CN110548017B - 一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牛血清白蛋白‑铁纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供的牛学清白蛋白‑铁纳米复合物通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到，通过实验发现，本发明提供的复合物能够很好的促进成纤维细胞生长，可用于小鼠烫伤伤口的治疗；同时还具有T2‑MRI成像作用，可以作为很好的肿瘤诊断剂。此外，本发明提供的牛血清白蛋白‑铁纳米复合物的制备方法简单，得到的复合物粒径均一，分散性好，生物相容性好，可用于生物体系。

Description

一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
纳米科技为经济发展和科技进步带来了前所未有的机遇和挑战，随着基础理论研究的进步，纳米科技在光学、电学、催化与生物科技等领域得到了普遍的研究和应用，也涌现了很多合成纳米材料的新方法。
生物矿化指由生物体通过生物大分子的调控生成无机矿物的过程。受自然界生物体矿化的启发，人们将各种生物有机物质用作模板来指导无机纳米材料的合成，并得到了广泛的应用。其中，牛血清蛋白(BSA)作为一种常见的药物输送的多功能蛋白质载体受到了人们广泛的关注。
磁共振成像(MRI)由于具备很强的软组织分辨率，可用于诊断及分析不同阶段的疾病，在确定肿瘤部位，判断肿瘤性质和评价手术效果方面具有很大的意义。
伤口修复是一种复杂的细胞和分子反应，在皮肤受到创伤之后皮肤立即启动包括止血/炎症，组织形成和瘢痕重塑等生理过程。在整个伤口愈合过程中，成纤维细胞扮演着各种重要的角色。它们可以有效地产生细胞生长因子，降解和合成细胞外基质蛋白。具体来说，伤后最初几分钟，伤口区域被血凝块包围，造成止血。随后，免疫细胞迁移到凝块并通过吞噬细菌和细胞碎片引发炎症反应以清洁伤口；接下来，成纤维细胞在伤口区域内迁移、增殖并沉积大量细胞外基质，形成完全覆盖伤口的肉芽组织；最终，通过细胞凋亡实现胶原纤维的重塑并进一步转变为瘢痕组织，因此，制备新型的伤口愈合剂并揭示伤口修复的潜在机制至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供的牛血清白蛋白-铁纳米复合物可以用于伤口的愈合和肿瘤MRI诊断，且制备工艺简单。
与现有技术相比，本发明提供了一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供的牛学清白蛋白-铁纳米复合物通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到，通过实验发现，本发明提供的复合物能够很好的促进成纤维细胞生长，可用于小鼠烫伤伤口的治疗；同时还具有T2-MRI成像作用，可以作为很好的肿瘤诊断剂。此外，本发明提供的牛血清白蛋白-铁纳米复合物的制备方法简单，得到的复合物粒径均一，分散性好，生物相容性好，可用于生物体系。
附图说明
图1为实施例1制备的BSA-Fe NCs的TEM图；
图2为实施例1制备的FeCl3与BSA-Fe NCs的照片；
图3为实施例1制备的BSA-Fe NCs的红外光谱图；
图4为实施例1制备的BSA-Fe NCs对L929与HeLa细胞的选择性促进生长图；
图5为实施例1制备的BSA-Fe NCs水溶液在不同浓度条件下的MRI成像图；
图6为实施例1制备的BSA-Fe NCs原位注射小鼠肿瘤前后的MRI成像图；
图7为实施例1制备的BSA-Fe NCs在活体水平对小鼠伤口的促进愈合能力；
图8为实施例1制备的BSA-Fe NCs在活体水平对小鼠伤口的促进愈合过程中的体重与存活率的变化情况。
具体实施方式
本发明提供了一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物，通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到。
按照本发明，本发明所述牛血清白蛋白-铁纳米复合物是通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到；其中，所述铁源优选为FeCl3；所述混合优选为将铁源水溶液逐滴加入牛血清白蛋白水溶液中实现混合；其中，所述牛血清白蛋白水溶液的浓度为10～40mg/mL，优选25～30mg/mL；所述铁源水溶液的浓度为50～300mM，优选为150～200mM；所述反应的温度为10～50℃，优选20～40℃，更优选为25～37℃；所述反应的时间优选0.5-12h，优选4h。
本发明还提供了一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物的制备方法，包括：
将铁源溶液逐滴加入牛血清白蛋白溶液中混合，然后反应，得到牛血清白蛋白-铁纳米复合物；其中，所述铁源优选为FeCl3；所述牛血清白蛋白溶液为牛血清白蛋白水溶液，所述牛血清白蛋白水溶液的浓度为10～40mg/mL，优选25～30mg/mL；所以铁源溶液为铁源水溶液；所述铁源水溶液的浓度为50～300mM，优选为150～200mM；所述反应的温度为10～50℃，优选20～40℃，更优选为25～37℃；所述反应的时间优选0.5-12h，优选4h。
本发明还提供了一种磁共振成像的造影剂，包括本发明所述的牛血清白蛋白-铁纳米复合物；所述诊断剂优选为肿瘤诊断剂。
本发明还提供了一种促进伤口修复的药物，包括本发明所述的牛血清白蛋白-铁纳米复合物，所述促进伤口修复的药物中牛血清白蛋白-铁纳米复合物的浓度为20～25mM，优选为22～24mM。、
本发明提供了一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物及其制备方法和应用，本发明提供的牛学清白蛋白-铁纳米复合物通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到，通过实验发现，本发明提供的复合物能够很好的促进成纤维细胞生长，可用于小鼠烫伤伤口的治疗；同时还具有T2-MRI成像作用，可以作为很好的肿瘤诊断剂。此外，本发明提供的牛血清白蛋白-铁纳米复合物的制备方法简单，得到的复合物粒径均一，分散性好，生物相容性好，可用于生物体系。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)称取0.25g BSA溶解在10mL去离子水中，室温下磁力搅拌10min，混合均匀，得到无色溶液。然后逐滴加入5mL FeCl3水溶液(150mM)，继续搅拌，使混合液充分分散；
2)将溶液转移到水浴锅内，在37℃下反应4h；
3)将反应物进行透析处理，用透析袋(MWCO＝100kD)透析24h后得到牛血清白蛋白-铁纳米复合物(BSA-Fe NCs)。透析过程中换水4-6次。所得产物用真空冷冻干燥机干燥收集。
对得到的牛血清白蛋白-铁纳米复合物的结构进行鉴定，结果如下：
图1为本发明实施例1中BSA-Fe NCs的透射电镜图(TEM)，从图中可以看到材料为纳米颗粒结构，尺寸均一，大概在15±5nm左右。
图2为本发明实施例1中为实施例1制备的BSA-Fe NCs与FeCl3水溶液的对比图，通过对比发现，单独的FeCl3水溶液呈淡黄色，加入BSA以后BSA-Fe NCs的颜色呈红棕色，说明Fe3+与BSA发生了配位作用，形成了BSA-Fe的纳米复合物，且复合物分散性很好，可以应用于生物体内。
图3为本发明实施例1中BSA-Fe NCs的红外光谱图(FT-IR)，从图中可知材料中实现了BSA的有效包覆，使该材料具有高生物相容性。
实施例2
为了证明本发明实施例1所得BSA-Fe NCs具有良好的生物相容性以及促进成纤维细胞生长的作用，我们使用MTT实验来测试材料与细胞共同培养一段时间后，细胞的增值情况，具体测试方法如下：
1)取对数生长期的HeLa与L929细胞(1×105/mL)加入到96孔细胞培养板中(200μL/孔)，将96孔板中的细胞放在5％CO2，37℃二氧化碳培养箱培养24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)。
2)然后将BSA-Fe NCs用DMEM细胞培养基分散，配成不同浓度的分散液，其中Fe浓度分别为：0，0.16，0.31，0.62，1.25，2.5mM，然后向96孔板中加入不同浓度的BSA-Fe NCs，6个复孔，细胞与材料在5％CO2，37℃下孵育24h，对照组不加样品，倒置显微镜下观察。
3)培养结束后，吸去孔内培养液，小心用PBS洗2-3遍，洗去材料，然后每孔加100μL含MTT的PBS溶液(0.5mg/mL)，终止培养，MTT与活细胞琥珀酸脱氢酶作用下形成不溶性的蓝紫色物质甲瓒沉积在细胞中。
4)3-5h后加入100μL二甲基亚砜(DMSO)溶液将甲瓒溶出，置摇床上低速震荡10min，使结晶物质充分溶解。在酶标仪上检测570nm处的吸光度值(OD值)，求出细胞的存活率。
结果见图4，图4为实施例1制备的BSA-Fe NCs对L929与HeLa细胞的选择性促进生长图。从图中可以看出，即使材料中Fe的浓度达到了2.5mM，HeLa细胞活性仍能基本维持在100％。可以看出，该材料有着良好的生物相容性，可以适用于生物体内。而随着Fe浓度的增加，L929细胞表现出很明显的被促进生长作用。
实施例3
为了检测本发明实施例1所得BSA-Fe NCs对肿瘤的MRI造影能力，具体测试方法如下：
1)将BSA-Fe NCs配成不同浓度的水溶液，其中Fe浓度分别为：0，0.5，1，2，4，8mM，将上述BSA-Fe NCs水溶液置于1.5mL离心管内，并在3.0T的医用MRI成像仪(飞利浦，荷兰)检测，T2加权的图像是在自旋-回波序列下采集的，具体参数如下：TR/TE＝5310ms/99ms，视野＝48mm*48mm，频率*相位＝256*256。
2)使用雌性昆明鼠建立肿瘤模型。将雌性昆明鼠右腋下毛通过剃毛器剔除，将小鼠宫颈癌细胞(U14，1×106)皮下注射到小鼠腋下，待肿瘤生长至约250mm3，原位注射50μLBSA-Fe NCs的生理盐水溶液(8mM)，24小时后在3.0T的医用MRI成像仪(飞利浦，荷兰)采集T2成像图片。
结果如下：
图5为实施例1中制备的BSA-Fe NCs水溶液在不同浓度下体外MRI成像能力。BSA-Fe NCs中Fe的浓度依次是0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mM，MRI图像由亮变暗，与其较高的横向弛豫值(r2)相对应，并且弛豫时间的倒数(1/T2)对Fe的浓度呈现显著的线性关系，这说明BSA-Fe NCs可作为有效的T2造影剂。
图6为实施例1制备的BSA-Fe NCs原位注射小鼠肿瘤前后的MRI成像图。将50μLBSA-Fe NCs(Fe浓度为2.0mM)原位注射到小鼠体内，采集注射前后的T2加权MR图像。注射材料24h后小鼠肿瘤部位的图像明显变暗，说明BSA-Fe NCs具有有效的T2-MRI造影能力。
实施例4
为了检测本发明实施例1所得BSA-Fe NCs对伤口的促进愈合作用，具体测试方法如下：
(1)实验选取6-8周龄，体重25±5g的雌性昆明小鼠作为模型小鼠。通过热铁片物理烫伤小鼠建立小鼠烫伤模型。具体方法如下：首先，用水合氯醛的PBS溶液(10％)对小鼠进行麻醉，采用物理方法在小鼠后腿肌肉处进行剃毛，剃毛的面积约为3.0cm×3.0cm。接着，将1.5cm×3.0cm的铁片放到电阻炉上加热2min，立即紧贴小鼠去毛区域持续10s。烫伤完成后12只小鼠被随机分为控制组和实验组。
(2)建立动物模型以后，将两组小鼠分笼饲养。每天用游标卡尺测量伤口长度和宽度，记录小鼠体重变化，用相机采集小鼠创面情况。控制组：每天依次用75％的乙醇，医用碘液和过氧化氢(10mM)消毒。实验组：每天依次用75％的乙醇，医用碘液和过氧化氢(10mM)消毒，再另喷涂1mL BSA-Fe NCs(Fe含量为22mM)。
结果如图7～图8所示，图7为实施例1中制备的BSA-Fe NCs(实验组)喷涂在小鼠伤口前后的伤口照片与伤口面积；图8为实施例1制备的BSA-Fe NCs对小鼠伤口治疗过程中的小鼠体重与存活率变化。
从图中可以看出，完成烫伤后12h内，小鼠伤口处明显变红并出现少量水肿。由图8中的A可以看出，实验组第2天时伤口皱缩且出现明显结痂的现象，第6天时创伤进一步好转使得结痂掉落，第24天时创伤处基本完全痊愈且没有留下疤痕。相比之下，控制组的伤口愈合情况远不如材料组。第6天时还有创面明显溃烂和出血的情况，第24天时创伤处基本痊愈但留下了烫伤疤痕。总的来说，材料组的伤口面积变小的速度远大于控制组(B)。
两组小鼠体重变化并无明显差异，说明BSA-Fe NCs并无明显毒副作用。我们发现在整个实验时间范围内并无小鼠死亡，说明了BSA-Fe NCs具有较好的生物相容性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种牛血清白蛋白-铁纳米复合物，通过将牛血清白蛋白溶液和铁源溶液混合反应得到；
所述牛血清白蛋白-铁纳米复合物的制备方法由以下步骤组成：
1)称取0.25g牛血清白蛋白溶解在10mL去离子水中，室温下磁力搅拌10min，混合均匀，得到无色溶液；然后逐滴加入5mL 150mM的FeCl3水溶液，继续搅拌，使混合液充分分散；
2)将溶液转移到水浴锅内，在37℃下反应4h；
3)将反应物进行透析处理，用透析袋透析24h后，用真空冷冻干燥机干燥收集，得到牛血清白蛋白-铁纳米复合物；所述透析过程中换水4～6次；所述透析袋的MWCO＝100kD。
2.一种磁共振成像的造影剂，包括权利要求1所述的牛血清白蛋白-铁纳米复合物。
3.一种促进伤口修复的药物，包括权利要求1所述的牛血清白蛋白-铁纳米复合物。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述促进伤口修复的药物中牛血清白蛋白-铁纳米复合物的浓度为20～25mM。
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