CN110551780A - 一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：(1)称取壳聚糖配置成一定浓度的壳聚糖溶液，加入活化后的降解酶进行酶解反应，得到初级壳聚糖降解液；(2)向初级壳聚糖降解液中加入过氧化氢溶液，进行氧化降解反应，得到含壳寡糖的降解液；(3)将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到壳寡糖。以壳聚糖为原料，采用酶解和氧化降解耦合技术，实现了壳寡糖的便捷、高效、经济及清洁制备，具有工艺简单、反应条件温和、产率高及过程清洁等显著特点，是一种具有工业化应用前景的壳寡糖制备技术。
Description
技术领域
本发明涉及天然高分子降解及精细转化领域，具体涉及一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法。
背景技术
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基作用后的衍生物，在自然界中的产量仅次于纤维素(文献：Rojas G，Silva J，Flores JA，et al.Adsorption of chromium onto cross-linkedchitosan[J].Separation and Purification Technology，2005，44(1)：31-36.)，是至今发现的唯一的天然碱性氨基多糖，其脱乙酰后游离的氨基基团带有正电荷，使壳聚糖呈现独特的特性和多种生理活性，但由于壳聚糖的分子量较大，不溶于水等一些普通的溶剂，大大限制了其应用。壳寡糖，是壳聚糖降解而得到的高端衍生物，是多糖中唯一带正电荷的小分子物质，并具有稳定的三维结构，特殊的生理活性。与壳聚糖相比，壳寡糖具有相对分子质量小、水溶性好、生物活性高、易于吸收和应用范围广等优点。在医药、保健品、化妆品、农药、功能材料等方面展现出广阔的应用前景，被称为生命的“第六要素”(文献：邓培昌，胡杰珍，侯庆华，黄来珍.壳寡糖制备方法研究进展[J].广州化工，2012，40(6)：22-24)，因此，壳聚糖的降解制备壳寡糖获得了领域的广泛重视。
目前，壳聚糖制备壳寡糖的主要方法有：酸催化降解法、物理降解法、酶降解法和氧化降解法。酸降解法是壳聚糖分子中利用存在众多的游离氨基与溶液中氢离子结合，引起壳聚糖分子间与分子内部的氢键断裂，使得分子结构舒展，长链部分发生断裂，最终得到低分子量的壳聚糖(文献：刘燕，电化学降解壳聚糖的研究[硕士论文]，南京理工大学，2010)。酸降解法所用助剂价格低廉，但使用强酸，避免不了地造成环境污染和设备腐蚀等问题，且壳寡糖的产率相对较低，过程的环保性和绿色性不佳。物理降解法需采用专门的设备，降解产物的分子量较高，产率不佳，目前还处于实验室研究阶段。酶降解法通过专一性或非专一性酶作用于壳聚糖，选择性地切断聚多糖分子中的糖苷键(文献：蔡泉源，壳聚糖及透明质酸的电化学降解研究[D]，南京理工大学，2011)，从而制得低分子量的壳聚糖，具有反应条件温和、污染小等优点，是目前公认的比较理想的壳寡糖的绿色制备方法，但由于酶的反应周期较长，对外界环境敏感，酶的成本高及不能重复使用等因素制约其产业化应用进程。目前报道使用的酶包括专一性水解酶如壳聚糖酶，非专一性水解酶如脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶、元酶、聚糖酶，采用高效廉价的酶是此方法工业应用的关键。氧化降解法多采用过氧化氢作为氧化剂，过氧化氢降解在碱性、中性和酸性条件下都可进行。具有工艺过程简单降解速度快等特点，但由于氧化剂用量大，存在由于产品过度氧化使产品质量变差的问题。林强等人用纤维素酶与过氧化氢联合的进行壳聚糖的降解，反应的最佳反应条件为：pH为5.6、酶/糖为0.1、反应温度为54℃、反应时间为6h，在反应结束前0.5h加入一定量过氧化氢进行氧化降解可以得到平均分子量为1500的低聚壳聚糖(文献：林强，马可力.纤维素酶-过氧化氢降解法制备低聚壳聚糖的研究[J].海洋科学，2003.27(6)：7.)，其反应时间相对较长，纤维素酶的价格相对较高，并且没有给出产物的收率数据，无法评价其先进性。
发明内容
针对现有技术中壳寡糖制备方法中的不足，本发明提供了一种廉价酶解与氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，并通过工艺优化及降解用溶液的重复使用，实现了壳寡糖的便捷、高效、经济及清洁制备，为降解壳聚糖制备壳寡糖提供了新的路线。
为实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
本发明提供了一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取原料壳聚糖配制成一定浓度的壳聚糖溶液，加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，再按比例加入活化后的降解酶，然后在45-65℃温度下进行酶解反应，反应0.5-4h，得到初级壳聚糖降解液；
(2)再向初级壳聚糖降解液中加入一定体积的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为60-100℃，反应时间为10-50min，得到含壳寡糖的降解液；
(3)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
优选地，原料壳聚糖的脱乙酰度大于90％，粘均分子量为4×104-6×105。
优选地，壳聚糖溶液的质量百分浓度为10-30％。
优选地，降解酶为淀粉酶，酶活力为1000-4000u/g，淀粉酶与壳聚糖质量比为0.1-1.0：1。
优选地，降解酶活化处理的活化剂为无水氯化钙，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.1-0.5，活化温度为30-60℃，时间为0.5-2.5h。
优选地，过氧化氢溶液的质量百分浓度为10％-30％
优选地，步骤(3)中无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍。
本发明的有益效果是：
本发明提供的由壳聚糖制备壳寡糖的方法，采用廉价易得的工业级淀粉酶对壳聚糖进行初级降解，然后用过氧化氢对初级降解产物进行再降解，减少了氧化剂用量过大所带来的产物质量差，颜色深等问题，同时也减少了酶的用量，显著地降低了制备过程的成本，并获得了高产率(95％)和低分子质量(最低680)的壳寡糖产品。同时通过反应中产生的滤液的循环利用，保证了过程的清洁友好和过程的经济性。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和1.26×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为25％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为3000u/g淀粉酶活化，活化温度为55℃，时间为2h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.25；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.8：1，然后在55℃温度下进行酶解反应，反应2h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为20％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为90℃，反应时间为30min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为700，壳聚糖的产率为95％。
实施例2
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和4.83×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为2000u/g淀粉酶活化，活化温度为50℃，时间为1.5h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.3；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.6：1，然后在50℃温度下进行酶解反应，反应1h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为30％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为80℃，反应时间为25min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为947，壳聚糖的产率为94.7％。
实施例3
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和4.83×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为4000u/g淀粉酶活化，活化温度为45℃，时间为1h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.3；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.5：1，然后在60℃温度下进行酶解反应，反应1.5h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为30％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为100℃，反应时间为40min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1760，壳聚糖的产率为91.3％。
实施例4
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和1.26×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为2000u/g淀粉酶活化，活化温度为40℃，时间为2h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.2；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.9：1，然后在60℃温度下进行酶解反应，反应3h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为20％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为70℃，反应时间为40min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1545，壳聚糖的产率为90.6％。
实施例5
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和1.26×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为2000u/g淀粉酶活化，活化温度为50℃，时间为1.5h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.25；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.8：1，然后在55℃温度下进行酶解反应，反应1h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为20％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为80℃，反应时间为40min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1219，壳聚糖的产率为89.8％。
实施例6
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和4.83×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为25％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为4000u/g淀粉酶活化，活化温度为50℃，时间为2h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.3；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.7：1，然后在60℃温度下进行酶解反应，反应1.5h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为25％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为90℃，反应时间为20min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1543，壳聚糖的产率为87.5％。
实施例7
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和3.34×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为4000u/g淀粉酶活化，活化温度为55℃，时间为1.5h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.4；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.8：1，然后在55℃温度下进行酶解反应，反应2h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为30％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为100℃，反应时间为20min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1645，壳聚糖的产率为91.3％。
实施例8
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和1.26×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为20％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为3000u/g淀粉酶活化，活化温度为50℃，时间为2h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.3；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.6：1，然后在60℃温度下进行酶解反应，反应1h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为25％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为90℃，反应时间为20min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1900，壳聚糖的产率为92.4％。
实施例9
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和4.83×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为25％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为4000u/g淀粉酶活化，活化温度为55℃，时间为1h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.35；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.7：1，然后在40℃温度下进行酶解反应，反应2h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为20％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为80℃，反应时间为30min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1087，壳聚糖的产率为91.8％。
实施例10
一种酶解和清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
(1)称取脱乙酰度和粘均分子量分别为90％和4.83×105的原料壳聚糖配置质量百分浓度为25％的壳聚糖溶液；
(2)使用无水氯化钙对酶活力为4000u/g淀粉酶活化，活化温度为55℃，时间为2h，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.25；
(3)将步骤(1)中壳聚糖溶液加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，加入活化的淀粉酶，加入的淀粉酶与壳聚糖质量比为0.5：1，然后在50℃温度下进行酶解反应，反应2h，得到初级壳聚糖降解液；
(4)再向初级壳聚糖降解液中加入质量百分浓度为10％的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为90℃，反应时间为40min，得到含壳寡糖的降解液；
(5)最后将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品，剩余的滤液经简单处理后用于下次配制壳聚糖溶液。
制备的壳寡糖的分子量为1217，壳聚糖的产率为90.5％。
综上所述，本发明提供了一种方便、高效的由壳聚糖制备壳寡糖的方法，在适宜的条件下，降解后的壳寡糖粘均分子量最低至680，壳寡糖产品的收率最高达95％，具有工艺简单、反应条件温和、产率高及过程清洁等显著特点，是一种具有工业化应用前景的壳寡糖制备技术。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料过着特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (7)
1.一种酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取原料壳聚糖配制成一定浓度的壳聚糖溶液，加入带有搅拌、控温和回流装置的三口反应器中，再按比例加入活化后的降解酶，然后在45-65℃温度下进行酶解反应，反应0.5-4h，得到初级壳聚糖降解液；
(2)向初级壳聚糖降解液中加入一定体积的过氧化氢溶液使其继续进行氧化降解反应，氧化降解温度为60-100℃，反应时间为10-50min，得到含壳寡糖的降解液；
(3)将含壳寡糖的降解液自然冷却到室温后进行过滤，除去未反应完全的固体壳聚糖原料，向滤液中加入无水乙醇进行醇沉，将过滤分离出的壳寡糖，减压干燥，得到目标壳寡糖产品。
2.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰度大于90％，粘均分子量为4×104-6×105。
3.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的质量百分浓度为10-30％。
4.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述降解酶为淀粉酶，酶活力为1000-4000u/g，淀粉酶与壳聚糖质量比为0.1-1.0：1。
5.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述降解酶活化处理的活化剂为无水氯化钙，淀粉酶与无水氯化钙的质量比为2：0.1-0.5，活化温度为30-60℃，时间为0.5-2.5h。
6.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述过氧化氢溶液的质量百分浓度为10％-30％。
7.根据权利要求1所述的酶解与清洁氧化耦合降解壳聚糖制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中无水乙醇的用量为滤液体积的2-3倍。
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2019
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