CN110559333A - 一种地锦草发酵物及地锦草的发酵方法 - Google Patents

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CN110559333A CN201910957629.8A CN201910957629A CN110559333A CN 110559333 A CN110559333 A CN 110559333A CN 201910957629 A CN201910957629 A CN 201910957629A CN 110559333 A CN110559333 A CN 110559333A
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陈新瑶
梁世仁
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Abstract

本申请实施例提供一种地锦草发酵物及地锦草的发酵方法，涉及中药发酵领域。地锦草发酵物主要是原料发酵得到，按重量份数计，原料包括：地锦草干燥粉400‑600份；豆粕粉400‑600份；葡萄糖2‑4份；磷酸氢二钾2‑4份；水1200‑1800份；纤维素酶0.3‑0.7份；植物乳酸杆菌含量为105‑106CFU/mL的菌液40‑60份。地锦草的发酵方法主要是将上述原料于30‑39℃发酵5‑10天。地锦草发酵物及地锦草的发酵方法可以显著提高地锦草发酵物中没食子酸的含量，充分发挥地锦草的药用功能，提高地锦草的利用度。

Description

一种地锦草发酵物及地锦草的发酵方法
技术领域
本申请涉及中药发酵领域，具体而言，涉及一种地锦草发酵物及地锦草的发酵方法。
背景技术
地锦草(Humifuse Euphorbia Herb)，又名草血竭、血见愁草、血见愁等，为大戟科植物地锦(Euphorbia humifusa Willd.)及斑叶地锦(Euphorbia maculata L.)的全草。地锦草味辛、性平，归肝、大肠经，入药部分为地锦草全草，具有止血凉血、解毒清热之功效。研究表明，地锦草中主要含有黄酮及其苷类、有机酸、酚类、萜类和甾醇类等成分，其中较为大家熟知的是黄酮类成分和酚酸类的没食子酸。没食子酸(Gallic acid)又名五倍子酸、棓酸，其具有抗炎、抗突变、抗氧化等生物活性。
为了充分发挥地锦草的功效，研究者不断优化地锦草中黄酮、没食子酸等成分的提取工艺。现代发酵技术是在继承中药发酵法的基础上，利用微生物的强大的生物转化能力，对药材进行活性成分的转化，毒性成分降低以及有效成分的提取和分离。虽然目前已有通过现代发酵技术提高百药煎中没食子酸含量的方法，在一定程度上解决了发酵周期长，没食子酸含量低的问题，但是却没有能够提高地锦草提取物中没食子酸含量的方法，而且现有的发酵方法无法有效提高地锦草提取物中没食子酸含量。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种地锦草发酵物及地锦草的发酵方法，该发酵方法可以显著提高地锦草发酵物中没食子酸的含量，充分发挥地锦草的药用功能，提高地锦草的利用度。
第一方面，本申请实施例提供了一种地锦草发酵物，其主要是原料发酵得到，按重量份数计，原料包括：地锦草干燥粉400-600份；豆粕粉400-600份；葡萄糖2-4份；磷酸氢二钾2-4份；水1200-1800份；纤维素酶0.3-0.7份；植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40-60份。
在上述技术方案中，由于地锦草中含有鞣质成分，鞣质是由没食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其他多元醇)酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成的植物多元酚。鞣质在植物乳酸杆菌的发酵作用下可水解生成没食子酸和糖或多元醇，豆粕粉、葡萄糖和磷酸氢二钾提供发酵所需营养，具体的，豆粕粉为微生物的生长提供能量，葡萄糖提供碳元素，磷酸二氢钾可保持微生物生长环境的酸碱平衡，与水形成液态发酵体系，提高发酵效率和产量，并且这三种原料易获取，价格便宜；而且纤维素酶能够提高水解效率；由于微生物复苏到指数生长阶段需要一定时间、一定营养、一定温度的培养，本申请采用植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液能保证植物乳酸杆菌的含量，避免直接采用植物乳酸杆菌对地锦草发酵而导致发酵时间长的问题。本申请采用纤维素酶和植物乳酸杆菌能够充分发酵地锦草，提高地锦草中有效成分的提取和分离，从而可以显著提高地锦草发酵物中没食子酸的含量，充分发挥地锦草的药用功能，提高地锦草的利用度。
在一种可能的实现方式中，地锦草干燥粉为地锦草经干燥、粉碎得到，地锦草干燥粉的粒径为10-50目。
在上述技术方案中，地锦草干燥粉的粒径为10-50目，容易将其中的有效成分提取出来，从而提高地锦草经发酵处理后的没食子酸含量。
在一种可能的实现方式中，豆粕粉的粒径为10-50目。
在上述技术方案中，豆粕粉的粒径为10-50目，对地锦草的发酵作用强，使发酵完全、彻底进行，从而提高地锦草的利用度。
在一种可能的实现方式中，按重量份数计，原料包括：地锦草干燥粉450-550份；豆粕粉450-550份；葡萄糖2-4份；磷酸氢二钾2-4份；水1400-1600份；纤维素酶0.4-0.6份；菌液45-55份。
在上述技术方案中，原料按照特定的配比使用，能够发挥较佳的协同作用，从而提高地锦草中有效成分的提取和分离。
第二方面，本申请实施例提供了一种地锦草的发酵方法，其包括以下步骤：将第一方面提供的原料于30-39℃发酵5-10天。
在上述技术方案中，将原料在30-39℃进行一段时间的发酵，可以显著提高地锦草发酵物中没食子酸的含量，充分发挥地锦草的药用功能，提高地锦草的利用度。
在一种可能的实现方式中，其还包括将发酵所得的发酵液干燥、粉碎的步骤。
在上述技术方案中，将发酵液干燥、粉碎得到粉末状产品，更容易保存、应用。
在一种可能的实现方式中，干燥的方法为：将发酵液于55℃-75℃恒温干燥至含水量为10％-12％。
在上述技术方案中，于55℃-75℃恒温干燥能够尽量避免活性成分失效，从而减少活性成分，尤其是没食子酸的损失。
在一种可能的实现方式中，粉碎的方法为：将干燥所得的固体经精细粉碎至24-50目。
在上述技术方案中，将干燥后的固体粉碎至24-50目，能够得到细微粉末，便于保存和应用于各种产品中。
在一种可能的实现方式中，原料中的菌液的制备方法包括以下步骤：
将植物乳酸杆菌按接种量10％-50％接种在MRS培养基中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到104-106CFU/mL，得到活化培养液；
取活化培养液按接种量10％-50％接种在MRS培养基中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到105-106CFU/mL，得到菌液。
在上述技术方案中，将植物乳酸杆菌经过活化、传代培养，能够得到活性菌种含量高的菌液，从而保证对地锦草的发酵水解效果。
在一种可能的实现方式中，按重量份数计，MRS培养基的配方原料包括：胰蛋白胨9-11份、牛肉膏9-11份、酵母膏4.5-5.5份、葡萄糖18-22份、吐温80 0.9-1.1份、磷酸氢二钾1.8-2.2份、乙酸钠4.5-5.5份、柠檬酸铵1.8-2.2份、硫酸镁0.45-0.55份、四水合硫酸镁0.45-0.55份、蒸馏水800-1200份；MRS培养基的pH为5.5-6.0。
在上述技术方案中，经过改良后的MRS培养基对植物乳酸杆菌的活化、培养效果好，能够快速培养得到植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的地锦草发酵物及地锦草的发酵方法进行具体说明。
本申请实施例提供了一种地锦草发酵物，其主要是原料发酵得到，原料按重量份数计包括：地锦草干燥粉400-600份；豆粕粉400-600份；葡萄糖2-4份；磷酸氢二钾2-4份；水1200-1800份；纤维素酶0.3-0.7份；植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40-60份。可选地，原料按重量份数计包括：地锦草干燥粉450-550份；豆粕粉450-550份；葡萄糖2-4份；磷酸氢二钾2-4份；水1400-1600份；纤维素酶0.4-0.6份；菌液45-55份。在一些可能的实现方式中，原料按重量份数计包括：地锦草干燥粉400份、420份、430份、450份、460份、480份、490份、500份、510份、530份、550份、560份、570份、590份或600份；豆粕粉400份、420份、430份、450份、460份、480份、490份、500份、510份、530份、550份、560份、570份、590份或600份；葡萄糖2份、2.5份、3份、3.5份或4份；磷酸氢二钾2份、2.5份、3份、3.5份或4份；水1200份、1300份、1400份、1500份、1600份、1700份或1800份；纤维素酶0.3份、0.4份、0.5份、0.6份或0.7份；植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40份、50份或60份。
本申请是采用植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40-60份作为原料。在其他一些情形下，如果采用植物乳酸杆菌含量更高的菌液作为原料，就算为了保证总菌数而减少菌液重量份，也会因为植物乳酸杆菌的浓度过高而造成发酵培养基质中的营养消耗过快，营养物质枯竭而使植物乳酸杆菌的活力下降，对地锦草中药材的发酵作用也会随之下降。如果采用植物乳酸杆菌含量更低的菌液作为原料，就算为了保证总菌数而增加菌液重量份，也会因为植物乳酸杆菌的浓度过低而导致发酵时间延长才能发酵完全；另外因为中药材中还含有其他微生物，若植物乳酸杆菌的浓度偏低，则其相对于其他微生物没有生长优势，从而其他微生物占据生长优势，导致植物乳酸杆菌的发酵作用下降。
需要说明的是，地锦草干燥粉为地锦草经干燥、粉碎得到，本实施例可以采用现成的地锦草干燥粉，也可以采用自制的地锦草干燥粉。通常情况下，地锦草干燥粉的粒径为10-50目；可选地，地锦草干燥粉的粒径为30-50目，比如30目、40目或50目。
本实施例采用的豆粕粉的粒径一般为10-50目；可选地，豆粕粉的粒径为30-50目，比如30目、40目或50目。
本实施例采用的纤维素酶可以是市售的粉状产品，比如购自于山东苏柯汉生物工程股份有限公司出售的纤维素酶产品。
本申请实施例还提供了一种地锦草的发酵方法，其包括以下步骤：
(1)取地锦草，除杂、洗净、干燥，将其进行粉碎处理，粒径达到10-50目，得地锦草干燥粉备用；取豆粕粉碎，粒径达到10-50目，得豆粕粉备用。
(2)将上述原料：地锦草干燥粉400-600重量份、豆粕粉400-600重量份、葡萄糖2-4重量份、磷酸氢二钾2-4重量份、水1200-1800重量份、纤维素酶0.3-0.7重量份、植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40-60重量份，充分混合后得到发酵混合物。
本申请原料中的菌液可以购买，也可以自制，只需要保证菌液中的植物乳酸杆菌含量即可。可选地，菌液的制备方法包括以下步骤：
①将植物乳酸杆菌按接种量10％-50％接种在MRS培养基(乳酸细菌培养基)中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到104-106CFU/mL，得到活化培养液。
②取活化培养液按接种量10％-50％接种在MRS培养基中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到105-106CFU/mL，得到菌液。
上述过程中使用的MRS培养基的配方原料按重量份数计包括：胰蛋白胨9-11份、牛肉膏9-11份、酵母膏4.5-5.5份、葡萄糖18-22份、吐温80 0.9-1.1份、磷酸氢二钾1.8-2.2份、乙酸钠4.5-5.5份、柠檬酸铵1.8-2.2份、硫酸镁0.45-0.55份、四水合硫酸镁0.45-0.55份、蒸馏水800-1200份；MRS培养基的pH为5.5-6.0。
(3)将发酵混合物于30-39℃发酵5-10天，比如在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃的温度条件下发酵5天、6天、7天、8天、9天或10天，需要说明的是，本申请的发酵温度还可以在一个温度范围内变化，发酵时间也可以不是整天。在本申请的一些实施例中，发酵在无氧条件下进行，这是因为植物乳酸杆菌的生长环境要求是无氧条件；示例性地，将上述发酵混合物装入容器中，排尽空气、密封，置于30-39℃环境中发酵5-10天。
(4)发酵结束后，将发酵所得的发酵液干燥，干燥的方法一般为：将发酵液于55℃-75℃恒温干燥至含水量为10％-12％(wt％)。
(5)干燥结束后，将干燥所得的固体粉碎，通常是经精细粉碎至24-50目。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
本申请实施例使用的菌液按照以下培养方法得到：
1.植物乳酸杆菌的活化：将植物乳酸杆菌接种在改良的MRS培养基中，接种量为培养基质量的30％，培养温度为35℃，厌氧培养24小时，培养基中植物乳酸杆菌含量达到105CFU/mL。
2.传代培养：取经活化培养的植物乳酸杆菌液接种在改良的MRS培养基中，接种量为培养基质量的30％，培养温度为35℃，厌氧培养36小时，培养基中植物乳酸杆菌含量达到5·105CFU/mL，得到菌液。
上述过程使用的改良的MRS培养基的配方为：胰蛋白胨10重量份、牛肉膏10重量份、酵母膏5重量份、葡萄糖20重量份、吐温80 1重量份、磷酸氢二钾2重量份、乙酸钠5重量份、柠檬酸铵2重量份、硫酸镁0.5重量份、四水合硫酸镁0.05重量份、蒸馏水1000重量份，pH5.5-6.0，以上配方混合均匀后，灭菌处理20min，制得改良的MRS培养基。
实施例1
本实施例提供一种地锦草发酵物，其采用以下制备方法得到：
1、取地锦草，除杂、洗净、干燥，将其进行粉碎处理，粒径达到10目，得地锦草干燥粉备用。
2、取豆粕粉碎，粒径达到10目，得豆粕粉备用。
3、备料：步骤1的地锦草干燥粉400份、步骤2的豆粕粉400份、纤维素酶0.3份、葡萄糖2份、磷酸氢二钾2份、水1200份、菌液40份，将上述物料均匀混匀，充分混合后得到发酵混合物。
4、将上述发酵混合物装入容器中，排尽空气、密封，置于30℃环境中发酵10天。
5、发酵结束后，将所得发酵液进行恒温干燥，温度为55℃。
6、干燥结束后，将所得固体进行精细粉碎至24目，得地锦草发酵物，装袋密封保存。
实施例2
本实施例提供一种地锦草发酵物，其采用以下制备方法得到：
1、取地锦草，除杂、洗净、干燥，将其进行粉碎处理，粒径达到50目，得地锦草干燥粉备用；
2、取豆粕粉碎，粒径达到50目，得豆粕粉备用。
3、备料：步骤1的地锦草干燥粉600份、步骤2的豆粕粉600份、纤维素酶0.7份、葡萄糖4份、磷酸氢二钾4份、水1800份、菌液60份，将上述物料均匀混匀，充分混合后得到发酵混合物。
4、将上述发酵混合物装入容器中，排尽空气、密封，置于39℃环境中发酵5天。
5、发酵结束后，将所得发酵液进行恒温干燥，温度为75℃。
6、干燥结束后，将所得固体进行精细粉碎至50目，得地锦草发酵物，装袋密封保存。
实施例3
本实施例提供一种地锦草发酵物，其采用以下制备方法得到：
1、取地锦草，除杂、洗净、干燥，将其进行粉碎处理，粒径达到24目，得地锦草干燥粉备用。
2、取豆粕粉碎，粒径达到24目，得豆粕粉备用。
3、备料：步骤1的地锦草干燥粉500份、步骤2的豆粕粉500份、纤维素酶0.5份、葡萄糖3份、磷酸氢二钾3份、水1500份、菌液50份，将上述物料均匀混匀，充分混合后得到发酵混合物。
4、将上述发酵混合物装入容器中，排尽空气、密封，置于37℃环境中发酵7天。
5、发酵结束后，将所得发酵液发酵物进行恒温干燥，温度为65℃。
6、干燥结束后，将所得固体进行精细粉碎至40目，得地锦草发酵物，装袋密封保存。
实施例4
本实施例提供一种地锦草发酵物，其制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于，本实施例的原料为：地锦草干燥粉450份、豆粕粉550份、纤维素酶0.6份、葡萄糖2份、磷酸氢二钾4份、水1400份、菌液45份。最后制得地锦草发酵物。
实施例5
本实施例提供一种地锦草发酵物，其制备方法与实施例2的制备方法大致相同，不同之处在于，本实施例的原料为：地锦草干燥粉550份、豆粕粉450份、纤维素酶0.4份、葡萄糖4份、磷酸氢二钾2份、水1600份、菌液55份。最后制得地锦草发酵物。
对比例1
本对比例提供一种地锦草发酵物，其制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于，本对比例的原料未加入纤维素酶，最后制得地锦草发酵物。
对比例2
本对比例提供一种地锦草发酵物，其制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于，本对比例的原料未加入菌液，最后制得地锦草发酵物。
对比例3
本对比例提供一种地锦草发酵物，其制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于，本对比例采用1重量份酒曲代替实施例3中的纤维素酶和菌液，最后制得地锦草发酵物。
以下对地锦草发酵物中的没食子酸含量进行测定。
测定过程：取未经发酵的地锦草干燥粉作为空白样品，取上述实施例1-5和对比例1-3制备的地锦草发酵物的试验样品分别检测没食子酸含量。试验采用高效液相色谱法测定各样品中的没食子酸的含量，色谱条件：色谱柱为C18(填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶)，流动相为0.1％磷酸：甲醇＝95：5，检测波长为270nm。检测结果如表1。
表1各样品的没食子酸含量(wt％)
编号 样品 没食子酸含量
1 空白样品 0.46％
2 实施例1 0.64％
3 实施例2 0.66％
4 实施例3 0.67％
5 实施例4 0.57％
6 实施例5 0.56％
7 对比例1 0.47％
8 对比例2 0.48％
9 对比例3 0.48％
试验结果显示，实施例1-实施例5、对比例1-对比例3的没食子酸含量高于空白样品的没食子酸含量，说明地锦草经过微生物发酵之后，没食子酸的含量均高于未发酵地锦草。实施例1-实施例5的没食子酸含量又高于对比例1-对比例3的没食子酸含量，说明本申请采用纤维素酶和植物乳酸杆菌进行协同发酵，能够达到比较好的发酵效果。本申请实施例的发酵方法将地锦草经发酵处理后，其中没食子酸含量显著提高，有利用进一步扩大对地锦草的研发、利用、生产等范围及应用。
综上所述，本申请实施例的地锦草发酵物及地锦草的发酵方法，该发酵方法可以显著提高地锦草发酵物中没食子酸的含量，充分发挥地锦草的药用功能，提高地锦草的利用度。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种地锦草发酵物，其特征在于，其主要是原料发酵得到，按重量份数计，所述原料包括：地锦草干燥粉400-600份；豆粕粉400-600份；葡萄糖2-4份；磷酸氢二钾2-4份；水1200-1800份；纤维素酶0.3-0.7份；植物乳酸杆菌含量为105-106CFU/mL的菌液40-60份。
2.根据权利要求1所述的地锦草发酵物，其特征在于，所述地锦草干燥粉为地锦草经干燥、粉碎得到，所述地锦草干燥粉的粒径为10-50目。
3.根据权利要求1所述的地锦草发酵物，其特征在于，所述豆粕粉的粒径为10-50目。
4.根据权利要求1所述的地锦草发酵物，其特征在于，按重量份数计，所述原料包括：所述地锦草干燥粉450-550份；所述豆粕粉450-550份；所述葡萄糖2-4份；所述磷酸氢二钾2-4份；所述水1400-1600份；所述纤维素酶0.4-0.6份；所述菌液45-55份。
5.一种地锦草的发酵方法，其特征在于，其包括以下步骤：将如权利要求1所述的原料于30-39℃发酵5-10天。
6.根据权利要求5所述的地锦草的发酵方法，其特征在于，其还包括将发酵所得的发酵液干燥、粉碎的步骤。
7.根据权利要求6所述的地锦草的发酵方法，其特征在于，所述干燥的方法为：将所述发酵液于55℃-75℃恒温干燥至含水量为10％-12％。
8.根据权利要求6所述的地锦草的发酵方法，其特征在于，所述粉碎的方法为：将干燥所得的固体经精细粉碎至24-50目。
9.根据权利要求5所述的地锦草的发酵方法，其特征在于，所述原料中的所述菌液的制备方法包括以下步骤：
将植物乳酸杆菌按接种量10％-50％接种在MRS培养基中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至所述MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到104-106CFU/mL，得到活化培养液；
取所述活化培养液按接种量10％-50％接种在MRS培养基中，于30-38℃厌氧培养6-48小时，直至所述MRS培养基中植物乳酸杆菌含量达到105-106CFU/mL，得到所述菌液。
10.根据权利要求9所述的地锦草的发酵方法，其特征在于，按重量份数计，所述MRS培养基的配方原料包括：胰蛋白胨9-11份、牛肉膏9-11份、酵母膏4.5-5.5份、葡萄糖18-22份、吐温80 0.9-1.1份、磷酸氢二钾1.8-2.2份、乙酸钠4.5-5.5份、柠檬酸铵1.8-2.2份、硫酸镁0.45-0.55份、四水合硫酸镁0.45-0.55份、蒸馏水800-1200份；所述MRS培养基的pH为5.5-6.0。
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