例中制备的包括咪喹莫特的多域囊泡[imMDV(R837-HCl)、imMDV(R837-碱)和imMDV[R837-HCl:R837-碱]对针对卵清蛋白模型抗原的抗体的形成的影响。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法确定，随着向小鼠注射50μg的多域囊泡，体液免疫反应增加。
如图12a、12b和12c所示，可以证实，在施用了负载有咪喹莫特的多域囊泡样品(12a:imMDV(R837-HCl)样品，12b:imMDV(R837-碱)样品和12c:imMDV[R837-HCl:R837-碱(1:1)样品])的实验组中，针对卵清蛋白(OVA)模型抗原的体液免疫作用(IgG，注射后1周)显著增加。此外，可以确认，即使在注射后3周(图13a、13b和13c)和5周(图14a、14b和14c)过去之后，以这种方式增加的体液免疫效果也得以维持。
可以看出，在第一次注射后5周过去的时间点额外进行一次加强免疫时，体液免疫效果显著提高(图15a、15b、15c、16、17和18)。可以确认，在第5周加强免疫后的甚至第1、2和6周可以持续维持增加的体液免疫效果(图19、20和21)。可以证实，即使与临床阶段使用的油状佐剂(DMSO(R837))相比，基于多域囊泡的佐剂对免疫增强和可持续性的诱导也是优异的(图22)。最重要的是，最大优势是，当使用基于多域囊泡的佐剂(imMDV(R837-HCl))时，根本不发生施用油状佐剂(DMSO(R837))时发生的炎症现象(图23)。
1-11.包括基于角鲨烯的STING(环状DNA)的多域囊泡(imMDV-10)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖，1mg STING(InvivoGen，美国))中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-12.包括基于角鲨烯的MPLA/CpG的多域囊泡(imMDV-11)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)，MPLA(10mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖，1mg CpG)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-13.包括基于角鲨烯的MPLA和聚(I:C)的多域囊泡(imMDV-12)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)，MPLA(10mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相[5％蔗糖、1mg聚(I:C)]中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-14.包括基于角鲨烯的CpG/聚(I:C)的多域囊泡(imMDV-13)的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相[5％蔗糖、1mg CpG和1mg聚(I:C)]中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-15.包括基于蓖麻油的MPLA的多域囊泡(imMDV-14)的制备
将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、MPLA(10mg)、蓖麻油(12mg，Sigma-Aldrich，美国)和三油酸甘油酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
1-16.包括基于矿物油的MPLA的多域囊泡(imMDV-15)的制备
将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、MPLA(10mg)、矿物油(12mg，Sigma-Aldrich，美国)和三油酸甘油酯(12mg)溶解于氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下沉淀无溶剂的多域囊泡分散液或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到脂质体。
实施例2.评价多域囊泡针对病毒抗原的免疫增强功效
为了研究包括实施例1中制备的免疫功能调节物质的多域囊泡样品对禽流感病毒的特异性免疫作用，研究了B细胞(特别是在抗体特异性免疫反应过程中与抗体的产生相关联的B细胞)对体液免疫反应的影响。首先，从KOATECH(韩国平泽市)购买雌性BALB/c和C57BL/6小鼠(5至6周龄)。所有使用小鼠的实验均根据照顾和使用实验室研究动物的韩国NIH指南进行。
在第一次肌内注射后2周(图24)和4周(图25)收集小鼠血清，并且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测量针对血清中的HA蛋白的抗体滴度。在ELISA方法中，用PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)封闭涂有HA蛋白的板，然后将对照实验组血清以各种系列稀释液温育。之后，向其中添加附着有辣根过氧化物酶的小鼠IgG。所有温育均于37℃进行1小时，并且在上述各步骤之后，对照实验组血清用PBS/0.05％吐温20洗涤3次。通过向其添加100μL的四甲基联苯胺(TMB，BD Biosciences，美国)作为底物使反应展开后，用ELISA读取器测量450nm处的吸光度，结果示于图24和25。
实施例3.评价多域囊泡针对癌症抗原的免疫增强功效
3-1：多域囊泡的OVA特异性抗体制备的确认
通过小鼠实验(C57BL/6、6至7周大的雌性)验证了包括实施例1中制备的免疫功能调节物质的多域囊泡的癌症预防疫苗作用。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法确定，随着向小鼠中注射包括多域囊泡的50μg免疫调节物质(防癌疫苗)，体液免疫反应增加，结果显示于图26(对制备的IgG量的测量)。通过在疫苗接种后对小鼠进行眼科血液采样以比较制备的免疫球蛋白G(IgG)的量与对照组的IgG量来确认体液免疫反应。
3-2：确认多域囊泡引起的特异性细胞介导的T细胞反应
研究了包括免疫功能调节物质的多域囊泡引起的小鼠脾脏中T细胞的细胞免疫反应。从实施例3-1中接种的小鼠中的OVA和OVA多域囊泡组中选择三只小鼠，两周后，从每只小鼠中摘除脾脏，然后将脾脏组织转移至无菌的培养皿中，用细胞过滤器研磨脾脏，并从组织上皮中分离细胞。在将培养皿中的所有内容物转移到50mL试管中并在管中填充RPMI培养基后，将管以1,500rpm离心5分钟，然后将5mL红细胞裂解缓冲液(Sigma Aldrich，德国)加入已除去上清液的沉淀(pellet)中，并通过将该沉淀在30℃的水浴中静置5分钟至10分钟来溶解红细胞。将管中包括的细胞用PBS洗涤，然后悬浮在RPMI培养基中以分离脾细胞。将分离的脾细胞以5x 105细胞/100μL的浓度摊铺在涂有IFN-γ的96孔板上并用浓度为5μg/mL的MHC I类限制性OVA肽处理48小时。之后，向其中添加附着有辣根过氧化物酶的IFN-γ。通过向其中添加100μL 3-氨基-9-乙基咔唑(ACE，BD Biosciences，美国)作为底物开始反应后，通过酶联免疫斑点(ELISPOT)方法进行测量(图27))。
实施例4.负载有用于调节实体癌微环境的药物的多域囊泡的制备
4-1.含有用于去除MDSC的物质的多域囊泡的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X)将制备的油相溶液分散在1mL内部水相(5％蔗糖、吉西他滨((Eli Lilly and Company，美国印第安纳州印第安纳波利斯))，5mg)中10分钟。之后，将混合溶液在3mL外部水相(7.5％葡萄糖、40mM赖氨酸)中涡旋10秒。最后，使用真空蒸发器从形成的双重乳液中除去氯仿，并通过将温度升至37℃除去残留的溶剂。在低温下使无溶剂的多域囊泡分散液沉淀或用离心机沉降分散液后，除去上清液，得到多域囊泡(imMDV(SQ-Gem))。负载有吉西他滨，同时包括油酸油而不包括角鲨烯流体油(squalene fluid oil)的多域囊泡(imMDV(OA-Gem))以及负载有吉西他滨，同时不包括角鲨烯的多域囊泡(imMDVGem)可以通过上述相同的方法制备。图28示出了由此制备的三个样品的光学显微镜图像。可以确认，包含角鲨烯的多域囊泡中所负载的吉西他滨缓慢释放，而在不包括角鲨烯的多域囊泡中，大多数所负载的药物在24小时内释放(图29)。可以确认，当使用油酸植物油代替动物油(如角鲨烯)时，负载的吉西他滨的持续释放行为在24至72小时内呈现高耸形状，然后在72小时后呈现线性行为。这意味着可以使用流体油来调节所负载的药物的释放行为(图30)。
4-2.包括诱导免疫原性细胞死亡的药物的多域囊泡的制备
通过诱导癌细胞的死亡，从抗癌剂中选择了紫杉醇、阿霉素、氨甲蝶呤和奥沙利铂，其使抗原呈递细胞能够有效识别癌症剂，并制备了负载有这些药物的多域囊泡。使用与实施例4-1中相同的方法制备多域囊泡，但是通过将紫杉醇药物添加至油相溶液中来使用imMDV(紫杉醇)(图31)，以及通过将每种药物添加到内部水相中来制备多域囊泡，例如imMDV(阿霉素)(图32)、imMDV(甲氨蝶呤)(图33)和imMDV(奥沙利铂)(图34)。从图31可以看出，可以确认所负载的药物在2周内缓慢释放。
4-3.包含用于去除Treg细胞的物质的多域囊泡的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在其中分散有MK-2206(一种Akt抑制剂，SelleckChem，5mg)的1mL内部水相(5％蔗糖，(伊马替尼：(Novartis Pharmaceuticals Corp，美国新泽西州东汉诺威))5mg)中10分钟。通过与实施例4-1相同的后续过程，制备了多域囊泡(图35)。
4-4.包含能够控制PI3K信号传导的药物的多域囊泡的制备
通过将DOPC(10mg)、胆固醇(8mg)、角鲨烯(12mg)和甘油三油酸酯(12mg)溶解在氯仿(1mL)中来制备油相溶液。使用均质器(20,000X g)将制备的油相溶液分散在分散有PF-04691502(PI3K抑制剂，SelleckChem，5mg)的1mL内部水相(5％蔗糖，(伊马替尼：(Novartis Pharmaceuticals Corp，美国新泽西州东汉诺威))5mg)中10分钟。通过与实施例4-1相同的后续过程，制备了多域囊泡(图36)。
4-5.包括能够控制表观遗传机制的药物的多域囊泡的制备
在能够诱导表观遗传机制的药物中，选择了氮杂胞苷、Resminostat、帕比司他和OTX015(iBET)，并制备了负载有这些药物的多域囊泡。具体地，通过使用与实施例4-1中相同的方法以将每种药物添加到内部水相中来制备多域囊泡，例如imMDV(氮杂胞苷)(图37)、imMDV(瑞米司他)(图38)，imMDV(帕比司他)(图39)和imMDV(OTX015(iBET))(图40)。从图38和39可以看出，可以确认所负载的药物在2周内缓慢释放。
4-6.包含用于去除TAM细胞的物质的多域囊泡的制备
使用与实施例4-1相同的方法，但是将能够去除TAM细胞的药物BLZ945(CSF-1R激酶抑制剂)溶解在油相中，然后制备多域囊泡(图41)。
4-7.包含肿瘤免疫抑制细胞因子抑制剂的多域囊泡的制备
在将5mg肿瘤免疫抑制细胞因子抑制剂药物(塞来昔布，Sigma-Aldrich)溶解在实施例4-1的油相中之后，制备多域囊泡(图42)。
实施例5.组合有实体癌微环境免疫调节物质的多域囊泡的制备
作为其中组合有调节实体癌微环境中的免疫功能的物质的多域囊泡的制备的示例，制备了一种多域囊泡(imMDV(GEM/R837))(图43)，其具有稳定的结构，同时包含能够杀死MDSC和癌细胞的吉西他滨(实施例4-1)以及作为用于活化免疫细胞的toll样受体的咪喹莫特(实施例1-9)。
此外，制备了一种多域囊泡(imMDV(BLZ945/R837))(图44)，其具有稳定的结构，同时包含能够去除TAM细胞的药物BLZ945(实施例4-6)和作为用于活化免疫细胞的toll样受体的咪喹莫特(实施例1-9)。
提供本发明的上述描述是出于说明性目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应该理解，上述示例仅在所有方面进行了说明，而不是限制性的。例如，被描述为单数形式的每个组成元素可以以分布形式来实现，并且类似地，被描述为分布的组成元素可以以组合形式来实现。本发明的范围由下面将要描述的权利要求而不是详细描述来表示，并且应当解释为，权利要求的含义和范围以及从等同概念得出的所有改变或修改形式均落入本发明的范围内。
【工业适用性】
根据本发明的多域囊泡可以通过在脂质体内负载各种免疫调节物质，同时将免疫调节物质负载到脂质体的膜和/或囊泡的外壁上来增加免疫调节物质的有效持续时间。此外，根据本发明的用于制备多域囊泡的方法的优点在于，可以通过引入诸如角鲨烯之类的流体油来改进在多域囊泡的制备过程中的稳定性和储存稳定性，流体油的引入使不溶于一般有机溶剂的代表性的难溶性免疫调节物质易于溶解，因此，可以制备包含各种难溶性免疫调节物质的多域囊泡。

Claims (15)

1.一种多域囊泡，其包括：彼此接触并连接的至少两个脂质体；以及围绕所述至少两个脂质体的多域囊泡外壁，
其中所述多域囊泡由油相和水相形成，
所述油相包含第一免疫调节物质和流体油，并且所述油相形成所述脂质体的膜，以及所述多域囊泡外壁，
所述水相包含第二免疫调节物质，并且所述水相是所述脂质体的所述膜的内部水相，以及所述脂质体的所述膜的外部水相，
所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质，以及
所述流体油改进了彼此接触和连接的所述至少两个脂质体的结构稳定性。
2.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述多域囊泡具有1μm至100μm的尺寸。
3.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述流体油包括选自以下的一种：动物油、植物油、生育酚、矿物油、蓖麻油及其组合。
4.如权利要求3所述的多域囊泡，其中所述动物油是角鲨烯以及所述植物油是油酸。
5.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含在固体癌微环境中调节免疫抑制作用的药物。
6.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含能够控制髓样来源的抑制细胞(MDSC)的功能的药物。
7.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含能够控制调节性T细胞(Treg)的功能的药物。
8.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含能够控制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的功能的药物。
9.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含选自以下的免疫抑制环境因子抑制剂药物：转化生长因子β(TGF-β)抑制剂、硝基阿司匹林、环加氧酶-2(COX2)抑制剂、吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)抑制剂、磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂和抗白介素10(IL-10)。
10.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含抗癌剂，所述抗癌剂通过借助化学疗法诱导免疫原性细胞死亡来提高免疫细胞的功效。
11.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包含能够通过表观遗传学机制杀死癌细胞或控制肿瘤微环境的药物。
12.如权利要求1所述的多域囊泡，其中所述免疫抑制因子控制物质包括调节至少一种免疫抑制作用的药物。
13.一种免疫调节物质，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的多域囊泡，以及抗原。
14.如权利要求13所述的免疫调节物质，其中所述抗原选自蛋白质、基因、细胞、病毒及其组合。
15.一种用于制备多域囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
通过将第一免疫调节物质和流体油溶解在溶剂中来制备油相溶液；
通过将包含第二免疫调节物质的第一水相分散在所述油相溶液中来制备油包水(W/O)乳液；以及
将所述油包水乳液与第二水溶液混合并蒸发所述溶剂，
其中所述第一免疫调节物质和所述第二免疫调节物质是免疫抑制因子控制物质。
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