CN109675061B - 纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米生物医药材料领域，具体而言，提供了一种纳米材料及其制备方法和应用。所述纳米材料包括BSA:RE1,RE2内核，包覆在BSA:RE1,RE2内核表面的PDA壳层，以及PDA表面的FA，其中RE1和RE2不同。该纳米材料分散性好，易于制备，具有优异的生物相容性和安全性，能够精准的对肿瘤进行多模态MRI/CT成像，并具有良好肿瘤光热治疗效果。

Description

纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米生物医药材料领域，具体而言，涉及一种纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤，又称癌症，一直严重危害人类健康和生命安全，它具有无限增殖、侵袭和转移特点，已超过心血管疾病成为造成人类死亡最严重的疾病。肿瘤的诊断在肿瘤治疗中占有重要的地位，伴随着医学成像手段与仪器设备的不断发展和更新，多种影像学诊断方法，包括磁共振成像(MRI)、X射线计算机断层扫描成像(CT)、超声成像(UI)、光学成像(OI)和正电子衍射成像(PET)等成像方式正逐渐涌现和完善，为肿瘤的检测与位置分析提供了新的思路。近年来发展起来的多模态成像方式(MRI/CT、MRI/OI等)，能够整合单模态成像优势于一体，弥补了单模态成像的不足，可以提供更加准确完整的互补信息。而在传统的肿瘤临床中，诊断和治疗是两个相对独立的过程，但多次成像和治疗试剂的口服或注射会给病人带来叠加的副作用，增加患者的体内代谢负担，造成不必要的痛苦和风险，重要的是，在治疗过程中也需要影像学来监控原发病灶、转移和生长变化过程及药物在体内的分布情况，为医生提供准确信息以优化治疗方案。所以，自从集诊断与治疗于一体的“诊疗”概念被提出以来，设计合成高灵敏度、高疗效和低毒副作用的多功能诊疗探针就成为癌症诊断与治疗研究领域的重中之重。
近年来，随着纳米技术的飞速发展，一系列具有优越理化性质的纳米材料作为诊疗探针被不断开发出来，同时用于肿瘤的活体成像诊断及光热治疗。镧系金属具有内在的超顺磁性和X射线吸收能力，通常被用于MRI和CT成像探针的原料，但是这些纳米材料通常需要苛刻的合成条件(高温、耗时)，制备过程复杂，并需要多步修饰，得到的产物分散性差、易于聚集，影响诊疗材料在体内的分布和代谢，进一步限制了其临床应用。所以开发新型高效、高生物相容性的多功能光热型诊疗试剂至关重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种纳米材料，该纳米材料分散性好，易于制备，具有优异的生物相容性和安全性，能够精准的对肿瘤进行多模态MRI/CT成像，并具良好肿瘤光热治疗效果。
本发明的第二目的在于提供一种纳米材料的制备方法，该方法工艺简单，可在生理温度下进行，无需高温、高压和无氧环境，得到的纳米材料分散性好，生物相容性和安全性高，可用于肿瘤靶向的多模态MRI/CT成像和光热治疗。
本发明的第三目的在于提供一种纳米材料在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种药物。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种纳米材料，所述纳米材料包括BSA:RE1,RE2内核，包覆在BSA:RE1,RE2内核表面的PDA壳层，以及PDA表面的FA，其中RE1和RE2不同。
作为进一步优选地技术方案，RE1或RE2各自独立地为Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb或Lu中的任意一种；
优选地，RE1为Gd，RE2为Dy；
优选地，RE1和RE2的摩尔比为2：(1-3)。
作为进一步优选地技术方案，BSA的质量与RE1和RE2的总质量的比例为(2-7)：1；
优选地，BSA:RE1,RE2内核在所述纳米材料中的含量为70％-90％；
优选地，PDA在所述纳米材料中的含量为10％-20％；
优选地，FA在所述纳米材料中的含量为1％-10％。
作为进一步优选地技术方案，所述内核的粒径为7-8.5nm，所述纳米材料的粒径为11.5-16.5nm。
作为进一步优选地技术方案，所述纳米材料为BSA:Gd,Dy@PDA-FA，Zeta电位为-30.4毫伏。
第二方面，本发明提供了一种上述纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)BSA:RE1,RE2的合成：将BSA溶液、RE1盐溶液和RE2盐溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2；
(b)BSA:RE1,RE2@PDA的合成：将多巴胺的盐溶液和BSA:RE1,RE2溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA；
(c)BSA:RE1,RE2@PDA-FA的合成：将活化后的FA与BSA:RE1,RE2@PDA溶液混合后避光反应，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA-FA纳米材料。
作为进一步优选地技术方案，步骤(a)中混合溶液的pH为11.5-12.5；
优选地，步骤(a)中所述反应的反应时间为5-7h；
优选地，BSA溶液的浓度为20-40毫克/毫升，RE1盐溶液或RE2盐溶液的浓度为2-4毫克/毫升。
作为进一步优选地技术方案，步骤(b)中混合溶液的pH为8-9；
优选地，步骤(b)中所述反应的反应时间为11-13h；
优选地，多巴胺的盐溶液包括多巴胺盐酸盐水溶液；
优选地，将多巴胺的盐溶液通过进样泵加入到BSA:RE1,RE2溶液中，进样泵的速率优选为15-25微克/分钟；
优选地，多巴胺的盐溶液的浓度为4-5毫克/毫升，BSA:RE1,RE2溶液的浓度为4-6毫克/毫升。
优选地，步骤(c)中，采用EDC、NHS和DMSO对FA进行活化，活化温度为36.5-37.5℃；
优选地，FA、EDC、NHS和DMSO的质量比为(7-9)：(5-7)：(3-5)：(1000-1200)；
优选地，步骤(c)中所述反应的反应时间为3-5h；
优选地，BSA:RE1,RE2@PDA溶液的浓度为4-6毫克/毫升；
优选地，步骤(a)、(b)或(c)中，在反应后还包括纯化的步骤，优选采用去离子水透析来纯化；
优选地，步骤(b)中，在去离子水透析后还包括分离的步骤，分离后得到BSA:RE1,RE2@PDA纳米粒子。
第三方面，本发明提供了一种上述纳米材料或采用上述纳米材料的制备方法制备得到的纳米材料在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中的应用。
第四方面，本发明提供了一种药物，包括上述纳米材料或采用上述纳米材料的制备方法制备得到的纳米材料，和药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的纳米材料分散性好，易于制备，具有优异的生物相容性和安全性，能够用于肿瘤靶向的MRI/CT成像，同时进行成像介导的光热治疗。
本发明提供的纳米材料制备方法具有以下优点：
(1)能够在生理温度下进行，反应条件简单，不需要高温、高压和无氧环境，有效的减少了合成步骤和合成时间。
(2)所选用的原料多巴胺，是天然存在于人体中的物质，形成的PDA具有优异的生物相容性，避免了由于外来物质引起的毒副作用；此外，PDA在近红外区具有很好的光吸收能力，能够使肿瘤部位温度升高，达到杀死肿瘤细胞的目的，是一种良好的肿瘤光热治疗试剂。
(3)FA受体在肿瘤细胞表面是过表达的，所以在纳米粒子表面连接上FA，能够有效的提高纳米粒子在肿瘤部位的积累，提高成像和治疗效果。
将上述纳米材料应用于制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中，能够显著提高MRI/CT成像制剂的靶向性、成像对比度以及在生物体内的循环，能够提高光热治疗肿瘤药物的治疗效率和治疗效果，在激光的照射下，能够有效消融肿瘤组织，达到治疗肿瘤的目的。
本发明提供的药物包括上述纳米材料或采用上述纳米材料的制备方法制备得到的纳米材料，因而至少具有与上述纳米材料相同的优势，能够有效消融肿瘤组织，达到治疗肿瘤的目的。
附图说明
图1(a)为实施例1合成的BSA:Gd,Dy纳米粒子的TEM图；
图1(b)为实施例1合成的BSA:Gd,Dy@PDA纳米粒子的TEM图；
图1(c)为实施例1合成的BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的TEM图；
图2为实施例1合成的BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的X射线电子能谱；
图3为实施例1合成的BSA:Gd,Dy、BSA:Gd,Dy@PDA和BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的Zeta电位图；
图4为FA、实施例1合成的BSA:Gd,Dy@PDA和BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的UV-Vis-NIR吸收光谱图；
图5为不同浓度BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子培育HeLa细胞24h之后的细胞存活率图；
图6为静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子组和对照组小鼠的脏器经苏木精和伊红染色之后的组织切片图；
图7为BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的纵向弛豫速率(1/T1)(a)和横向弛豫速率(1/T2)(b)与对应浓度的线性关系图；
图8为静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子之前和不同时间点之后肿瘤小鼠的MRI图像；
图9为静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子之前和不同时间点之后肿瘤小鼠的CT图像；
图10为经过BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子光热治疗的肿瘤小鼠和没有经过治疗的肿瘤小鼠对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“1-3”表示本文中已经全部列出了“1-3”之间的全部实数，“1-3”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
第一方面，在至少一个实施例中提供了一种纳米材料，所述纳米材料包括BSA:RE1,RE2内核，包覆在BSA:RE1,RE2内核表面的PDA壳层，以及PDA表面的FA，其中RE1和RE2不同。
上述“BSA:RE1,RE2内核”是指结合了镧系金属离子RE1和RE2的BSA内核，上述“PDA表面的FA”是指PDA壳层表面结合了FA，上述纳米材料可简写为BSA:RE1,RE2@PDA-FA。
BSA(Albumin from bovine serum，牛血清白蛋白)又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。生物矿化(biomineralization)，是指由生物体通过生物大分子的调控生成无机矿物的过程，与一般矿化最大不同在于有生物大分子生物体代谢、细胞、有机基质的参与；是生物形成矿物的作用，是生物在特定的部位，在一定的物理化学条件下，在生物有机物质的控制或影响下，将溶液中的离子转变为固相矿物的作用。BSA能够通过生物矿化法结合上稀土离子。
RE1和RE2是指镧系金属，二者不同。镧系金属具有内在的超顺磁性和X射线吸收能力，能够作为MRI和CT成像探针的原料，本发明采用两种镧系金属共同掺杂到BSA中，实现同时的MRI/CT多模态成像。
优选地，RE1或RE2各自独立地为La(镧)、Ce(铈)、Pr(镨)、Nd(钕)、Pm(钷)、Sm(钐)、Eu(铕)、Gd(钆)、Tb(铽)、Dy(镝)、Ho(钬)、Er(铒)、Tm(铥)、Yb(镱)或Lu(镥)中的任意一种。
优选地，RE1或RE2为Gd(钆)、Tb(铽)、Dy(镝)、Ho(钬)、Er(铒)、Tm(铥)、Yb(镱)或Lu(镥)中的任意一种。
优选地，RE1为Gd，RE2为Dy。
PDA(polydopamine，聚多巴胺)是一种生物安全性高的聚合物，并不干扰多种哺乳动物细胞的活性和增殖能力，即使在很高剂量下，也不会产生明显的细胞毒性，更为重要的是，PDA已被证实在体内可完全降解，相比其他共轭聚合物具有更高的安全性。在光学性质方面，PDA具有与黑色素相似的光吸收性能，其在紫外光到可见光的范围内有宽波段的吸收，并且光吸收一直延伸到近红外区域，能够把吸收的光能转换成热能，杀死肿瘤细胞，对肿瘤具有显著的光热治疗效果。此外，PDA表面具有丰富的官能团，能够和叶酸结合，提高此纳米材料在肿瘤部位的积累，实现肿瘤的靶向成像和治疗。
FA(Folic acid，叶酸)是人体必需但又无法合成的一种维生素，它参与一碳单位代谢和嘌呤、胸腺嘧啶的从头合成，在体内主要是通过叶酸受体的内吞途径将叶酸带入细胞内。研究表明，一定结构的叶酸衍生物也能被含叶酸受体的细胞摄取。由于叶酸受体在卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌和胃癌等恶性肿瘤中有过度表达，在正常组织中的表达高度保守，因此可利用叶酸受体对肿瘤进行选择性靶向显像。FA具有较好的靶向性，能够使得该纳米材料在肿瘤部位聚集，提高纳米材料在肿瘤部位的积累，提高成像和治疗效果。
上述纳米材料分散性好，易于制备，具有优异的生物相容性和安全性，能够用于肿瘤靶向的MRI/CT成像，同时进行成像介导的光热治疗。
在一种优选地实施方式中，RE1和RE2的摩尔比为2：(1-3)。上述摩尔比典型但非限制性的为2：1、2：1.5、1：1、2：2.5或2：3等，优选为1：1。
在一种优选地实施方式中，BSA的质量与RE1和RE2的总质量的比例为(2-7)：1。上述比例典型但非限制性的为2：1、3：1、4：1、5：1、6：1或7：1。在该比例下，既能够保证BSA充分结合上RE1和RE2，保证结合量，从而实现良好的成像效果，还能避免金属离子的过多损耗，降低成本。
在一种优选地实施方式中，BSA:RE1,RE2内核在所述纳米材料中的含量为70％-90％。上述含量是指“质量含量”，典型但非限制性的，BSA:RE1,RE2内核的含量为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％。
优选地，PDA在所述纳米材料中的含量为10％-20％。上述含量是指“质量含量”，典型但非限制性的，PDA的含量为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。上述PDA的含量科学合理，能够使得该纳米材料将光能充分转化成热能，杀死肿瘤细胞，保证肿瘤的光热治疗效果。
优选地，FA在所述纳米材料中的含量为1％-10％。上述含量是指“质量含量”，典型但非限制性的，FA的含量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。上述FA的含量科学合理，能够保证纳米材料中具有充足的FA，提高该纳米材料在肿瘤部位的积累，提高成像效果和治疗效果。
在一种优选地实施方式中，所述内核的粒径为7-8.5nm，所述纳米材料的粒径为11.5-16.5nm。上述内核的粒径典型但非限制性的为7nm、7.1nm、7.2nm、7.3nm、7.4nm、7.5nm、7.6nm、7.7nm、7.8nm、7.9nm、8.0nm、8.1nm、8.2nm、8.3nm、8.4nm或8.5nm；上述纳米材料的粒径典型但非限制性的为11.5nm、11.7nm、11.9nm、12nm、12.2nm、12.4nm、12.6nm、12.8nm、13nm、13.2nm、13.4nm、13.6nm、13.8nm、14nm、14.2nm、14.4nm、14.6nm、14.8nm、15nm、15.2nm、15.4nm、15.6nm、15.8nm、16nm、16.2nm、16.4nm或16.5nm。
优选地，所述内核的粒径为7.5-8.0nm，所述纳米材料的粒径为12-15nm。
在一种优选地实施方式中，所述纳米材料为BSA:Gd,Dy@PDA-FA，Zeta电位为-30.4毫伏。本优选实施方式的纳米材料是以BSA:Gd,Dy为内核，以PDA为壳层，以及PDA表面的FA，其Zeta电位为-30.4毫伏，说明PDA成功包覆在了BSA:Gd,Dy表面，且FA成功连接在了PDA表面。
第二方面，在至少一个实施例中提供了一种上述纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(a)BSA:RE1,RE2的合成：将BSA溶液、RE1盐溶液和RE2盐溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2；
(b)BSA:RE1,RE2@PDA的合成：将多巴胺的盐溶液和BSA:RE1,RE2溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA；
(c)BSA:RE1,RE2@PDA-FA的合成：将活化后的FA与BSA:RE1,RE2@PDA溶液混合后避光反应，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA-FA纳米材料。
上述制备方法中，BSA能够通过生物矿化法结合上稀土离子RE1和RE2，实现同时的多模态成像；多巴胺在碱性条件下，能够在BSA表面进行原位聚合，形成聚多巴胺(PDA)涂层，此涂层在近红外区具有很强的吸收，能够把吸收的光能转换成热能，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤的光热治疗；此外，PDA涂层表面具有丰富的官能团，能够和靶向分子叶酸(FA)结合，提高此纳米材料在肿瘤部位的积累，实现肿瘤的靶向成像和治疗。
具体的：
步骤(a)中，BSA溶液、RE1盐溶液和RE2盐溶液混合时能够通过生物矿化原理，使BSA结合RE1和RE2金属离子，形成RE1-BSA-RE2复合物，然后在碱性条件下，BSA发生构象的改变，从3D折叠结构展开或者转变成第三组态，同时，碱性条件也促进加入的RE1盐和RE1盐水解成金属氧化物和/或金属氢氧化物。
步骤(b)中，在碱性条件下，多巴胺能够在BSA:RE1,RE2表面进行自聚合，溶液逐渐变成黑色，即形成PDA涂层。
步骤(c)中，在避光条件下，FA与PDA结合，从而形成BSA:RE1,RE2@PDA-FA。
上述制备方法具有以下优点：
(1)能够在生理温度下进行，反应条件简单，不需要高温、高压和无氧环境，有效的减少了合成步骤和合成时间。
(2)所选用的原料多巴胺，是天然存在于人体中的物质，形成的PDA具有优异的生物相容性，避免了由于外来物质引起的毒副作用；此外，PDA在近红外区具有很好的光吸收能力，能够使肿瘤部位温度升高，达到杀死肿瘤细胞的目的，是一种良好的肿瘤光热治疗试剂。
(3)FA受体在肿瘤细胞表面是过表达的，所以在纳米粒子表面连接上FA，能够有效的提高纳米粒子在肿瘤部位的积累，提高成像和治疗效果。
在一种优选地实施方式中，步骤(a)中混合溶液的pH为11.5-12.5。上述pH典型但非限制性的为11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4或12.5。
可选地，上述混合溶液的pH可选用碱金属氢氧化物来调节，包括但不限于氢氧化钠或氢氧化钾等，氢氧化钠或氢氧化钾的浓度为1-2mol/L。
可选地，RE1盐溶液和RE2盐溶液为RE1和RE2的氯化盐溶液。
优选地，步骤(a)中所述反应的反应时间为5-7h。上述反应时间典型但非限制性的为5h、5.5h、6h、6.5h或7h。
优选地，BSA溶液的浓度为20-40毫克/毫升，RE1盐溶液或RE2盐溶液的浓度为2-4毫克/毫升。上述BSA溶液的浓度典型但非限制性的为20毫克/毫升、22毫克/毫升、24毫克/毫升、26毫克/毫升、28毫克/毫升、30毫克/毫升、32毫克/毫升、34毫克/毫升、36毫克/毫升、38毫克/毫升或40毫克/毫升。上述RE1盐溶液或RE2盐溶液的浓度典型但非限制性的为2毫克/毫升、2.2毫克/毫升、2.4毫克/毫升、2.6毫克/毫升、2.8毫克/毫升、3毫克/毫升、3.2毫克/毫升、3.4毫克/毫升、3.6毫克/毫升、3.8毫克/毫升或4毫克/毫升。
在一种优选地实施方式中，步骤(b)中混合溶液的pH为8-9。上述pH典型但非限制性的为8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9。
上述混合溶液的pH可选用弱碱来调节，包括但不限于Tris(三羟甲基氨基甲烷)、柠檬酸、碳酸、醋酸或巴比妥酸等。
优选地，步骤(b)中所述反应的反应时间为11-13h。上述反应时间典型但非限制性的为11h、11.5h、12h、12.5h或13h。
优选地，多巴胺的盐溶液包括多巴胺盐酸盐水溶液。
优选地，将多巴胺的盐溶液通过进样泵加入到BSA:RE1,RE2溶液中，进样泵的速率优选为15-25微克/分钟。上述速率典型但非限制性的为15微克/分钟、16微克/分钟、17微克/分钟、18微克/分钟、19微克/分钟、20微克/分钟、21微克/分钟、22微克/分钟、23微克/分钟、24微克/分钟或25微克/分钟。上述速率能够保证多巴胺在BSA表面进行自聚合，速率过快会使得多巴胺在溶液中聚合成PDA球，而非包覆在BSA表面。
优选地，多巴胺的盐溶液的浓度为4-5毫克/毫升，BSA:RE1,RE2溶液的浓度为4-6毫克/毫升。上述多巴胺的盐溶液的浓度典型但非限制性的为4毫克/毫升、4.1毫克/毫升、4.2毫克/毫升、4.3毫克/毫升、4.4毫克/毫升、4.5毫克/毫升、4.6毫克/毫升、4.7毫克/毫升、4.8毫克/毫升、4.9毫克/毫升或5毫克/毫升。上述BSA:RE1,RE2溶液的浓度典型但非限制性的为4毫克/毫升、4.2毫克/毫升、4.4毫克/毫升、4.6毫克/毫升、4.8毫克/毫升、5毫克/毫升、5.2毫克/毫升、5.4毫克/毫升、5.6毫克/毫升、5.8毫克/毫升或6毫克/毫升。
在一种优选地实施方式中，步骤(c)中，采用EDC、NHS和DMSO对FA进行活化，活化温度为36.5-37.5℃，活化时间为1.5-2.5h。上述活化温度典型但非限制性的为36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃或37.5℃；上述活化时间典型但非限制性的为1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h或2.5h。
其中，EDC为1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
NHS为N-Hydroxysuccinimide；1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione，N-羟基琥珀酰亚胺；
DMSO为Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜。
优选地，FA、EDC、NHS和DMSO的质量比为(7-9)：(5-7)：(3-5)：(1000-1200)。上述质量比典型但非限制性的为7：5：3：1000、7：6：4：1100、7：7：5：1200、8：5：3：1000、8：6：4：1100、8：7：5：1200、9：5：3：1000、9：6：4：1100或9：7：5：1200等。
优选地，步骤(c)中所述反应的反应时间为3-5h。上述反应时间典型但非限制性的为3h、3.5h、4h、4.5h或5h。
优选地，BSA:RE1,RE2@PDA溶液的浓度为4-6毫克/毫升。上述BSA:RE1,RE2@PDA溶液的浓度典型但非限制性的为4毫克/毫升、4.2毫克/毫升、4.4毫克/毫升、4.6毫克/毫升、4.8毫克/毫升、5毫克/毫升、5.2毫克/毫升、5.4毫克/毫升、5.6毫克/毫升、5.8毫克/毫升或6毫克/毫升。
优选地，步骤(a)、(b)或(c)中，在反应后还包括纯化的步骤，优选采用去离子水透析来纯化。
可选地，在采用去离子水透析时，每隔3-5h换一次水，可以每隔3h、3.5h、4h、4.5h或5h换一次水。
优选地，步骤(b)中，在去离子水透析后还包括分离的步骤，分离后得到BSA:RE1,RE2@PDA纳米粒子。
可选地，上述分离包括过滤和离心，过滤时采用0.1-0.3微米过滤器过滤，优选采用0.22微米过滤器过滤，在10000-12000rpm离心10-20分钟。
需要说明的是，上述“避光反应”是指通过阻隔光线，在黑暗环境中进行反应，保证反应的顺利进行。
第三方面，在至少一个实施例中提供了一种上述纳米材料或采用上述方法制备得到的纳米材料在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中的应用。
将上述纳米材料应用于制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中，能够显著提高MRI/CT成像制剂的靶向性、成像对比度以及在生物体内的循环，能够提高光热治疗肿瘤药物的治疗效率和治疗效果，在激光的照射下，能够有效消融肿瘤组织，达到治疗肿瘤的目的。
优选地，在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物之前，还包括通过MTT法检测所述纳米材料毒性的步骤。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。该方法能够用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，它的特点是灵敏度高、经济效益好。
优选地，所述检测的方法包括以下步骤：将所述纳米材料与Hela细胞共孵育，3-5小时后通过MTT法检测细胞存活率。孵育时间典型但非限制性的为3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或5小时。
优选地，在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物之前，还包括评估所述纳米材料在体内的生物相容性的步骤。通过评估生物相容性来确定该纳米材料是否适合应用到体内，进而判断该纳米材料是否能够用于制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物。
优选地，所述评估的方法包括以下步骤：静脉注射所述纳米材料到小鼠体内后，取小鼠的脏器切片，再用苏木精和伊红染色，最后通过显微镜观察各组织细胞有无异常变化。
上述脏器包括心、肝、脾、肺或肾。
优选地，在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物之前，还包括评估所述纳米材料MRI成像能力的步骤。
优选地，所述评估的方法包括以下步骤：在5-8T磁场条件下使用标准反转恢复脉冲序列和自旋回波脉冲序列测量所述纳米材料的溶液的纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)；将弛豫时间的倒数值与RE1 3+和RE2 3+进行线性拟合得到相应函数，所得直线的斜率即为纵向弛豫效率(r1)和横向弛豫效率(r2)。当纵向弛豫效率(r1)和横向弛豫效率(r2)较高时，说明该纳米材料具有很好的MRI成像应用潜力。上述磁场的强度典型但非限制性的为5T、5.5T、6T、6.5T、7T、7.5或8T。
优选地，在制备得到MRI/CT成像制剂后，将所述制剂进行成像试验。
优选地，所述试验包括以下步骤：建立小鼠的肿瘤模型，静脉注射所述制剂到小鼠体内，在注射之前和注射不同时间点之后，通过核磁共振波谱仪和CT成像仪器，进行MRI和CT成像。
优选地，在制备得到光热治疗肿瘤药物后，将所述药物进行光热治疗试验。
优选地，所述试验包括以下步骤：建立小鼠的肿瘤模型，待肿瘤长到90-110mm3时，对小鼠进行静脉注射所述药物，随后对肿瘤部位进行800-810nm的激光照射，一段时间内观察肿瘤的变化。肿瘤的大小典型但非限制性的为90mm3、92mm3、94mm3、96mm3、98mm3、100mm3、102mm3、104mm3、106mm3、108mm3或110mm3。上述激光的波长典型但非限制性的为800nm、801nm、802nm、803nm、804nm、805nm、806nm、807nm、808nm、809nm或810nm。
第四方面，本发明提供了一种药物，包括上述纳米材料或采用上述纳米材料的制备方法制备得到的纳米材料，和药学上可接受的载体。上述药物包括上述纳米材料或采用上述纳米材料的制备方法制备得到的纳米材料，因而至少具有与上述纳米材料相同的优势，能够有效消融肿瘤组织，达到治疗肿瘤的目的。
优选地，所述药物为注射剂，更优选为静脉注射剂。
实施例1
一种纳米材料BSA:Gd,Dy@PDA-FA，其制备方法包括以下步骤：
(a)BSA:Gd,Dy的合成：在37℃水浴条件下，取300毫克BSA于50毫升烧瓶中，加入10毫升去离子水溶解；另取30毫克GdCl3·6H2O和30毫克DyCl3·6H2O溶于10毫升水中，在剧烈搅拌下缓慢加入到上述BSA溶液，反应液逐渐混浊，两分钟后，在反应液中快速加入氢氧化钠溶液(1M，1毫升)调节pH值为12，溶液变成透明，在剧烈搅拌下继续反应6小时，最后通过去离子水进行透析，每4小时更换一次水，去除过量的Gd3+和Dy3+，得到BSA:Gd,Dy纳米粒子。
(b)BSA:Gd,Dy@PDA的合成：通过Tris调整pH值为8.5，将溶于10毫升去离子水的45毫克多巴胺盐酸盐水溶液通过进样泵加入到10毫升BSA:Gd,Dy溶液中，BSA:Gd,Dy溶液浓度为5毫克每毫升；设置进样泵速率为20微克每分钟，溶液逐渐变黑；12小时后，将溶液通过去离子水透析和0.22微米过滤器过滤，最后通过离心(11000rpm，15分钟)得到BSA:Gd,Dy@PDA纳米粒子。
(c)BSA:Gd,Dy@PDA-FA的合成：将8毫克FA、6毫克EDC和4毫克NHS与1毫升DMSO(密度为1.1g/mL)混合以活化FA；2小时后，加入10毫升BSA:Gd,Dy@PDA溶液(5毫克每毫升)，在室温下黑暗中继续反应4小时；最后通过透析纯化产物，除去未反应的物质，得到BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子。
实施例1中纳米粒子的表征
(1)透射电镜(TEM)
将各步骤合成的纳米粒子分散在水中，充分超声后，滴在碳支持膜上，通过TEM仪器得到纳米粒子形态和尺寸。如图1(a)、图1(b)和图1(c)所示，得到的纳米粒子为类球形，具有比较均匀的粒子尺寸，BSA:Gd,Dy、BSA:Gd,Dy@PDA和BSA:Gd,Dy@PDA-FA的尺寸分别为7.8±0.4纳米、12.4±1.3纳米和13.9±2.2纳米，粒径的增加证实了PDA的包覆和FA的连接。
(2)X射线电子能谱(XPS)
将得到的BSA:Gd,Dy@PDA-FA冻干成粉末状后，通过VG ESCALAB MKII光谱仪进行XPS表征。图2中，我们观察到了C,N,O,Gd和Dy的结合能，说明稀土元素Gd和Dy成功的掺杂进了BSA中。
(3)Zeta电势
图3分别为BSA:Gd,Dy、BSA:Gd,Dy@PDA和BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的Zeta电位，三者的Zeta电位分别为-21.7毫伏、-16.4毫伏和-30.4毫伏。由于BSA中有大量的羧基，得到的BSA:Gd,Dy的电位为-21.7毫伏；包覆上PDA之后，BSA:Gd,Dy@PDA的电位为-16.4毫伏，尽管PDA表面有一些氨基，但是羟基的数量更多，所以在碱性条件下BSA:Gd,Dy@PDA的电位是负值；由于FA表面存在大量的羧基，因此连接上FA之后BSA:Gd,Dy@PDA-FA的电位减小到-30.4毫伏。
(4)紫外-可见分光光度计(UV-Vis-NIR)
图4为FA、BSA:Gd,Dy@PDA和BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的UV-Vis-NIR吸收光谱图。可见，与BSA:Gd,Dy@PDA不同，BSA:Gd,Dy@PDA-FA在283nm处出现了一个吸收峰，此峰来自于FA中蝶呤环的π-π*的跃迁，该图证明了叶酸被成功的修饰在纳米粒子表面。
上述纳米材料能够用于制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物。
(1)在进行体内应用之前，通过MTT法检测BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子毒性：
在5％CO2、95％湿度和37℃温度条件下，使HeLa细胞铺满细胞板，培育细胞24小时后，加入不同浓度(0.125、0.25、0.5、0.75、1mg/mL)的BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液，再分别培育细胞24小时；然后加入100微升MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)继续培育4小时，再将培养基移除，用DMSO溶解形成的紫色染料，15分钟后，通过多功能酶标仪测量其在570nm处的紫外吸收值来得到细胞存活率。
如图5所示，在纳米粒子最大浓度为1毫克每毫升时，细胞的存活率还能达到90％以上，说明此BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子具有很低的细胞毒性，可以进行体内应用。
(2)组织切片分析：
将Balb/c雌性小鼠体通过尾静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子(15毫克Gd每千克体重)；14天之后，收集实验组和空白小鼠的主要脏器包括心、肝、脾、肺和肾，福尔马林溶液保存后进行石蜡包埋，采用组织切片机切片(3-5微米)，把切片放置在载玻片上干燥处理后，分别用75％的酒精和去离子水洗涤2分钟，将苏木精溶液逐滴滴在载玻片上染色10分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色，用盐酸的稀释溶液对切片分色，使细胞核和细胞质分别呈红紫色和无色，采用去离子水蓝化，再把载玻片浸入伊红染液中浸泡2分钟，使细胞内的嗜酸性物质着色，再分别用75％酒精和去离子水洗涤5分钟。通过树胶将盖玻片覆盖在切片上；最后用光学显微镜观察并拍照。
如图6所示，与对照组小鼠相比，经过静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子的小鼠心脏样品中的心肌组织没有显示出任何水样变性，肝脏样品中的肝细胞和肾脏切片中的肾小球结构都和正常小鼠是一样的，在肺样品中没有观察到肺纤维化，任何切片样都没有出现坏死。由此可见，BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子具有良好的生物相容性，可以应用到体内。
(3)测定水质子纵向和横向弛豫时间：
通过Bruker avance III 400MHz核磁共振波谱仪(7T)测定样品的纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)。将样品用水和重水按1:1稀释，配备一系列浓度的BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液(Gd和Dy的浓度设置为0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mg/mL)。将弛豫时间的倒数值与Gd和Dy浓度做函数，所得到直线的斜率为纵向弛豫效率(r1)和横向弛豫效率(r2)。
如图7所示，得到的r1为18.42，r2为12.95，明显高于现在临床上常用的MRI成像造影剂，所以，BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子具有很好的MRI成像应用潜力。
(4)建立小鼠的肿瘤模型，静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液到小鼠体内，在注射之前和注射不同时间点之后，通过1.5T核磁共振波谱仪和CT成像仪器，进行MRI和CT成像。
小鼠体内的MRI/CT成像应用：
在体内成像之前，先通过腹腔注射水合氯醛(100微升，10％)的方式将小鼠麻醉，进行一次T1/T2-MRI和CT成像，然后通过尾静脉注射将100微升BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液(15毫克Gd和Dy每千克体重)溶液注射到小鼠体内，经过不同时间间隔进行T1/T2-MRI和CT成像。
从图6和图7中可以看出，随注射时间的延长，无论是MRI成像还是CT成像，肿瘤部位相比注射部位都呈现出明显的对比增强，并且能够持续到12小时。由此说明，该纳米材料能够实现长时间的体内循环，因此有利于该纳米材料的光热治疗应用。
(5)建立小鼠的肿瘤模型，待肿瘤长到100mm3时，对小鼠进行静脉注射BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液，随后对肿瘤部位进行808nm的激光照射，一段时间内观察肿瘤的变化。
小鼠体内的肿瘤光热治疗应用：
建立小鼠的肿瘤模型，待小鼠肿瘤长到100mm3时，给小鼠静脉注射100mL浓度为20mg/mL的BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子溶液，12小时后，通过808nm激光器照射小鼠肿瘤部位，进行光热治疗。在一定时间内，对小鼠进行拍照，观察肿瘤的变化情况。
如图10所示，经过光热治疗之后的小鼠，在第三天时肿瘤明显收缩，14天出现结痂，经过28天后，肿瘤完全消失，并长出新毛发，而没有经过光热治疗的小鼠肿瘤快速生长并扩大，说明BSA:Gd,Dy@PDA-FA纳米粒子具有良好的光热治疗效率，能够有效的消融肿瘤组织，达到肿瘤治疗的目的。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (25)

1.一种纳米材料，其特征在于，所述纳米材料包括BSA:RE1,RE2内核，包覆在BSA:RE1,RE2内核表面的PDA壳层，以及PDA表面的FA，其中RE1为Gd，RE2为Dy；
所述的纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
（a）BSA:RE1,RE2的合成：将BSA溶液、RE1盐溶液和RE2盐溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2；
（b）BSA:RE1,RE2@PDA的合成：将多巴胺的盐溶液和BSA:RE1,RE2溶液混合均匀后调节混合溶液pH至碱性，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA；
（c）BSA:RE1,RE2@PDA-FA的合成：将活化后的FA与BSA:RE1,RE2@PDA溶液混合后避光反应，反应后得到BSA:RE1,RE2@PDA-FA纳米材料。
2.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，RE1和RE2的摩尔比为2：（1-3）。
3.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，BSA的质量与RE1和RE2的总质量的比例为（2-7）：1。
4.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，BSA:RE1,RE2内核在所述纳米材料中的含量为70%-90%。
5.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，PDA在所述纳米材料中的含量为10%-20%。
6.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，FA在所述纳米材料中的含量为1%-10%。
7.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，所述内核的粒径为7-8.5 nm，所述纳米材料的粒径为11.5-16.5 nm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的纳米材料，其特征在于，所述纳米材料为BSA:Gd,Dy@PDA-FA，Zeta电位为-30.4毫伏。
9.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（a）中混合溶液的pH为11.5-12.5。
10.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（a）中所述反应的反应时间为5-7 h。
11.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，BSA溶液的浓度为20-40毫克/毫升，RE1盐溶液或RE2盐溶液的浓度为2-4毫克/毫升。
12.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（b）中混合溶液的pH为8-9。
13.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（b）中所述反应的反应时间为11-13 h。
14.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，多巴胺的盐溶液包括多巴胺盐酸盐水溶液。
15.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，将多巴胺的盐溶液通过进样泵加入到BSA:RE1,RE2溶液中，进样泵的速率为15-25微克/分钟。
16.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，多巴胺的盐溶液的浓度为4-5毫克/毫升，BSA:RE1,RE2溶液的浓度为4-6毫克/毫升。
17.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（c）中，采用EDC、NHS和DMSO对FA进行活化，活化温度为36.5-37.5℃。
18.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，FA、EDC、NHS和DMSO的质量比为（7-9）：（5-7）：（3-5）：（1000-1200）。
19.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（c）中所述反应的反应时间为3-5 h。
20.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，BSA:RE1,RE2@PDA溶液的浓度为4-6毫克/毫升。
21.根据权利要求1所述的纳米材料，其特征在于，步骤（a）、（b）或（c）中，在反应后还包括纯化的步骤。
22.根据权利要求21所述的纳米材料，其特征在于，采用去离子水透析来纯化。
23.根据权利要求22所述的纳米材料，其特征在于，步骤（b）中，在去离子水透析后还包括分离的步骤，分离后得到BSA:RE1,RE2@PDA纳米粒子。
24.权利要求1-23任一项所述的纳米材料在制备MRI/CT成像制剂或光热治疗肿瘤药物中的应用。
25.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1-23任一项所述的纳米材料和药学上可接受的载体。
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