CN110558993B - 一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监测贴片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程领域，尤其涉及一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监测贴片及其制备方法。本发明提供的普鲁士蓝微针电极包括：金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；复合在所述金微针表面的普鲁士蓝层；和复合在所述普鲁士蓝层表面的壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层。本发明解决了目前针对糖尿病血糖监测必须进行抽血化验造成工作繁琐的问题，只需将本发明提供的微针电极穿透皮肤角质层，即可长效迅速准确的测试组织液中的葡萄糖糖浓度，且微针电极尺寸小巧，便于携带，具备作为一种良好的安全便携无痛的血糖电化学传感器的潜力。

Description

一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监 测贴片及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，尤其涉及一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监测贴片及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高，糖尿病的患病率呈逐年增加的趋势。糖尿病患者的血糖水平如果长期无法调节，将会引发许多严重的并发症，所以糖尿病患者需要在日常生活中时刻管理血糖水平。当前在监测血糖方面占主流的使用方式是刺破手指出血用专用试纸检测，为了反应患者血糖变化，患者需要在三餐前后进行多次重复采血，这个过程会给患者带来很大的身体痛苦，还有可能引发伤口感染，而且这种测量方式并不能知道血糖连续变化的情况。而目前已上市的血糖监测仪大都不便于携带，患者在外出时检测血糖含量很不方便。因此，开展无需重复采血就能快速检测血糖的无痛便携血糖监测装置的开发与研究就很有必要。
目前糖尿病的检测大都是通过采集血液样本来分析，但人体除血液外，组织液也存在着与血液中含量正相关的葡萄糖浓度。组织液是存在于细胞间隙的液体，不断地与血液进行着物质交换，相比于血液，组织液可以以微创的方式连续不断的获取，是血液检测的一个很好的替代液体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监测贴片及其制备方法，本发明提供的普鲁士蓝微针电极适用于长时间灵敏无痛的对人体组织液中葡萄糖成分进行监测，且便于携带。
本发明提供了一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极，包括：
金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；
复合在所述金微针表面的普鲁士蓝层；
和复合在所述普鲁士蓝层表面的壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层。
优选的，所述金微针电极包括：
硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针；
和复合在所述硅基微针表面的金层。
优选的，所述金微针电极还包括设置在所述硅基微针表面与所述金层之间的粘附层；
所述粘附层为铬层或钛层。
优选的，所述普鲁士蓝微针电极的微针高度为200～400μm。
本发明提供了一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极的制备方法，包括以下步骤：
a)提供金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；之后将所述金微针电极置于普鲁士蓝沉积液中，采用三电极恒电位法在金微针电极表面沉积普鲁士蓝，得到表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极；
b)将所述表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极置于掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液中，采用三电极恒电位法在普鲁士蓝层表面沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶，得到用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
优选的，步骤a)中，所述金微针电极按照以下步骤制备得到：
提供硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针；之后在所述硅基微针表面沉积金，得到金微针电极。
本发明提供了一种血糖监测贴片，包括：
柔性衬底；
键合在所述柔性衬底上的工作电极、辅助电极和参比电极；
所述工作电极为上述技术方案所述的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
优选的，所述辅助电极为铂微针电极；所述参比电极为银/氯化银微针电极。
本发明提供了一种血糖监测贴片的制备方法，包括以下步骤：
对柔性衬底进行等离子体表面处理，之后将工作电极、辅助电极和参比电极键合到处理后的柔性衬底上，得到血糖监测贴片；
所述工作电极为上述技术方案所述的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
优选的，所述辅助电极为铂微针电极，所述铂微针电极按照以下步骤制备得到：
在硅基微针表面沉积铂，得到铂微针电极；
所述参比电极为银/氯化银微针电极，所述银/氯化银微针电极按照以下步骤制备得到：
在硅基微针表面沉积银，得到银微针电极；之后将所述银微针电极浸泡在氯化物溶液中使银微针电极上的部分银转变成氯化银，得到银/氯化银微针电极。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极、其制备方法、血糖监测贴片及其制备方法。本发明提供的普鲁士蓝微针电极包括：金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；复合在所述金微针表面的普鲁士蓝层；和复合在所述普鲁士蓝层表面的壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层。在本发明中，普鲁士蓝微针电极上沉积的固定化葡萄糖氧化酶可与组织液中葡萄糖反应释放出过氧化氢，其与普鲁士蓝发生氧化还原反应产生电流，通过在间隔均匀的时间内测量电流的大小即可实现血糖浓度的监测。采用本发明提供的微针电极进行血糖监测时，无需采血，刺入皮肤时不必触及神经末梢富集区域，患者的痛感极小，可降低患者使用时的心理负担，在不引起意外感染的情况下实现对人体长时间的连续血糖监测，且普鲁士蓝电化学反应灵敏，能够保证监测结果的准确性。本发明解决了目前针对糖尿病血糖监测必须进行抽血化验造成工作繁琐的问题，只需将本发明提供的微针电极穿透皮肤角质层，即可长效迅速准确的测试组织液中的葡萄糖糖浓度，且微针电极尺寸小巧，便于携带，具备作为一种良好的安全便携无痛的血糖电化学传感器的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的血糖监测贴片的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极，包括：
金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；
复合在所述金微针表面的普鲁士蓝层；
和复合在所述普鲁士蓝层表面的壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层。
本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极包括金微针电极、普鲁士蓝层和壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层。其中，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针，优选包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的多根金微针，多根所述金微针在金微针电极基底上构成金微针阵列。在本发明提供的一个实施例中，所述金微针电极包括硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针，和复合在所述硅基微针表面的金层。其中，所述硅基微针优选包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的多根硅微针，多根所述硅微针在硅基微针基底上构成硅微针阵列。在本发明中，所述金层的厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、 80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、 170nm、180nm、190nm或200nm。在本发明中，所述金微针电极优选还包括设置在所述硅基微针表面与所述金层之间的粘附层；所述粘附层优选为铬层或钛层；所述粘附层的厚度优选为5～20nm，具体可为5nm、6nm、7nm、8nm、 9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、 19nm或20nm。
在本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极中，所述普鲁士蓝层复合在所述金微针电极的金微针表面。其中，所述普鲁士蓝层的厚度优选为 50～300nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、 120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200 nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、 290nm或300nm。
在本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极中，所述壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层复合在所述普鲁士蓝层的表面。其中，所述壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层的厚度优选为1～5μm，具体可为1μm、1.5μm、2μm、2.5 μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm。在本发明中，所述壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层由掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液在普鲁士蓝层表面沉积形成；所述壳聚糖溶液中葡萄糖氧化酶与壳聚糖的质量比优选为1：(0.5～2)，具体可为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、 1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2；所述沉积的方式优选为电沉积；所述电沉积的电压优选为-1～-3V，具体可为-1V、-1.5V、-2V、-2.5V或-3V；所述电沉积的时间优选为200～400s，具体可为200s、250s、300s、350s或400s。
在本发明中，所述用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极的微针高度优选为 200～400μm，具体可为200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250 μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330 μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm或400μm。
本发明还提供了一种上述所述用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极的制备方法，包括以下步骤：
a)提供金微针电极，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针；之后将所述金微针电极置于普鲁士蓝沉积液中，采用三电极恒电位法在金微针电极表面沉积普鲁士蓝，得到表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极；
b)将所述表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极置于掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液中，采用三电极恒电位法在普鲁士蓝层表面沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶，得到用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
在本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极制备方法中，首先提供金微针电极。其中，所述金微针电极包括金微针电极基底和底部固定在所述金微针电极基底上的若干根金微针。在本发明中，所述金微针电极优选按照以下步骤制备得到：
提供硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针；之后在所述硅基微针表面沉积金，得到金微针电极。
在本发明提供的上述金微针电极制备步骤中，首先提供硅基微针。其中，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针。在本发明中，所述硅基微针优选按照以下步骤制备得到：
硅片依次进行生长二氧化硅掩膜、光刻、干法刻蚀和湿法腐蚀，得到硅基微针。
在本发明提供的上述硅基微针制备步骤中，所述硅片的厚度优选为 0.5～2mm，具体可为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、 1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm；所述生长二氧化硅掩膜所采用的方法优选为等离子体增强化学的气相沉积法 (PECVD，Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)；所述生长的厚度优选为2～5μm，具体可为2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5 μm。
在本发明提供的上述硅基微针制备步骤中，所述光刻的具体步骤包括：对生长了二氧化硅掩膜的硅片进行反应离子刻蚀(RIE)；然后进行烘烤；之后依次在硅片上涂布增粘剂和光刻胶；接着依次进行曝光、显影和坚膜，得到图形化的光刻胶层。其中，所述反应离子刻蚀所用的气体为氧气；所述反应离子刻蚀的时间优选为2～5min，具体可为2min、2.5min、3min、3.5min、 4min、4.5min或5min；所述烘烤的温度优选为160～200℃，具体可为160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃或200℃；所述烘烤的时间优选为10～15min，具体可为10min、10.5min、11min、11.5min、12min、 12.5min、13min、13.5min、14min、14.5min或15min；所述光刻胶优选为 AZ4620光刻胶；所述曝光的时间优选为30～40s，具体可为30s、31s、32s、 33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s。
在本发明提供的上述硅基微针制备步骤中，所述干法刻蚀的具体步骤包括：首先利用反应离子刻蚀(RIE)去除图形化的硅片上的二氧化硅掩膜，然后将硅片放入感应耦合等离子刻蚀机(ICP)中进行深硅刻蚀。深硅刻蚀过程中，每循环的沉积时间优选为3～6s，具体可为4s，刻蚀时间优选为8～12s，具体可为10s。在本发明中，所述深硅刻蚀的高度优选为200～400μm，具体可为 200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、 280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、 360μm、370μm、380μm、390μm或400μm。
在本发明提供的上述硅基微针的制备步骤中，所述湿法腐蚀使用的腐蚀液优选为醋酸、硝酸和氢氟酸的混合液；所述湿法腐蚀的时间优选为2.5～3min，具体可为2.5min、2.6min、2.7min、2.8min、2.9min或3min。在本发明中，所述湿法腐蚀的目的是使微针的针头呈圆锥状。
在本发明提供的上述金微针电极制备步骤中，获得硅基微针后，在所述硅基微针表面沉积金。在本发明中，在沉积金之前，优选先在所述硅基微针表面沉积铬或钛，作为粘附层；所述铬或钛的沉积方式优选为在加偏压的条件下进行磁控溅射；所述铬或钛的沉积厚度优选为5～20nm，具体可为5nm、 6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、 17nm、18nm、19nm或20nm。在本发明中，所述金的沉积方式优选为磁控溅射；所述金的沉积厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、 80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、 170nm、180nm、190nm或200nm。金在硅基微针表面沉积结束后，得到金微针电极。
在本发明提供的普鲁士蓝微针电极制备方法中，获得金微针电极后，在所述金微针电极表面沉积普鲁士蓝。在本发明中，在沉积普鲁士蓝之前，优选先对所述金微针电极进行清洗和腐蚀。在本发明中，所述清洗的清洗剂优选为浓硫酸和过氧化氢的混合液；所述清洗的方式优选为将金微针电极浸泡在清洗剂中，所述浸泡的时间优选为2～8min，具体可为2min、3min、4min、 5min、6min、7min或8min。在本发明中，所述腐蚀的腐蚀剂优选为碘化钾溶液；所述腐蚀的方式优选为将金微针电极浸泡在腐蚀剂中，所述浸泡的时间优选为6～8s，具体可为6s、7s或8s。在本发明中，腐蚀的目的是使金微针电极的表面产生孔洞，从而更容易沉积普鲁士蓝。
在本发明提供的普鲁士蓝微针电极制备方法中，沉积普鲁士蓝的具体过程包括：将金微针电极置于普鲁士蓝沉积液中，采用三电极恒电位法在金微针电极表面沉积普鲁士蓝。其中，所述普鲁士蓝沉积液的成分包括氯化铁、铁氰化钾、盐酸、氯化钾和水；所述氯化铁在沉积液中的浓度优选为 2.5mmol/L，所述铁氰化钾在沉积液中的浓度优选为2.5mmol/L，所述盐酸在沉积液中的浓度优选为0.05mol/L，所述氯化钾在沉积液中的浓度优选为0.1mol/L，所述沉积液的pH值优选为2。在本发明中，沉积所述普鲁士蓝时所采用的辅助电极优选为铂圆盘电极，所采用的参比电极优选为银/氯化银电极；沉积所述普鲁士蓝时所采用的电压优选为0.2～0.6V，具体可为0.2V、0.3V、 0.4V、0.5V或0.6V；沉积时间优选为200～300s，具体可为200s、210s、220s、 230s、240s、250s、260s、270s、280s、290s或300s。在本发明中，普鲁士蓝沉积结束后，在金微针表面形成普鲁士蓝层，即得表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极。
在本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极制备方法中，得到表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极后，在所述表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极表面沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶。在本发明中，在沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶之前，优选先对所述表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极进行稳定化处理和活化处理。其中，所述稳定化处理的具体过程包括：将表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极放入盐酸和氯化钾的混合溶液中，采用循环伏安法 (CV)对其进行扫描，使其稳定；之后依次进行清水浸泡和干燥。在本发明中，所述混合溶液中盐酸的浓度优选为0.05～0.2mol/L，具体可为0.05mol/L、 0.1mol/L、0.15mol/L或0.2mol/L；所述混合溶液中氯化钾的浓度优选为0.05～0.2mol/L，具体可为0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L或0.2mol/L；所述扫描的电压优选在0.35～-0.05V之间；所述扫描的速率优选为0.03～0.07V/s，具体可为0.03V/s、0.04V/s、0.05V/s、0.06V/s或0.07V/s；所述扫描的循环次数优选为30～50次，具体可为30次、35次、40次、45次或50次；所述干燥的方式优选为烘干；所述干燥的温度优选为90～110℃，具体可为90℃、95℃、100℃、 105℃或110℃；所述干燥的时间优选为0.5～2h，具体可为0.5h、1h、1.5h或 2h。在本发明中，所述活化处理的具体过程包括：将经过稳定化处理的微针电极放入磷酸缓冲液中，先采用三电极恒电位法进行处理，再采用循环伏安法(CV)进行扫描。在本发明中，所述磷酸缓冲液的成分包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾和水；所述磷酸氢二钾在缓冲液中的浓度优选为 0.03～0.07mol/L，具体可为0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、 0.07mol/L；所述磷酸二氢钾在缓冲液中的浓度优选为0.03～0.07mol/L，具体可为0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L；所述氯化钾在缓冲液中的浓度优选为0.05～2mol/L，具体可为0.05mol/L、0.1mol/L、 0.15mol/L或2mol/L；所述三电极恒电位法的处理电压优选为-0.08～-0.03V，具体可为-0.08V、-0.07V、-0.06V、-0.05V、-0.04V或-0.03V；所述三电极恒电位法的处理时间优选为400～800s，具体可为400s、450s、500s、550s、600s、 650s、700s、750s或800s；所述扫描的电压优选在0.35～-0.05V之间；所述扫描的速率优选为0.03～0.07V/s，具体可为0.03V/s、0.04V/s、0.05V/s、0.06V/s 或0.07V/s；所述扫描的循环次数优选为10～30次，具体可为10次、15次、20 次、25次或30次。
在本发明提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极制备方法中，沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶的具体过程包括：将所述表面沉积有普鲁士蓝层的金微针电极置于掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液中，采用三电极恒电位法在普鲁士蓝层表面沉积壳聚糖和葡萄糖氧化酶。在本发明中，所述掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液的成分包括葡萄糖氧化酶、壳聚糖和水，优选还包括醋酸；所述葡萄糖氧化酶与壳聚糖的质量比优选为1：(0.5～2)，具体可为1:0.5、1:0.6、 1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、 1:1.9或1:2；所述壳聚糖和水的用量比优选为(0.1～1)g：100mL，具体可为 0.1g:100mL、0.2:100mL、0.3:100mL、0.4:100mL、0.5:100mL、0.6:100mL、0.7:100mL、0.8:100mL、0.9:100mL或1:100mL；所述醋酸优选占醋酸和水总质量的0.5～5wt％，具体可为0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、 3.5wt％、4wt％、4.5wt％或5wt％。在本发明中，沉积所述壳聚糖和葡萄糖氧化酶时所采用的辅助电极优选为铂圆盘电极，所采用的参比电极优选为银/氯化银电极；沉积所述壳聚糖和葡萄糖氧化酶时所采用的电压优选为-1～-3V，具体可为-1V、-1.5V、-2V、-2.5V或-3V；沉积时间优选为200～400s，具体可为200s、250s、300s、350s或400s。在本发明中，壳聚糖和葡萄糖氧化酶结束后，在微针电极的普鲁士蓝层表面形成壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶层，将微针电极从掺有葡萄糖氧化酶的壳聚糖溶液中取出，过水，干燥，即得用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
本发明提供的微针电极在进行血糖监测时，无需采血，刺入皮肤时不必触及神经末梢富集区域，患者的痛感极小，可降低患者使用时的心理负担，在不引起意外感染的情况下实现对人体长时间的连续血糖监测，且普鲁士蓝电化学反应灵敏，能够保证监测结果的准确性。本发明解决了目前针对糖尿病血糖监测必须进行抽血化验造成工作繁琐的问题，只需将本发明提供的微针电极穿透皮肤角质层，即可长效迅速准确的测试组织液中的葡萄糖糖浓度，且微针电极尺寸小巧，便于携带，具备作为一种良好的安全便携无痛的血糖电化学传感器的潜力。
本发明还提供了一种血糖监测贴片，包括：
柔性衬底；
键合在所述柔性衬底上的工作电极、辅助电极和参比电极；
所述工作电极为上述技术方案所述的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
参见图1，图1是本发明实施例提供的血糖监测贴片的结构示意图。图1中， 1表示柔性衬底，2表示工作电极，3表示辅助电极，4表示参比电极。
本发明提供的血糖监测贴片包括柔性衬底1、工作电极2、辅助电极3和参比电极4。其中，柔性衬底1的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)；柔性衬底1的厚度优选为1～5mm，具体可为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3 mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。
在本发明提供的血糖监测贴片中，工作电极2、辅助电极3和参比电极4键合在所述柔性衬底上。其中，工作电极1为上述技术方案提供的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极，在此不再赘述。
在本发明提供的血糖监测贴片中，辅助电极3优选为铂微针电极；所述铂微针电极优选包括铂微针电极基底和底部固定在所述铂微针电极基底上的若干根铂微针，更优选包括铂微针电极基底和底部固定在所述铂微针电极基底上的多根铂微针，多根所述铂微针在铂微针电极基底上构成铂微针阵列。在本发明提供的一个实施例中，所述铂微针电极包括硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针，和复合在所述硅基微针表面的铂层。其中，所述硅基微针优选包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的多根硅微针，多根所述硅微针在硅基微针基底上构成硅微针阵列。在本发明中，所述铂层的厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、 130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm。在本发明中，所述铂微针电极优选还包括设置在所述硅基微针表面与所述铂层之间的粘附层；所述粘附层优选为铬层或钛层；所述粘附层的厚度优选为 5～20nm，具体可为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、 13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm。
在本发明提供的血糖监测贴片中，参比电极4优选为银/氯化银微针电极；所述银/氯化银微针电极优选包括银/氯化银微针电极基底和底部固定在所述铂微针电极基底上的若干根银/氯化银微针，更优选包括银/氯化银微针电极基底和底部固定在所述银/氯化银微针电极基底上的多根银/氯化银微针，多根所述银/氯化银微针在银/氯化银微针电极基底上构成银/氯化银微针阵列。在本发明提供的一个实施例中，所述银/氯化银微针电极包括硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的若干根硅微针，和复合在所述硅基微针表面的银/氯化银层。其中，所述硅基微针优选包括硅基微针基底和底部固定在所述硅基微针基底上的多根硅微针，多根所述硅微针在硅基微针基底上构成硅微针阵列。在本发明中，所述银/氯化银层的厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、 110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190 nm或200nm。在本发明中，所述银/氯化银微针电极优选还包括设置在所述硅基微针表面与所述银/氯化银层之间的粘附层；所述粘附层优选为铬层或钛层；所述粘附层的厚度优选为5～20nm，具体可为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、 10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm 或20nm。
本发明还提供了一种上述所述血糖监测贴片的制备方法，包括以下步骤：
对柔性衬底进行等离子体表面处理，之后将工作电极、辅助电极和参比电极键合到处理后的柔性衬底上，得到血糖监测贴片；
所述工作电极为上述技术方案所述的用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。
在本发明提供的血糖监测贴片制备方法中，首先提供柔性衬底、工作电极、辅助电极和参比电极。其中，所述柔性衬底优选为PDMS衬底；所述PDMS 衬底优选由PDMS烘烤固化制成，所述烘烤的温度优选为70～90℃，具体可为70℃、75℃、80℃、85℃或90℃，所述烘烤固化的时间优选为30～60min，具体可为30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
在本发明提供的血糖监测贴片制备方法中，所述辅助电极优选为铂微针电极，本发明对所述铂微针电极的来源没有特别限定，优选按照以下步骤制备得到：
在硅基微针表面沉积铂，得到铂微针电极。
在本发明提供的上述铂微针电极制备步骤中，首先提供硅基微针。其中，所述硅基微针优选采用上文制备金微针电极时所采用的硅基微针，在此不再赘述。在本发明中，在沉积铂之前，优选先在所述硅基微针表面沉积铬或钛，作为粘附层；所述铬或钛的沉积方式优选为在加偏压的条件下进行磁控溅射；所述铬或钛的沉积厚度优选为5～20nm，具体可为5nm、6nm、7nm、8nm、9 nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、 19nm或20nm。在本发明中，所述铂的沉积方式优选为磁控溅射；所述铂的沉积厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、 100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180 nm、190nm或200nm。铂在硅基微针表面沉积结束后，得到铂微针电极。
在本发明提供的血糖监测贴片制备方法中，所述参比电极优选为银/氯化银微针电极，本发明对所述银/氯化银微针电极的来源没有特别限定，优选按照以下步骤制备得到：
在硅基微针表面沉积银，得到银微针电极；之后将所述银微针电极浸泡在氯化物溶液中使银微针电极上的部分银转变成氯化银，得到银/氯化银微针电极。
在本发明提供的上述银/氯化银微针电极制备步骤中，首先提供硅基微针。其中，所述硅基微针优选采用上文制备金微针电极时所采用的硅基微针，在此不再赘述。在本发明中，在沉积银之前，优选先在所述硅基微针表面沉积铬或钛，作为粘附层；所述铬或钛的沉积方式优选为在加偏压的条件下进行磁控溅射；所述铬或钛的沉积厚度优选为5～20nm，具体可为5nm、6nm、7nm、 8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、 18nm、19nm或20nm。在本发明中，所述银的沉积方式优选为磁控溅射；所述银的沉积厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、 90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、 180nm、190nm或200nm。银在硅基微针表面沉积结束后，得到银微针电极。
在本发明提供的上述银/氯化银微针电极制备步骤中，得到银微针电极后，将所述银微针电极浸泡在氯化物溶液中。其中，所述氯化物溶液优选为氯化钾溶液；所述氯化物溶液的浓度优选为0.2～0.6mol/L，具体可为0.2mol/L、0.25 mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.45mol/L、0.5mol/L、0.55mol/L 或0.6mol/L；所述浸泡的时间优选为1～3h，具体可为1h、1.5h、2h、2.5h或 3h；所述浸泡的温度优选为15～35℃，具体可为15℃、20℃、25℃(室温)、 30℃或35℃。浸泡过程中，银微针电极上的部分银与氯化物溶液进行反应变成氯化银，浸泡结束后，得到银/氯化银微针电极。
在本发明提供的血糖监测贴片制备方法中，获得柔性衬底、铂微针电极、银/氯化银微针电极和所述用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极后，对所述柔性衬底进行等离子体表面处理，所述处理的时间优选为10～30s，具体可为10s、15s、20s、25s或30s。处理结束后，将处理后的柔性衬底快速与铂微针电极、银/氯化银微针电极和所述用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极进行键合，得到血糖监测贴片。
本发明提供的血糖监测贴片衬底为柔性材质，其上键合有所述用于血糖监测的普鲁士蓝微针电极。采用本发明提供的血糖监测贴片进行血糖监测时，无需采血，血糖监测贴片上的微针电极刺入皮肤时不必触及神经末梢富集区域，患者的痛感极小，可降低患者使用时的心理负担，在不引起意外感染的情况下实现对人体长时间的连续血糖监测，且普鲁士蓝电化学反应灵敏，能够保证监测结果的准确性。本发明解决了目前针对糖尿病血糖监测必须进行抽血化验造成工作繁琐的问题，只需将本发明提供的血糖监测贴片贴在皮肤表层，并时血糖监测贴片上的微针电极穿透皮肤角质层，即可长效迅速准确的测试组织液中的葡萄糖糖浓度，且血糖监测贴片尺寸小巧，贴合皮肤，便于携带，具备作为一种良好的安全便携无痛的血糖电化学传感器的潜力。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种如图1所示结构的血糖监测贴片，包括：柔性衬底1、工作电极2、辅助电极3和参比电极4。其中，柔性衬底1为PDMS软衬底，厚度为3mm；工作电极2为壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极；辅助电极3为铂微针阵列电极；参比电极4为银/氯化银微针阵列电极。
下面描述一下本实施例所提供的血糖监测贴片的制作方法，具体步骤如下：
首先通过PECVD在1mm厚的本征硅片上生长4μm二氧化硅掩膜，之后使用RIE对硅片进行2～5min的氧气刻蚀表面处理，取出后放于热板上以180℃烘烤10～15min，这是为后续的匀胶光刻做准备。待硅片散热后先将增粘剂旋涂在硅片表面，之后再继续旋涂光刻胶AZ4620，使用紫外光刻机对其曝光35s，显影、坚膜后完成光刻图形化。利用RIE干法刻蚀去除二氧化硅掩膜层后将硅片放入ICP，以每循环沉积时间4s，刻蚀时间10s完成对硅片表面300μm高度的深硅刻蚀。为了达到微针针头呈圆锥状的目的，配置湿法腐蚀溶液将硅片放入2.5～3min，取出过水清洗。湿法腐蚀溶液的配置方式为：先加入醋酸(浓度99.5wt％)20mL，再加入硝酸(浓度85wt％)77mL，最后加入氢氟酸(浓度40wt％)15mL，静置10min。腐蚀处理结束后，得到硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底(即硅片上未被深硅刻蚀的区域)和底部与所述硅基微针基底一体化连接的多根硅微针，多根所述硅微针在硅基微针基底上构成硅微针阵列。
硅基微针制作完成后，开始制作不同电极相应金属层，先使用磁控溅射在加偏压的条件下在所有硅基微针上镀一层钛作为粘附层，厚度为10nm，再分别对其镀上相应的金属银、铂、金，厚度均为100nm，分别得到银微针阵列电极、铂微针阵列电极、金微针阵列电极。然后，将银微针阵列电极在0.4mol/L 氯化钾溶液中浸泡2小时，使其中一部分转变成氯化银，形成银/氯化银微针阵列电极。
之后，进行金微针阵列电极的表面清洗、腐蚀、电化学修饰稳定普鲁士蓝。将金微针阵列电极放入浓硫酸与过氧化氢以体积3:1配置的溶液中浸泡约 4min以清洗杂质，再将金微针阵列电极放入碘化钾溶液中竖直浸泡6～8s，使金表面产生孔洞更容易沉积普鲁士蓝。
将金微针阵列电极放在普鲁士蓝沉积液中，以三电极恒电位法在+0.4V下沉积240s，使生成的普鲁士蓝完全包覆微针，普鲁士蓝的沉积厚度约140nm。其中，辅助电极为铂圆盘电极，参比电极为银/氯化银电极。普鲁士蓝沉积液的组成为2.5mmol/L氯化铁、2.5mmol/L铁氰化钾、0.05mol/L盐酸以及0.1mol/L 氯化钾，pH值为2.0。
为了使新镀上的普鲁士蓝保持稳定状态，将镀完普鲁士蓝的金微针阵列电极放入0.1mol/L盐酸与0.1mol/L氯化钾混合溶液中以循环伏安法在0.35V至 -0.05V之间以0.05V/s的速率扫描40个循环使其稳定。用纯水浸泡后取出，在 100℃下烘烤1h。
接下来将完成稳定处理的微针阵列电极放入磷酸缓冲液先以三电极恒电位法在-0.05V条件下反应600s，再用循环伏安法在-0.05V至0.35V范围内以 0.05V/s的速率扫描20个循环以进行电极的活化。磷酸缓冲液的组成为： 0.05mol/L磷酸氢二钾、0.05mol/L磷酸二氢钾与0.1mol/L氯化钾。至此，完成普鲁士蓝-金微针阵列电极的制作。
为了达到测量组织液中葡萄糖含量的目的，在普鲁士蓝-金微针阵列电极上继续电沉积掺葡萄糖氧化酶壳聚糖。将制得普鲁士蓝-金微针阵列电极插入壳聚糖掺葡萄糖氧化酶溶液，采用三电极恒电位法在-2.0V条件下沉积300s，使壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶完全包覆微针，壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶的沉积厚度约3μm。其中，壳聚糖掺葡萄糖氧化酶溶液制作方式为：0.5g壳聚糖粉末加入到100mL 2wt％的醋酸溶液中，取其中5mL加入25mg葡萄糖氧化酶搅拌溶解。沉积结束后，将电极取出过水，置于空气中晾干，得到壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极。
最后，将之前制作的铂微针阵列电极、银/氯化银微针阵列电极和壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极一起集成在PDMS衬底上，具体方式为：将搅拌好的PDMS在85℃下烘烤40min以固化，之后再将其放入等离子体清洗机处理20s，取出后快速与三种微针阵列电极的背面对准键合，完成血糖监测贴片的制作。
实施例2
血糖监测贴片的性能测试
1)仪器与试剂信息：
CHI660电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；
85-2恒温磁力搅拌器(金坛市城东新满仪器厂)；
S2Pipette单道可调式移液器(国药集团化学试剂有限公司)；
磷酸缓冲液：0.05mol/LKH2PO4+0.05mol/LK2HPO4+0.1mol/LKCl；
葡萄糖溶液：0.5mol/L；
所有试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司；
实验用水均为去离子水。
2)实验过程：
首先将铜丝用银胶与实施例1制备的血糖监测贴片上的壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极、铂微针阵列电极和银/氯化银微针阵列电极结合，待其凝固，将交界处用绝缘胶带覆盖包裹。同时在烧杯中倒入 200mL磷酸缓冲液，将贴片固定在特制绝缘夹具上放入溶液，恰好使微针阵列电极的针尖没入水面，将铜线分别与电化学工作站对应三端夹具相结合，使用三电极恒电位法以-0.05v，60s的条件读取最终稳定电流值，测得基底电流后，用移液枪取1μL及以上的葡萄糖溶液加入烧杯，继续以三电极恒电位法在-0.05v，60s的条件下读取最终电流，之后重复上一步，向烧杯内添加相同量葡萄糖溶液，得到不同葡萄糖浓度下电流值。整个实验过程都在均匀磁力搅拌中进行，实验温度恒定为17℃。
3)实验结果：
血糖监测贴片在0.01～6.25mmol/L的葡萄糖浓度范围内对电流有线性响应，检测下限为0.0025mmol/L，检测上限为15mmol/L；在17℃干燥空气中放置一星期，响应电流依然可以维持在初始值的80％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种血糖监测贴片，包括：柔性衬底和键合在所述柔性衬底上的工作电极、辅助电极和参比电极；其中，所述柔性衬底为PDMS软衬底，厚度为3mm；所述工作电极为壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极；所述辅助电极为铂微针阵列电极；所述参比电极为银/氯化银微针阵列电极；
所述血糖监测贴片按照以下步骤制备得到：
首先通过PECVD在1mm厚的本征硅片上生长4μm二氧化硅掩膜，之后使用RIE对硅片进行2～5min的氧气刻蚀表面处理，取出后放于热板上以180℃烘烤10～15min；待硅片散热后先将增粘剂旋涂在硅片表面，之后再继续旋涂光刻胶AZ4620，使用紫外光刻机对其曝光35s，显影、坚膜后完成光刻图形化；利用RIE干法刻蚀去除二氧化硅掩膜层后将硅片放入ICP，以每循环沉积时间4s，刻蚀时间10s完成对硅片表面300μm高度的深硅刻蚀；为了达到微针针头呈圆锥状的目的，配置湿法腐蚀溶液将硅片放入2.5～3min，取出过水清洗；湿法腐蚀溶液的配置方式为：先加入浓度99.5wt％的醋酸20mL，再加入浓度85wt％的硝酸77mL，最后加入浓度40wt％的氢氟酸15mL，静置10min；腐蚀处理结束后，得到硅基微针，所述硅基微针包括硅基微针基底和底部与所述硅基微针基底一体化连接的多根硅微针，多根所述硅微针在硅基微针基底上构成硅微针阵列；
硅基微针制作完成后，开始制作不同电极相应金属层，先使用磁控溅射在加偏压的条件下在所有硅基微针上镀一层钛作为粘附层，厚度为10nm，再分别对其镀上相应的金属银、铂、金，厚度均为100nm，分别得到银微针阵列电极、铂微针阵列电极、金微针阵列电极；然后，将银微针阵列电极在0.4mol/L氯化钾溶液中浸泡2小时，使其中一部分转变成氯化银，形成银/氯化银微针阵列电极；
之后，进行金微针阵列电极的表面清洗、腐蚀、电化学修饰稳定普鲁士蓝；将金微针阵列电极放入浓硫酸与过氧化氢以体积3:1配置的溶液中浸泡约4min以清洗杂质，再将金微针阵列电极放入碘化钾溶液中竖直浸泡6～8s，使金表面产生孔洞更容易沉积普鲁士蓝；
将金微针阵列电极放在普鲁士蓝沉积液中，以三电极恒电位法在+0.4V下沉积240s，使生成的普鲁士蓝完全包覆微针，普鲁士蓝的沉积厚度约140nm；其中，辅助电极为铂圆盘电极，参比电极为银/氯化银电极；普鲁士蓝沉积液的组成为2.5mmol/L氯化铁、2.5mmol/L铁氰化钾、0.05mol/L盐酸以及0.1mol/L氯化钾，pH值为2.0；
将镀完普鲁士蓝的金微针阵列电极放入0.1mol/L盐酸与0.1mol/L氯化钾混合溶液中以循环伏安法在0.35V至-0.05V之间以0.05V/s的速率扫描40个循环使其稳定；用纯水浸泡后取出，在100℃下烘烤1h；
接下来将完成稳定处理的微针阵列电极放入磷酸缓冲液先以三电极恒电位法在-0.05V条件下反应600s，再用循环伏安法在-0.05V至0.35V范围内以0.05V/s的速率扫描20个循环以进行电极的活化；磷酸缓冲液的组成为：0.05mol/L磷酸氢二钾、0.05mol/L磷酸二氢钾与0.1mol/L氯化钾；至此，完成普鲁士蓝-金微针阵列电极的制作；
将制得普鲁士蓝-金微针阵列电极插入壳聚糖掺葡萄糖氧化酶溶液，采用三电极恒电位法在-2.0V条件下沉积300s，使壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶完全包覆微针，壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶的沉积厚度约3μm；其中，壳聚糖掺葡萄糖氧化酶溶液制作方式为：0.5g壳聚糖粉末加入到100mL 2wt％的醋酸溶液中，取其中5mL加入25mg葡萄糖氧化酶搅拌溶解；沉积结束后，将电极取出过水，置于空气中晾干，得到壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极；
最后，将之前制作的铂微针阵列电极、银/氯化银微针阵列电极和壳聚糖固定化葡萄糖氧化酶-普鲁士蓝-金微针阵列电极一起集成在PDMS衬底上，具体方式为：将搅拌好的PDMS在85℃下烘烤40min以固化，之后再将其放入等离子体清洗机处理20s，取出后快速与三种微针阵列电极的背面对准键合，完成血糖监测贴片的制作。
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