CN110546154B - 糖苷酶的荧光底物及其相关检测方法 - Google Patents

糖苷酶的荧光底物及其相关检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有式(I)的新的糖苷酶底物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9、V、X、Y和Z如权利要求1所定义，以及通过所述底物之一检测催化活性糖苷酶的存在的方法。

Description

糖苷酶的荧光底物及其相关检测方法
本发明涉及用于检测糖苷酶型酶活性的探针。具体地，本发明涉及用于检测催化活性糖苷酶存在的新型荧光底物和使用这种底物的检测方法。
在生物样品或化学样品的分析中，糖苷酶活性的检测可能非常有用(BoonackerE.和Van Noorden C.J.F.(2001)。活细胞代谢图谱的酶细胞化学技术，特别参考proteolysis.J.Histochem.Cytochem.49,1473-1486；Perry，1.D.，James，A.L.，K.A.，Oliver，M.，Chilvers，K.F.，Reed，R.H.，&Gould，F.K.(2006)。Evaluation of novelfluorogenic substrates for the detection of glycosidases in Escherichia coliand enterococci.Journal of Applied Microbiology,101(5),977—985；Orenga,S.,James,A.L.,Manafi,M.,Perry,1.D.,&Pincus,D.H.(2009)。Enzymatic substrates inmicrobiology.Journal of Microbiological Methods,79(2),139-155)。整个生物体、细胞或细胞提取物、生物流体或化学混合物是可以检测糖苷酶活性的生物样品或化学样品的实例。糖苷酶是一个巨大的酶家族，其包括用于多种病理的许多生物标志。它们还参与许多良性细胞过程，因而是细胞生物学家各种研究的主题。因此，例如它们的检测可以给出关于特定代谢状态或疾病状况的信息。有效的检测还可以实现高通量筛选，使得可以检测新的天然糖苷酶或通过已知酶的定向进化来开发新的糖苷酶、或通过其基因组的诱变或实验进化来改善某些微生物的糖酵解产率成为可能。
由于这个原因，能够检测糖苷酶活性的探针是非常有用的。
通过捕获探针发出的荧光来检测该活性是比在探针简单吸收过程中收集白光剩余部分更灵敏的方法，即检测阈值低得多。荧光发射的检测非常容易实现，因此荧光探针是生命科学中非常有吸引力的工具。例如，在激发态发生分子内质子转移的荧光团类，称为ESIPT(ESIPT，来自英语，“激发态分子内质子转移”)，具体描述于a)Ormson,S.M.等人的Progress in Reaction Kinetics(1994)19,45-91；b)Legourrierec,D.等人的Progressin Reaction Kinetics(1994),19,211-275；和c)Zhao,1.,Ji,S.,Chen,Y.,Guo,H.,&Yang,P.(2012).Excited state intramolecular proton transfer(ESIPT):from principalphoto physics to the development of new chromophores and applications influorescent molecular probes and luminescent materials.Physical ChemistryChemical Physics，14(25)，8803。在某些酚类化合物中发现的升高的荧光作为ESIPT现象的第一种解释可以归因于Weller(对于水杨酸甲酯：Weller,A.(1961).Fast Reactions ofExcited MolecuIles.Progress in Reaction Kinetics and Mechanism 1,187)以及Heller和Williams(对于对羟基苯基苯并唑:Heller A.,et Williams,D.L.,1.Phys.Chem.(1970)74,4473-4480)。
ESIPT荧光团类对生命科学领域的研究人员尤其具有吸引力，因为它与常规的荧光团相比具有优异的性质。ESIPT荧光团的特殊性质是：
(a)大的斯托克斯位移通常超过130nm，能够达到250nm的值，这使得使检测的灵敏度最大化的仪器选择成为可能；
(b)对光漂白具有优异的耐受性，其速率可能比模型荧光团如荧光素高几个数量级；
(c)设计在固态下发出明亮荧光的荧光团的能力，这种性质在所有已知的荧光团中是罕见的。这最后的特征使得可以在激活位点产生高强度信号，并且由扩散引起的稀释最小；
(d)设计ESIPT荧光团的能力，该荧光团以红色或近红外线发出(600nm至850nm)，其中组织透明度最大；使用这种荧光团的探针也特别适用于在活体动物中成像；最后，
(e)能够通过用对化学分析物或生化分析物具有特定反应性的替代物替换ESIPT荧光团的羟基所携带的氢原子来设计不发荧光的底物，该替代物的裂解驱动荧光的出现。
通过使用导致产生荧光的底物，酶活性检测方法的灵敏度水平与(i)光漂白率，(ii)荧光信号在其产生现场的累积程度(因此，与从该位点的扩散速率，以及与知道荧光团是否沉淀的问题)，(iii)底物功能的实际灭火/照明模式(缺少由未转换底物的荧光引起的背景)和(iv)激发光谱和发射光谱堆叠的程度(它们在基线处的分离是最有利的配置，见上文a))密切相关。(iv)具有非常特别的重要性，因为在基线处的完全分离为光源提供了选择各种滤光器的机会(为了在每个可能的波长激发荧光团)，但更重要的是，对于探测器来说(为了收集来自荧光团发出的所有波长的光子)。(iv)还通过组织自发荧光(其特征在于天然荧光团的弱斯托克斯位移)来最小化对检测过程的干扰，这是已确定的荧光团遇到的反复出现的问题，已确定的荧光团本身也具有弱的斯托克斯位移。
在重要的ESIPT荧光团类中，二氯-HPQ(6-氯-2-(5-氯-2-羟基苯基)-4(3H)-喹唑啉酮；CAS号：28683-92-3)特别令人感兴趣，因为它在水/生理介质中完全不溶，同时在固态下并仅在固态下也具有高荧光性。尽管如此，在分子探针的设计中使用二氯-HPQ是非常困难的，该分子探针提供了关于糖苷酶活性的信息。此外，已经设计的(和商业化的)基于HPQ的探针的主要活性是磷酸酶的活性，由于不可能产生具有糖基化的酚羟基的稳定的基于HPQ的探针，因为所得产物倾向于快速自发水解，这是众所周知的，释放出游离的不溶性二氯-HPQ，因此产生错误的荧光信号(“底部信号”)。还应注意到，由于酚类糖苷的固有水解不稳定性，尤其是那些使用低电子酚的酚类糖苷，如二氯-HPQ对这些糖基化合物(ELF 97葡萄糖醛酸酶底物(编号E6587)和ELF 97几丁质酶底物/N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(编号E22011))的分子探针商业化于2008年中断。事实上，已知任何基于硝基苯酚的糖苷(其也是像二氯-HPQ这样的缺电子苯酚)将在生理pH下自发水解。还已知与生理pH(pH7.4)相比，这种稳定性问题在酸性更强的pH(例如，pH6.5)下严重恶化。
近年来，通过使用自我分解的间隔基作为键合剂，对具有几种释放/间隔基/荧光团组分的酶底物的设计越来越感兴趣。可以具体引用本专利申请的发明人之一的工作，其对应于申请WO 2013/045854、WO 2014/020285和WO 2015/197981，其中使用将肽酶和/或糖苷酶底物键合到芳基上的自折叠间隔基，在切割底物后，其驱动间隔基的环化和ESIPT荧光团的释放。
然而，利用现有技术，糖苷酶的检测不够可靠(探针不稳定，在没有目标酶的情况下释放荧光)、需要太多时间(酶促反应太慢)和/或不够精确(释放的荧光团不会在一点沉淀，而是在整个培养基中扩散)。
在本文中，申请人提出了新的糖苷酶酶底物，其提供特别快速的酶促反应动力学。本发明提出使用新的间隔基，其可以产生适合于掺入ESIPT荧光团的稳定探针，从而最小化来自未加工探针的背景荧光，这使得可以显著增加灵敏度，从而可以导致待使用的数量减少，因此，特别是可以使体内成像应用成为可能，同时减少毒性问题。
本发明的目的是提出新的糖苷酶底物，其在水性介质中是稳定的并且在与释放的荧光团本身发荧光的波长非常不同的波长下保持非荧光性或轻度荧光，但是它与糖苷酶快速反应，以产生对应于ESIPT荧光团的小荧光分子。根据本发明，提出了具有以下性质的糖苷酶底物：
-根据探针上存在的糖基的选择，对特定糖苷酶的高特异性；
-由于在不存在目标酶的情况下探针的高稳定性而没有背景荧光、荧光团在酶位点上的沉淀和荧光团在培养基中不扩散；和
-在目标糖苷酶的作用下的快速加工动力学。
因此，根据本发明的糖苷酶底物使得可以保留现有技术的糖苷酶底物(即对特定糖苷酶的高特异性和没有背景荧光)，同时在目标糖苷酶的作用下具有快速加工动力学。
更具体地，本发明涉及式(I)的化合物：
其中：
-R1使得在式(I)中存在的-C(O)-OR1键断裂后获得的HOR1属于在激发态下发生分子内质子转移的荧光团类，其称为ESIPT，
-R2、R3和R4定义如下：
o或者R2是(C1至C4)烷基、R3是(C1至C4)烷基或氢原子、R4是(C1至C4)烷基，
o或者R3是(C1至C4)烷基或氢原子，R2和R4键合在一起，并与它们键合的碳原子和氮原子形成可以被水溶性基团取代的脂肪族杂环，
o或者R2是(C1至C4)烷基，R3和R4键合在一起，并与它们键合的碳原子形成脂肪族碳环，
-R5和R6相同或不同，彼此独立地表示氢原子、(C1至C4)烷基或(C5至C10)芳基，
-R7是氢原子或选自(C1至C4)烷基和(C1至C4)烷氧基的基团，
-R8表示氢原子、或经取代或未经取代的(C1至C10)烷基、或D1-D2-D3基团，其中：
o D1表示三唑基或-CH2-三唑基，
o D2表示(C1至C10)亚烷基、(C1至C10)亚烯基或(C1至C10)亚炔基，所述基团可能被一个或数个选自O或N的杂原子、二价糖基、-O-(CHR-CHR’-O)n-基团或-N-(CHR-CHR’-O)n-中断，n是1至20的整数，R和R’相同或不同，表示H或CH3，条件是R和R’不同时是CH3、氨基酸或肽、或这些基团的组合，
o D3表示与D2键合的马来酰亚胺己酰基基序、氨基酸、肽、叶酸、抗体或抗体片段，通过其中包含的羧酸官能团形成酯或酰胺键，
-R9和R’9相同或不同，表示氢原子、或吸电子基团如卤素原子、或选自-NO2、-CN或-NH-C(O)-CH2-Ab的基团，其中Ab表示抗体，
-V表示氧原子或硫原子，
-X、Y和Z为：
o或者X表示CR10、Y表示CR’10和Z表示OR0，
o或者X表示CR10、Y表示COR0和Z表示R’10，
o或者X表示CR10、Y表示氮原子和Z表示OR0，
o或者X表示氮原子、Y表示COR0和Z表示R10，
其中：
o R0表示通过其异头碳原子与式(I)分子的其余部分键合的糖基，和
o R10和R’10相同或不同，表示氢原子或给电子基团，如(C1至C20)烷基、(C5至C24)芳基或(C1至C20)烷氧基，
其按所有比例的光学异构体混合物形式或富集了光学异构体的形式。
根据所选择的糖基，本发明的化合物(I)充当能够通过检测荧光揭示特定糖苷酶酶活性存在的分子探针。存在于式(I)化合物中的R0-O键能够在作为裂解反应催化剂的目标葡糖苷酶的存在下通过水解裂解。
更具体地，探针在遇到目标糖苷酶之前是不可见的(即，“隐形探针”)，但是当它被所述酶化学修饰时，它通过级联反应碎裂以产生强荧光。探针由4个分子部分组成：i)串联的自动折叠间隔基，其一端带有ii)起目标酶底物作用的糖基，另一端带有iii)OR1基团，当在水性介质中通过所述断裂以其羟基化形式HOR1释放时，属于ESIPT荧光团类。
该对间隔基包括消除型间隔基和预先组织用于环化的环化型间隔基。这种间隔基对的特定选择使得可以获得相应分子探针的两个基本性质：(a)它对自发恶化不敏感，因此对产生假阳性荧光信号不敏感；(b)它确保了目标酶在加工过程中的快速碎裂动力学，以适应生命科学领域的应用。R0基团可以通过目标糖苷酶的作用从分子的其余部分裂解，这产生不稳定的中间体，其通过自发和快速的消除反应和环化/裂解反应自动消除，以释放荧光沉淀并因此产生荧光信号。这种独特的分子结构使得特别快速的酶促反应成为可能，特别是比使用文献WO2014/020285中描述的探针所获得的快得多。
因此，本发明涉及用于在人体内检测糖苷酶的式(I)化合物，不论它们在本专利申请中描述的实施变体如何。根据本发明的式(I)化合物还可用于检测动物体内的糖苷酶。
根据另一个实施方案，本发明涉及通过本发明的化合物(I)体外或离体检测糖苷酶存在的方法。更具体地，本发明涉及用于体外或离体检测糖苷酶存在的方法，包括以下步骤：
-将认为含有所述糖苷酶的样品与根据本发明的化合物(I)接触，
-应用合适的条件，以便通过裂解O和R0之间的共价键，然后裂解-C(O)OR1键，在这对间隔基的消除和环化反应后释放HOR1，使荧光化合物形成，特别是以沉淀物的形式形成，和
-所述荧光沉淀物的定量分析或定性分析。
使用根据本发明的式(I)化合物，通过裂解O和R0之间的共价键，然后裂解-C(O)-OR1键，在这对间隔基的消除和环化后，可以获得的沉淀物是强荧光的，而相应的式(I)的化合物是轻度荧光或根本不发荧光。根据本发明的化合物，即糖苷酶酶底物，表现得像根据开/关模式操作的探针。
特别地，根据本发明的检测方法可以在生理条件下实施，特别是在缓冲至7.4的pH的水性介质中实施。
本发明还涉及式(II)化合物，其是合成式(I)化合物的中间体：
其中：
-R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9和V如对式(I)化合物所定义的，
-R12表示氢原子或胺官能团保护基团，
-X、Y’和Z’为：
o或者X表示CR10、Y’表示CR’10和Z’表示OR’0，
o或者X表示CR10、Y’表示COR’0和Z’表示R’10，
o或者X表示CR10、Y’表示氮原子和Z’表示OR’0，
o或者X表示氮原子，Y’表示COR’0，Z’表示R10，其中R’0表示R0基团，其所有醇官能团均受保护基团保护，R0、R10和R’10如式(I)化合物所定义的，
其以所有比例的光学异构体混合物形式或富集了光学异构体的形式。
本发明还涉及制备化合物(I)的方法，其包括以下步骤：
-获得如本发明上下文中所定义的化合物(II)，
-获得式(III)的化合物
其中R1如式(I)化合物所定义的，M表示离去基团，特别是卤原子，尤其是氯原子、咪唑基或对硝基苯氧基，优选M表示氯原子。
-通过所述化合物(II)和化合物(III)的加成反应得到化合物(IV)，所述化合物(IV)具有下式：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9、V、X、Y’和Z’如式(I)和式(II)的化合物所定义的，和
-使所述化合物(IV)的R’O基团中存在的醇官能团脱保护，以获得它们的化合物(I)。
至少在没有另外说明的情况下，根据本发明的不同化合物可以以根据所有比例混合的所有可能的光学异构体形式存在。根据一个具体实施方案，发现包含不对称碳原子的本发明化合物为外消旋形式，其中R和S形式以几乎相等的比例存在。根据另一个实施方案，本发明的式(I)化合物可以以富集了非对映异构体或对映异构体的形式存在，其中非对映异构体或对映异构体过量大于80％，或甚至大于95％，或者为纯异构形式，即非对映异构体或对映异构体过量大于99％。
通过经典分离技术将化合物(I)分离为富集了非对映异构体或对映异构体的形式：例如，外消旋盐与光学活性酸或碱的分级重结晶，其原理是众所周知的，或者最常见的是手性或非手性相上的经典色谱技术。
如果适用，当根据本发明的化合物包含可成盐的官能团时，它们可以以盐的形式存在，特别是盐酸盐或三氟乙酸盐。将以更详细的方式描述本发明。首先，将定义使用的某些术语。
定义
在本发明的上下文中，“脂肪族杂环”是指经取代或未经取代的饱和环，其包含3元至20元，优选5元至10元，更优选为5元、6元、7元或8元，并且包含至少一个例如O、N或S的杂原子。
在本发明的上下文中，“脂肪族碳环”是指经取代或未经取代的饱和环，其包含3元至30元，优选5元至10元，更优选5元、6元、7元或8元，仅由碳原子构成。
在本发明的上下文中，“烷基”是指饱和的烃链，其可以是直链或带支链的。优选地，至少在没有特别说明的情况下，术语烷基指包含1至12个碳原子、优选1至6个碳原子的烷基，尤其是烷基(C1至C4)基团。甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基是(C1至C4)烷基(具有1至4个碳原子的烷基)的实例。
“亚烷基”是指二价烷基。
“芳基”是指单环、双环或多环不饱和烃，至少在没有特别说明的情况下，其包含5元至24元，5元至20元，5元至15元，优选包含交替的单键双键和至少一个芳香族环。作为任何芳基的实例，可以列举苯基、萘基、蒽基、菲基和肉桂基。术语芳基包括这些单环、双环或多环不饱和的烃环，其中一个组成碳以-C(O)羰基形式存在，例如1H-非那烯-1-酮(CAS号548-39-0)。
“亚芳基”是指二价芳基。
“杂芳基”是指单环、双环或多环碳环，至少在没有特别说明的情况下，其包含5元至24元，优选6元至20元，更优选6元至15元，并且包含至少一个芳香族基团和至少一个选自氧原子、氮原子或硫原子的杂原子，杂原子与碳环结合。作为杂芳基的实例，可以提及2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基、2-糠酰基或3-糠酰基、2-噻吩基或3-噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、苯并噻唑基、唑基、苯并/>唑基、异/>唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、噻二唑基、/>二唑基、三唑基、哒嗪基、吲哚基、草氨酰、4(1H)-喹啉基、二苯并噻吩基、二苯并呋喃基和9H-咔唑基。术语杂芳基还包括其中一个组成碳原子以羰基-C(O)-形式存在，例如4(3H)-嘧啶酮基或4(3H)-喹唑啉酮基。
当陈述基团被取代而没有进一步说明时，这意味着它被一个或几个取代基，特别选自氯原子、溴原子、碘原子或氟原子、氰基、烷基、三氟烷基、三氟甲基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环烷基、氨基、烷氨基、二烷氨基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基取代，所述基团本身能够被取代。用于定义这些取代基的术语是本领域技术人员通常认可的术语。
“烷氧基”和“芳氧基”分别是指-O-烷基和-O-芳基，其中烷基和芳基如本发明上下文中所定义的。
“卤代烷基”是指饱和的、直链或带支链的烃链，其中至少一个氢原子已被卤原子取代。
“糖苷酶”是指水解酶、糖苷酶，其具有催化糖苷键水解的能力，从而释放至少一种糖苷化合物。
“糖基”基团是指通过糖基键，即通过其异头碳与分子的其余部分结合的任何单糖或多糖。异头碳可以采用α构型或β构型。作为糖基的实例，可以列举单糖基，即由单糖单元形成的糖基，和多糖基，即由若干相同或不同的糖单元形成的糖基。糖单元可以具体为己糖类或戊糖类，选自例如半乳糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖、塔罗糖、岩藻糖、果糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖和木糖。糖单元的立体构型可以是L或D构型。
通常，术语“烯基”表示包含至少一个碳-碳双键的直链或带支链的烃链，除非另有说明，否则表示具有2至20个碳原子，优选2至6个碳原子。
在本发明的上下文中，术语“亚烯基”表示二价烯基。
术语“炔基”表示包含至少一个碳-碳三键的直链或带支链的烃链，除非另有说明，否则表示具有2至12个碳原子，优选2至6个碳原子。
“亚炔基”是指二价炔基。
“水溶性基团”是指亲水性基团，其可以提高探针在水性介质中的溶解度，特别是相对于仅通过用氢原子取代水溶性基团而与之不同的探针。
“荧光”是分子由给定波长的光激发而发射更长波长的光的性质。荧光是由荧光团与入射光子的相互作用产生的现象。这个过程也称为激发。光子的吸收导致荧光团中的电子从其基态变为更高的能级。然后，电子通过发射光子返回其原始水平。该过程称为荧光发射。然后荧光团发射波长比吸收光子的波长更长的光。这仅仅是因为在激发态的生命周期内，由于能量耗散，发射光子的能量小于吸收光子的能量。这是专利申请WO2004/058787中给出的定义。
根据本发明的化合物(I)被称为“糖苷酶底物”，因为它们在化学反应特别是由糖苷酶催化的水解反应过程中转化为另一种物质。在水性介质中进行这种反应时，化合物(I)(也称为“探针”)在目标糖苷酶的作用下裂解，这导致形成荧光沉淀物和非荧光产物。
在本发明的上下文中，“间隔基对”是化合物(I)的片段，其一端带有糖基-R0基团，另一端带有-OR1基团，其通过水解释放后，属于ESIPT类荧光团。这对间隔基由消除型的第一间隔基(其将在释放R0的水解后经历消除反应)和第二循环型间隔基(在消除了消除型间隔基后，它将环化，从而可以产生HOR1)组成。图1表示使用式(I)化合物的降解机理，其使用根据本发明的间隔基对。
式(I)的化合物
本发明涉及式(I)的化合物：
其中：
-R1使得在式(I)中存在的-C(O)-OR1键断裂后获得的HOR1属于在激发态下发生分子内质子转移的荧光团类，其称为ESIPT，
-R2、R3和R4定义如下：
o或者R2是(C1至C4)烷基、R3是(C1至C4)烷基或氢原子、R4是(C1至C4)烷基，
o或者R3是(C1至C4)烷基或氢原子，R2和R4键合在一起，并与它们键合的碳原子和氮原子形成可以被水溶性基团取代的脂肪族杂环，
o或者R2是(C1至C4)烷基，R3和R4互相键合在一起，并与它们键合的碳原子形成脂肪族碳环。
-R5和R6相同或不同，彼此独立地表示氢原子、(C1至C4)烷基或(C5至C10)芳基，
-R7是氢原子或选自(C1至C4)烷基和(C1至C4)烷氧基的基团，
-R8表示氢原子、或经取代或未经取代的(C1至C10)烷基、或D1-D2-D3基团，其中：
o D1表示三唑基或-CH2-三唑基，
o D2表示(C1至C10)亚烷基、(C1至C10)亚烯基或(C1至C10)亚炔基，所述基团可能被一个或多于一个选自O或N的杂原子、二价糖基、-O-(CHR-CHR’-O)n-基团或-N-(CHR-CHR’-O)n中断，其中n是1至20的整数，R和R’相同或不同，表示H或CH3，条件是R和R’不同时是CH3、氨基酸或肽、或这些基团的组合，
o D3表示与D2结合的马来酰亚胺己酰基基序、氨基酸、肽、叶酸、抗体或抗体片段，通过其中包含的羧酸官能团形成酯或酰胺键，
-R9和R’9相同或不同，表示氢原子、或吸电子基团如卤素原子、或选自-NO2、-CN或-NH-C(O)-CH2-Ab的基团，其中Ab表示抗体，
-V表示氧原子或硫原子，
-X、Y和Z为：
o或者X表示CR10、Y表示CR’10和Z表示OR0，
o或者X表示CR10、Y表示COR0和Z表示R’10，
o或者X表示CR10、Y表示氮原子和Z表示OR0，
o或者X表示氮原子、Y表示COR0和Z表示R10，
其中：
o R0表示通过其异头碳原子与式(I)分子的其余部分键合的糖基，和
o R10和R’10相同或不同，表示氢原子或给电子基团，如(C1至C20)烷基、(C5至C24)芳基或(C1至C20)烷氧基，
其以所有比例的光学异构体混合物形式或富集了光学异构体的形式。
选择OR1基团，使得在裂解-C(O)-OR1键后释放的对应于R1OH的所得荧光沉淀物是ESIPT荧光团。
优选地，R1是包含一个或多于一个经取代或未经取代的芳香族环的芳基，所述环能够包含一个或多于一个选自氮原子、氧原子或硫原子的杂原子和/或一个或多于一个形式为C＝O羰基的碳原子。
这种OR1基团的实例对应于式(A1)：
其中：
-或者X2是氧原子，X1是-NH2、-OH、-SH、(C1至C20)烷基、(C5至C24)芳基、-O-(C1至C20)烷基、-O-苯基、-NH-(C1至C20)烷基或-NH-苯基，-S-(C1至C20)烷基或-S-(C5至C24)芳基，所述烷基和苯基可以是经取代的或未经取代的，
或者X2表示氮原子并与X1键合，然后X1表示CH、O、S、N或NH，以形成经取代或未经取代的(C5至C24)杂芳基，
表示经取代或未经取代的(C5至C24)芳基或(C5至C24)杂芳基，例如选自苯基、萘基和：
所述基团可以是经取代或未经取代的，
其中X3表示S、O或NRd，Rd表示氢原子或(C1至C4)烷基。
ESIPT荧光团显示斯托克斯位移超过100nm并且通常接近200nm。如果酚类型的OH基团引起激发态的质子的分子内转移、烷基化、酰基化或以其他方式官能化，则所有ESIPT荧光团都失去对应于斯托克斯位移大于100nm的荧光发射。在通过照射激发期间，该官能化防止氢原子转移到式(A1)提供的图示中的X2杂原子，从而防止了质子转移方法的荧光发射特征。
将HOR1羟基引入式(I)化合物的氨基甲酸酯基团中可防止质子转移。然后可以使用在-C(O)-OR1键断裂后获得的羟基进行分子内质子转移。
最常见的是，R1基团对应于未经取代或经取代的苯基和/或并入一个或多于一个不饱和碳环，可能包含杂原子如氮。当该OR1苯氧基衍生物未与底物键合时，其质子化形式对应于属于ESIPT类荧光团的HO-R1酚衍生物。
例如，一些-OR1衍生物对应于以下优选结构(A2)或(A3)中的一个：
其中：
o T是-NH-C(O)-、-S-、-O-、-NH-、-N((C1至C20)烷基)-或-N((C5至C24)芳基)-，
o Re是氢原子或吸电子碳取代基，如-CN或-COORh，Rh表示(C1至C4)烷基，或Re是-CONRiRj，Ri和Rj相同或不同，表示氢原子、或(C1至C4)烷基，或Re是-CF3、或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基，
o Rf是氢原子、氯原子、溴原子、碘原子或氟原子、-OH、-NH2、-NRkRI、-NHRk或-ORk，其中Rk和RI相同或不同，各自独立地表示(C1至C4)烷基，
或者Re和Rf彼此键合以形成饱和或不饱和的、经取代的或未经取代的4元或5元烃链，其可能被一个或多于一个选自N、S和O的杂原子中断，
o Rg是氢原子、Br原子、Cl原子、I原子或F原子，
其中：
o T’是-NH2、-OH、(C5至C24)芳基、(C1至C4)烷基、-SH、-NHR’g、-OR’g、-NR’gRh’或-SR’g，R’g和Rh’相同或不同，表示(C1至C4)烷基或芳基，
o R’e是氢原子或吸电子碳取代基，如-CN或-COOR’i，其中R’i表示(C1至C4)烷基，
或者R’e是-CONR’jR’k，R’j和R’k相同或不同，表示氢原子或(C1至C4)烷基，或R’e是-CF3、或2-唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉-2-基，
o R’f是氢原子、氯原子、溴原子、碘原子或氟原子、-OH、-NH2、-NR’IR’m或-OR’I，其中R’I和R’m相同或不同，表示(C1至C4)烷基。
o或者R’e和R’f彼此键合以形成饱和或不饱和的、经取代或未经取代的4元或5元烃链，其可能被一个或多于一个选自N、S和O的杂原子中断。
可以具体参考申请WO 2013/045854、WO 2014/020285和WO 2015/197981，其给出了可以用于本发明的这种ESIPT荧光团的实例。
根据本发明的一个特定实施方案，R1是具有-OR1的芳香族基团，其对应于下式(A4)或(A5)中的一个：
这种荧光团(A5大约170nm)或HPQ的任何类似物的非常大的斯托克斯位移将有助于探针的优异灵敏度并使释放的荧光团容易与天然荧光区分开，天然荧光可以来自在其上进行分析的生物样品。
根据本发明的一个实施方案，R2是(C1至C4)烷基，R3是(C1至C4)烷基或氢原子，R4是(C1至C4)烷基。根据另一个特定实施方案，R2、R3和R4相同或不同，表示(C1至C4)烷基，例如甲基或乙基。根据一个特定实施方案，R2＝R3＝R4＝-CH3。
根据另一个实施方案，R3是(C1至C4)烷基或氢原子，R2和R4键合在一起，并与它们键合的碳原子和氮原子形成可以被水溶性基团取代的脂肪族杂环。根据一个实施方案，R3是氢原子或(C1至C4)烷基，优选氢原子，R2和R4彼此键合并形成-(CH2)m-链，其中m＝3、4或5。根据另一个实施方案，R3为氢原子或(C1至C4)烷基，优选为氢原子，R2和R4彼此键合，在R2至R4的方向上形成-CH2CH2-NR11-CH2-链，R11表示氢原子或-(L)n-GP，其中n等于0或1，L为连接臂，GP为水溶性基团，即化合物(I)具有下式：
通常，用于合成目的，n＝1且L是连接臂，具体地，-(L1)m1-(L2)m2-(L’1)m’1-臂(在哌嗪→GP基团方向)，其中：
-L1和L’1相同或不同，其选自-O-、-NH-、-N(C1至C6)烷基-、-N(苯基)-、-N(芳基)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-O-、-NHC(O)-O-、-OC(O)-NH-、-NHC(O)-NH-、-S-、-SO2-、-N＝N-、-NHC(O)-和-CONH-；
-L2选自以下二价基团：(C1至C20)亚烷基、(C1至C20)亚烯基、(C1至C20)亚炔基、(C6至C24)亚芳基、(C7至C44)烷基亚芳基、(C7至C44)烯基亚芳基、(C7至C44)炔基亚芳基、(C7至C44)烷基亚环烷基、(C7至C44)烯基亚环烷基、(C7至C44)炔基亚环烷基、(C7至C44)烷基杂亚环烷基、(C7至C44)烯基杂亚环烷基、(C7至C44)炔基杂亚环烷基；所述基团可能被三唑基团中断或终止，其可以是经取代或未经取代的，特别是被选自(C1至C10)烷氧基、(C1至C10)烷基、(C6至C10)芳基、酰胺、酰亚胺、磷化物、氮化物、(C1至C10)烯基、(C1至C10)炔基和-OH的一种或多于一种取代基取代；和
-m1、m’1和m2相同或不同，等于0或1。
当L臂存在时，将选择L臂以使GP基团从哌嗪延伸或用于合成原因。根据一个优选的实施方案，L表示-(L1)m1-(L2)m2-(L’1)m’1，其中L1＝-C(O)-，m1＝m2＝1，m’1＝1或0，L2和L’1如上所定义的，具体而言，L表示-C(O)-(CH2)p-L3-，其中p等于1、2、3或4，L3是三唑基，特别是1H-1,2,3-三唑基。
GP是水溶性基团。作为水溶性基团的实例，引用可以在水溶液中形成带电物质的基团。作为水溶性GP基团的实例，引用选自胺(伯胺、仲胺或叔胺)、脒、胍或四唑的F1官能团；F2阳离子或阴离子官能团，特别是铵、羧酸根、磺酸根或磷酸根类基团；包括这些F1和/或F2官能团中的一个或多于一个的基团；聚乙二醇；糖类或多糖类，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖；肽基团如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、TAT-肽。作为胺官能团的实例，引用-NH2、-NH(C1至C4)烷基和其中烷基相同或不同并且包含1至4个碳原子的二烷基胺。
根据另一个实施方案，R2是(C1至C4)烷基，R3和R4键合在一起，并与它们键合的碳原子形成脂肪族碳环，优选环己基。
这两种预先组织间隔基用于环化的方法，包括在-NC(V)-O-基团的α碳上引入两个烷基取代基(或形成碳环)，或包括在杂环中的氮-N-C(V)-O-和其α碳之间的键合，加速消除过程。
根据一个实施方案，R5和R6相同并表示氢原子。根据一个实施方案，R7表示氢原子或(C1至C4)烷基，如甲基，优选氢原子。
根据一个实施方案，R5、R6和R7分别表示氢原子。
根据一个实施方案，R8是氢原子。
根据另一个实施方案，R8是-D1-D2-D3基团，其中D1、D2和D3如本发明上下文中所定义的。根据该实施方案，D3可以特异性地表示叶酸基序、抗体或肽，其是靶向细胞受体的基团，以便改善式(I)的化合物对某些特定细胞的选择性。
根据本发明的一个特定实施方案，R8是-D1-D2-D3基团，其中D1表示-CH2-三唑基，D2表示(C1至C10)亚烷基，优选被一个或多于一个选自O或N，优选O的杂原子中断，D3表示马来酰亚胺己酰基基序、氨基酸、肽、叶酸、抗体或抗体片段，优选叶酸，其通过羧酸官能团与D2键合，从而形成酰胺或酯键，优选酰胺官能团。根据一个特定实施方案，R8是-D1-D2-D3基团，具有以下结构式：
根据一个实施方案，R9或R’9基团中的至少一个表示卤原子、-NO2基团或-CN基团，优选-NO2基团。根据一个优选的实施方案，R9表示氢原子，R’9表示卤原子、-NO2基团或-CN基团，优选-NO2基团。
根据一个实施方案，R10和R10’(如果适用)表示氢原子。根据一个实施方案，V表示氧原子。
R0基团具有能够通过糖苷酶的作用从分子的其余部分裂解的特征。该酶在R0和与其键合的氧原子之间的断裂中起催化剂的作用。这种断裂可以是在水性介质中水解的结果，其中糖苷酶将起催化剂的作用。这是因为所述糖苷酶被称为催化活性酶。
R0表示通过其异头碳原子与分子的其余部分键合的糖基。R0可以通过糖苷酶的催化作用从式(I)的化合物的其余部分裂解，特别是在水性介质中。作为根据本发明的荧光探针可以靶向的糖苷酶的实例，引用N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-纤维二糖酶、β-几丁二糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-麦芽糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-L-岩藻糖苷酶、L-艾杜糖苷酶或纤维素酶(Orenga,S.,James,A.L.,Nanafi,N.,Perry,1.D.,&Pincus,D.H.(2009).Enzymatic substrates in microbiology.Journal of MicrobiologicalMethods,79(2),139-155)。
优选地，选择R0基团以使其对目标糖苷酶具有特异性。另一方面，某些糖苷酶能够裂解一组不同的R0基团；其中，引用己糖胺酶。
对应于在糖苷酶存在下在水性介质中可裂解的R0-O基团的所有可能的糖基可以用作R0。糖基单元可以被官能化或不被官能化，特别是具有乙酰基或氨基。N-乙酰基己胺是糖基的实例。最常见的是，糖基包含1至50个糖单元。在多糖基的情况下，这可以作为均聚物或具有无规、交替或嵌段结构的共聚物。
R0基团的实例如下：选自半乳糖基、葡糖基、甘露糖基、古洛糖基、阿洛糖基、阿卓糖基、艾杜糖基、塔罗糖基、岩藻糖基、果糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、核糖基、木糖基、葡糖醛酸基和N-乙酰基-氨基己糖基的单糖基和由几个相同或不同的这些单糖基构成的多糖基。
根据一个实施方案，R0是在糖苷酶的作用下可裂解的基团，糖苷酶选自N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-纤维二糖酶、β-几丁二糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-麦芽糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-L-岩藻糖苷酶、L-艾杜糖苷酶或纤维素酶；R0是由其异头碳结合的单糖基化基团，选自半乳糖基、葡糖基、甘露糖基、古洛糖基、阿洛糖基、阿卓糖基、艾杜糖基、塔罗糖基、岩藻糖基、果糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、核糖基、木糖基、葡糖醛酸基和N-乙酰基-氨基己糖基，或是由几个，例如2至20个、优选2至10个、更优选2至6个相同或不同的这些单糖基化的基团构成的多糖基团。
根据一个实施方案，R0是在半乳糖苷酶、如β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、葡萄糖苷酶、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰基-D-半乳糖胺酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、特别是β-葡萄糖醛酸酶或纤维素酶作用下可裂解的基团；R0是由其异头碳结合的单糖基化基团，选自D-葡糖醛酸基、L-艾杜糖基、D-吡喃葡萄糖基、D-吡喃半乳糖基、N-乙酰基-D-氨基葡糖基、N-乙酰基-D-氨基半乳糖基、D-吡喃甘露糖基、L-吡喃葡萄糖基，或是由几个，例如2至20个、优选2至10个、更优选2至6个相同或不同的这些单糖基化的基团构成的多糖基团。
根据一个实施方案，X、Y和Z为：
-或者X表示CR10、Y表示CR’10和Z表示OR0，
-或者X表示CR10、Y表示COR0和Z表示R’10，
R10、R’10和R0如本发明上下文中所定义。
在本发明的上下文中，将特别使用组合给出的取代基的具体定义。
根据第一个具体实施方案，化合物(I)如下式(Ia)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R0和V如本发明上下文中所定义的：
根据第二个具体实施方案，化合物(I)如下式(Ib)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R1、R2、R3、R4、R9、R’9、X、Y和Z如本发明上下文中所定义的：
根据第三个实施方案，化合物(I)如下式(Ic)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R0和R1如本发明上下文中所定义的：
根据第四个实施方案，化合物(I)如下式(Id)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R1、R2、R3、R4、R9、R’9、D1、D2、D3、X、Y和Z如本发明上下文中所定义的：
根据第五个实施方案，化合物(I)如下式(Ie)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R0、R1、D1、D2和D3如本发明上下文中所定义的：
根据一个具体实施方案，化合物(I)如下式(If)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R0如本发明上下文中所定义的：
根据一个具体实施方案，本发明涉及根据所有比例的光学异构体混合物形式的化合物，或作为富集了光学异构体的形式的化合物，其选自：
式(II)化合物
本发明还涉及式(II)的化合物：
其中：
-R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9和V如式(I)的化合物所定义的，
-R12表示氢原子或胺官能团保护基团，
-X、Y’和Z’定义如下：
o或者X表示CR10、Y’表示CR’10和Z’表示OR’0，
o或者X表示CR10、Y’表示COR’0和Z’表示R’10，
o或者X表示CR10、Y’表示氮原子和Z’表示OR’0，
o或者X表示氮原子、Y’表示COR’0和Z表示R10，
其中R0’表示氮原子，其所有醇官能团均受保护基团保护，R0、R10和R’10如式(I)的化合物所定义的，
其为所有比例的光学异构体混合物形式或为富集了光学异构体的形式。
式(II)的化合物是式(I)的化合物的合成中间体，胺官能团保护基被理解为例如Protective Groups in Organic Synthesis,Greene T.W.et Wuts P.G.N.,ed.JohnWiley and Sons,2006和Protective Groups,Kocienski P.J.,1994,Georg ThiemeVerlag中描述的那些保护基团。
根据一个实施方案，R12是胺官能团的保护基团。例如，R12表示选自烯丙基或氨基甲酸酯基团的胺官能保护基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)基团、氟苯基甲氧基羰基(Fmoc)基团、烯丙氧基羰基(Alloc)基团或2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)基团。
根据一个具体实施方案，R12表示氢原子。
根据一个实施方案，R’0表示R0基团，其醇官能团被醇官能保护基保护，优选在化合物(II)和(III)之间的反应过程中使用的反应条件下，特别是甲硅烷基如三甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基保护；其以缩醛特别是1,3-二氧戊环的形式；或以脂肪酸酯的形式。
根据一个实施方案，化合物(II)如下式(IIa)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R12、R0和V如本发明上下文中所定义的：
根据本发明的第二个具体实施方案，化合物(II)如下式(IIb)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R2、R3、R4、R9、R’9、R12、X、Y和Z如本发明上下文中所定义的：
根据第三个实施方案，化合物(II)如下式(IIc)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R0和R12如本发明上下文中所定义的：
根据本发明的第四个具体实施方案，化合物(II)如下式(IId)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R2、R3、R4、R9、R’9、R12、D1、D2、D3、X、Y和Z如本发明上下文中所定义的：
根据第五个实施方案，化合物(II)如下式(IIe)所示，其为所有比例的光学异构体混合物的形式，或为富集了光学异构体的形式，其中R0、R12、D1、D2和D3如本发明上下文中所定义的：
制备式(I)的化合物的方法
本发明还涉及制备化合物(I)的方法，如在本发明的上下文中所述，包括以下步骤：
-获得如本发明上下文中所定义的化合物(II)，
-获得式(III)的化合物
其中R1如式(I)的化合物所定义的，M表示离去基团，特别是卤原子，尤其是氯、咪唑基或对硝基苯氧基，优选M表示氯原子。
-通过所述化合物(II)和化合物(III)的加成反应获得化合物(IV)，所述化合物(IV)具有下式：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9、V、X、Y’和Z’如式(I)和式(II)的化合物所定义的，和
-使所述化合物(IV)的R’0基团中存在的醇官能团脱保护，以获得所述化合物(I)。
根据一个实施方案，化合物(II)至化合物(Ⅲ)的加成反应用其中R12是氢原子的化合物(II)进行。
根据另一个实施方案，得到其中R12不是氢原子的化合物(II)，并且在化合物(II)至化合物(III)的加成反应之前进行使化合物(II)的胺官能团脱保护的步骤以获得化合物(II)，例如R12＝H。
当V＝O时，化合物(II)可以根据以下步骤有利地获得：
-获得以下式(V)的化合物：
-获得式(VI)的化合物：
-通过所述化合物(VI)与化合物(V)的加成反应获得化合物(II)，
其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9、R12、X、Y’和Z’如本发明上下文中所定义的，并且K表示离去基团，特别是卤素，尤其是氯或咪唑基或对硝基苯基。
当R8＝D1-D2-D3时，可以通过点击化学反应引入R8。三唑基团的形成可以通过-N3和炔基官能团之间的反应使用本领域技术人员公知的技术来进行。
更具体地，当R8＝D1-D2-D3且D1表示-CH2-三唑基、D2表示(C1至C10)亚烷基，优选被一个或多于一个选自O或N、优选O的杂原子中断，D3表示叶酸基序，通过其中包含的羧酸官能团与D2结合从而形成酰胺键时，R8可以通过式(I)的前体负载的炔与根据惠斯根环加成反应的叠氮化物之间的反应引入。在叶酸的酸官能团与式H2N-D2-N3的化合物的胺官能团之间的反应之前形成叠氮化物。
优选地，还可以使用实施例中示出的方法。
检测糖苷酶的存在
根据本发明的式(I)的化合物还可用于检测动物或人类体内的糖苷酶。
式(I)的化合物的施用可以通过静脉内或腹膜内注射完成，或通过使用例如在溶液中含有分子的喷雾经皮肤完成。
可以使用荧光或落射荧光型X射线断层摄影技术在成像室中进行式(I)化合物的荧光分析。本发明还涉及通过本发明的化合物(I)体外或离体检测糖苷酶存在的方法。更具体地，本发明涉及用于体外或离体检测糖苷酶存在的方法，包括以下步骤：
-将认为含有所述糖苷酶的样品与根据本发明的化合物(I)接触，
-通过裂解O和R0之间的共价键，然后裂解-C(O)-OR1键使HOR1释放，应用适于形成荧光化合物，特别是以沉淀物的形式的条件，和
-定量分析或定性分析所述荧光沉淀物。
样品可以是来自人类、动物、植物或微生物的任何合适的生物样品。在来自人类样品或动物样品的情况下，该样品可以具体地是生物流体的样品，特别是全血、血清、血浆、尿液、组织样品或分离细胞样品的样品，尤其是细胞培养基的样品。在来自植物样品的情况下，该样品可以是植物提取物、真菌或藻类、活细胞，特别是细胞培养基的提取物。样品也可以直接包含植物。在来自微生物的样品的情况下，微生物可以是细菌、病毒、真菌或酵母，也可以是微生物群。样品可以直接包含微生物、或微生物的提取物、或甚至是培养微生物的培养基。在所有情况下，样品可以原样使用，或者可以在放入探针之前制成本领域技术人员熟知的富集型或培养型制剂。
在来自动物、植物或微生物的样品的情况下，本发明涉及检测催化活性糖苷酶的存在的方法，包括以下步骤：
-将认为含有所述糖苷酶的样品与根据本发明的化合物(I)接触，
-应用合适的条件，以便通过裂解O和R0之间的共价键，然后裂解-C(O)OR1键，在这对间隔基的消除和环化反应后，使荧光化合物形成，特别是以沉淀物的形式形成，和
-定量分析或定性分析所述荧光沉淀物。
化合物或荧光沉淀物的分析可包括：
-将荧光沉淀物暴露于能够在荧光沉淀物的吸收波长下产生光的光源的步骤，和
-检测所得沉淀物的荧光的步骤。
该分析还可以包括在检测荧光的步骤之后，基于由所述荧光沉淀物提供的信号对分析的样品进行分选的步骤。分选的样品可以是在空间，例如微生物培养物的培养皿中分离的微生物菌落。分选的样品也可以是含有生物分子或微生物菌落的小物体、液体、固体、凝胶状或非均相组合物。当在几个样品上并行进行检测时，例如可以通过在设备中转向设置成运动的样本流，使得可以根据代表发射荧光的光学信号来完成分选，例如流式细胞术或数字毫米流体或微流体设备。
本发明通过使用ESIPT荧光团的荧光成像可以获得糖苷酶的活性。有利地，没有观察到由于自发降解引起的背景噪音(即，在生理培养基中不存在目标糖苷酶)。探针本身略微发荧光或者根本不发荧光，特别是在设置检测/成像仪器的ESIPT荧光团光纤的发射波长处。因此，探针以开/关模式起作用，并且可以用于以最大灵敏度开发分析。根据所选择的R0基团，本发明可以靶向糖苷酶，对特定的糖基具有高选择性。
根据本发明的探针对于生命科学中的几种高灵敏度应用是有意义的，具体地：(1)在琼脂平板上由细菌菌落表达的糖苷酶活性的高产率靶向(菌落分析)；(2)生物流体中的糖苷酶的体外检测(血液学等)；(3)在流式细胞术中观察单个细胞水平上的糖苷酶活性；(4)培养细胞中亚细胞糖苷酶的检测(共聚焦荧光显微镜)；(5)糖苷酶的组织化学检测(组织水平)；和最后(6)，整个动物的体内图像。
因此，作为根据本发明的糖苷酶底物的式(I)化合物具有大量潜在的应用。这些应用的实例包括细菌菌落分析的设计。这些目前在琼脂培养皿(培养皿)上进行，其中可以区分多达3000个菌落，而不必将它们主动分离到单独的区室中，例如多孔培养皿中包含的孔。因此，有可能(1)对临床样品进行设计测试，使得可以从一组细菌系中鉴定出感兴趣的致病系，以及(2)完成由经典细菌宿主(通常是商业的)表达的一组自产蛋白的大规模平行测试。该蛋白质集合可以理解为含有特别感兴趣的蛋白质，例如，对特定糖基具有选择性的糖苷酶、或水解非天然糖苷键的糖苷酶。特别是在糖苷酶或酶的定向进化领域，对筛选非常大量蛋白质变体的有效和灵敏分析的需求很高，容易超过106。根据本发明的探针的应用可以最容易地设想通过在将琼脂溶液倒入培养皿中或在其自身凝胶化之前溶解在琼脂溶液中。作为替代方案，通过在将过滤器引入菌落之前浸没过滤器将底物与菌落一起孵育。根据本发明的探针有助于这种菌落分析的主要益处是荧光团的原位沉淀；因此，荧光信号的稀释度非常低，这使得长的孵育期成为可能，因此对分析的灵敏度更高。不应错误估计二氯-HPQ(约140nm)或HPQ的任何类似物的非常大的斯托克斯位移；它还有助于提高灵敏度，发射的荧光很容易与可能来自生物样品的本身的荧光区分开来。
根据本发明的探针也可用于宏观荧光成像，即用于整个生物体。在这种情况下，探针将穿透细胞壁以达到感兴趣的活性。
与附图相关的实例使得可以说明本发明，但不是限制性的。
图1是显示使用式(I)化合物的降解机理的图，其使用根据本发明的一对间隔基。
图2是实施例1和实施例3的探针13和探针27以及现有技术的探针28在37℃下的固态荧光的演变曲线(浓度：10μM)。
图3表示实施例2的探针21在37℃下的固态荧光的演变曲线(浓度：0μM、5μM、10μM、25μM和50μM)。
图4表示控制微生物产生的纤维素酶活性的光信号。
图5是表示检测微生物培养基中纤维素酶活性的动力学的图。
实施例
一般信息
柱层析在60目硅胶(40μm至63μm)上进行。1H RMN谱和13C RMN谱分别在300MHz和75MHz或125MHz下在氘代氯仿、氘代DMSO或氘代甲醇中记录。化学位移(δ)以ppm表示，并参照四甲基硅烷或根据残留溶剂信号记录；使用缩写s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，b＝宽峰。RMN(J)耦合常数以赫兹表示。荧光分析在96孔黑色聚丙烯板(CorningCostar，Corning，Inc.)中进行，并登记在微板荧光计(Perkin Elmer的EnSpire读板仪)上。除非购买具有分析反应性质的特定化学产品且未经其他纯化使用。
将商业干燥的DCM干燥并在氩气下通过活化铝柱(GT S100Solvent StationSystem)进行纯化。使用氢化钙蒸馏TEA并储存在KOH颗粒中。标记为干燥的其他试剂在分子筛上干燥。如果没有另外说明，所有反应均在大气下用溶剂和商业试剂进行，无需另外干燥或纯化。在所有实验中使用通过Elga Purelab纯化系统获得的Millipore水。
使用的缩写如下：
DIPEA＝二异丙基乙胺
TEA＝三乙胺
py＝吡啶
DCM＝二氯甲烷
Yld.＝收率
DMSO＝二甲基亚砜
TFA＝三氟乙酸
rt＝室温。
实施例1
如下面方案1中所述制备化合物13。
方案1：化合物13的化学合成
化合物2的制备：
向2-氨基乙基哌啶1(3.0g，26.3mmol，1.0当量)在100mL甲苯中的溶液中缓慢加入邻苯二甲酸酐(3.89g，26.3mmol，1.0当量)，并逐滴加入三乙胺(550μL，3.95mmol，0.15当量)。然后使用Dean-Stark装置将混合物在回流下加热2小时。然后，过滤混合物，减压蒸发溶剂。获得浅黄色固体形式的化合物2(6.605g，24.7mmol，收率94％)，无需纯化即可使用。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.89-7.82(m，2H)，7.75-7.68(m，2H)，3.68(d，J＝4Hz，2H)，3.13-3.05(m，1H)，2.98-2.88(m，1H)，2.64-2.54(m，1H)，1.87-1.78(m，1H)，1.76-1.68(m，1H)，1.63-1.54(m，1H)，1.45-1.34(m，2H)，1.30-1.15(m，1H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝168.4，133.7，131.9，123.0，55.5，46.4，43.4，30.6，26.1，24.1.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值245.1290，计算值245.1290。
化合物3的制备：
冰浴冷却下，向化合物2(6.605g，24.7mmol，1.0当量)在80mL乙醇的溶液中，加入碳酸钾(4.36g，31.6mmol，1.3当量)、四正丁基碘化铵(912mg，2.47mmol，0.10当量)和烯丙基溴(2.73mL，31.6mmol，1.3当量)。移去冰浴，将混合物搅拌36小时。在反应结束时，将混合物用硅藻土过滤并减压蒸发。将残余油状物溶于EtOAc中，加入饱和NH4Cl水溶液。分离两相，有机相用饱和NH4C1水溶液洗涤两次。将合并的水相用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并减压浓缩。通过硅胶柱色谱纯化粗产物(纯DCM，然后DCM：MeOH：Et3N/99：0.5：0.5/体积％)，得到黄色油形式的化合物3，其结晶(2.24g，7.89mmol，收率35％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.84-7.78(m，2H)，7.72-7.65(m，2H)，5.95-5.81(m，1H)，5.22-5.08(m，2H)，3.93(dd，1H，J＝13Hz，J＝5Hz)，3.73(dd，1H，J＝13Hz，J＝8Hz)，3.42(dd，1H，J＝14Hz，J＝6Hz)，3.21(dd，1H，J＝14Hz，J＝6Hz)，2.88-2.76(m，2H)，2.37-2.28(m，2H)，1.74-1.47(m，4H)，1.40-1.25(m，2H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝168.3，135.5，133.8，132.0，123.0，117.2，57.6，57.3，50.3，38.4，28.1，24.7，22.0.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值285.1595，计算值285.1603。
化合物4的制备：
冰冷却下，向3(1.312g，4.6mmol，1.0当量)在iPrOH∶H2O/6∶1/体积％(50mL)的溶液中缓慢加入硼氢化钠(874mg，23mmol，5.0当量)。在室温下搅拌一夜后，使用37％的HCl水溶液将pH酸化至pH＝1。过滤混合物，然后加热至80℃保持2小时。减压蒸发iPrOH，将得到的水溶液用乙醚洗涤5次，然后冻干，得到白色粉末形式的化合物4(1.045g，4.6mmol，定量收率)。
碱性产物(1-烯丙基-2-(氨基甲基)哌啶)的RMN：
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝5.99-5.86(m，1H)，5.24-5.13(m，2H)，3.41(ddt，1H，J＝14Hz，J＝5.7Hz，J＝1.5Hz)，3.04-2.90(m，3H)，2.74(dd，1H，J＝13Hz，J＝3.3Hz)，2.21(tt，2H，J＝9.6Hz，J＝3.3Hz)，1.80-1.71(m，1H)，1.68-1.43(m，2H)，1.39-1.25(m，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝134.93，116.87，61.47，56.23，51.93，42.97，28.28，24.95，23.66.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值155.1543，计算值155.1548。
化合物6的制备：
将乙酰溴半乳糖5(700mg，1.70mmol，1.0当量)、4-羟基-3-硝基苯甲醛(313mg，1.87mmol，1.1当量)和Ag2O(1.300g，5.61mmol，3.3当量)溶解在乙腈中并在室温下搅拌一夜。然后将反应混合物用硅藻土过滤并减压浓缩。所得油状物通过硅胶柱色谱纯化(石油醚∶乙酸乙酯/4∶6/体积％)，得到浅黄色固体形式的化合物6(669mg，1.34mmol，收率79％)。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)＝9.98(s，1H)，8.45(d，J＝2Hz，1H)，8.26(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.60(d，J＝9Hz，1H)，5.80(d，J＝8Hz，1H)，5.40(bs，1H)，5.30-5.27(m，2H)，4.55(td，J＝6Hz，J＝1Hz，1H)，4.15(d，J＝6Hz，2H)，2.16(s，3H)，2.05(s，3H)，2.04(s，3H)，1.96(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝188.55，170.24，170.07，169.16，153.45，141.25，133.96，131.48，126.84，118.80，100.09，71.82，70.35，67.59，66.58，61.36，20.66，20.61，20.59，20.55.
HRMS：ESI：[M+Na]+m/z实测值520.1052，计算值520.1067。
化合物7的制备：
在冰浴中，向化合物6(636mg，1.28mmol，1.0当量)在CHCl3∶iPrOH 5∶1体积％(12mL)的溶液中加入硼氢化钠(53mg，1.41mmol，1.1当量)。将反应搅拌1小时，并通过加入饱和NH4Cl的水溶液终止反应。
搅拌5分钟后，分离各相，水相用二氯甲烷萃取2次。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并减压蒸发，得到白色粉末形式的化合物7(605mg，1.22mmol，收率95％)，其无需纯化即可用于下一步骤。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)＝7.80(d，J＝2Hz，1H)，7.63(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.37(d，J＝9Hz，1H)，5.56(d，J＝7Hz，1H)，5，43(t，J＝6Hz，1H)，5.37(d，J＝3Hz，1H)，5.31-5.19(m，2H)，4.53-4.45(m，3H)，4.19-4.08(m，2H)，2.16(s，3H)，2.04(s，6H)，1.95(s，3H).
13C-NMR(125MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)＝170.54，170.46，170.13，169.47，147.70，140.84，138.90，132.41，122.80，118.30，99.34，71.35，70.54，68.34，67.72，61.94，61.87，21.10，20.98，20.92.
HRMS：ESI：[M+Na]+m/z实测值522.1209，计算值522.1224。
化合物8的制备：
冰冷却下，向化合物7(120mg，0.240mmol，1.0当量)的无水DCM(5mL)溶液中，依次加入4-硝基氯甲酸苯酯(107mg，0.53mmol，2.2当量)和逐滴加入吡啶(48μL，0.60mmol，2.5当量)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟并在室温下搅拌2小时。在反应结束时，使用HCl1M水溶液终止反应，分离各相。将有机相用HCl 1M溶液洗涤，并将合并的水相用DCM萃取。将有机相用Na2SO4干燥、过滤并减压蒸发。通过硅胶柱色谱法(梯度洗脱，石油醚：乙酸乙酯/85：15至50：50/体积％)纯化粗产物，得到白色固体形式的化合物7(111mg，0.18mmol，收率75％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝8.32(d，J＝9Hz，2H)，7.94(d，J＝2Hz，1H)，7.64(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.44-7.39(m，3H)，5.59(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5，52(d，J＝3Hz，1H)，5.33(s，2H)，5.17-5.14(m，2H)，4.30(dd，J＝11Hz，J＝7Hz，1H)，4.23-4.14(m，2H)，2.23(s，3H)，2.17(s，3H)，2.11(s，3H)，2.06(s，3H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ＝171.0，137.8，135.1，129.4，128.9，128.9，128.8，128.4，127.3，127.2，80.1，62.8，54.2，53.0，49.7，43.9，41.0，40.1，28.5ppm.
MS：ESI：[M+Na]+m/z实测值687.1263，计算值687.1286。
化合物9的制备：
向化合物4(44mg，0.20mmol，1.3当量)在DCM(3mL)的悬浮液中加入化合物8(100mg，0.150mmol，1.0当量)。将反应混合物在冰浴中冷却，加入DIPEA(81qL，0.47mmol，3.1当量)。5分钟后，移去冰浴，将反应混合物加热至30℃过夜。然后将混合物用Na2CO3和NaHCO3饱和水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到白色固体形式的化合物9(56mg，0.083mmol，收率55％)。
NMR：
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.82(d，J＝2Hz，1H)，7.53(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.35(d，J＝9Hz，1H)，5.93-5.75(m，1H)，5.56(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5，48(d，J＝3Hz，1H)，5.32(bs，1H)，5.22-5.06(m，6H)，4.29-4.14(m，2H)，4.11-4.06(m，1H)，3.43-3.22(m，3H)，2.99-2.88(m，2H)，2.43-2.36(m，1H)，2.21(s，3H)，2.14(s，3H)，2.09(s，3H)，2.03(s，3H)，1.76-1.25(m，6H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.31，170.19，170.13，169.40，156.26，148.92，141.30，134.68，133.19，133.14，124.59，119.83，117.75，100.82，71.47，70.57，67.85，66.75，64.74，61.37，58.30，56.36，51.99，42.51，28.97，25.00，23.73，20.70，20.67，20.59.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值680.2683，计算值680.2667。
化合物10的制备：
将化合物9(20mg，0.029mmol，1.0当量)和1，3-二甲基巴比妥酸(37mg，0.24mmol，8.0当量)在无水DCM(3mL)的溶液用氩气流脱气。然后，加入钯(0)四(三苯基膦)(0.6mg，0.0005mmol，2mol％)。在反应结束时，将反应混合物干燥蒸发并通过硅胶柱色谱纯化，得到白色固体形式的化合物10(13mg，0.020mmol，收率70％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.82(d，J＝2Hz，1H)，7.52(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.35(d，J＝9Hz，1H)，5.56(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5.48(d，J＝3Hz，1H)，5.32-5.26(m，1H)，5.14-5.06(m，4H)，4.30-4.15(m，2H)，4.11-4.06(m，1H)，3.29-3.20(m，1H)，3.11-3.00(m，2H)，2.72-2.58(m，2H)，2.20(s，3H)，2.14(s，3H)，2.09(s，3H)，2.03(s，3H)，1.87-1.77(m，1H)，1.68-1.59(m，2H)，1.42-1.34(m，2H)，1.31-1.26(m，1H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.32，170.19，170.14，169.40，156.15，148.92，141.30，133.14，133.10，124.59，119.84，100.82，71.48，70.57，67.85，66.73，64.73，61.36，56.03，46.88，46.68，30.26，26.47，24.26，20.70，20.67，20.59.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值640.2337，计算值640.2354。
化合物12的制备：
在氩气氛和冰冷却下，向化合物10(13mg，0.020mmol，1.0当量)在无水DCM(2mL)的悬浮液中，逐滴加入化合物11的溶液(8mg，0.021mmol，1.05当量)和DIPEA(10qL，0.060mmol，3.0当量)。添加后，将反应混合物在0℃下混合30分钟，然后在室温下混合过夜。然后将反应混合物用NaHCO3饱和水溶液洗涤，并将有机相用Na2SO4干燥、过滤并减压蒸发。通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到白色粉末形式的化合物12(10mg，0.010mmol，收率52％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝10.41-10.29(m，1H)，8.24(bs，1H)，8.16-8.05(m，1H)，7.85-7.63(m，2.5H)，7.57-7.46(m，2H)，7.45-7.37(m，0.5H)，7.25-7.08(m，2H)，6.23-6.10(m，0.5H)，5.83-5.75(m，0.5H)，5.57(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5.49(d，J＝3Hz，1H)，5.17-4.96(m，2H)，4.94-4.69(m，1H)，4.58(bs，1H)，4.33-3.99(m，4H)，3.79-3.63(m，1H)，3.39-3.01(m，2H)，2.21(s，3H)，2.16(s，3H)，2.09(s，3H)，2.04(s，3H)，1.82-1.24(m，6H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.36，170.20，170.14，169.39，161.09，156.42，152.66，149.05，147.37，140.98，139.32，135.29，133.30，132.64，132.37，130.70，129.72，127.87，125.88，125.39，125.04，124.39，124.03，122.30，119.77，114.09，100.76，71.43，70.62，67.84，66.73，64.44，61.31，40.84，29.72，29.40，25.38，22.72，20.69，20.60，18.89.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值972.2077，计算值972.2109。
化合物13的制备：
在冰浴中，向化合物12(10mg，0.010mmol，1.0当量)在干燥甲醇的溶液中加入甲醇钠(1.1mg，0.020mmol，2.0当量)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。然后用Dowex@50X8-100树脂终止反应，然后过滤并减压浓缩。得到白色树脂形式的产物13(8mg，0.010mmol，定量收率)。使用HPLC在反相色谱(等度洗脱，水∶乙腈，1∶1体积％，含有0.1％TFA)中得到高纯度的白色粉末形式的化合物13。
1H-NMR(300MHz，CD3OD)：δ(ppm)＝8.07(m，1H)，7.73-7.69(m，2H)，7.67-7.60(m，2H)，7.50-7.31(m，2H)，7.31-7.23(m，1H)，7.13-7.05(m，1H)，5.02-4.93(m，1H)，4.93-4.82(m，2H)，4.51-4.40(m，1H)，4.13-4.03(m，1H)，3.83-3.78(m，1H)，3.77-3.71(m，1H)，3.68-3.58(m，3H)，3.53-3.44(m，2H)，3.12-3.01(m，1H)，2.94-2.83(m，1H)，1.59-1.25(m，6H).
13C-NMR(125MHz，CD3OD)：δ(ppm)＝163.06，158.56，154.58，152.42，151.11，149.16，148.62，141.78，136.22，134.26，134.07，132.97，132.68，132.09，131.01，130.43，129.97，126.45，126.12，125.42，125.22，123.48，118.91，103.10，96.37，77.36，74.86，71.96，70.10，65.76，62.32，53.19，52.68，41.16，27.00，26.27，19.86.
HRMS：ESI：m/z[M+H]+实测值804.1671，计算值804.1687。
实施例2
如下面图2中所述制备化合物21。
方案2：化合物21的化学合成
化合物15的制备：
使用类似于用于制备化合物6的方法，使用乙酰溴-D-纤维二糖14(2g，2.86mmol，1.0当量)、4-羟基-3-硝基苯甲醛(478mg，2.86mmol，1.0当量)和Ag2O(729mg，3.15mmol，1.1当量)，以获得浅黄色固体形式的化合物15(1.864g，2.37mmol，收率83％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝9.98(s，1H)，8.30(d，J＝2Hz，1H)，8.07(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.43(d，J＝9Hz，1H)，5.35-5.05(m，5H)，4.95(t，J＝8Hz，1H)，4.64-4.57(m，2H)，4.38(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.16-3.98(m，3H)，3.94-3.87(m，1H)，3.74-3.67(m，1H)，2.12(s，3H)，2.11(s，3H)，2.08(s，3H)，2.04(s，3H)，2.03(s，3H)，2.02(s，3H)，2.00(s，3H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝189.23，170.88，170.54，170.46，170.11，169.71，169.68，169.47，153.68，141.40，134.58，131.65，127.10，118.64，101.22，98.98，76.24，73.60，73.19，72.39，71.93，70.97，68.11，61.91，21.02，20.88，20.86.
HRMS：ESI：[M+Na]+m/z实测值808.1874，计算值808.1912。
化合物16的制备：
使用化合物15(650g，0.83mmol，1.0当量)和NaBH4(34mg，0.91mmol，1.1当量)以类似于制备化合物7的方法，获得白色粉末形式的化合物16(580mg，0.74mmol，收率89％)，其无需纯化即可用于下一反应。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.82(d，J＝2Hz，1H)，7.54(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.32(d，J＝9Hz，1H)，5.31-5.06(m，5H)，4.97(t，J＝8Hz，1H)，4.74(d，J＝6Hz，1H)，4.64-4.57(m，2H)，4.40(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.15-4.07(m，2H)，4.01-3.95(m，1H)，3.84-3.78(m，1H)，3.74-3.68(m，1H)，2.14(s，3H)，2.12(s，3H)，2.09(s，3H)，2.08(s，3H)，2.06(s，3H)，2.04(s，3H)，2.01(s，3H)，1.87(t，J＝6Hz，1H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.48，170.20，170.12，169.79，169.54，169.32，169.11，148.15，141.10，137.49，131.78，123.00，119.23，100.71，99.61，76.01，73.04，72.86，72.23，71.95，71.60，70.85，67.83，63.04，61.63，61.57，20.60，20.54，20.41.
HRMS：ESI：[M+Na]+m/z实测值810.2022，计算值810.2069。
化合物17的制备：
使用类似于用于制备化合物8的方法，使用化合物16(400mg，0.51mmol，1.0当量)、4-氯甲酸硝基苯酯(225mg，1.07mmol，2.2当量)和吡啶(102HL，1.27mmol，2.5当量)，以获得白色粉末形式的化合物17(380mg，0.40mmol，收率79％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝8.32(d，J＝9Hz，2H)，7.92(d，J＝2Hz，1H)，7.63(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.41(d，J＝9Hz，2H)，7.35(d，J＝9Hz，2H)，5.32-5.07(m，5H)，4.97(t，J＝8Hz，1H)，4.67-4.58(m，2H)，4.64-4.57(m，2H)，4.40(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.15-4.06(m，2H)，4.03-3.97(m，1H)，3.87-3.81(m，1H)，3.74-3.68(m，1H)，2.14(s，3H)，2.12(s，3H)，2.09(s，3H)，2.08(s，3H)，2.06(s，3H)，2.04(s，3H)，2.01(s，3H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.51，170.07，170.05，169.68，169.33，169.28，169.03，155.27，152.18，149.47，145.42，140.92，133.94，130.03，125.35，125.29，121.71，119.05，100.75，99.22，75.98，73.09，72.80，72.09，71.91，71.54，70.70，68.81，67.74，61.56，61.53，20.60，20.55，20.42.
HRMS：ESI：[M+Na]+m/z实测值975.2103，计算值975.2131。
化合物18的制备：
使用类似于用于制备化合物9的方法，使用化合物17(100mg，0.11mmol，1.0当量)、4(30mg，0.20mmol，1.3当量)和DIPEA(40μL，0.23mmol，2.1当量)，以获得白色固体形式的化合物18(68mg，0.070mmol，收率67％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.82(d，J＝2Hz，1H)，7.53(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.28(d，J＝9Hz，1H)，5.94-5.80(m，1H)，5.44-5.06(m，9H)，4.96(t，J＝8Hz，1H)，4.64-4.56(m，2H)，4.40(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.15-4.06(m，2H)，4.01-3.95(m，1H)，3.84-3.78(m，1H)，3.73-3.67(m，1H)，3.44-3.24(m，3H)，3.05-2.91(m，2H)，2.42(bs，1H)，2.22(t，J＝11Hz，1H)，2.13(s，3H)，2.12(s，3H)，2.08(s，6H)，2.05(s，3H)，2.03(s，3H)，2.01(s，3H)，1.77-1.26(m，6H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.49，170.18，170.12，169.72，169.47，169.29，169.02，156.20，148.73，141.14，134.66，133.19，132.93，124.56，119.18，117.69，100.80，99.37，75.94，73.01，72.86，72.18，72.06，71.59，70.84，67.74，64.64，61.51，61.48，58.28，56.31，51.93，42.47，28.93，24.94，23.67，20.69，20.64，20.54，20.52.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值968.3545，计算值968.3512。
化合物19的制备：
使用类似于用于制备化合物10的方法，使用化合物18(68mg，0.070mmol，1.0当量)、1，3-二甲基巴比妥酸(86mg，0.56mmol，8.0当量)和钯(0)四(三苯基膦)(1.6mg，0.0014mmol，2mol％)，以获得白色固体形式的化合物19(49mg，0.053mmol，收率77％)。
1H-NNR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.79(d，J＝2Hz，1H)，7.51(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.27(d，J＝9Hz，1H)，5.49-5.42(m，1H)，5.29-5.04(m，7H)，4.95(t，J＝8Hz，1H)，4.63-4.55(m，2H)，4.39(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.14-4.04(m，2H)，4.00-3.93(m，1H)，3.84-3.78(m，1H)，3.73-3.67(m，1H)，3.30-3.21(m，1H)，3.12-3.02(m，2H)，2.70-2.62(m，2H)，2.13(s，3H)，2.12(s，3H)，2.08(s，6H)，2.05(s，3H)，2.03(s，3H)，2.01(s，3H)，1.85-1.12(m，6H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.50，170.20，170.12，169.72，169.48，169.30，169.02，156.10，148.74，141.15，133.18，132.84，124.56，119.20，100.82，99.36，75.93，73.02，72.87，72.19，72.08，71.60，70.85，67.75，64.68，61.53，61.47，56.00，46.83，46.63，30.22，26.42，24.22，20.70，20.66，20.55，20.53.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值928.3230，计算值928.3199。
化合物20的制备：
使用类似于用于制备化合物12的方法，使用化合物19(49mg，0.053mmol，1.0当量)、11(21mg，0.054mmol，1.05当量)和DIPEA(28μL，0.16mmol，3.0当量)以获得白色粉末形式的化合物20(29mg，0.023mmol，收率43％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝10.52(bs，1H)，8.21(bs，1H)，8.10-7.97(m，1H)，7.76-7.64(m，2.5H)，7.56(m，0.5H)，7.50-7.43(m，2H)，7.18-7.09(m，2H)，6.17-6.07(m，0.5H)，5.76(bs，0.5H)，5.30-5.04(m，5H)，4.95(t，J＝8Hz，1H)，4.91-4.72(m，2H)，4.63-4.48(m，3H)，4.40(dd，J＝13Hz，J＝4Hz，1H)，4.19-4.04(m，3H)，4.00-3.93(m，1H)，3.83-3.57(m，3H)，3.37-3.18(m，1.5H)，3.11-2.98(m，0.5H)，2.12(s，3H)，2.11(s，3H)，2.08(s，3H)，2.06(s，6H)，2.03(s，3H)，2.01(s，3H)，1.81-1.44(m，6H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.52，170.21，170.18，169.74，169.50，169.31，169.04，161.13，156.33，154.23，152.63，149.11，147.57，147.34，140.89，135.28，133.22，132.80，132.24，130.59，129.54，127.82，126.91，125.85，125.24，124.84，124.17，122.22，119.11，100.85，99.30，75.97，72.98，72.90，72.24，72.20，72.08，71.61，70.85，67.76，64.47，61.53，61.48，51.46，40.79，26.03，25.27，20.70，20.67，20.54，18.84.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值1260.2914，计算值1260.2954。
化合物21的制备：
使用类似于用于制备化合物13的方法，使用化合物20(23g，0.018mmol，1.0当量)和甲醇钠(1.0mg，0.036mmol，2.0当量)，以获得白色粉末形式的化合物21(17mg，0.017mmol，收率97％)。
1H-NMR(300MHz，CD3OD)：δ(ppm)＝8.19(bs，1H)，7.85-7.81(m，2H)，7.79-7.72(m，2H)，7.62-7.43(m，2H)，7.40-7.33(m，1H)，7.27-7.17(m，2H)，5.14-5.04(m，1.5H)，4.99-4.94(m，1H)，4.62-4.52(m，0.5H)，4.47(d，J＝8Hz，2H)，4.26-4.16(m，1H)，3.97-3.82(m，3H)，3.74-3.56(m，5H)，3.44-3.35(m，3.5H)，3.30-2.95(m，3H)，3.11-2.98(m，0.5H)，1.72-1.15(m，6H).
13C-NMR(75MHz，CD3OD)：δ(ppm)＝161.65，157.10，153.33，153.05，150.98，149.35，148.93，147.75，147.23，140.47，134.82，132.84.132.67，131.57，130.77，129.62，129.05，128.55，125.05，123.86，122.08，117.46，103.16，100.77，78.53，76.75，76.50，75.55，74.94，73.51，73.00，72.99，69.98，64.34，61.05，60.19，51.29，39.52，25.73，24.79，18.46.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值966.2201，计算值966.2215。
实施例3
如下面图3中所述制备化合物21。
方案3：化合物27的化学合成。
化合物22的制备：
向3(335mg，1.48mmol，1.0当量)在5mL二氯甲烷的溶液中加入碳酸钾(636mg，4.6mmol，3.1当量)，并逐滴加入氯甲酸甲酯(115μL，1.48mmol，1.0当量)。在室温下搅拌10分钟后，减压蒸发溶剂。通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到淡黄色油状物形式的化合物22(282mg，1.33mmol，收率90％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝5.96-5.82(m，1H)，5.24-5.16(m，3H)，3.69(s，3H)，3.41-3.30(m，3H)，3.01-2.91(m，2H)，2.40(m，1H)，2.23-2.17(m，1H)，1.75-1.70(m，1H)，1.60-1.56(m，2H)，1.54-1.40(m，2H)，1.37-1.24(m，1H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝157.34，134.50，117.71，58.62，56.29，51.90，42.31，28.85，24.92，23.58.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值213.1601，计算值213.1603。
化合物23的制备：
向四氢铝酸锂(2.64mmol，2.0当量)在5mL四氢呋喃的溶液中逐滴加入22(280mg，1.32mmol，1.0当量)，并将该反应介质在40℃下搅拌过夜。蒸发溶剂，不经纯化使用产物23。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝5.97-5.82(m，1H)，5.24-5.08(m，2H)，3.43-3.33(m，1H)，2.98-2.84(m，2H)，2.71-2.53(m，3H)，2.46-2.30(m，3H)，2.23-2.12(m，2H)，1.83-1.23(m，8H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝127.43，124.84，61.65，58.05，55.71，52.99，52.19，50.49，48.26，45.28，34.14，27.96，26.19，21.68，21.43，20.96，20.02.
化合物24的制备：
使用类似于用于制备化合物9的方法，使用化合物8(150mg，0.23mmol，1.0当量)、23(100mg，0.42mmol，1.8当量)和DIPEA(300μL，1.72mmol，7.6当量)，以获得白色固体形式的化合物24(84mg，0.12mmol，收率53％)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.75(s，1H)，7.48(dd，J＝9Hz，J＝2Hz，1H)，7.30(d，J＝9Hz，1H)，5.90-5.72(m，1H)，5.50(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5，42(d，J＝3Hz，1H)，5.14(d，J＝6Hz，1H)，5.12-4.99(m，6H)，4.25-4.11(m，2H)，4.11-4.01(m，1H)，3.58-3.47(m，1H)，3.35-3.19(m，2H)，3.09-2.96(m，1H)，2.88(d，J＝3Hz，3H)，2.81-2.71(m，1H)，2.68-2.58(m，1H)，2.14(s，3H)，2.08(s，3H)，2.02(s，3H)，1.97(s，3H)，1.70-1.36(m，6H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.29，170.18，170.11，169.38，156.04，148.92，141.16，135.08，133.27，133.23，124.60，119.66，117.51，100.69，71.41，70.53，67.81，66.74，65.25，61.36，57.46，57.10，51.26，49.88，35.68，30.92，29.67，28.20，24.90，22.60，20.64.
LRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值694.2，计算值694.2823。
化合物25的制备：
使用类似于用于制备化合物10的方法，使用化合物24(84mg，0.12mmol，1.0当量)、1，3-二甲基巴比妥酸(95mg，0.61mmol，5.0当量)和钯(0)四(三苯基膦)(1mg，0.0012mmol，1mol％)，以获得白色固体形式的化合物25(49mg，0.07mmol，收率62％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝7.78(d，J＝9Hz，1H)，7.49(d，J＝8Hz，1H)，7.30(d，J＝9Hz，1H)，5.51(dd，J＝10Hz，J＝8Hz，1H)，5.43(d，J＝3Hz，1H)，5.32-5.26(m，1H)，5.13-4.98(m，4H)，4.24-4.19(m，1H)，4.16-4.10(m，1H)，4.08-4.03(m，1H)，3.26-3.19(m，1H)，3.18-3.12(m，1H)，3.06-3.01(m，1H)，2.93(d，J＝7Hz，3H)，2.82-2.68(m，1H)，2.61-2.51(m，1H)，2.15(s，3H)，2.09(s，3H)，2.04(s，3H)，1.98(s，3H)，1.79-1.75(m，1H)，1.61-1.50(m，2H)，1.42-1.20(m，3H).
13C-NMR(125MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.34，170.22，170.16，169.42，156.23，148.93，141.26，133.30，133.20，124.59，119.74，100.77，71.47，70.57，67.86，66.77，65.28，61.39，55.55，55.12，46.80，36.00，30.56，26.30，24.35，20.72，20.70，20.62.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值654.2484，计算值654.2504。
化合物26的制备：
使用类似于用于制备化合物12的方法，使用化合物25(25mg，0.04mmol，1.0当量)、11(21mg，0.04mmol，1.0当量)和DIPEA(33μL，0.19mmol，5.0当量)以获得白色粉末形式的化合物26(10mg，0.01mmol，收率27％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝10.65-10.32(m，1H)，8.27-8.14(m，1H)，8.06-7.90(m，1H)，7.86-7.67(m，3H)，7.57-7.46(m，1H)，7.46-7.34(m，1H)，7.34-7.21(m，1H)，7.11-7.03(m，1H)，5.56-5.49(m，1H)，5.46(br s，1H)，5.13-4.98(m，2H)，4.98-4.67(m，1H)，4.55(br s，1H)，4.31-3.97(m，4H)，3.93-3.78(m，1H)，3.28-3.03(m，2H)，3.01-2.88(m，3H)，2.19(s，3H)，2.12(s，3H)，2.04(s，3H)，2.01(s，3H)，1.78-1.23(m，6H).
13C-NMR(75MHz，CDCl3)：δ(ppm)＝170.41，170.30，170.25，169.52，160.53，156.49，153.10，149.15，147.52，141.32，139.29，135.29，133.31，132.92，132.28，130.79，129.79，127.87，126.09，125.49，125.13，124.45，124.38，122.55，119.83，114.28，100.84，71.54，70.67，67.94，66.82，65.99，61.42，40.78，29.83，29.46，26.68，25.40，20.78，20.70，20.54，19.04.
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值986.2219，计算值986.2260。
化合物27的制备：
使用类似于用于制备化合物13的方法，使用化合物26(10g，0.01mmol，1.0当量)和甲醇钠(2.0mg，0.04mmol，3.5当量)，以获得白色粉末形式的化合物27(3.57mg，0.004mmol，收率43％)。
RMN光谱的分辨率太低而无法使用。
HRMS：ESI：[M+H]+m/z实测值818.1838，计算值818.1838。
实施例4
根据本发明的探针13、探针21和探针27通过在设计用于荧光读数器的多孔微板中的体外培养基中与目标酶β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23；“b-gal”；商业)一起孵育来评估。使用以下标准评估探针：
-检测酶因活性的存在(“开”)产生的荧光强度升高，
-检测不含目标酶(无内源荧光)的样品中荧光完全缺失(“关”)，
-检测探针随时间的任何水解降解的缺失，证明探针在pH7的水性介质中的稳健性(无假阳性信号)，
-检测对酶活性存在的反应速度，使得快速达到最大信号成为可能，
-检测双间隔基探针的改进动力学，
-检测荧光读数器在延长照射下产生的固体荧光团的高光稳定性。
将这些结果与使用现有技术的探针(申请WO 2014/020285中的化合物I.1)获得的结果进行比较，所述探针包含环化型间隔基(28)：
检测荧光的方案：
用PBS(Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline，Invitrogen Corp.)稀释MeOH中的10mM探针母体溶液，以获得浓度范围为50μM至1mM的溶液。将10μL这些溶液中的每一种加入到96孔黑色板中的80μLPBS中，并在加入纯化的酶之前加热至37℃。最终探针浓度为5μM至100μM。然后将板在37℃(或25℃)孵育，并通过荧光读数器(EnSpire，Perkin Elmer；采集波长：λ激发＝355nm，λ发射＝530nm)随时间测量荧光。得到的曲线是重复测量的平均值。
结果：
获得的结果显示在图2和图3中。
与探针28相比，包含一对消除/环化间隔基的根据本发明的探针13使得可以获得更高响应速度的益处，同时在不存在目标酶(假阳性信号)的情况下保持探针的高稳定性。因此，在相同的温度、pH和浓度条件下，基于一对间隔基的探针13具有比仅包含单个间隔基的探针28快5倍的酶促响应。此外，在没有酶的情况下，探针13稳定超过15小时并且不产生任何可测量的荧光。
根据本发明的探针21和探针27使得可以受益于更快的响应时间，同时在不存在目标酶(缺乏假阳性信号)的情况下保持探针的高稳定性。
以不同浓度：5μM，10μM，25μM和50μM测试探针21。测量的荧光与探针的浓度成比例。可以在5μM探针含量下检测荧光。
实施例5
将不分泌(A)或分泌(B)B-葡糖苷酶的酵母菌株培养物的上清液加入到响应该酶活性的本发明的探针21中。为此，带有提供潮霉素抗性且携带或不携带分泌的β-葡糖苷酶表达盒的质粒的酵母细胞在30℃下在5mL含有200μg/mL潮霉素的富含YPD的培养基(10gBacto蛋白胨Difco，10g Bacto酵母膏Difco，20g葡萄糖，20g Bacto琼脂，qsp 1L蒸馏水)中培养86小时。然后将培养物在20℃在Allegra 25R离心机(Beckman/Coulter)上以4000转/分钟的旋转斜盘(TS-5.1-500)中离心，取20μL上清液并加入180μL含有50μM探针底物的PBS1X溶液中。然后将混合物均化并在37℃下孵育30分钟。将10μL该混合物沉积在显微镜载玻片和盖玻片之间，并通过荧光显微镜用340nm激发滤光器和525nm发射滤光器观察。
在图4中表示的照片是在浸没在Zeiss AX10显微镜上时以100倍放大率获得的。
荧光沉淀物(白点)显得明显，这使得可以预测高通量成像(自动分割和定量)的使用。
实施例6
微生物培养基中纤维素酶活性的检测动力学通过在MITHRAS LB 940装置上的光学读数来评估，所述装置具有分泌(“上清液”)或不分泌(“对照”)β-葡萄糖酶的酵母细胞培养物上清液的酶活性。
根据实施例5中描述的方案进行酵母培养，直至获得20μL上清液。然后在不透明背景微孔板孔中将该上清液以50μM加入180μL含有本发明探针21的PBS1X溶液中。在将探针激发至340nm并在535nm处收集发射之后，在MITHRAS LB 940装置上随时间执行信号读取。
结果如图5所示，表明本发明可以检测培养45分钟后分泌到上清液中的糖苷酶活性，培养3小时45分钟后信号最大，信噪比约为55。

Claims (23)

1.一种式(I)的化合物：
其中：
-R1使得在式(I)中存在的-C(O)-OR1键断裂后获得的HOR1属于在激发态下发生分子内质子转移的荧光团类，所述分子内质子转移称为ESIPT，R1是芳香族基团并且-OR1是苯氧基类型并且对应于以下结构(A2)或(A3)之一：
-其中：
οT是-NH-C(O)-、-S-、-O-、-NH-、-N(C1至C20烷基)-或-N(C5至C24芳基)-，
οRe是氢原子或吸电子碳取代基，所述吸电子碳取代基选自-CN和-COORh，Rh表示C1至C4烷基，或Re是-CONRiRj，其中Ri和Rj相同或不同，表示氢原子、或C1至C4烷基，或Re是-CF3、或2-噁唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基，
οRf是氢原子、氯原子、溴原子、碘原子或氟原子、-OH、-NH2、-NRkRl、-NHRk或-ORk，其中Rk和Rl相同或不同，各自独立地表示C1至C4烷基，
ο或者Re和Rf彼此键合以形成饱和或不饱和的、经取代或未经取代的4元或5元烃链，其任选地被一个或多于一个选自N、S和O的杂原子中断，
οRg是氢原子、Br原子、Cl原子、I原子或F原子，
-其中：
οT’是-NH2、-OH、C5至C24芳基、C1至C4烷基、-SH、-NHR’g、-OR’g、-NR’gRh’或-SR’g，R’g和Rh’相同或不同，表示C1至C4烷基或C5至C24芳基，
οR’e是氢原子或吸电子碳取代基，所述吸电子碳取代基选自-CN和-COOR’i，其中R’i表示C1至C4烷基，或R’e是-CONR’jR’k，其中R’j和R’k相同或不同，表示氢原子、或C1至C4烷基，或R’e是-CF3、或2-噁唑基、2-噻唑基、2-咪唑基、2-苯并咪唑基、4-嘧啶酮-2-基或喹唑啉酮-2-基，
ο R’f是氢原子、氯原子、溴原子、碘原子或氟原子、-OH、-NH2、-NR’lR’m或-OR’l，其中R’l和R’m相同或不同，表示C1至C4烷基，
ο或者R’e和R’f彼此键合以形成饱和或不饱和的、经取代或未经取代的4元或5元烃链，其任选地被一个或多于一个选自N、S和O的杂原子中断；
-R2、R3和R4定义如下：
ο或者R2是C1至C4烷基、R3是C1至C4烷基或氢原子、R4是C1至C4烷基，
ο或者R3是氢原子或C1至C4烷基，R2和R4彼此键合并形成-(CH2)m-链，其中m＝3、4或5，
ο或者R3为氢原子或C1至C4烷基，R2和R4彼此键合，在R2至R4的方向上形成-CH2CH2-NR11-CH2-链，R11表示氢原子或-(L)n-GP，其中n等于0或1，L为连接臂，GP是水溶性基团，所述水溶性基团选自
-选自胺、脒、胍或四唑的F1官能团；
-选自铵、羧酸根、磺酸根或磷酸根类基团的F2阳离子或阴离子官能团；
-包括这些F1和/或F2官能团中的一个或多于一个的基团；
-聚乙二醇；
-糖类；
-肽基团；
ο或者R2是C1至C4烷基，R3和R4键合在一起，并与同它们键合的碳原子形成C3至C30脂肪族碳环，
-R5和R6相同或不同，彼此独立地表示氢原子、C1至C4烷基或C5至C10芳基，
-R7是氢原子或选自C1至C4烷基和C1至C4烷氧基的基团，
-R8表示氢原子、或经取代或未经取代的C1至C10烷基、或-D1-D2-D3基团，其中：
οD1表示三唑基或-CH2-三唑基，
ο D2表示C1至C10亚烷基、C1至C10亚烯基或C1至C10亚炔基，所述基团任选地被一个或多于一个选自O或N的杂原子、二价糖基、-O-(CHR-CHR’-O)n-或-N-(CHR-CHR’-O)n-基团中断，n是1至20的整数，R和R’相同或不同，表示H或CH3、氨基酸或肽、或这些基团的组合，条件是R和R’不同时是CH3，
οD3表示与D2键合的马来酰亚胺己酰基部分、氨基酸、肽、叶酸、抗体或抗体片段，通过它包含的羧酸官能团形成酯键或酰胺键，
-R9和R’9相同或不同，表示氢原子、或选自卤素原子的吸电子基团、选自-NO2和-CN的基团、选自-NH-C(O)-CH2-Ab的基团，其中Ab表示抗体，
-V表示氧原子或硫原子，
-X、Y和Z为：
ο或者X表示CR10、Y表示CR’10和Z表示OR0，
ο或者X表示CR10、Y表示COR0和Z表示R’10，
ο或者X表示CR10、Y表示氮原子和Z表示OR0，
ο或者X表示氮原子、Y表示COR0和Z表示R10，
其中：
οR0表示通过其异头碳原子与式(I)分子的其余部分键合的糖基，和
οR10和R’10相同或不同，表示氢原子或给电子基团，所述给电子基团选自C1至C20烷基、C5至C24芳基和C1至C20烷氧基，
式(I)的化合物为所有比例的光学异构体混合物的形式；
其中如果4元或5元烃链或C1至C10烷基被取代，则取代基选自氯、溴、碘、氟、氰基、C1至C12-烷基、C1至C12-三氟烷基、C2至C20-烯基、C2至C12-炔基、具有5个至24个碳原子的芳基、具有5元至24元且至少一个杂原子选自氧、氮或硫的杂芳基、氨基、C1至C12-烷基氨基、二(C1至C12)烷基氨基、羟基、-O-C1至C12-烷基、-O-C5至C24-芳基、-O-C1至C12-烷基羰基或-O-C5至C24-芳基羰基。
2.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于所述糖类为多糖类。
3.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R2、R3和R4相同或不同，表示C1至C4烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R1是芳香族基团，-OR1对应于下式(A5)：
5.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R0是通过糖苷酶的催化作用从化合物(I)的其余部分可裂解的。
6.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R0是在糖苷酶的作用下可裂解的基团，糖苷酶选自N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-纤维二糖酶、β-几丁二糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-麦芽糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-L-岩藻糖苷酶、L-艾杜糖苷酶或纤维素酶；R0是通过其异头碳结合的单糖基化基团，选自半乳糖基、葡糖基、甘露糖基、古洛糖基、阿洛糖基、阿卓糖基、艾杜糖基、塔罗糖基、岩藻糖基、果糖基、阿拉伯糖基、来苏糖基、核糖基、木糖基、葡糖醛酸基和N-乙酰基-氨基己糖基，或是由几个相同或不同的这些单糖基化基团构成的多糖基化基团。
7.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R5和R6相同并表示氢原子。
8.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R7表示氢原子或C1至C4烷基。
9.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R8表示氢原子。
10.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于V表示氧原子。
11.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于X、Y和Z为：
ο或者X表示CR10、Y表示CR’10和Z表示OR0，
ο或者X表示CR10，Y表示COR0，Z表示R’10，其中R10、R’10和R0如权利要求1所定义的。
12.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R9或R’9基团中的至少一个表示卤原子、-NO2基团或-CN基团。
13.根据权利要求1所述的化合物(I)，其特征在于R10和R’10是相同的并且表示氢原子。
14.根据权利要求1所述的化合物(I)，其具有式(Ia)：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R0和V如权利要求1中所定义的，所述化合物是所有比例的光学异构体混合物的形式。
15.根据权利要求1所述的化合物(I)，其具有式(Ib)：
其中R1、R2、R3、R4、R9、R’9、X、Y和Z如权利要求1中所定义的，所述化合物是所有比例的光学异构体混合物的形式。
16.根据权利要求1所述的化合物(I)，其具有式(Ic)：
其中R0和R1如权利要求1所定义的，所述化合物是所有比例的光学异构体混合物的形式。
17.根据权利要求1所述的化合物(I)在制造用于在人类体内检测糖苷酶的产品中的用途。
18.根据权利要求1所述的式(I)的化合物在制造用于在体外或离体检测糖苷酶的试剂盒中的用途，其中：
-将认为含有所述糖苷酶的样品与根据权利要求1所述的化合物(I)接触，
-应用合适的条件，以通过裂解O和R0之间的共价键，然后裂解-C(O)-OR1键，使HOR1释放，形成荧光沉淀物，和
-定量分析或定性分析荧光沉淀物。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于荧光沉淀物的分析包括：
-将荧光沉淀物暴露于能够在荧光沉淀物的吸收波长下产生光的光源的步骤，和
-检测所得沉淀物的荧光的步骤。
20.一种式(II)的化合物：
其中：
-R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9和V如权利要求1所定义的，
-R12表示氢原子或胺官能团保护基团，
-X、Y’和Z’定义如下：
ο或者X表示CR10、Y’表示CR’10和Z’表示OR’0，
ο或者X表示CR10、Y’表示COR’0和Z’表示R’10，
ο或者X表示CR10、Y’表示氮原子和Z’表示OR’0，
ο或者X表示氮原子、Y’表示COR’0和Z’表示R10，
R’0表示其中所有的醇官能团都被保护基团保护的R0基团，R0、R10和R’10如权利要求1所定义的，
所述化合物是所有比例的光学异构体混合物的形式。
21.根据权利要求20所述的化合物(II)，其特征在于R12表示氢原子。
22.根据权利要求20所述的化合物(II)，其特征在于R12表示胺保护基团，所述胺保护基团为烯丙基或氨基甲酸酯。
23.一种制备根据权利要求1所述的式(I)的化合物的方法，其包括以下步骤：
-获得根据权利要求20所述的化合物(II)，
-获得式(III)的化合物
其中R1是如权利要求1所定义的且M表示离去基团，所述离去基团为卤原子、咪唑基或对硝基苯氧基，
-通过所述化合物(II)与化合物(III)的加成反应获得化合物(IV)，所述化合物(IV)具有下式：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R’9、V和X是如权利要求1所定义的，Y’和Z’是如权利要求20所定义的，和
-使所述化合物(IV)的R’0基团中存在的醇官能团脱保护，以获得所述化合物(I)。
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