CN110551787A

CN110551787A - 一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺

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Publication number: CN110551787A
Application number: CN201810548549.2A
Authority: CN
Inventors: 伏广好; 田永红; 高启超; 徐亚娟; 李文全; 高雷; 王斌; 刘超
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-12-10

Abstract

本发明属于黄原胶发酵生产技术领域，公开了一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺，其包括如下步骤：1）酶解豆粕蛋白，2）发酵制备黄原胶。本发明采用高品质的豆粕酶解液作为氮源，能够促进微生物生长，较采用牛肉膏的对比例相比，发酵液中的黄原胶产量提高，并且节约了成本。

Description

一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺

技术领域

本发明属于黄原胶发酵技术领域，涉及一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺。

背景技术

黄原胶(xanthan gum)是20世纪50年代美国农业部的北方研究室从野油菜黄单孢菌NRRLB21459发现了分泌的中性水溶性多糖，又称为汉生胶。它是由葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸以218∶2∶2的摩尔比组成的一种微生物胞外杂多糖，其“五糖重复单元”主链由2个D-葡萄糖分子经β-1，4糖苷键连接而成，具有类似纤维素的骨架结构，每2个葡萄糖中的一个碳键上连接有一个由2个甘聚糖和1个葡萄糖醛酸组成的三糖侧链。黄原胶独特的分子结构赋予了它众多卓越的理化性能，如良好的增稠性、触变性、乳化性、假塑性等。它还有一个重要的特性是能够与其他多聚糖产生交互作用导致黏度增加，同时，还是一种经反复确认的无毒安全的绿色物质，因此成为食品工业中广泛使用的一种细菌多糖和目前国际上性能最优越的生物胶之一。自20世纪60年代初美国Kelco公司投入工业化生产以来，黄原胶产品在食品、轻工、医药、纺织、化妆品、石油开采和消防等领域得到了非常广泛的应用。

目前，黄原胶的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产黄原胶的主流方法，但在微生物发酵液提取过程中，存在成本高的缺陷。申请人之前的专利技术“CN103074408A，一种速溶黄原胶的生产方法”公开了一种采用黄单胞菌发酵制备黄原胶的方法，其中种子罐培养基：葡萄糖2.5％、牛肉膏3％、K2HPO4·3H2O0.2％、Na2HPO40.2％、生物素0.5％、 MgSO4·7H2O0.2％、尿素0.025％，115℃灭菌15min；发酵罐培养基组分：葡萄糖10％、玉米浆0.5％、牛肉膏3％、MgSO4·7H2O0.2％、K2HPO4·3H2O 0.2％、 FeSO4 0.0001％、VB1 0.00001％，pH7.0～7.2。上述培养过程中，采用主要采样牛肉膏作为氮源，成本较高，也有其他研究中选用酵母膏等作为氮源，同样存在成本高的缺陷。

豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是重要的植物性蛋白来源，蛋白含量丰富，而且价格相对较低。现有技术大多是采用酶解的方式处理豆粕用于饲料或短肽生产中，也有部分研究通过菌株发酵豆粕来提高饲用品质，但是极少研究利用菌株对豆粕进行发酵酶解的产物来作为发酵制备氨基酸培养基组分。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中黄原胶发酵成本较高的缺陷，提供了一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺，其包括如下步骤：1）酶解豆粕蛋白，2）发酵制备黄原胶。

具体地，所述工艺包括如下步骤：

1）酶解豆粕蛋白：将豆粕和水按照1:1的质量比混合，121℃蒸汽处理10min，然后自然冷却至室温，得到豆粕培养液；将地衣芽孢杆菌种子液、产黄纤维单胞菌种子液、黑曲霉种子液以及米曲霉种子液按照2:2:1:1的体积比混合，得到混合种子液；然后将混合种子液按照10%的接种量接入到含有豆粕培养液的发酵罐中进行发酵产酶，温度为35℃，罐压为0.03MPa，风量为500L/h，发酵产酶时间为60h，超声处理，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到豆粕酶解液；

2）发酵制备黄原胶：将产黄原胶的菌液按照5％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为30℃，pH值7.2的条件下，培养15小时得到种子培养液，按照2％的接种比例转入发酵罐中培养，温度30℃，pH值7.2，培养时间70小时，得到黄原胶发酵液。

进一步地，所述种子罐培养基和发酵罐培养基中均含有豆粕酶解液。

进一步地，所述种子罐培养基为：葡萄糖2.5％、豆粕蛋白酶解液9％、K₂HPO₄·3H₂O0.2％、Na₂HPO₄0.2％、生物素0.5%、MgSO₄·7H₂O 0.2％、尿素0.025％，115℃灭菌15min。上述比例均为质量百分比。

进一步地，所述发酵罐培养基为：葡萄糖10％、玉米浆0.5％、豆粕蛋白酶解液9％、MgSO₄·7H₂O 0.2％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、FeSO₄ 0.0001％、VB₁ 0.00001％，pH 7.0-7.2。上述比例均为质量百分比。

进一步地，所述超声处理的条件为：超声频率为25kHz，超声时间为30min。

作为本发明的另一发明点，本发明还要求保护按照上述工艺制备的黄原胶。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

米曲霉和黑曲霉在单独制曲及混合培养条件下,能够产生中性蛋白酶、酸性蛋白酶、糖化酶；产黄纤维单胞菌能够产生纤维素酶，将豆粕中的纤维组分进行酶解得到还原糖；地衣芽孢杆菌产生α-淀粉酶和蛋白酶；豆粕中的碳水化合物可以在淀粉酶和糖化酶的作用下，酶解得到糖组分；豆粕中的部分蛋白和纤维交织在一起，普通的蛋白酶难以将蛋白完全与纤维分离，本发明采用产黄纤维单胞菌产生纤维素酶对纤维组分进行酶解，与其他酶协同作用，既可以得到还原糖，还可以将蛋白从纤维中分离出去，提高了蛋白的酶解效果；本发明利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温，对菌体细胞进行冲击，导致菌体细胞变形和破裂，有助于菌体蛋白利用；本发明采用四种菌株酶解豆粕，混合培养中各菌株互不拮抗，相互协同共生，因而使得混合培养体系处于一个平衡状态；本发明的酶解产物以豆粕为主要原料获得酶解液，可以替代培养基中价格较高的酵母膏组分，营养丰富，价格低廉，降低了企业成本。

本发明采用3倍左右的酶解液来替代牛肉膏，蛋白含量接近，但是成本仅为酵母膏的30％左右（按照普通工业发酵用牛肉膏25元/kg、豆粕3元/kg进行计算，微生物培养的其他成本核算为2元/kg豆粕，1kg豆粕产生2倍左右的酶解液）。

本发明采用上述工艺制备出高品质的氮源，能够促进微生物生长，较采用牛肉膏的对比例相比，发酵液中的黄原胶产量提高了16％左右。

附图说明

图1：不同菌株配伍对豆粕蛋白水解度的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺，其包括如下步骤：

1）酶解豆粕蛋白：将豆粕和水按照1:1的质量比混合，121℃蒸汽处理10min，然后自然冷却至室温，得到豆粕培养液；将地衣芽孢杆菌种子液、产黄纤维单胞菌种子液、黑曲霉种子液以及米曲霉种子液按照2:2:1:1的体积比混合，得到混合种子液；然后将混合种子液按照10%的接种量接入到含有豆粕培养液的发酵罐中进行发酵产酶，温度为35℃，罐压为0.03MPa，风量为500L/h，发酵产酶时间为60h，超声处理，超声频率为25kHz，超声时间为30min，每次破停（破壁、停止）时间均为4s，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到豆粕酶解液。

所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得地衣芽孢杆菌种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，七水硫酸镁2g/L；

所述产黄纤维单胞菌种子液的制备方法为：将产黄纤维单胞菌接种到斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得产黄纤维单胞菌种子液；所述斜面培养基组分为：酵母膏60g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉30g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸镁0.05g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；

所述黑曲霉种子液的制备方法为：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯200g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉60g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L；

所述米曲霉种子液的制备方法为：将米曲霉划线接种在PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行培养，得到米曲霉种子液；

2）发酵制备黄原胶：野油菜黄单胞菌ATCC19046和黄单胞菌CGMCCNO:3624、黄单孢菌ATCC 17915以及东方伊萨酵母CCTCC M2010167，四种菌液体积比为5:3:2:2混合，菌液中菌体的浓度均为1×10⁸CFU/mL，按照5％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为30℃，PH值7.2的条件下，培养15小时得到种子培养液，按照2％（种子培养液：发酵液体积比2％）的接种比例转入发酵罐中培养，温度30℃，pH值7.2，培养时间70小时，得到发酵液；黄原胶产量为4.86g/100mL。

其中种子罐培养基：葡萄糖2.5％、豆粕蛋白酶解液9％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、Na₂HPO₄0.2％、生物素0.5%、MgSO₄·7H₂O 0.2％、尿素0.025％，115℃灭菌15min；

发酵罐培养基组分：葡萄糖10％、玉米浆0.5％、豆粕蛋白酶解液9％、MgSO₄·7H₂O0.2％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、FeSO₄ 0.0001％、VB₁ 0.00001％，pH 7.0－7.2。

对比例1

参照“CN103074408A，一种速溶黄原胶的生产方法”。

实施例2

各种大豆种类产生的豆粕组分相差并不大，本发明选择带皮豆粕，各主要组分含量为：蛋白质45%，灰分7％，纤维20％，水分10％，脂肪2%，碳水化合物14％，其它为无机矿物质。

主要指标检测方法：凯氏定氮法测定总蛋白；SDS-PAGE对蛋白分子量进行区分测定；还原糖含量的测定：直接滴定法，参照GB/T5009.7-2008；常规HPLC检测游离氨基酸、寡肽以及多肽含量；蛋白水解度测定方法采用茚三酮显色法测定水解度。

设置组别验证各菌株的配伍效果，其中，对照组1为地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌和米曲霉三种菌配伍，其余同实施例1；对照组2为地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌和黑曲霉，其余同实施例1；对照组3为地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉，其余同实施例1；对照组4为产黄纤维单胞菌、米曲霉和黑曲霉，其余同实施例1。

1.豆粕酶解液的蛋白组分测定，具体结果见表1：

表1

指标	低分子蛋白比例（10KD以下）%	中分子蛋白比例（10-60KD）%	高分子蛋白比例（大于60KD）%
				实施例1	94.7	3.2	2.1
对照组1	88.1	5.3	6.6
				对照组2	86.2	7.9	5.9
对照组3	90.3	4.6	5.1
				对照组4	82.6	9.1	8.3

2.豆粕酶解液的游离氨基酸、寡肽（2-9个氨基酸）、多肽（10-50个氨基酸）以及还原糖组分测定结果，具体见表2：

表2

指标	游离氨基酸g/L	寡肽g/L	多肽g/L	还原糖g/L
					实施例1	1.7	4.6	8.4	7.6
对照组1	0.6	4.3	6.6	5.7
					对照组2	0.8	2.9	5.0	4.6
对照组3	1.3	4.1	6.8	2.9
					对照组4	0.9	3.5	4.1	6.1

如表1和表2所示，本发明采用四种菌合理配伍，相互促进产酶，能够充分降解豆粕蛋白，酶解液中游离氨基酸、寡肽（2-9个氨基酸）、多肽（10-50个氨基酸）以及还原糖组分均高于仅采用三种菌株的对照组1-4，总蛋白含量测定中，低分子量蛋白也明显高于对照组1-4；豆粕蛋白水解度（蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质的总肽键数之比）达到47%（如图1所示）。上述结果说明本发明对豆粕蛋白的酶解效果更充分彻底，游离氨基酸、短肽以及还原糖比例更高，可用于替代培养基中的氮源以及部分碳源。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种用酶解蛋白优化黄原胶菌发酵的工艺，其包括如下步骤：1）酶解豆粕蛋白，2）发酵制备黄原胶。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述种子罐培养基和发酵罐培养基中均含有豆粕酶解液。

4.根据权利要求2或3所述的工艺，其特征在于，所述种子罐培养基为：葡萄糖2.5％、豆粕蛋白酶解液9％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、Na₂HPO₄0.2％、生物素0.5%、MgSO₄·7H₂O 0.2％、尿素0.025％，115℃灭菌15min。

5.根据权利要求2或3所述的工艺，其特征在于，所述发酵罐培养基为：葡萄糖10％、玉米浆0.5％、豆粕蛋白酶解液9％、MgSO₄·7H₂O 0.2％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、FeSO₄0.0001％、VB₁ 0.00001％，pH 7.0-7.2。

6.根据权利要求2或3所述的工艺，其特征在于，所述超声处理的条件为：超声频率为25kHz，超声时间为30min。

7.按照权利要求1－6所述工艺制备的黄原胶。