CN110564677B - 诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用 - Google Patents

诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用，具体地本发明公开了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂，该诱导剂为小分子化合物WIKI4，其具有高效诱导多能干细胞向心肌细胞进行分化的作用。

Description

诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学和再生医学领域，具体地说，本发明涉及一种诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用。
背景技术
据世界心脏联盟统计，在世界范围内每死亡三个人中就有一人的死因与心血管疾病有关。心脏病已然成为人类健康的头号杀手。人心肌组织中的干细胞有限，分化能力差，细胞坏死或凋亡后心肌难以修复，导致心肌细胞数量减少，心率失常，最终造成心力衰竭。我国心血管病危险因素流行趋势明显,心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。据《中国心血管病报告2016》推算我国心血管病现患人数2.9亿,其中脑卒中1300万,冠心病1100万,心力衰竭450万,肺原性心脏病500万,风湿性心脏病250万,先天性心脏病200万,高血压2.7亿；心血管病死亡率居首位,高于肿瘤和其他疾病,占居民疾病死亡构成的40％以上,特别是农村,近几年来心血管病死亡率持续高于城市水平。心脑血管病住院总费用也在快速增加,2004年至今,其年均增速远高于GDP增速。我国心血管疾病负担日渐加重,已成为重大的公共卫生问题,防治心血管病刻不容缓。
诱导人多能干细胞定向分化为心肌细胞，有望为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者提供治疗细胞修复受损心肌细胞；为构建器官移植用的人造心脏提供种子细胞；为体外研究心脏发育提供充足的细胞材料；为体外药物筛选和药物心脏毒性评价提供良好的细胞模型。
已有研究表明，人多能干细胞可分化为多种细胞，包括心肌组织中的多种细胞。目前诱导人多能干细胞定向分化为心肌细胞的主要方法如下：
1.类胚体法
人多能干细胞在体外培养的过程中细胞间会自发或通过悬滴法聚集形成类胚体，悬浮培养10天后贴壁，在不添加额外的诱导因子下，可自发产生搏动的心肌细胞，但是效率较低，只能达到5～15％。在添加激活素-A(Activin A)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子(FGF)等诱导因子的情况下，可提高心肌细胞的诱导效率，达到70％左右。
尽管此法在诱导因子的作用下心肌细胞诱导效率有所提升，但效率依然有限，不能满足细胞移植治疗的目的。此外，此法的不可控因素较多，如类胚体的大小难以统一，类胚体细胞量的变化直接导致类胚体产生心肌细胞的数量和质量差异；细胞间相互作用机制仍不清楚，细胞株类型及培养方法的差异将直接影响诱导效率。
2.共培养法
共培养法依赖于动物细胞，人多能干细胞与小鼠内胚层样细胞(END2)共培养，从而产生合同心肌细胞。此法模拟细胞发育调控机制，内胚层样细胞可分泌多种细胞因子，从而诱导多能干细胞向心肌细胞分化。这是一种比较原始的方法，诱导效率也只能达到35％左右。
此法模拟了细胞发育的调控机制，但是具有诱导效率低和需要使用动物源细胞等缺点。
3.转基因法
转基因法能将特定的基因通过转染到多能干细胞，促进其分化成心肌细胞。目前的方法有：转染Nkx2.5基因，心肌特异性α肌球蛋白重链启动子和增强绿色荧光蛋白标记基因联合转染，转染阿尔法肌球蛋白启动子联合嘌呤毒素抗性基因、表皮生长因子基因和增强绿色荧光蛋白标记基因，共同转染miRNA-208和miRNA-133a，转染不同组合的miRNA-1和miRNA-133，转染钠钙交换体启动子。该方法的机理是通过上调心肌细胞相关的特异性基因、miRNA和启动子，激活心肌发育相关的信号传导通路，诱导多能干细胞向心肌细胞分化。
此方法需构建带有某种特定基因的载体转染细胞，并筛选出具有这种基因的细胞，再继续诱导分化。此法的缺点是：1.安全性，转基因安全性是重中之重，此法难以做到绝对安全，难以确保转基因能在特定细胞中的表达受到精确的调控；2.复杂性，此法工序较为复杂，从构建载体到转染细胞再到筛选细胞，最终才能诱导，工序复杂，难以规模化批量化生产；3.效率低，细胞转染效率有限，同时难以保证转染进细胞中的特定基因的量，将直接影响心肌细胞诱导效率。
因此，本领域技术人员致力于开发诱导效率和安全性更高的诱导人多能干细胞定向分化为心肌细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用。
在本发明的第一方面，提供了化合物WIKI4的用途，用于诱导干细胞分化为心肌细胞；或者用于制备诱导剂，所述诱导剂用于诱导干细胞分化为心肌细胞。
在另一优选例中，所述干细胞包括：胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞、功能与形态与胚胎干细胞类似的细胞、具有多向分化潜能的干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
在另一优选例中，所述干细胞为多能干细胞，优选地包括诱导多能干细胞。
在另一优选例中，所述心肌细胞为搏动的心肌细胞。
在另一优选例中，所述用途为非治疗目的。
本发明的第二方面，提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的诱导剂，其中所述诱导剂包含WIKI4。
在另一优选例中，所述诱导剂还包含细胞培养添加剂；优选地为无血清细胞培养添加剂；更优选地为B27细胞培养添加剂。
在另一优选例中，所述细胞培养添加剂中不含胰岛素。
本发明的第三方面，提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的培养基，所述培养基包括WIKI4。
在另一优选例中，所述培养基包括一基础培养基，优选地，所述基础培养基为RPMI1640。
在另一优选例中，所述培养基还包括不含胰岛素的B27细胞培养添加剂。
在另一优选例中，所述培养基中WIKI4的含量为1～5μM。
在另一优选例中，所述培养基中不含胰岛素的B27细胞培养添加剂的含量为1～3vol/％。
在另一优选例中，所述诱导干细胞分化为心肌细胞的培养基包括：
诱导培养基Ⅰ，所述的诱导培养基Ⅰ包含：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈(CHIR99201)和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
诱导培养基Ⅱ，所述的诱导培养基Ⅱ包含：WIKI4和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
诱导培养基Ⅲ，所述的诱导培养基Ⅲ包含：不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；和
诱导培养基Ⅳ，所述的诱导培养基Ⅳ包含：B27细胞培养添加剂。
在另一优选例中，所述诱导培养基Ⅰ、所述诱导培养基Ⅱ、所述诱导培养基Ⅲ、和/或所述诱导培养基Ⅳ由基础培养基RPMI 1640配制。
本发明的第四方面，提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括WIKI4。
在另一优选例中，所述试剂盒包括诱导基础培养基、第一诱导添加物、第二诱导添加物和维持培养基，其中，诱导基础培养基包含RPMI-1640培养基和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；第一诱导添加物包含CHIR99021；第二诱导添加物包含WIKI4；维持培养基包含RPMI-1640培养基和B27细胞培养添加剂。
本发明的第五方面，提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括步骤：给需要诱导的干细胞施用WIKI4，从而将所述干细胞诱导分化为心肌细胞。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
将培养的干细胞用诱导培养基Ⅰ培养1至3天；然后换诱导培养基Ⅱ培养2至4天；之后换诱导培养基Ⅲ培养1至3天；最后换诱导培养基Ⅳ培养1至3天。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为免疫荧光检测诱导产生的细胞表达心肌细胞特异标志物cTnT和Actinin；
图2为WIKI4不同浓度梯度诱导产生表达cTnT的细胞百分比。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂，该诱导剂为小分子化合物WIKI4，该诱导剂具有高效诱导多能干细胞向心肌细胞进行分化的作用。本发明还提供了包含该诱导剂的诱导培养基，可以通过以下方法制得：将WIKI4加入用于诱导多能干细胞分化的基础培养基；其中，所述诱导培养基中WIKI4的浓度为1μM-5μM。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂及培养基。通过该诱导剂及其配制的培养基高效率地诱导多能干细胞产生心肌细胞，产生的心肌细胞搏动频率接近人体正常心肌细胞，产生的心肌细胞不含动物源成分，可用于细胞移植、药物开发、毒性评价和生理学研究等技术问题。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂，该诱导剂为WIKI4，其中中文名为：2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮，分子结构为：
Figure BDA0002161683350000041
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的培养基，所述的诱导培养基包含诱导培养基Ⅰ，诱导培养基Ⅱ，诱导培养基Ⅲ和诱导培养基Ⅳ。
进一步地，所述的诱导培养基Ⅰ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：5～7μM 6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈(CHIR99201)和1～3vol/％不含胰岛素的B27。
进一步地，所述的诱导培养基Ⅱ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～5μM WIKI4和1～3vol/％不含胰岛素的B27(B27细胞培养添加剂，购自Thermofisher公司)。
进一步地，所述的诱导培养基Ⅲ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～3vol/％不含胰岛素的B27。
进一步地，所述的诱导培养基Ⅳ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～3vol/％B27。
在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了所述的诱导培养基在诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的应用方法，包括步骤：
将多能干细胞接种到铺有低生长因子基质胶的培养皿中，使用mTeSR1完全培养基培养细胞至汇合度达到80％～90％；弃培养基，更换为诱导培养基Ⅰ培养2天；然后换诱导培养基Ⅱ培养3天；之后换诱导培养基Ⅲ培养2天；最后换诱导培养基Ⅳ培养2天，即可产生搏动的心肌细胞。
本发明中的多能干细胞，包括但并不限于：胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞、功能与形态与胚胎干细胞类似的细胞、具有多向分化潜能的干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂，所述的诱导剂为WIKI4。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的培养基，所述的诱导培养基包含诱导培养基Ⅰ，诱导培养基Ⅱ，诱导培养基Ⅲ和诱导培养基Ⅳ。所述的诱导培养基Ⅰ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：5～7μM CHIR99021和1～3vol/％不含胰岛素的B27；所述的诱导培养基Ⅱ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：1～5μM WIKI4和1～3vol/％不含胰岛素的B27；所述的诱导培养基Ⅲ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：1～3vol/％不含胰岛素的B27；所述的诱导培养基Ⅳ包含基础培养基RPMI1640，进一步地，所述的培养基还包含：1～3vol/％B27。
优选地，所述的诱导培养基Ⅰ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：约6μM CHIR-99021和约2vol/％不含胰岛素的B27。
优选地，所述的诱导培养基Ⅱ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：约3μM WIKI4和约2vol/％不含胰岛素的B27。
优选地，所述的诱导培养基Ⅲ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：约2vol/％不含胰岛素的B27。
优选地，所述的诱导培养基Ⅳ包含基础培养基RPMI 1640，进一步地，所述的培养基还包含：约2vol/％B27。
本发明还提供了上述任一项所述的诱导培养基在诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的应用：将多能干细胞接种到铺有低生长因子基质胶的培养皿中，使用mTeSR1完全培养基培养细胞至汇合度达到80％～90％；弃培养基，更换为诱导培养基Ⅰ培养2天；然后换诱导培养基Ⅱ培养3天；之后换诱导培养基Ⅲ培养2天；最后换诱导培养基Ⅳ培养2天。
上述任一项所述的方法得到的心肌细胞，其中，心肌细胞不含动物源成分。
上述任一项所述的方法得到的心肌细胞，其中，心肌细胞搏动频率接近人体正常心肌细胞。
本发明使用的多能干细胞，特别是高频率使用hiPSC作为制备心肌细胞的多能干细胞源，通过本发明的方法，由多能干细胞诱导而来的心肌细胞具有与正常人体心肌细胞相近的搏动频率，同时表达心肌细胞特异标志物cTnT和Actinin。
在一些实施方式中，本发明涉及到以使用本发明方法制备的心肌细胞，为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者提供治疗细胞修复受损心肌细胞；为构建器官移植用的人造心脏提供种子细胞；为体外研究心脏发育提供充足的细胞材料；为体外药物筛选和药物心脏毒性评价提供良好的细胞模型。
本发明还涉及到提供一种用于将人多能干细胞诱导分化为搏动的心肌细胞的试剂盒。试剂盒包括诱导基础培养基、第一诱导添加物、第二诱导添加物和维持培养基。试剂盒主要包含以下成份：诱导基础培养基包含RPMI-1640培养基和不含胰岛素的B27，为细胞生长提供基础营养；第一诱导添加物包含CHIR99021小分子，作为诱导多能干细胞向中胚层分化；第二诱导添加物包含WIKI4小分子作为诱导中胚层细胞向心肌前体和心肌细胞分化；维持培养基包含RPMI-1640培养基和B27，作为心肌细胞长期维持培养提供基础营养。
所述的诱导基础培养基包含RPMI-1640培养基作为基础培养基和1～3vol/％不含胰岛素的B27；优选地，所述不含胰岛素的B27浓度为2vol/％。
所述的诱导添加物Ⅰ包含5～7mM CHIR90021；优选地，CHIR90021浓度为6mM。
所述的诱导添加物Ⅱ包含1～5mM WIKI4；优选地，WIKI4浓度为2～4mM；更优选地，WIKI4浓度为3mM。
所述的维持培养基包含RPMI-1640培养基作为基础培养基和1～3vol/％B27；优选地，所述B27浓度为2vol/％。
上述的试剂盒在诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞中的应用(以6孔板培养为例)，包括：
1)将多能干细胞接种到铺有低生长因子基质胶的6孔板中，使用mTeSR1完全培养基，调整培养基体积为2mL/孔，培养细胞至汇合度达到80％～90％；
2)将诱导添加物Ⅰ按1:1000的比例溶解于诱导基础培养基中，充分混匀后，每孔加2mL进行培养，计时为第0天，培养2天；
3)在第2天时，弃旧培养基，将诱导添加物Ⅱ按1:1000的比例溶解于诱导基础培养基中，充分混匀后，每孔加2mL进行培养，连续培养3天；
4)在第5天时，弃旧培养基，换诱导基础培养基，每孔加2mL，培养2天；
5)在第7天时，弃旧培养基，换维持培养基，每2天换液。
本发明可以采用单层培养法在培养皿中单层培养细胞，在诱导因子的刺激下诱导多能干细胞向心肌细胞分化。此法操作简单，可批量化生产，是一种优选的诱导方案。与类胚体法和共培养法相比，它的好处是能提高诱导效率和容易监测结果。此方法操作简单，易于批量化生产，纯化方法简单等优势。
本文使用的术语“多能干细胞”，通常缩写为PSC，指的是具有多向分化潜能且能无限增殖和自我更新的人体细胞。其中“胚胎干细胞”通常缩写为ESC，指的是从早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。其中“诱导多能干细胞”通常缩写为iPSC，指的是通过重编程使终末分化的细胞(如皮肤细胞、成纤维细胞、造血细胞、上皮细胞等)去分化为胚胎干细胞样状态的细胞。
本文使用的术语“分化”指的是在体外培养条件下，使用特定的试剂组合将PSC转化为特定的功能细胞(如心肌细胞)的生物过程。
本文使用的术语“诱导”指的是利用特定的条件(如特定的培养方法，特定的试剂组合)诱使PSC分化为特定的功能细胞(如心肌细胞)的实验方法。
本文使用的术语“心肌细胞”指的是任何心脏发育过程中产生的细胞，包括但不限于心肌祖细胞、心室肌细胞、心房肌细胞、蒲肯野细胞、窦房结P细胞。
本文使用的术语“WIKI4”包括2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮及其类似物，2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮分子结构为：
Figure BDA0002161683350000071
典型的2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮的类似物包括该化合物与酸或碱所形成的适合的盐，包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是该化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
典型的2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮的类似物还包括该化合物基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代所形成的化合物：卤素(如氟、氯、溴)、氰基、羟基、氨基、C1-6烃氧基、C1-6卤代烃基、C1-6酰基、C1-6磺酰基、CF3、硝基、CN、-C≡CH、C1-6烷基(直链或支链，可被1个或多个卤素、C1-6烷氧基取代)。
本文未特别指明的实施例中所用的试剂耗材和技术手段为本领域技术人员所熟知的市售商品和常规技术方法。
本发明的主要优点在于：
1、提供一种诱导剂及含该诱导剂的培养基，具有诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的作用，所述方法中使用的培养基不含动物源血清，无毒，诱导分化产生的心肌细胞无需纯化可直接应用于心肌细胞移植治疗、药物筛选、毒理评价等。
2、开拓了WIKI4的新用途，既诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞。
3、所述方法使用的诱导剂与培养基成本低廉，使用简单，诱导方法稳定，可批量化生产。
4、提供一种诱导多能干细胞定向分化为心肌细胞的试剂盒，该试剂盒成分明确，使用简单。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：诱导人诱导多能干细胞hiPSC定向分化为搏动的心肌细胞
细胞株：人诱导多能干细胞hiPSC(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。
主要实验试剂：mTeSR1完全培养基(STEMCELL Technologies公司)、Accutase(STEMCELL Technologies公司)、Y27632(selleck公司)、RPMI-1640培养基(Thermofisher公司)、低生长因子Matrigel(Corning公司)、不含胰岛素B27(Thermofisher公司)、B27(Thermofisher公司)、CHIR99021(Medchemexpress公司)、WIKI4(Medchemexpress公司)。
包被培养皿：冰上解冻低生长因子Matrigel，在RPMI 1640培养中按1：100的比例稀释后包被培养皿，培养箱中静置30分钟，备用。
接种hiPSC：正常培养的hiPSC经Accutase消化液消化为单细胞后离心，使用含10μM Y27632的mTeSR1培养基重悬细胞并接种到上述的培养皿中，每天更换mTeSR1培养基直到细胞覆盖培养皿底面积达到80％～90％。
诱导hiPSC：弃旧培养基，更换培养基为：RPMI-1640培养基、2vol/％不含胰岛素的B27、CHIR99021的浓度为6μM。培养2天后更换培养基为：RPMI-1640培养基、2vol/％不含胰岛素B27、WIKI4的浓度为3μM，连续培养3天。而后，更换培养基为：RPMI-1640培养基、2vol/％不含胰岛素B27，连续培养2天。在第7天时，更换培养基为：RPMI-1640培养基、2vol/％无血清细胞培养添加剂B27，每2天换一次液，连续培养。
通过对心肌细胞特异标志基因的表达进行RT-PCR鉴定及特异标志蛋白表达进行免疫荧光鉴定。其中，图1为诱导8天后心肌细胞特异标志cTnT和Actinin的表达情况。
其他实施例：本发明的其他实施例仅涉及到权利要求范围内的细胞及各组分的含量变化，其配制方法和用于多能干细胞的定向分化的方法与实施例1基本相同。
例如，在具体实施方案中，本发明的诱导培养基Ⅰ、诱导培养基Ⅱ和诱导培养基Ⅲ可包含1～3vol/％不含胰岛素B27，优选地2vol/％不含胰岛素B27。
在其它实施方案中，本发明的诱导培养基Ⅰ可包含5～7μM CHIR99021，优选地6μMCHIR99021。
在其它实施方案中，本发明的诱导培养基Ⅱ可包含1～5μM WIKI4，优选地3μMWIKI4。
在其它实施方案中，本发明的诱导培养基Ⅳ可包含1～3vol/％B27，优选地2vol/％B27。
虽然上述实施例中各组分的含量在一定范围内变化，但均可实现诱导多能干细胞定向分化为搏动的心肌细胞，只是诱导分化产生的心肌细胞纯度有部分差异，部分结果见图2。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.化合物2-[3-[[4-(4-甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)-4H-1,2,4-三唑-3-基]硫基]丙基]-1H-苯并[DE]异喹啉-1,3(2H)-二酮(WIKI4)的用途，其特征在于，用于制备诱导剂，所述诱导剂用于诱导干细胞分化为心肌细胞；其中，所述干细胞为诱导多能干细胞（iPSC），并且所述诱导剂包含WIKI4和细胞培养添加剂，所述细胞培养添加剂中不含胰岛素；并且，诱导所述干细胞分化为心肌细胞时培养基中WIKI4的含量为3～4μM。
2.一种诱导干细胞分化为心肌细胞的培养基，其特征在于，所述干细胞为诱导多能干细胞（iPSC）；所述培养基包括：诱导培养基Ⅰ、诱导培养基Ⅱ、诱导培养基Ⅲ和诱导培养基Ⅳ；所述诱导培养基Ⅰ、所述诱导培养基Ⅱ、所述诱导培养基Ⅲ和所述诱导培养基Ⅳ均由基础培养基RPMI 1640配制；
并且，
所述的诱导培养基Ⅰ包含：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅱ包含：WIKI4和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅲ包含：不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅳ包含：B27细胞培养添加剂。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述的诱导培养基Ⅱ中WIKI4的含量为1～5μM。
4.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述的诱导培养基Ⅰ中不含胰岛素的B27细胞培养添加剂的含量为1～3vol/%，所述的诱导培养基Ⅱ中不含胰岛素的B27细胞培养添加剂的含量为1～3vol/%，所述的诱导培养基Ⅲ中不含胰岛素的B27细胞培养添加剂的含量为1～3vol/%。
5.一种诱导干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括诱导基础培养基、第一诱导添加物、第二诱导添加物和维持培养基，其中，诱导基础培养基包含RPMI-1640培养基和不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；第一诱导添加物包含CHIR99021；第二诱导添加物包含WIKI4；维持培养基包含RPMI-1640培养基和B27细胞培养添加剂。
6.一种非治疗目的的诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括步骤：
将培养的干细胞用诱导培养基Ⅰ培养1至3天；然后换诱导培养基Ⅱ培养2至4天；之后换诱导培养基Ⅲ培养1至3天；最后换诱导培养基Ⅳ培养1至3天；
所述的诱导培养基Ⅰ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：5～7μM 6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈和1～3vol/%不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅱ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～5μMWIKI4和1～3vol/%不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅲ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～3vol/%不含胰岛素的B27细胞培养添加剂；
所述的诱导培养基Ⅳ，包含基础培养基RPMI 1640，所述的培养基还包含：1～3vol/%B27细胞培养添加剂。
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