JP2020502127A - 蛍光発生グリコシダーゼ基質および関連する検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明は式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９およびＶ、Ｘ、ＹおよびＺが請求項１において定義される式（Ｉ）の新規のグリコシダーゼ基質、および前記基質の１つにより触媒活性グリコシダーゼの存在を検出する方法に関する。【化１】

Description

発明の詳細な説明

本発明は、グリコシダーゼ型酵素活性の検出のためのプローブに関する。特に、本発明は、触媒活性グリコシダーゼの存在を検出するための新規の蛍光発生基質、およびその基質を使用する検出方法に関する。

生物学的または化学的試料の分析において、グリコシダーゼ活性の検出は、非常に有用であり得る（Boonacker E. and Van Noorden C. J. F. (2001). Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J. Histochem. Cytochem. 49, 1473-1486; Perry, 1. D., James, A. L., Plorris, K. A., Oliver, M., Chilvers, K. F., Reed, R. H., & Gould, F. K. (2006). Evaluation of novel fluorogenic substrates for the detection of glycosidases in Escherichia coli and enterococci. Journal of Applied Microbiology, 101(5), 977-985; Orenga, S., James, A. L., Manafi, M., Perry, 1. D., & Pincus, D. H. (2009). Enzymatic substrates in microbiology. Journal of MicrobioIogicaI Methods, 79(2), 139-155）。全生物、細胞または細胞抽出物、生物学的流体または化学的混合物は、グリコシダーゼ活性が検出され得る生物学的または化学的試料の例である。グリコシダーゼは酵素の広範なファミリーであり、多様な病理に対する多数のバイオマーカーを含む。グリコシダーゼはまた、多数の良性細胞プロセスに関与するため、細胞生物学者による無数の研究の対象となっている。したがって、グリコシダーゼ活性の検出は、例えば、特定の代謝状態または病的状態に関する情報を与えることができる。また、効果的な検出が、ハイスループットスクリーンを実施することを可能にし、新規の天然グリコシダーゼを検出すること、または既知の酵素の指向性進化によって新規のグリコシダーゼを開発すること、または特定の微生物の解糖収率をそれらのゲノムの突然変異誘発または実験的進化を通して改善することを可能にする。

このため、グリコシダーゼ活性を検出できるプローブが非常に有用である。

プローブによって発せられる蛍光の捕捉によるグリコシダーゼ活性の検出は、プローブによる単純な吸収の間の残留白色光の収集よりもはるかに感度の高い方法であり、すなわち、検出閾値がはるかに低い。蛍光発光の検出は実施が非常に容易であるので、蛍光プローブは生命科学にとって非常に魅力的なツールである。例えば、ＥＳＩＰＴ（ＥＳＩＰＴ、英語、「Excited State Intramolecular Proton Transfer」から）と呼ばれる、励起状態における分子内プロトン移動をもたらす発蛍光団のクラスは特に、ａ）Ormson, S.M., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994) 19, 45-91；ｂ）Legourrierec, D., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994), 19, 211-275；およびｃ）Zhao, 1., Ji, S.,Chen, Y., Guo, H., & Yang, P. (2012). Excited state intramolecular proton transfer (ESIPT): from principal photo physics to the development of new chromophores and applications in fluorescent molecular probes and luminescent materials. Physical Chemistry Chemical Physics, 14 (25), 8803に記載されている。初めてＥＳＩＰＴ現象として特定のフェノール化合物を見出だした高い蛍光の解説は、Ｗｅｌｌｅｒ（サリチル酸メチルについて:Weller, A. (1961). Fast Reactions of Excited MoIecuIes. Progress in Reaction Kinetics and Mechanism 1, 187）、ならびにＨｅｌｌｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（ヒドロキシフェニルベンゾオキサゾールについて: Heller A., et Williams, D.L., 1. Phys. Chem. (1970) 74, 4473-4480）に記載されたものであり得る。

ＥＳＩＰＴ発蛍光団のクラスは従来の発蛍光団と比較して例外的な物性を有するため、生命科学の研究者にとって特に魅力的である。ＥＳＩＰＴ発蛍光団の例外的な特性は以下の通りである：
（ａ）しばしば１３０ｎｍを超え、２５０ｎｍの値に達することができ、検出感度を最大にする機器の選択を可能にする大きなストークスシフト；
（ｂ）フルオレセインのようなモデル発蛍光団のものより数桁大きくなり得る速度での光退色に対する優れた耐性；
（ｃ）固体状態で輝く蛍光を発する発蛍光団を設計する能力、すべての既知の発蛍光団の中で稀な特性。この最後の特徴は、拡散によって引き起こされる希釈を最小にして、活性化部位で高強度のシグナルを産生することを可能にする；
（ｄ）組織の透明性が最大である赤色または近赤外（６００〜８５０ｎｍ）で生じるＥＳＩＰＴ発蛍光団を設計する能力；このような発蛍光団を使用するプローブはまた、生きている動物における画像化に特に適している；最後に、
（ｅ）ＥＳＩＰＴ発蛍光団のヒドロキシルによって運ばれる水素原子を、化学的または生化学的分析物に関して特異的な反応性を有する置換基で置き換えることによって、蛍光を発しない基質を設計する能力であって、この置換基の開裂が、蛍光の出現を促進する能力。

蛍光の産生をもたらす基質の使用による、酵素活性の検出方法の感度レベルは、（ｉ）光退色の速度、（ｉｉ）蛍光シグナルの、その産生部位における蓄積の程度（すなわち、この部位からの拡散速度、および発蛍光団が析出するかどうかを知ることの問題）、（ｉｉｉ）基質が機能する実際の消光／発光モード（未変換基質の蛍光によるバックグラウンドの欠如）、（ｉｖ）励起スペクトルおよび発光スペクトルのスタッキングの程度（最も好ましい配置であるベースラインにおける分離。上記ａ）参照）に密接に関連している。ベースラインでの完全な分離が（あらゆる可能な波長で発蛍光団を励起するために）光源のフィルターの非常に広範な選択の機会を提供するので、ポイント（ｉｖ）は非常に特別に重要であるが、さらに重要なことは（発蛍光団によって発せられたすべての波長から来る光子を収集するための）検出器である。ポイント（ｉｖ）はまた、これら自体も弱いストークスシフトを有する確立された発蛍光団を用いると遭遇する、多発する問題である組織自己蛍光（天然発蛍光団の弱いストークスシフトによって特徴付けられる）による検出プロセスの妨害を最小限にする。

ＥＳＩＰＴ発蛍光団の重要なクラスの中で、ジクロロ−ＨＰＱ（６−クロロ−２−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−４（３Ｈ）−キナゾリノン；ＣＡＳ番号：２８６８３−９２−３）は、固体状態および固体状態のみで高い蛍光を示しながらも、それが水性／生理学的媒体に完全に不溶であり、特に興味深い。それにもかかわらず、グリコシダーゼ活性に関する情報を提供する分子プローブの設計において、ジクロロ−ＨＰＱを使用することは非常に困難である。さらに、ＨＰＱベースのプローブが既に設計（および市販化）されている主な活性は、ホスファターゼ活性である。これは、得られた産生物を急速に自然に加水分解する傾向があるため、グリコシル化フェノールヒドロキシルを用いた安定なＨＰＱベースのプローブを産生することが不可能であることに起因する。そしてこの加水分解は、遊離する不溶性のジクロロ−ＨＰＱを放出するため、誤った蛍光シグナル（「基底シグナル」）を産生することがよくわかっている。また、そのようなグリコシル化化合物（ＥＬＦ９７、グルクロニダーゼ基質（Ｅ６５８７号）およびＥＬＦ９７キチナーゼ基質／Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ２２０１１号））の分子プローブの市販化は、フェノールグリコシド、特にジクロロ−ＨＰＱなどの低電子フェノールを使用して構築される化合物が加水分解の内在的な不安定性を有するために、２００８年に中断されたことにも留意されたい。実際、任意のニトロフェノール系グリコシド（ジクロロ−ＨＰＱのような電子に乏しいフェノールでもある）は、生理学的なｐＨで自然に加水分解することが知られている。また、この安定性の問題は生理学的なｐＨ（ｐＨ７．４）と比較して、より酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ６．５）で深刻に悪化することも知られている。

近年、結合剤として自己犠牲的スペーサーを使用することによる、いくつかの放出／スペーサー／発蛍光団成分を有する酵素基質の設計に関心が高まっている。本発明者らは特に、出願ＷＯ２０１３／０４５８５４、ＷＯ２０１４／０２０２８５およびＷＯ２０１５／１９７９８１に対応している本特許出願の発明者らの１人の研究を引用し得る。そして、これらの出願では、自己折り畳みスペーサーを使用し、ペプチダーゼおよび／またはグリコシダーゼ基質を、基質の切断後にスペーサーの環化およびＥＳＩＰＴ発蛍光団の放出を促進するアリール基に結合させている。

しかしながら、既存の技術ではグリコシダーゼの検出が十分な信頼性を有さず（プローブは不安定であり、標的酵素の非存在下で蛍光を放出する）、多大な時間を必要とし（酵素反応が遅すぎる）、および／または十分な正確性を有さない（放出された発蛍光団は一点で析出せず、媒体全体に拡散する）。

これに関連して、本出願人は、特に急速な酵素反応速度を提供する新規のグリコシダーゼ酵素基質を提案する。本発明は、ＥＳＩＰＴ発蛍光団の組み込みに適合した、安定なプローブを作製することを可能にする新規のスペーサーを使用することを提案する。すなわち、本発明は、未処理プローブからのバックグラウンド蛍光の最小化によって、有意な感度の増幅を可能にし、使用する基質の量の減少をもたらすことができる。したがって、特に、本発明は、毒性の問題を低減しながら、in vivoにおける画像化の応用を可能にする。

本発明の目的は、新規のグリコシダーゼ基質を提供することである。当該グリコシダーゼ基質は、水性媒体中で安定であり、非蛍光性のままであるか、または放出された発蛍光団自体が蛍光性である場合とは全く異なる波長で穏やかな蛍光が残存するが、ＥＳＩＰＴ発蛍光団に対応する小さな蛍光分子を産生するためにグリコシダーゼと速やかに反応する。本発明によれば、以下の特性を有するグリコシダーゼ基質を提案する：
プローブ上に存在するグリコシル基の選択機能としての、特定のグリコシダーゼに対する高い特異性；
標的酵素の非存在下でのプローブの高い安定性、酵素部位での発蛍光団の析出および媒体中での発蛍光団の拡散の欠如によるバックグラウンド蛍光の欠如；および
標的グリコシダーゼの作用下での急速な処理速度。

したがって、本発明のグリコシダーゼ基質は先行技術のグリコシダーゼ基質を保存することを可能にする一方で（すなわち、特定のグリコシダーゼに対する高い特異性およびバックグラウンド蛍光の欠如）、標的グリコシダーゼの作用下で急速な処理速度を有する。

より具体的には、本発明は式（Ｉ）の化合物に関する：

式中：
すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合の切断後に得られるＨＯＲ１が、ＥＳＩＰＴと呼ばれる、励起状態における分子内のプロトンの移動をもたらす発蛍光団のクラスに属するものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、以下のいずれかで定義され：
Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、およびＲ４は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
あるいはＲ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、並びに、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に、水可溶化基で置換され得る脂肪族複素環を形成し、
あるいはＲ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、並びに、Ｒ３およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子とともに、脂肪族炭素環を形成し、
Ｒ５およびＲ６は同一または異なり、互いに独立して、水素原子、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１０）アリールを表し、
Ｒ７は水素原子、または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシの中から選択される基であり、
Ｒ８は水素原子または置換もしくは非置換の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基、またはＤ１−Ｄ２−Ｄ３基であり：
Ｄ１はトリアゾリルまたは−ＣＨ_２−トリアゾリル基を表し、
Ｄ２は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニレンまたは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレン基であってＯまたはＮの中から選択される１個またはいくつかのヘテロ原子によって割り込まれ得る基、２価のグリコシル基、−Ｏ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’）ｎ−または−Ｎ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’−Ｏ）ｎ−基であってｎは１〜２０の整数であり、ＲおよびＲ’は同一または異なり、ＲおよびＲ’が同時にＣＨ_３ではない条件でＨまたはＣＨ_３である基、アミノ酸またはペプチド、あるいはこれらの基の組み合わせであり、
Ｄ３は、エステル結合もしくはアミド結合を形成するカルボン酸官能基を含むことによってＤ２に結合した、マレイミドカプロイルモチーフ、アミノ酸、ペプチド、葉酸、抗体または抗体フラグメントを表し、
Ｒ９およびＲ’９は、同一または異なり、水素原子、またはハロゲン原子、もしくは−ＮＯ_２、−ＣＮから選択される基、もしくは抗体を表すＡｂを含む−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ａｂから選択される基などの電子求引基を表し、
Ｖは酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
または、ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ’１０を表し、
または、ＸはＣＲ１０を表し、Ｙは窒素原子を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
または、Ｘは窒素原子を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ１０を表し：
Ｒ０は、アノマー炭素原子によって式（Ｉ）の分子の残部に結合したグリコシル基を表し、そして
Ｒ１０およびＲ’１０は、同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール、もしくは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシなどの電子供与基を表す。

本発明に係る化合物（Ｉ）は、選択されたグリコシル基の機能として、蛍光の検出によって特定のグリコシダーゼ酵素活性の存在を明らかにすることができる分子プローブとして作用する。式（Ｉ）の化合物中に存在するＲ０−Ｏ結合は、切断反応の触媒として作用する標的グリコシダーゼ酵素の存在下で、加水分解によって切断することができる。

より具体的には、分子プローブは標的グリコシダーゼ酵素に遭遇する前は見えない（すなわち、「ステルスプローブ」）が、前記酵素によって化学的に修飾されると、カスケード反応を介して断片化して強い蛍光を産生する。分子プローブは以下の４つの分子成分を含む：（ｉ）自動折り畳みスペーサーのタンデムであり、一端に（ｉｉ）標的酵素の基質の役割を果たすグリコシル基を有し、他端に（ｉｉｉ）水性媒体中で、前記断片化によってそのヒドロキシル化形態ＨＯＲ１を放出する場合にＥＳＩＰＴ発蛍光団のクラスに属するＯＲ１基を有する。

スペーサーのペアは、除去型スペーサーと、環化のために予め組織化された環化型スペーサーとを含む。このスペーサーのペアの特定の選択は、対応する分子プローブの以下の２つの本質的な特性を得ることを可能にする：（ａ）自発的な劣化に反応せず、それゆえに偽の陽性蛍光シグナルの産生に反応しないようにする、そして（ｂ）生命科学の分野での応用に適合する産生物として、標的酵素による処理中の急速な断片化反応速度を確実にする。Ｒ０基は標的グリコシダーゼの作用によって分子の残部から切断され得、これは、脱離反応および環化／切断反応を介して自己犠牲化する不安定な中間体をもたらし、自発的かつ急速に、蛍光析出物を放出し、そして蛍光シグナルを産生する。この独特の分子構造は特に急速な酵素反応を可能にし、特に、文献ＷＯ２０１４／０２０２８５に記載されるプローブの使用によって得られるものよりもはるかに急速である。

したがって、本発明は、本特許出願に記載する実施された変形にかかわらず、グリコシダーゼのヒトにおけるin vivoでの検出のための式（Ｉ）の化合物に関する。本発明に係る式（Ｉ）の化合物はまた、動物中のin vivoでの検出に使用することもできる。

別の実施形態によれば、本発明は、本発明に係る化合物（Ｉ）を用いてグリコシダーゼの存在をin vitroまたはex vivoで検出する方法に関する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含む、グリコシダーゼの存在をin vitroまたはex vivoで検出する方法に関する：
前記グリコシダーゼを含有すると考えられる試料を本発明に係る化合物（Ｉ）と接触させる工程、
ＯとＲ０との間の共有結合を切断し、続いて、ＨＯＲ１の放出をもたらすスペーサーのペアの脱離および環化反応の後、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合を切断することによって、特に析出物の形態での蛍光化合物の形成を可能にするのに適切な条件を適用する工程、
前記蛍光析出物の定量的または定性的分析を行う工程。

本発明に係る式（Ｉ）の化合物を用いて得られる析出物は、ＯとＲ０との間の共有結合を切断し、続いて、スペーサーのペアの脱離および環化の後、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合を切断することによって、強い蛍光を発する。しかし、対応する式（Ｉ）の化合物は穏やかな蛍光を発するか、または全く蛍光を発しない。グリコシダーゼ酵素基質である本発明に係る化合物は、オン／オフモードに従って作動するプローブのように挙動する。

特に、本発明に係る検出方法は、生理学的条件、特にｐＨ約７．４に緩衝された水性媒体中で実施することができる。

本発明はまた、式（Ｉ）の化合物の合成における中間体である、式（ＩＩ）の化合物に関する：

式中：
すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９およびＶは式（Ｉ）の化合物において定義されるとおりであり、
Ｒ１２は水素原子またはアミン官能基保護基を表し、
Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そしてＺはＯＲ’０を表し、
またはＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ’１０を表し、
またはＸはＣＲ１０を表し、Ｙ’は窒素原子を表し、そしてＺ’はＯＲ’０を表し、
またはＸは窒素原子を表し、Ｙ’はＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ１０を表し、
Ｒ’０はすべてのアルコール官能基が保護基によって保護されているＲ０基を表し、Ｒ０、Ｒ１０およびＲ’１０は式（Ｉ）の化合物において定義されるとおりである。

本発明はまた、以下の工程を含む化合物（Ｉ）の調製方法に関する：
本発明の文脈において定義される化合物（ＩＩ）を入手できる工程、
下記式の化合物（ＩＩＩ）を入手できる工程であり、

前記Ｒ１は式（Ｉ）の化合物の定義のとおりであり、Ｍは脱離基であって具体的にはハロゲン原子、特に塩素原子である基、イミダゾリル基またはパラニトロフェノキシを表し、好ましくはＭが塩素原子を表す工程、
前記化合物（ＩＩＩ）の付加反応により化合物（ＩＶ）を得、前記化合物（ＩＶ）は以下の構造を有し：

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、Ｖ、Ｘ、Ｙ’およびＺ’は式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において定義されるとおりである工程、
前記化合物（Ｉ）を得るために前記化合物（ＩＶ）のＲ’０基に存在するアルコール官能基を脱保護する工程。

本発明に係る異なる化合物は、少なくとも特に指定されていないとしても、すべての可能な光学異性体の形態において、場合によってはすべての割合の混合物において、見出され得る。特定の実施形態によれば、不斉炭素原子を含む本発明に係る化合物はラセミ体で見出され、ＲおよびＳ体はほぼ等しい割合で見出される。別の実施形態によれば、本発明の式（Ｉ）化合物は、ジアステレオマーまたはエナンチオマーにおいて、ジアステレオマーまたはエナンチオマー過剰率が８０％を超えるか、またはさらに９５％を超える濃縮された形態、または純粋な異性体形態で、すなわちジアステレオマーまたはエナンチオマー過剰率が９９％を超える濃縮された形態で見出され得る。

これらの化合物はジアステレオマーまたはエナンチオマー中で、古典的な分離技術、例えば、既知の原理である光学活性酸または光学活性塩基を用いたラセミ塩の分別再結晶、または最も頻繁には、キラル相または非キラル相上での古典的なクロマトグラフィー技術によって、濃縮された形態で単離される。

適用可能であれば、本発明に係る化合物が塩形成可能な官能基を含む場合、それらは塩、特に塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩の形態で見出され得る。本発明をより詳細に説明する。まず、使用する用語を定義する。

〔定義〕
「脂肪族複素環」とは、本発明の文脈において、３〜２０員、好ましくは５〜１０員、さらにより好ましくは５、６、７または８員を含み、Ｏ、ＮまたはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含む、置換されているかまたは置換されていない飽和環と理解される。

「脂肪族炭素環」とは、本発明の文脈において、炭素原子のみで構成される３〜３０員、好ましくは５〜１０員、さらにより好ましくは５、６、７または８員を含む、置換されているかまたは置換されていない飽和環であると理解される。

「アルキル」とは、本発明の文脈において、直鎖状または分枝状であり得る飽和炭化水素鎖であると理解される。好ましくは、用語「アルキル」は、少なくとも特に指定されない限り、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基、特にアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）基を意味する。メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、およびｔｅｒｔ−ブチルは、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基（１〜４個の炭素原子を有するアルキル）の例である。

「アルキレン」とは、二価のアルキル基であると理解される。

「アリール」とは、少なくとも特に断らなければ、５〜２４員、５〜２０員、好ましくは単結合および二重結合が交互である５〜１５員を含み、少なくとも１つの芳香環を含む、単環式、二環式または多環式の不飽和炭化水素であると理解される。任意のアリール基の例として、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニルおよびシンナミル基を挙げることができる。アリールという用語はまた、１Ｈ−フェナレン−１−オン（ＣＡＳ番号 ５４８−３９−０）などの、構成炭素の１つが−Ｃ（Ｏ）のカルボキシ形態で見出される上記単環式、二環式または多環式の不飽和炭化水素環を含む。

「アリーレン」とは、二価のアリール基であると理解される。

「ヘテロアリール」とは、単環式、二環式または多環式の炭素環式環であり、少なくとも特に断らない限り、５〜２４員、好ましくは６〜２０員、より好ましくは６〜１５員を含み、少なくとも１個の芳香族基および炭素環式環に組み込まれた酸素、窒素または硫黄の原子の中から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む。ヘテロアリール基の例として、２−、３−または４−ピリジニル、２−または３−フロイル、２−または３−チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チアダゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、ピリダジニル、インドリル、オキサニル、４（１Ｈ）−キノリノニル、ジベンゾチオフェニル、ジベンゾフラニルおよび９Ｈ−カルバゾリルを挙げることができる。ヘテロアリールという用語はまた、４（３Ｈ）−ピリミジノニルまたは４（３Ｈ）−キナゾリノニルなどの、構成炭素原子の１つが−Ｃ（Ｏ）のカルボキシ形態で見出される前記基を含む。

特に断りのない限り、基が置換されていると記載されている場合、これは塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素の原子、シアノ、アルキル、トリフルオロアルキル、トリフルオロメチル、アルセニル、アルシニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル基の中から特に選択される１つまたはいくつかの置換基によって置換されており、前記基自体が置換され得ることを意味する。これらの置換を定義するために使用される用語は、当業者によって通常認識されるものである。

「アルコキシ」および「アリールオキシ」とは、それぞれ、本発明の文脈において定義されるアルキルおよびアリールを有する−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ−アリール基であると理解される。

「ハロアルキル」とは、少なくとも１個の水素原子がハロゲン原子で置換されている飽和、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖であると理解される。

「グリコシダーゼ」とは、加水分解酵素、グリコシド結合の加水分解を触媒し、少なくとも１つのオシド化合物を放出する能力を有するグリコシド酵素であると理解される。

「グリコシル」基とは、グリコシル結合によって、すなわちそのアノマー炭素を介して、分子の残部に結合した任意の単糖類または多糖類の糖であると理解される。アノマー炭素は、アルファまたはベータの立体配置をとることができる。グリコシル基の例として、モノグリコシル基、すなわち単一の糖単位によって形成されるモノグリコシル基、またはポリグリコシル基、すなわち複数の同一または異なる糖単位によって形成されるポリグリコシル基を挙げることができる。具体的には、糖単位はヘキソースまたはペントース型であり得、例えば、ガラクトース、グルコース、マンノース、グロース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、フコース、フルクトース、アラビノース、リキソース、リボースおよびキシロースの中から選択され得る。糖単位は、ＬまたはＤ立体化学的配置のものであってもよい。

古典的には、用語「アルケニル」は少なくとも１つの二重炭素−炭素結合を含み、特に明記しない限り、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子を示す直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を示す。

本発明の文脈において、用語「アルケニレン」は、二価のアルケニル基を示す。

用語「アルキニル」は少なくとも１つの三重炭素−炭素結合を含み、特に明記しない限り、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜６個の炭素原子を示す直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を示す。

「アルキニレン」とは、二価のアルキニル基であると理解される。

「水可溶化基」とは、水性媒体中でのプローブの溶解性を改善することを可能にする親水性基であると理解され、特に、水素原子による水可溶化基の置換が異なるのみであるプローブに関する。

「蛍光」は、所与の波長の光によって励起される分子がより長い波長の光を放出する特性である。蛍光は、発蛍光団と入射光子との相互作用から生じる現象である。このプロセスは励起とも呼ばれる。光子の吸収により、発蛍光団中の電子がその基底状態からより高いエネルギーレベルになる。そして、電子は、光子を放出することによって元のレベルに戻る。このプロセスは蛍光発光と呼ばれる。次いで、発蛍光団は、吸収された光子の波長よりも長い波長の光を放出する。これは、単に、励起状態の寿命の間のエネルギーの分散により、放出された光子のエネルギーが吸収された光子のエネルギーよりも小さいという事実によるものである。これは、特許出願ＷＯ２００４／０５８７８７において与えられている定義である。

本発明に係る化合物（Ｉ）は、化学反応、特にグリコシダーゼによって触媒される加水分解の間に別の基質に変換されるので、「グリコシダーゼ基質」と呼ばれる。水性媒体中でのこの反応の間、化合物（Ｉ）（「プローブ」とも呼ばれる）は標的グリコシダーゼの作用下で切断され、これは蛍光析出物および非蛍光生成物の形成をもたらす。

本発明の文脈における「スペーサーのペア」は化合物（Ｉ）の断片であり、これは、一端にグリコシル−Ｒ０基を有し、他端に、加水分解によって放出されるとＥＳＩＰＴクラスの発蛍光団に属する−ＯＲ１基を有する。このスペーサーのペアは（Ｒ０を放出する加水分解の後に脱離反応を受ける）脱離型の第１のスペーサーと、（脱離型スペーサーの脱離の後に環化し、これによりＨＯＲ１を生成することを可能にする）第２の環化型スペーサーとを含む。図１は、本発明に係るスペーサーのペアを必要とする式（Ｉ）化合物を用いた分解機構を表す。

〔式（Ｉ）の化合物〕
本発明は、式（Ｉ）の化合物に関する：

式中：
すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合の切断後に得られるＨＯＲ１が、ＥＳＩＰＴと呼ばれる、励起状態における分子内のプロトンの移動をもたらす発蛍光団のクラスに属するものであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、以下のいずれかで定義され：
Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、およびＲ４は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
あるいはＲ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、並びに、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に、水可溶化基で置換され得る脂肪族複素環を形成し、
あるいはＲ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、並びに、Ｒ３およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子とともに、脂肪族炭素環を形成し、
Ｒ５およびＲ６は同一または異なり、互いに独立して、水素原子、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１０）アリールを表し、
Ｒ７は水素原子、または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシの中から選択される基であり、
Ｒ８は水素原子または置換もしくは非置換の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基、またはＤ１−Ｄ２−Ｄ３基であり：
Ｄ１はトリアゾリルまたは−ＣＨ_２−トリアゾリル基を表し、
Ｄ２は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニレンまたは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレン基であってＯまたはＮの中から選択される１個以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る基、２価のグリコシル基、−Ｏ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’）ｎ−基または−Ｎ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’−Ｏ）ｎ−であってｎは１〜２０で変動する整数であり、ＲおよびＲ’は同一または異なり、ＲおよびＲ’が同時にＣＨ_３ではない条件でＨまたはＣＨ_３である基、アミノ酸またはペプチド、あるいはこれらの基の組み合わせであり、
Ｄ３は、エステル結合もしくはアミド結合を形成するカルボン酸官能基を含むことによってＤ２に結合した、マレイミドカプロイルモチーフ、アミノ酸、ペプチド、葉酸、抗体または抗体フラグメントを表し、
Ｒ９およびＲ’９は、同一または異なり、水素原子、またはハロゲン原子、もしくは−ＮＯ_２、−ＣＮから選択される基、もしくは抗体を表すＡｂを含む−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ａｂから選択される基などの電子求引基を表し、
Ｖは酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
または、ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ’１０を表し、
または、ＸはＣＲ１０を表し、Ｙは窒素原子を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
または、Ｘは窒素原子を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ１０を表し：
Ｒ０は、アノマー炭素原子によって式（Ｉ）の分子の残部に結合したグリコシル基を表し、そして
Ｒ１０およびＲ’１０は、同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール、もしくは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシなどの電子供与基を表す。

ＯＲ１基は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合の切断後に放出されるＲ１ＯＨに対応する得られた蛍光析出物がＥＳＩＰＴ発蛍光団となるように選択される。

好ましくは、Ｒ^１が置換または非置換の１つ以上の芳香環を含む芳香族基であり、前記環は窒素、酸素または硫黄原子から選択される１つ以上のヘテロ原子および／または１つ以上のＣ＝Ｏカルボニルの形態の炭素原子を含むことができる。

このようなＯＲ１基の例は、式（Ａ１）に対応する：

式中：
Ｘ２は酸素原子であり、Ｘ１は−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＳＨ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、−Ｏ−フェニル、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは−ＮＨ−フェニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは−Ｓ−（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール基であり、前記アルキルおよびフェニル基は置換または非置換であり得るか、
または、Ｘ２は窒素原子を表し、置換または非置換の（Ｃ５〜Ｃ２４）ヘテロアリールを形成するＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合するかのいずれかであり、

は、例えば、フェニル、ナフチル基、そして：

の中から選択される置換または非置換の（Ｃ５〜Ｃ２４）アリールまたは（Ｃ５〜Ｃ２４）ヘテロアリールを表し、
前記基は置換されていても置換されていなくてもよく。

Ｘ３は、Ｓ、ＯまたはＮＲｄを表し、Ｒｄは、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す。

ＥＳＩＰＴ発蛍光団は、１００ｎｍを超え、しばしば２００ｎｍに近いストークスシフトを示す。すべてのＥＳＩＰＴ発蛍光団は、フェノール型のＯＨ基が励起状態のプロトンの分子内移動を生じさせ、アルキル化、アシル化、または他に官能化される場合、１００ｎｍを超えるストークスシフトに対応するこの蛍光発光を失う。この官能化は、照射による励起の間、式（Ａ１）で与えられる図において、Ｘ２ヘテロ原子への水素原子の移動を妨げ、これにより、プロトン移動方法の特徴を示す蛍光の放出を妨げる。

式（Ｉ）化合物のカルバメート基へのＨＯＲ１ヒドロキシルの組み込みは、プロトン移動を妨げる。次に、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合の切断後に得られるヒドロキシ基を用いて、分子内プロトン移動を起こすことができる。

最も頻繁には、Ｒ１基は、非置換または置換されている、および／または窒素などのヘテロ原子を含み得る、１つ以上の不飽和炭素環と併合されているフェニル基に対応する。このＯＲ１フェノキシ誘導体は、基質に結合していない場合、そのプロトン化形態において、ＥＳＩＰＴクラスの発蛍光団に属するＨＯ−Ｒ１フェノール誘導体に対応する。

いくつかの−ＯＲ１誘導体は例えば、以下の好ましい構造（Ａ２）または（Ａ３）の１つに対応する：

式中：
Ｔは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル）−または−Ｎ（（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール）−であり、
Ｒｅは水素原子または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲｈなどの電子求引性炭素置換基であり、Ｒｈは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲｅは−ＣＯＮＲｉＲｊであり、ＲｉおよびＲｊは同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲｅは−ＣＦ_３、または２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イル基であり、
Ｒｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲｋＲｌ、−ＮＨＲｋまたは−ＯＲｋであり、ＲｋおよびＲｌは同一または異なり、それぞれ独立して（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であり、
または、ＲｅおよびＲｆが互いに結合して、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る、飽和または不飽和、置換または非置換の４つまたは５つの員を含む炭化水素鎖を形成し、
Ｒｇは、水素、Ｂｒ、Ｃｌ、ＩまたはＦ原子であり、

式中、
Ｔ’は−ＮＨ_２、−ＯＨ、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール基、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、−ＳＨ、−ＮＨＲ’ｇ、−ＯＲ’ｇ、−ＮＲ’ｇＲ’ｈまたは−ＳＲ’ｇであり、Ｒ’ｇおよびＲ’ｈは同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはアリール基であり、
Ｒ’ｅは水素原子または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲ’ｉなどの電子求引性炭素置換基であり、Ｒ’ｉは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、
あるいはＲ’ｅは−ＣＯＮＲ’ｊＲ’ｋであり、Ｒ’ｊおよびＲ’ｋは同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲ’ｅは−ＣＦ_３または２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イル基であり、
Ｒ’ｆは水素、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ化物原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲ’ｌＲ’ｍまたは−ＯＲ’ｌであり、Ｒ’ｌおよびＲ’ｍは同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、
またはＲ’ｅおよびＲ’ｆは互いに結合して、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る、飽和または不飽和、置換または非置換の４または５員を含む炭化水素鎖を形成する。

本発明者らは特に、本発明において使用され得る上記ＥＳＩＰＴ発蛍光団の例を与える出願ＷＯ２０１３／０４５８５４、ＷＯ２０１４／０２０２８５およびＷＯ２０１５／１９７９８１に言及し得る。

本発明の特定の実施形態によれば、Ｒ１は、以下の式（Ａ４）または（Ａ５）の１つに応答する−ＯＲ１を有する芳香族基である：

上記発蛍光団（Ａ５については約１７０ｎｍ）またはＨＰＱの任意のアナログの非常に大きなストークスシフトは、プローブの優れた感度に寄与し、放出された発蛍光団を、分析が行われる生物学的試料に由来し得る天然の蛍光と容易に区別可能にする。

本発明の一実施形態によれば、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。別の特定の実施形態によれば、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、例えば、メチルまたはエチルを表す。特定の実施形態によれば、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝−ＣＨ_３である。

別の実施形態によれば、またはＲ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素および窒素原子とともに、水可溶化基によって置換され得る脂肪族複素環を形成する。一実施形態によれば、Ｒ３は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、好ましくは水素原子であり、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、ｍ＝３、４または５である−（ＣＨ_２）ｍ鎖を形成する。別の実施形態によれば、Ｒ３は水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であり、好ましくは水素原子であり、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、Ｒ２からＲ４に向かう方向に−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＲ１１−ＣＨ_２−鎖を形成し、Ｒ１１は水素原子または−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表し、ｎは０または１に等しく、Ｌは連結アームおよびＧＰは水可溶化基であり、すなわち、化合物（Ｉ）は下記式の構造を有する：

合成を目的とする場合、ｎ＝１およびＬは連結アームであることが非常に多く、具体的には、−（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１−アーム（ピペラジン方向−＞ＧＰ基）であり：
Ｌ１およびＬ’１は、同一または異なり、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−、−Ｎ（フェニル）−、−Ｎ（アリール）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＳＯＣ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−および−ＣＯＮＨ−の中から選択され；
Ｌ２は以下の２価の基の中から選択され：（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキニレン、（Ｃ６〜Ｃ２４）アリーレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキルアリーレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルケニルアリーレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキニルアリーレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキルシクロアルキレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルケニルシクロアルキレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキニルシクロアルキレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルケニルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７〜Ｃ４４）アルキニルヘテロシクロアルキレン；前記基は、トリアゾール基によって割り込まれることまたは停止することが可能であり、具体的には（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、アミド、イミド、リン化物、窒化物、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニルおよび−ＯＨの中から選択され得る１つ以上によって置換または非置換であってもよく；そして
ｍ１、ｍ’１およびｍ２は同一または異なり、これらは０または１に等しい。

Ｌアームが存在する場合、ピペラジンまたは合成の理由からＧＰ基を延長するように選択される。好ましい一実施形態によれば、Ｌは上で定義したＬ１＝−Ｃ（Ｏ）−、ｍ１＝ｍ２＝１、ｍ’１＝１または０、およびＬ２およびＬ’１である（Ｌ１）ｍ１−（Ｌ２）ｍ２−（Ｌ’１）ｍ’１を表し、具体的には、Ｌは、ｐが１、２、３または４に等しく、Ｌ３がトリアゾール基、具体的には、１Ｈ−１，２，３−トリアゾール基である、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）ｐ−Ｌ３を表す。

ＧＰは水可溶化基である。水可溶化基の例として、水溶液中で荷電種を形成できる基が挙げられる。水可溶化ＧＰ基の例として、アミン（第一級、第二級または第三級）、アミジン、グアニジンまたはテトラゾールの中から選択されるＦ１官能基；Ｆ２カチオン性またはアニオン性官能基、特にアンモニウム、カルボキシレート、スルホネートまたはリン酸型基；これらのＦ１および／またはＦ２官能基の１つ以上を含む基；ポリエチレングリコール；グルコース、ガラクトースおよびマンノースなどの糖または多糖；ポリリジン、ポリアルギニン、ＴＡＴペプチドなどのペプチド基が挙げられる。アミン官能基の例として、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、およびアルキル基が同一または異なる１〜４個の炭素原子を含むジアルキルアミンが挙げられる。

別の実施形態によれば、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子とともに脂肪族炭素環式環、好ましくはシクロヘキシルを形成する。

環化のためのスペーサーを予め組織化するこれらの２つの方法は、−Ｎ−Ｃ（Ｖ）−Ｏ−基のアルファ炭素上に２つのアルキル置換基を導入すること（または炭素環を形成すること）、または複素環式環中に窒素−Ｎ−Ｃ（Ｖ）−Ｏ基とそのアルファ炭素との間の結合を含むことのいずれかからなり、犠牲プロセスを加速する。

一実施形態によれば、Ｒ５およびＲ６は同一であり、水素原子を表す。一実施形態によれば、Ｒ７は、水素原子、またはメチルなどの（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であり、好ましくは水素原子を表す。

一実施形態によれば、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ水素原子を表す。

一実施形態によれば、Ｒ８は水素原子である。

別の実施形態によれば、Ｒ８は−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３基であり、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３は、本発明の文脈において定義される。この実施形態によれば、Ｄ３は、特に、特定の細胞に対する式（Ｉ）の化合物の選択性を改善するために、細胞受容体を標的とする基である葉酸モチーフ、抗体またはペプチドを表し得る。

本発明の特定の実施形態によれば、Ｒ８は−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３基であり、Ｄ１は−ＣＨ２−トリアゾリル基を表し、Ｄ２は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン基を表し、好ましくはＯまたはＮから選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯによって割り込まれ、Ｄ３は、アミドまたはエステル結合、好ましくはアミド官能基を形成するようにカルボン酸官能基によってＤ２に結合するマレイミドカプロイルモチーフ、アミノ酸、ペプチド、葉酸、抗体または抗体フラグメントであり、好ましくは葉酸である。特定の実施形態によれば、Ｒ８は、以下の式を有する−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３基である：

一実施形態によれば、Ｒ９またはＲ’９基の少なくとも１つは、ハロゲン原子、−ＮＯ_２基または−ＣＮ基、好ましくは−ＮＯ_２基を表す。好ましい実施形態によれば、Ｒ９は水素原子を表し、Ｒ’９はハロゲン原子、−ＮＯ_２基または−ＣＮ基であり、好ましくは−ＮＯ_２基を表す。

一実施形態によれば、Ｒ１０および、適用可能であれば、Ｒ’１０は水素原子を表す。一実施形態によれば、Ｖは酸素原子を表す。

Ｒ０基は、グリコシダーゼ酵素の作用によって分子の残部から切断され得るという特徴を有する。この酵素は、Ｒ０と結合する酸素原子との間の切断において触媒の役割を果たす。このような切断は、グリコシダーゼ酵素が触媒の役割を果たす水性媒体中での加水分解の結果であり得る。これは、前記グリコシダーゼ酵素が触媒活性と呼ばれるからである。

Ｒ０は、そのアノマー炭素原子によって分子の残部に結合したグリコシル基を表す。Ｒ０は、特に水性媒体中の、グリコシダーゼ酵素の触媒作用によって、式（Ｉ）の化合物の残部から切断され得る。本発明に係る蛍光プローブによって標的化され得るグリコシダーゼ酵素の例として、Ｎ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ；Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ；α−アミラーゼ；α−アラビノフラノシダーゼ、α−アラビノシダーゼ；β−セロビオシダーゼ；β−チトビオシダーゼ；α−ガラクトシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；α−グルコシダーゼ；β−グルコシダーゼ；β−グルクロニダーゼ；α−マルトシダーゼ；α−マンノシダーゼ；β−マンノシダーゼ；β−キシロシダーゼ；β−Ｄ−フコシダーゼ；α−Ｌ−フコシダーゼ、β−Ｌ−フコシダーゼ；Ｌ−イズロニダーゼまたはセルラーゼが挙げられる（Orenga, S., James, A.L., Nanafi, N., Perry, 1.D., & Pincus, D.H.(2009). Enzymatic substrates in microbiology. Journal of MicrobioIogicaI Methods, 79(2), 139-155）。

Ｒ０基は、好ましくは目的のグリコシダーゼに特異的であるように選択される。一方、特定のグリコシダーゼは、異なるＲ０基のセットを切断することができる；これらの中で、ヘキソサミニダーゼが挙げられる。

グリコシダーゼの存在下で、水性媒体中で切断可能なＲ０−Ｏ基に対応するすべての可能なグリコシル基をＲ０として使用することができる。グリコシル単位は、特にアセチルまたはアミノ基で官能化されていてもされていなくてもよい。Ｎ−アセチルヘキソサミンはグリコシル基の例である。最も頻繁には、グリコシル基が１〜５０個の糖単位を含む。ポリグリコシルの場合、これは、ホモポリマー、またはランダム、交互もしくはブロック構造を有するコポリマーとして作用し得る。

上記Ｒ０基の例は、以下に与えられる：ガラクトシル、グルコシル、マンノシル、グロシル、アロシル、アルトロシル、イドシル、タロシル、フコシル、フルクトシル、アラビノシル、リキソシル、リボシル、キシロシル、グルクロニルおよびＮ−アセチル−ヘキソサミニルの中から選択されるモノグリコシル基、および同一または異なるこれらのモノグリコシル基のいくつかで構成されるポリグリコシル基。

一実施形態によれば、Ｒ０はＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ；Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ；α−アミラーゼ；α−アラビノフラノシダーゼ、α−アラビノシダーゼ；β−セロビオシダーゼ；β−チトビオシダーゼ；α−ガラクトシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；α−グルコシダーゼ；β−グルコシダーゼ；β−グルクロニダーゼ；α−マルトシダーゼ；α−マンノシダーゼ；β−マンノシダーゼ；β−キシロシダーゼ；β−Ｄ−フコシダーゼ；α−Ｌ−フコシダーゼ、β−Ｌ−フコシダーゼ；Ｌ−イズロニダーゼまたはセルラーゼの中から選択される、グリコシダーゼの作用下で切断可能な基であり；Ｒ０はガラクトシル、グルコシル、マンノシル、グロシル、アロシル、アルトロシル、イドシル、タロシル、フコシル、フルクトシル、アラビノシル、リキソシル、リボシル、キシロシル、グルクロニルおよびＮ−アセチル−ヘキソサミニルの中から選択されるそのアノマー炭素によって結合されるモノグリコシル化基、または同一または異なるこれらのモノグリコシル化基のいくつか、例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜６個で構成されるポリグリコシル化基である。

一実施形態によれば、Ｒ０はガラクトシダーゼ、例えば、β−ガラクトシダーゼ、イズロニダーゼ、グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、グルクロニダーゼ、特にβ−グルクロニダーゼまたはセルラーゼの作用によって切断可能な基であり；そして、Ｒ０はＤ−グルクロニル、Ｌ−イズロニル、Ｄ−グルコピラノシル、Ｄ−ガラクトピラノシル、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル、Ｄ−マンノピラノシル、Ｌ−フコピラノシルの中から選択される、そのアノマー炭素によって結合されるモノグリコシル化基、または同一または異なるこれらのモノグリコシル化基のいくつか、例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜６個で構成されるポリグリコシル化基である。

一実施形態によれば、Ｘ、Ｙ、およびＺは、以下のいずれかである：
ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そしてＺはＯＲ０を表し、
またはＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そしてＺはＲ’１０を表し、
Ｒ１０、Ｒ’１０およびＲ０は本発明の文脈で定義されるとおりである。

本発明の文脈において、本発明者らは特に、組み合わせて与えられる置換基の特定の定義を使用する。

第１の特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は下記の式（Ｉａ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ０およびＶは、本発明の文脈において定義されるとおりである。

第２の特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は下記の式（Ｉｂ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ’９、Ｘ、ＹおよびＺは、本発明の文脈において定義されるとおりである。

第３の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は下記の式（Ｉｃ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ０およびＲ１は、本発明の文脈において定義される通りである。

第４の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は以下の式（Ｉｄ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ’９、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｘ、ＹおよびＺは、本発明の文脈において定義される通りである：

第５の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は以下の式（Ｉｅ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ０、Ｒ１、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３は、本発明の文脈において定義されるとおりである：

特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は以下の式（Ｉｆ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ０は、本発明の文脈において定義されるとおりである：

特定の実施形態によれば、本発明はすべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態の化合物に関し、以下の中から選択される：

および

〔式（ＩＩ）の化合物〕
本発明はまた、式（ＩＩ）の化合物に関する：

式中：
すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９およびＶは式（Ｉ）の化合物において定義されるとおりであり、
Ｒ１２は水素原子またはアミン官能基保護基を表し、
Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そしてＺはＯＲ’０を表し、
またはＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ’１０を表し、
またはＸはＣＲ１０を表し、Ｙ’は窒素原子を表し、そしてＺ’はＯＲ’０を表し、
またはＸは窒素原子を表し、Ｙ’はＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ１０を表し、
Ｒ’０はすべてのアルコール官能基が保護基によって保護されているＲ０基を表し、Ｒ０、Ｒ１０およびＲ’１０は式（Ｉ）の化合物に定義されるとおりである。

式（ＩＩ）の化合物は式（Ｉ）の化合物の合成中間体であり、アミン官能基保護基は、Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G.N., ed. John Wiley and Sons, 2006 and in Protective Groups, Kocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlagに記載されているような保護基であると理解される。

一実施形態によれば、Ｒ１２はアミン官能基保護基である。一例として、Ｒ１２は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオロフェニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基または２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）基などの、アリルまたはカルバメート基から選択されるアミン官能基保護基を表す。

特定の実施形態によれば、Ｒ１２は水素原子を表す。

一実施形態によれば、Ｒ’０はアルコール官能基がアルコール官能基保護基によって保護されているＲ０基を表し、好ましくは化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）との反応中に使用される反応条件下で、特にトリメチルシリル基、例えばｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルおよびトリイソ−プロピルシリルなどのシリル基によって；アセタール、具体的には１，３−ジオキソランの形態；または脂肪酸エステルの形態で保護される。

一実施形態によれば、化合物（ＩＩ）は下記の式（ＩＩａ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１２、Ｒ０およびＶは、本発明の文脈において定義されるとおりである。

本発明の第２の特定の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）は下記の式（ＩＩｂ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ’９、Ｒ１２、Ｘ、ＹおよびＺは、本発明の文脈において定義されるとおりである。

第３の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）は下記の式（ＩＩｃ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ０およびＲ１２は、本発明の文脈において定義されるとおりである。

本発明の第４の特定の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）は下記の式（ＩＩｄ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ’９、Ｒ１２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｘ、ＹおよびＺは、本発明の文脈において定義されるとおりである。

第５の実施形態によれば、化合物（ＩＩ）は以下の式（ＩＩｅ）で表されるように、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態であり、式中、Ｒ０、Ｒ１２、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３は、本発明の文脈において定義されるとおりである。

〔式（Ｉ）の化合物の調製方法〕
本発明は以下の工程も含む、本発明の文脈に記載の化合物（Ｉ）の調製方法に関する：
本発明の文脈に定義される化合物（ＩＩ）を入手できる工程、
下記式の化合物（ＩＩＩ）を入手できる工程であって、

前記Ｒ１は式（Ｉ）の化合物の定義のとおりであり、Ｍは脱離基であって具体的にはハロゲン原子、特に塩素原子である基、イミダゾリル基またはパラニトロフェノキシを表し、好ましくはＭが塩素原子を表す工程、
前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応により化合物（ＩＶ）を得る工程であって、前記化合物（ＩＶ）は以下の構造を有し：

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、Ｖ、Ｘ、Ｙ’およびＺ’は式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において定義されるとおりである工程、
前記化合物（Ｉ）を得るために前記化合物（ＩＶ）のＲ’０基に存在するアルコール官能基を脱保護する工程。

一実施形態によれば、化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応は、Ｒ１２が水素原子である化合物（ＩＩ）を用いて実行される。

別の実施形態によれば、本発明者らはＲ１２が水素原子ではない化合物（ＩＩ）を入手可能であり、化合物（ＩＩ）のアミン官能基を脱保護する工程を、化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応の前に実施して、Ｒ１２＝Ｈなどの化合物（ＩＩ）を得る。

Ｖ＝Ｏの場合、化合物（ＩＩ）は、以下の工程に従って有利に得ることができる：
以下の式の化合物（Ｖ）を入手できる工程：

下記式の化合物（ＶＩ）を入手できる工程

および前記化合物（ＶＩ）の化合物（Ｖ）への付加反応によって化合物（ＩＩ）を得られ、
式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、Ｒ１２、Ｖ、Ｘ、Ｙ’およびＺ’は本発明の文脈において定義されるとおりであり、Ｋは脱離基であって特にハロゲン、特に塩素である基、またはイミダゾリル、またはパラニトロフェニル基を表す。

Ｒ８＝Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３の場合、Ｒ８はクリックケミストリーによって導入され得る。トリアゾール基の形成は、当業者に既知の技術を用いて、−Ｎ３とアルキニル官能基との間の反応によって実施することができる。

より具体的には、Ｒ８＝Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３であって、Ｄ１が−ＣＨ_２−トリアゾリル基を表し、Ｄ２は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン基を表し、好ましくはＯまたはＮの中から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯによって割り込まれており、Ｄ３はアミド結合を形成するように含まれるカルボン酸官能基によってＤ２に結合した葉酸モチーフを表す場合に、Ｒ８は式（Ｉ）の前駆体によって運ばれるアルキンと、ヒュンスケン環化付加反応によるアジドとの間の反応によって導入され得る。アジドは、葉酸の酸官能基と式Ｈ_２Ｎ−Ｄ２−Ｎ３の化合物のアミン官能基との間の反応の前に形成される。

好ましくは、実施例に示す方法を使用することも可能である。

〔グリコシダーゼの存在の検出〕
本発明に係る式（Ｉ）の化合物はまた、in vivo、動物またはヒトにおいてグリコシダーゼを検出するために使用することができる。

式（Ｉ）の化合物の投与は静脈内または腹腔内注射によって、または皮膚に、例えば溶液中に分子を含有するスプレーの使用によって完了することができる。

式（Ｉ）の化合物の蛍光の分析は、蛍光または落射蛍光型断層写真技術を用いて、撮像チャンバー内で行うことができる。本発明はまた、本発明に係る化合物（Ｉ）を用いてグリコシダーゼの存在をin vitroまたはex vivoで検出するための方法に関する。より具体的には、本発明は以下の工程を含む、グリコシダーゼの存在をin vitroまたはex vivoで検出するための方法に関する：
前記グリコシダーゼを含有すると考えられる試料を本発明に係る化合物（Ｉ）と接触させる工程、
ＯとＲ０との間の共有結合を切断し、続いて−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合を切断し、ＨＯＲ１の放出をもたらすことによって、特に析出物での形態での蛍光化合物の形成を可能にするのに適切な条件を適用する工程、そして
前記蛍光析出物の定量的または定性的分析をする工程。

試料は、ヒト、動物、植物または微生物由来の任意の適切な生物学的試料であり得る。ヒトまたは動物由来の試料の場合、これは、特に、生物学的流体の試料、特に、全血、血清、血漿、尿、組織試料、または単離された細胞の試料、特に、細胞培地の試料であり得る。植物由来の試料の場合、これは、植物抽出物、真菌または藻類の抽出物、生細胞の抽出物、特に細胞培地の抽出物であり得る。試料は植物を直接含んでいてもよい。微生物由来の試料の場合、微生物は、細菌、ウイルス、真菌または酵母であってもよく、微生物相であってもよい。試料は、微生物、または後者の抽出物、または微生物がインキュベートされた培養培地を直接含んでいてもよい。すべての場合において、試料はプローブの存在下に置かれる前に、当業者に周知の濃縮または培養型調製物にそのまま使用または提示され得る。

動物、植物または微生物由来のサンプルの場合、本発明は、以下の工程を含む、触媒活性グリコシダーゼの存在を検出するための方法に関する：
前記グリコシダーゼを含有すると考えられる試料を本発明に係る化合物（Ｉ）と接触させる工程、前記、
ＯとＲ０との間の共有結合を切断し、続いてスペーサーのペアの脱離および環化反応の後に−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１結合を切断することによって、特に析出物の形態での蛍光化合物の形成を可能にするために適切な条件を適用する工程、そして
前記蛍光析出物の定量的または定性的分析をする工程。

化合物または蛍光析出物の分析は、以下を含むことができる：
蛍光析出物を、蛍光析出物の吸収波長の光を発生させることができる光源に暴露する工程、および
得られた析出物の蛍光を検出する工程。

本分析はまた、蛍光の検出工程の後に、前記蛍光析出物によって提供されるシグナルに基づいて分析された試料を選別する工程を含んでもよい。選別された試料は、微生物培養物の皿のような空間で分離された微生物のコロニーであってもよい。選別された試料はまた、生体分子または微生物のコロニーのいずれかを含む、小さな物体、液体、固体、ゼラチン状または不均一な組成物であってもよい。検出をいくつかの試料に対して並行して行う場合、選別は例えば、フローサイトメトリーまたはデジタルミリ流体デバイスもしくはデジタルマイクロ流体デバイスなどの、放出された蛍光を表す光シグナルによって選別することを可能にするデバイスにおいて、動き始める試料のフローを転用することによって行うことができる。

本発明は、グリコシダーゼの活性を、ＥＳＩＰＴ発蛍光団を使用する蛍光画像化によって利用しやすいものにする。有益なことには、自然分解（すなわち、標的グリコシダーゼの非存在下、生理学的媒体中）に起因するバックグラウンドノイズは観察されなかった。プローブ自体は、特に、検出／撮像機器がセットされているＥＳＩＰＴ発蛍光団繊維の発光波長でわずかに蛍光性であるか、または全く蛍光性ではない。したがって、プローブはオン／オフモードで機能し、最大感度を有する分析の開発に使用することができる。選択されたＲ０基に応じて、本発明は、特定のグリコシル基に対して高い選択性を有するグリコシダーゼを標的化することを可能にする。

本発明に係るプローブは、生命科学におけるいくつかの高度な応用、特に：（１）寒天プレート上の細菌コロニーによって発現されるグリコシダーゼ活性の高収率標的化（コロニーの分析）；（２）生物学的液体中のグリコシダーゼのin vitro検出（血液学およびその他）；（３）フローサイトメトリーにおける細胞単体のレベルでのグリコシダーゼ活性の可視化；（４）培養細胞中の細胞下グリコシダーゼの検出（共焦点蛍光顕微鏡法）；（５）グリコシダーゼの組織化学的検出（組織レベルで）；および最後に（６）動物全体のin vivo画像について興味深い。

したがって、本発明に係るグリコシダーゼ基質としての式（Ｉ）の化合物は、多数の潜在的な用途を有する。これらの用途の例には、細菌コロニーの分析の設計が含まれる。これらは、現在、寒天皿（ペトリ皿）上で実施され、マルチウェルディッシュに含まれるウェルのような別々の区画に能動的に分離する必要なしに、３０００個までのコロニーを区別することができる。したがって、（１）細菌系統の群の中から目的の病原性系統を同定することを可能にする臨床試料に関する試験を設計すること、および（２）古典的な細菌宿主（しばしば市販されている）によって発現する自己産生タンパク質のバンクの大規模な並行試験を完了することが可能である。このタンパク質の収集は特定の目的のタンパク質、例えば、特定のグリコシル基に対する選択性を有するグリコシダーゼ、または非天然グリコシド結合を加水分解するグリコシダーゼを含むと理解できる。特に、グリコシダーゼまたは酵素の指向性進化の分野では、１０^６を容易に超える非常に多数のタンパク質変異体をふるい分けするための効果的かつ高感度な分析が強く求められている。本発明に係るプローブの用途は、それが皿に注がれるか、またはそれ自体ゲル化する前に寒天溶液に溶解することによって、最も容易に想定することができる。代わりとして、基質を、コロニーに導入する前に、フィルターの浸漬によってコロニーと共にインキュベートする。本発明に係るプローブがコロニーの分析などに寄与する主な利点は、発蛍光団の現場での析出であり、これにより蛍光シグナルの希釈を大きく低減する。そして、これは長いインキュベート期間を可能にし、よってより高い感度での分析を可能にする。ジクロロ−ＨＰＱ（約１４０ｎｍ）または任意のアナログＨＰＱの非常に大きなストークスシフトは誤って推定されるべきではなく；また、優れた感度に寄与し、放出された蛍光は、生物学的試料に由来し得る天然の蛍光と容易に区別可能である。

本発明に係るプローブはまた、巨視的蛍光画像化のため、すなわち、生物全体のために使用され得る。この場合、プローブは目的の活性に到達するため、細胞壁を貫通するであろう。

実施例は、添付の図面に関連し、本発明を例示することを可能にするが、これらに限定する方法ではない。

［図面の簡単な説明］
図１は、本発明に係るスペーサーのペアを必要とする式（Ｉ）化合物を用いた分解機構を示す図である。

図２は、３７℃（濃度：１０μＭ）での、実施例１および３のプローブ１３および２７、ならびに従来技術のプローブ２８についての固体状態の蛍光の進化曲線である。

図３は、３７℃（濃度：０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、および５０μＭ）での実施例２のプローブ２１についての固体状態の蛍光の進化曲線を表す。

図４は、微生物によって産生されるセルラーゼ活性を制御する光シグナルを表す。

図５は、微生物培養培地におけるセルラーゼ活性の検出速度を表すグラフである。

［実施例］
〔一般的情報〕
カラムクロマトグラフィーを６０メッシュシリカゲル（４０〜６３ｐｍ）で行った。^１Ｈおよび^１３ＣのＲＭＮスペクトルは、重水素化クロロホルム、重水素化ＤＭＳＯまたは重水素化メタノール中、それぞれ３００ＭＨｚおよび７５または１２５ＭＨｚで記録した。化学的変位（δ）をｐｐｍで示し、テトラメチルシランを参照して、または残留溶媒シグナルに従って記載する；略語にｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｍ＝多重線、ｂ＝幅広線を使用する。ＲＭＮ（Ｊ）結合定数をヘルツで示す。蛍光分析を９６−ウェルブラックポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で行い、マイクロプレート蛍光計（ＥｎＳｐｉｒｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ｂｙ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で記録した。ただし、特定の化学製品を分析反応性の品質で購入し、他の精製を行わずに使用した場合を除く。

市販の乾燥ＤＣＭを、アルゴン下の活性化アルミニウムカラム（ＧＴ Ｓ１００ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に通すことによって乾燥させ、精製した。ＴＥＡを、水素化カルシウムを用いて蒸留し、ＫＯＨペレット中に保存した。乾燥と記された他の試薬をモレキュラーシーブ上で乾燥させた。特に断らない限り、すべての反応は追加の乾燥または精製なしに、溶媒および市販の試薬を用いて大気下で行った。Ｅｌｇａ Ｐｕｒｅｌａｂ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いて得られたミリポア水を、すべての実験で使用した。

以下の略語を使用する：
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ｐｙ＝ピリジン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
Ｙｌｄ．＝収率
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ｒｔ＝室温。

〔実施例１〕
化合物１３は、以下のダイアグラム１に記載されるように調製される。

ダイアグラム１：化合物１３の化学合成

（化合物２の調製）
２−アミノエチルピペリジン１（３．０ｇ、２６．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む１００ｍＬのトルエン溶液に、無水フタル酸（３．８９ｇ、２６．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を少しずつ加え、トリエチルアミン（５５０μＬ、３．９５ｍｍｏｌ、０．１５当量）を１滴ずつ滴下した。次いで、混合物を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて還流下で２時間加熱した。次いで、混合物を濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。淡黄色の固体の形態で化合物２（６．６０５ｇ、２４．７ｍｍｏｌ、収率：９４％）を得た。化合物２を精製せずに使用した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８９−７．８２（ｍ、２Ｈ）、７．７５−７．６８（ｍ、２Ｈ）、３．６８（ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ、２Ｈ）、３．１３−３．０５（ｍ、１Ｈ）、２．９８−２．８８（ｍ、１Ｈ）、２．６４−２．５４（ｍ、１Ｈ）、１．８７−１．７８（ｍ、１Ｈ）、１．７６−１．６８（ｍ、１Ｈ）、１．６３−１．５４（ｍ、１Ｈ）、１．４５−１．３４（ｍ、２Ｈ）、１．３０−１．１５（ｍ、１Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１６８．４、１３３．７、１３１．９、１２３．０、５５．５、４６．４、４３．４、３０．６、２６．１、２４．１。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値２４５．１２９０、計算値２４５．１２９０。

（化合物３の調製）
化合物２（６．６０５ｇ、２４．７ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む８０ｍＬのエタノール溶液を氷浴中で冷却し、炭酸カリウム（４．３６ｇ、３１．６ｍｍｏｌ、１．３当量）、ヨウ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（９１２ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ、０．１０当量）および臭化アリル（２．７３ｍＬ、３１．６ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。氷浴を除去し、混合物を３６時間撹拌した。反応の終わりに、混合物をセライトで濾過し、減圧下で蒸発させた。残留油をＥｔＯＡｃに溶解し、ＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液を添加した。水溶液を２相に分離し、有機層をＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液で２回洗浄した。混合した水相をＥｔＯＡｃで３回抽出した。混合した有機層にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（純粋なＤＣＭ、次いでＤＣＭ：ＭｅＯＨ：Ｅｔ_３Ｎ／９９：０．５：０．５／ｖ：ｖ：ｖ）によって粗生成物を精製して、結晶化した黄色の油の形態で化合物３（２．２４ｇ、７．８９ｍｍｏｌ、収率：３５％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８４−７．７８（ｍ、２Ｈ）、７．７２−７．６５（ｍ、２Ｈ）、５．９５−５．８１（ｍ、１Ｈ）、５．２２−５．０８（ｍ、２Ｈ）、３．９３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝５Ｈｚ），３．７３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ）、３．４２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１４Ｈｚ、Ｊ＝６Ｈｚ）、３．２１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１４Ｈｚ，Ｊ＝６Ｈｚ）、２．８８−２．７６（ｍ、２Ｈ）、２．３７−２．２８（ｍ、２Ｈ）、１．７４−１．４７（ｍ、４Ｈ）、１．４０−１．２５（ｍ、２Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１６８．３、１３５．５、１３３．８、１３２．０、１２３．０、１１７．２、５７．６、５７．３、５０．３、３８．４、２８．１、２４．７、２２．０。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値２８５．１５９５、計算値２８５．１６０３。

（化合物４の調製）
氷で冷却した３（１．３１２ｇ、４．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むｉＰｒＯＨ：Ｈ_２Ｏ／６：１／ｖ：ｖ（５０ｍＬ）の溶液に、少しずつ、水素化ホウ素ナトリウム（８７４ｍｇ、２３ｍｍｏｌ、５．０当量）を加えた。室温で一晩撹拌した後、３７％のＨＣｌ水溶液を用いてｐＨをｐＨ＝１に酸性化した。得られた混合物を濾過し、次いで８０℃で２時間加熱した。ｉＰｒＯＨを減圧下で蒸発させ、得られた水溶液をジエチルエーテルで５回洗浄し、次いで凍結乾燥させ、白色の粉末の形態で化合物４（１．０４５ｇ、４．６ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た。

基本生成物（１−アリル−２−（アミノメチル）ピペリジン）のＲＭＮ：^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝５．９９〜５．８６（ｍ、１Ｈ）、５．２４−５．１３（ｍ、２Ｈ）、３．４１（ｄｄｔ、１Ｈ、Ｊ＝１４Ｈｚ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、Ｊ＝１．５Ｈｚ）、３．０４−２．９０（ｍ、３Ｈ）、２．７４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝３．３Ｈｚ）、２．２１（ｔｔ、２Ｈ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、ｊ＝３．３Ｈｚ）、１．８０−１．７１（ｍ、１Ｈ）、１．６８−１．４３（ｍ、２Ｈ）、１．３９−１．２５（ｍ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１３４．９３、１１６．８７、６１．４７、５６．２３、５１．９３、４２．９７、２８．２８、２４．９５、２３．６６。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値１５５．１５４３、計算値１５５．１５４８。

（化合物６の調製）
４−ヒドロキシ−３−ニトロベンズアルデヒド（３１３ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＡｇ_２Ｏ（１．３００ｇ、５．６１ｍｍｏｌ、３．３当量）を含む、アセトブロモガラクトース５（７００ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリルに溶解し、室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、減圧下で濃縮した。得られた油状物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル／４：６／ｖ：ｖ）により精製して、淡黄色の固体の形態で化合物６（６６９ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ、収率：７９％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝９．９８（ｓ、１Ｈ）、８．４５（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２６（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．８０（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４０（ｂｓ、１Ｈ）、５．３０−５．２７（ｍ、２Ｈ）、４．５５（ｔｄ、Ｊ＝６Ｈｚ，Ｊ＝１Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、２．１６（ｓ、３Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、１．９６（ｓ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１８８．５５、１７０．２４、１７０．０７、１６９．１６、１５３．４５、１４１．２５、１３３．９６、１３１．４８、１２６．８４、１１８．８０、１００．０９、７１．８２、７０．３５、６７．５９、６６．５８、６１．３６、２０．６６、２０．６１、２０．５９、２０．５５。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値５２０．１０５２、計算値５２０．１０６７。

（化合物７の調製）
氷浴中の化合物６（６３６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むＣＨＣｌ_３：ｉＰｒＯＨ／５：１／ｖ：ｖ（１２ｍＬ）溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（５３ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応物を１時間撹拌し、ＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液の添加によって停止させた。

５分間撹拌した後、相を分離し、水相をジクロロメタンで２回抽出した。混合した有機層に、Ｎａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、白色の粉末の形態で化合物７（６０５ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、収率：９５％）を得た。化合物７を精製せずに次の工程で使用した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝７．８０（ｄ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５６（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１−５．１９（ｍ、２Ｈ）、４．５３−４．４５（ｍ、３Ｈ）、４．１９−４．０８（ｍ、２Ｈ）、２．１６（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、６Ｈ）、１．９５（ｓ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．５４、１７０．４６、１７０．１３、１６９．４７、１４７．７０、１４０．８４、１３８．９０、１３２．４１、１２２．８０、１１８．３０、９９．３４、７１．３５、７０．５４、６８．３４、６７．７２、６１．９４、６１．８７、２１．１０、２０．９８、２０．９２。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値５２２．１２０９、計算値５２２．１２２４。

（化合物８の調製）
氷で冷却した化合物７（１２０ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥ＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に、４−ニトロフェニルクロロホルメート（１０７ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、２．２当量）およびピリジン（４８μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、２．５当量）を連続して１滴ずつ滴下した。反応混合物を０℃で３０分間および室温で２時間撹拌した。反応の終わりに、ＨＣｌ １Ｍ水溶液を用いて反応を停止し、相を分離した。有機層を１ＭのＨＣｌ溶液で洗浄し、次いで混合した水相を、ＤＣＭで抽出した。得られた有機層にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（石油エーテル勾配：酢酸エチル／８５：１５〜５０：５０／ｖ：ｖ）により精製し、白色の固体の形態で化合物７（１１１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、収率：７５％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝８．３２（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）、７．９４（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６４（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４−７．３９（ｍ、３Ｈ）、５．５９（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．５２（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３３（ｓ、２Ｈ）、５．１７−５．１４（ｍ、Ｈ）、４．３０（ｄｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３−４．１４（ｍ、２Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）、２．１７（ｓ、３Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７１．０、１３７．８、１３５．１、１２９．４、１２８．９、１２８．９、１２８．８、１２８．４、１２７．３、１２７．２、８０．１、６２．８、５４．２、５３．０、４９．７、４３．９、４１．０、４０．１、２８．５ｐｐｍ。

ＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値６８７．１２６３、計算値６８７．１２８６。

（化合物９の調製）
化合物４（４４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．３当量）を含むＤＣＭ（３ｍＬ）の懸濁液に、化合物８（１００ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。反応混合物を氷浴中で冷却し、ＤＩＰＥＡ（８１ｑＬ、０．４７ｍｍｏｌ、３．１当量）を加えた。５分後、氷浴を除去し、反応混合物を一晩３０℃で加熱した。次いで、混合物をＮａ_２ＣＯ_３およびＮａＨＣＯ_３を混合した飽和水溶液で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色の固体の形態で化合物９（５６ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ、収率：５５％）を得た。

ＮＭＲ：^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）Ｊ＝７．８２（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．９３−５．７５（ｍ、１Ｈ）、５．５６（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４８（ｄ、Ｊ＝／−３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２（ｂｓ、１Ｈ）、５．２２−５．０６（ｍ、６Ｈ）、４．２９−４．１４（ｍ、２Ｈ）、４．１１−４．０６（ｍ、１Ｈ）、３．４３−３．２２（ｍ、３Ｈ）、２．９９−２．８（ｍ、２Ｈ）、２．４３−２．３６（ｍ、１Ｈ）、２．２１（ｓ、３Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、１．７６−１．２５（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．３１、１７０．１９、１７０．１３、１６９．４０、１５６．２６、１４８．９２、１４１．３０、１３４．６８、１３３．１９、１３３．１４、１２４．５９、１１９．８３、１１７．７５、１００．８２、７１．４７、７０．５７、６７．８５、６６．７５、６４．７４、６１．３７、５８．３０、５６．３６、５１．９９、４２．５１、２８．９７、２５．００、２３．７３、２０．７０、２０．６７、２０．５９。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値６８０．２６８３、計算値６８０．２６６７。

（化合物１０の調製）
化合物９（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、１．０当量）および１，３−ジメチルバルビツール酸（３７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、８．０当量）を含む乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）溶液をアルゴン流で脱気した。次いで、パラジウム（０）テトラキス（トリフェニルホスフィン）（０．６ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ、２ｍｏｌ％）を添加した。反応の終わりに、反応混合物を乾燥蒸発させ、さらに、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固体の形態で化合物１０（１３ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、収率：７０％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８２（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５２（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５６（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４８（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２−５．２６（ｍ、１Ｈ）、５．１４−５．０６（ｍ、４Ｈ）、４．３０−４．１５（ｍ、２Ｈ）、４．１１−４．０６（ｍ、１Ｈ）、３．２９−３．２０（ｍ、１Ｈ）、３．１１−３．００（ｍ、２Ｈ）、２．７２−２．５８（ｍ、２Ｈ）、２．２０（ｓ、３Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、１．８７−１．７７（ｍ、１Ｈ）、１．６８−１．５９（ｍ、２Ｈ）、１．４２−１．３４（ｍ、２Ｈ）、１．３１−１．２６（ｍ、１Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．３２、１７０．１９、１７０．１４、１６９．４０、１５６．１５、１４８．９２、１４１．３０、１３３．１４、１３３．１０、１２４．５９、１１９．８４、１００．８２、７１．４８、７０．５７、６７．８５、６６．７３、６４．７３、６１．３６、５６．０３、４６．８８、４６．６８、３０．２６、２６．４７、２４．２６、２０．７０、２０．６７、２０．５９。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値６４０．２３３７、計算値６４０．２３５４。

（化合物１２の調製）
アルゴン雰囲気下、および氷で冷却した化合物１０（１３ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）の懸濁液に、化合物１１（８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＤＩＰＥＡ（１０ｑＬ、０．０６０ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を１滴ずつ滴下した。添加後、反応混合物を０℃で３０分間、次いで室温で一晩混合した。次いで、反応混合物をＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄し、有機層にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色の粉末の形態で化合物１２（１０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、収率：５２％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１０．４１−１０．２９（ｍ、１Ｈ）、８．２４（ｂｓ、１Ｈ）、８．１６−８．０５（ｍ、１Ｈ）、７．８５−７．６３（ｍ、２．５Ｈ）、７．５７−７．４６（ｍ、２Ｈ）、７．４５−７．３７（ｍ、０．５Ｈ）、７．２５−７．０８（ｍ、２Ｈ）、６．２３−６．１０（ｍ、０．５Ｈ）、５．８３−５．７５（ｍ、０．５Ｈ）、５．５７（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４９（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７−４．９６（ｍ、２Ｈ）、４．９４−４．６９（ｍ、１Ｈ）、４．５８（ｂｓ、１Ｈ）、４．３３−３．９９（ｍ、４Ｈ）、３．７９〜３．６３（ｍ、１Ｈ）、３．３９−３．０１（ｍ、２Ｈ）、２．２１（ｓ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、１．８２−１．２４（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．３６、１７０．２０、１７０．１４、１６９．３９、１６１．０９、１５６．４２、１５２．６６、１４９．０５、１４７．３７、１４０．９８、１３９．３２、１３５．２９、１３３．３０、１３２．６４、１３２．３７、１３０．７０、１２９．７２、１２７．８７、１２５．８８、１２５．３９、１２５．０４、１２４．３９、１２４．０３、１２２．３０、１１９．７７、１１４．０９、１００．７６、７１．４３、７０．６２、６７．８４、６６．７３、６４．４４、６１．３１、４０．８４、２９．７２、２９．４０、２５．３８、２２．７２、２０．６９、２０．６０、１８．８９。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値９７２．２０７７、計算値９７２．２１０９。

（化合物１３の調製）
化合物１２（１０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む乾燥メタノール溶液に、氷浴中で、ナトリウムメトキシド（１．１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。次いで、この反応をＤｏｗｅｘ＠５０Ｘ８−１００樹脂を加えて停止し、続いて反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。白色樹脂の形態で生成物１３（８ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、定量的収率）を得た。さらに、逆相ＨＰＬＣ（定組成、０．１％のＴＦＡを含む、水：アセトニトリル、１：１ ｖ：ｖ）を用い、高純度の化合物１３を白色の粉末の形態で得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）＝８．０７（ｍ、１Ｈ）、７．７３−７．６９（ｍ、２Ｈ）、７．６７−７．６０（ｍ、２Ｈ）、７．５０−７．３１（ｍ、２Ｈ）、７．３１−７．２３（ｍ、１Ｈ）、７．１３−７．０５（ｍ、１Ｈ）、５．０２−４．９３（ｍ、１Ｈ）、４．９３−４．８２（ｍ、２Ｈ）、４．５１−４．４０（ｍ、１Ｈ）、４．１３−４．０３（ｍ、１Ｈ）、３．８３−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．７７−３．７１（ｍ、１Ｈ）、３．６８−３．５８（ｍ、３Ｈ）、３．５３−３．４４（ｍ、２Ｈ）、３．１２−３．０１（ｍ、１Ｈ）、２．９４−２．８３（ｍ、１Ｈ）、１．５９−１．２５（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）＝１６３．０６、１５８．５６、１５４．５８、１５２．４２、１５１．１１、１４９．１６、１４８．６２、１４１．７８、１３６．２２、１３４．２６、１３４．０７、１３２．９７、１３２．６８、１３２．０９、１３１．０１、１３０．４３、１２９．９７、１２６．４５、１２６．１２、１２５．４２、１２５．２２、１２３．４８、１１８．９１、１０３．１０、９６．３７、７７．３６、７４．８６、７１．９６、７０．１０、６５．７６、６２．３２、５３．１９、５２．６８、４１．１６、２７．００、２６．２７、１９．８６。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ 実測値：８０４．１６７１、計算値８０４．１６８７。

〔実施例２〕
化合物２１は、以下のダイアグラム２に記載されるように調製される。

ダイアグラム２：化合物２１の化学合成。

（化合物１５の調製）
アセトブロモ−Ｄ−セロビオース１４（２ｇ、２．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンズアルデヒド（４７８ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＡｇ_２Ｏ（７２９ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）を用い、化合物６の調製に用いた方法と同様の方法で、淡黄色の固体の形態で化合物１５（１．８６４ｇ、２．３７ｍｍｏｌ、収率：８３％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝９．９８（ｓ、１Ｈ）、８．３０（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４３（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．３５−５．０５（ｍ、５Ｈ）、４．９５（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４−４．５７（ｍ、２Ｈ）、４．３８（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６−３．９８（ｍ、３Ｈ）、３．９４−３．８７（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．６７（ｍ、１Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、２．００（ｓ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１８９．２３、１７０．８８、１７０．５４、１７０．４６、１７０．１１、１６９．７１、１６９．６８、１６９．４７、１５３．６８、１４１．４０、１３４．５８、１３１．６５、１２７．１０、１１８．６４、１０１．２２、９８．９８、７６．２４、７３．６０、７３．１９、７２．３９、７１．９３、７０．９７、６８．１１、６１．９１、２１．０２、２０．８８、２０．８６。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値８０８．１８７４、計算値８０８．１９１２。

（化合物１６の調製）
化合物１５（６５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮａＢＨ_４（３４ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ、１．１当量）を用い、化合物７の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物１６（５８０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、収率：８９％）を得て、これを精製せずに次の反応に用いた。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８２（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５４（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３２（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１−５．０６（ｍ、５Ｈ）、４．９７（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．７４（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４−４．５７（ｍ、２Ｈ）、４．４０（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５−４．０７（ｍ、２Ｈ）、４．０１−３．９５（ｍ、１Ｈ）、３．８４−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．６８（ｍ、１Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．８７（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．４８、１７０．２０、１７０．１２、１６９．７９、１６９．５４、１６９．３２、１６９．１１、１４８．１５、１４１．１０、１３７．４９、１３１．７８、１２３．００、１１９．２３、１００．７１、９９．６１、７６．０１、７３．０４、７２．８６、７２．２３、７１．９５、７１．６０、７０．８５、６７．８３、６３．０４、６１．６３、６１．５７、２０．６０、２０．５４、２０．４１。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値８１０．２０２２、計算値８１０．２０６９。

（化合物１７の調製）
化合物１６（４００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）、４−ニトロフェニルクロロホルメート（２２５ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、２．２当量）およびピリジン（１０２μＬ、１．２７ｍｍｏｌ、２．５当量）を用い、化合物８の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物１７（３８０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、収率：７９％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝８．３２（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）、７．３５（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）、５．３２−５．０７（ｍ、５Ｈ）、４．９７（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６７−４．５８（ｍ、２Ｈ）、４．６４−４．５７（ｍ、２Ｈ）、４．４０（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．０３−３．９７（ｍ、１Ｈ）、３．８７−３．８１（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．６８（ｍ、１Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．５１、１７０．０７、１７０．０５、１６９．６８、１６９．３３、１６９．２８、１６９．０３、１５５．２７、１５２．１８、１４９．４７、１４５．４２、１４０．９２、１３３．９４、１３０．０３、１２５．３５、１２５．２９、１２１．７１、１１９．０５、１００．７５、９９．２２、７５．９８、７３．０９、７２．８０、７２．０９、７１．９１、７１．５４、７０．７０、６８．８１、６７．７４、６１．５６、６１．５３、０．６０、２０．５５、２０．４２。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｍ／ｚ 実測値９７５．２１０３、計算値９７５．２１３１。

（化合物１８の調製）
化合物１７（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（３０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．３当量）およびＤＩＰＥＡ（４０μＬ、０．２３ｍｍｏｌ、２．１当量）を用い、化合物９の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の固体の形態で化合物１８（６８ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ、収率：６７％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．８２（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．９４−５．８０（ｍ、１Ｈ）、５．４４−５．０６（ｍ、９Ｈ）、４．９６（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４−４．５６（ｍ、２Ｈ）、４．４０（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ，Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５−４．０６（ｍ、２Ｈ）、４．０１−３．９５（ｍ、１Ｈ）、３．８４−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．７３−３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．４４−３．２４（ｍ、３Ｈ）、３．０５−２．９１（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｂｓ、１Ｈ）、２．２２（ｔ、Ｊ＝１１Ｈｚ、１Ｈ）、２．１３（ｓ、３Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、６Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．７７−１．２６（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．４９、１７０．１８、１７０．１２、１６９．７２、１６９．４７、１６９．２９、１６９．０２、１５６．２０、１４８．７３、１４１．１４、１３４．６６、１３３．１９、１３２．９３、１２４．５６、１１９．１８、１１７．６９、１００．８０、９９．３７、７５．９４、７３．０１、７２．８６、７２．１８、７２．０６、７１．５９、７０．８４、６７．７４、６４．６４、６１．５１、６１．４８、５８．２８、５６．３１、５１．９３、４２．４７、２８．９３、２４．９４、２３．６７、２０．６９、２０．６４、２０．５４、２０．５２。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［ＮＩ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値９６８．３５４５、計算値９６８．３５１２。

（化合物１９の調製）
化合物１８（６８ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ、１．０当量）、１，３−ジメチルバルビツール酸（８６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、８．０当量）およびパラジウム（０）テトラキス（トリフェニルホスフィン）（１．６ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ、２ｍｏｌ％）を用い、化合物１０の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の固体の形態で化合物１９（４９ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ、収率：７７％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．７９（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５１（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．４９−５．４２（ｍ、１Ｈ）、５．２９−５．０４（ｍ、７Ｈ）、４．９５（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．６３−４．５５（ｍ、２Ｈ）、４．３９（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１４−４．０４（ｍ、２Ｈ）、４．００−３．９３（ｍ、１Ｈ）、３．８４−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．７３−３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．３０−３．２１（ｍ、１Ｈ）、３．１２−３．０２（ｍ、２Ｈ）、２．７０〜２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．１３（ｓ、３Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ），２．０８（ｓ、６Ｈ）、２．０５（ｓ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．８５−１．１２（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．５０、１７０．２０、１７０．１２、１６９．７２、１６９．４８、１６９．３０、１６９．０２、１５６．１０、１４８．７４、１４１．１５、１３３．１８、１３２．８４、１２４．５６、１１９．２０、１００．８２、９９．３６、７５．９３、７３．０２、７２．８７、７２．１９、７２．０８、７１．６０、７０．８５、６７．７５、６４．６８、６１．５３、６１．４７、５６．００、４６．８３、４６．６３、３０．２２、２６．４２、２４．２２、２０．７０、２０．６６、２０．５５、２０．５３。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値９２８．３２３０、計算値９２８．３１９９。

（化合物２０の調製）
化合物１９（４９ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１１（２１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＤＩＰＥＡ（２８μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、３．０当量）を用い、化合物１２の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物２０（２９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、収率：４３％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１０．５２（ｂｓ、１Ｈ）、８．２１（ｂｓ、１Ｈ）、８．１０−７．９７（ｍ、１Ｈ）、７．７６−７．６４（ｍ、２．５Ｈ）、７．５６（ｍ、０．５Ｈ）、７．５０−７．４３（ｍ、２Ｈ）、７．１８−７．０９（ｍ、２Ｈ）、６．１７−６．０７（ｍ、０．５Ｈ）、５．７６（ｂｓ、０．５Ｈ）、５．３０−５．０４（ｍ、５Ｈ）、４．９５（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、４．９１−４．７２（ｍ、２Ｈ）、４．６３−４．４８（ｍ、３Ｈ）、４．４０（ｄｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１９−４．０４（ｍ、３Ｈ）、４．００−３．９３（ｍ、１Ｈ）、３．８３−３．５７（ｍ、３Ｈ）、３．３７−３．１８（ｍ、１．５Ｈ）、３．１１−２．９８（ｍ、０．５Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．１１（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０６（ｓ、６Ｈ）、２．０３（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．８１−１．４４（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．５２、１７０．２１、１７０．１８、１６９．７４、１６９．５０、１６９．３１、１６９．０４、１６１．１３、１５６．３３、１５４．２３、１５２．６３、１４９．１１、１４７．５７、１４７．３４、１４０．８９、１３５．２８、１３３．２２、１３２．８０、１３２．２４、１３０．５９、１２９．５４、１２７．８２、１２６．９１、１２５．８５、１２５．２４、１２４．８４、１２４．１７、１２２．２２、１１９．１１、１００．８５、９９．３０、７５．９７、７２．９８、７２．９０、７２．２４、７２．２０、７２．０８、７１．６１、７０．８５、６７．７６、６４．４７、６１．５３、６１．４８、５１．４６、４０．７９、２６．０３、２５．２７、２０．７０、２０．６７、２０．５４、１８．８４。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値１２６０．２９１４、計算値１２６０．２９５４。

（化合物２１の調製）
化合物２０（２３ｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびナトリウムメトキシド（１．０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、２．０当量）を用い、化合物１３の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物２１（１７ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率：９７％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝８．１９（ｂｓ、１Ｈ）、７．８５−７．８１（ｍ、２Ｈ）、７．７９−７．７２（ｍ、２Ｈ）、７．６２−７．４３（ｍ、２Ｈ）、７．４０−７．３３（ｍ、１Ｈ）、７．２７−７．１７（ｍ、２Ｈ）、５．１４−５．０４（ｍ、１．５Ｈ）、４．９９−４．９４（ｍ、１Ｈ）、４．６２−４．５２（ｍ、０．５Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、４．２６−４．１６（ｍ、１Ｈ）、３．９７−３．８２（ｍ、３Ｈ）、３．７４−３．５６（ｍ、５Ｈ）、３．４４−３．３５（ｍ、３．５Ｈ）、３．３０−２．９５（ｍ、３Ｈ）、３．１１−２．９８（ｍ、０．５Ｈ）、１．７２−１．１５（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１６１．６５、１５７．１０、１５３．３３、１５３．０５、１５０．９８、１４９．３５、１４８．９３、１４７．７５、１４７．２３、１４０．４７、１３４．８２、１３２．８４、１３２．６７、１３１．５７、１３０．７７、１２９．６２、１２９．０５、１２８．５５、１２５．０５、１２３．８６、１２２．０８、１１７．４６、１０３．１６、１００．７７、７８．５３、７６．７５、７６．５０、７５．５５、７４．９４、７３．５１、７３．００、７２．９９、６９．９８、６４．３４、６１．０５、６０．１９、５１．２９、３９．５２、２５．７３、２４．７９、１８．４６。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値９６６．２２０１、計算値９６６．２２１５。

〔実施例３］
化合物２１は、以下のダイアグラム３に記載されるように調製される。ダイアグラム３：化合物２７の化学合成。

（化合物２２の調製）
３（３３５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）を含む５ｍＬのジクロロメタン溶液に、炭酸カリウム（６３６ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ、３．１当量）を加え、メチルクロロホルメート（１１５μＬ、１．４８ｍｍｏｌ、１．０当量）を一滴ずつ滴下した。室温で１０分間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色の油の形態で化合物２２（２８２ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、収率：９０％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝５．９６−５．８２（ｍ、１Ｈ）、５．２４−５．１６（ｍ、３Ｈ）、３．６９（ｓ、３Ｈ）、３．４１−３．３０（ｍ、３Ｈ）、３．０１−２．９１（ｍ、２Ｈ）、２．４０（ｍ、１Ｈ）、２．２３−２．１７（ｍ、１Ｈ）、１．７５−１．７０（ｍ、１Ｈ）、１．６０−１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．５４−１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．３７−１．２４（ｍ、１Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌｓ）：δ（ｐｐｍ）＝１５７．３４、１３４．５０、１１７．７１、５８．６２、５６．２９、５１．９０、４２．３１、２８．８５、２４．９２、２３．５８。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［ＮＩ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値２１３．１６０１、計算値２１３．１６０３。

（化合物２３の調製）
テトラヒドロアルミン酸リチウム（２．６４ｍｍｏｌ、２．０当量）を含む５ｍＬのテトラヒドロフラン溶液に、２２（２８０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）を１滴ずつ加え、媒体を４０℃で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物２３を精製せずに使用した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝５．９７−５．８２（ｍ、１Ｈ）、５．２４−５．０８（ｍ、２Ｈ）、３．４３−３．３３（ｍ、１Ｈ）、２．９８−２．８４（ｍ、２Ｈ）、２．７１−２．５３（ｍ、３Ｈ）、２．４６−２．３０（ｍ、３Ｈ）、２．２３−２．１２（ｍ、２Ｈ）、１．８３−１．２３（ｍ、８Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１２７．４３、１２４．８４、６１．６５、５８．０５、５５．７１、５２．９９、５２．１９、５０．４９、４８．２６、４５．２８、３４．１４、２７．９６、２６．１９、２１．６８、２１．４３、２０．９６、２０．０２。

（化合物２４の調製）
化合物８（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物２３（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．８当量）およびＤＩＰＥＡ（３００ｑＬ、１．７２ｍｍｏｌ、７．６当量）を用い、化合物９の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の固体の形態で化合物２４（８４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、収率：５３％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．７５（ｓ、１Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３０（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．９０−５．７２（ｍ、１Ｈ）、５．５０（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４２（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．１４（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２−４．９９（ｍ、６Ｈ）、４．２５−４．１１（ｍ、２Ｈ）、４．１１−４．０１（ｍ、１Ｈ）、３．５８−３．４７（ｍ、１Ｈ）、３．３５−３．１９（ｍ、２Ｈ）、３．０９−２．９６（ｍ、１Ｈ）、２．８８（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ、３Ｈ）、２．８１−２．７１（ｍ、１Ｈ）、２．６８−２．５８（ｍ、１Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）、１．９７（ｓ、３Ｈ）、１．７０−１．３６（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．２９、１７０．１８、１７０．１１、１６９．３８、１５６．０４、１４８．９２、１４１．１６、１３５．０８、１３３．２７、１３３．２３、１２４．６０、１１９．６６、１１７．５１、１００．６９、７１．４１、７０．５３、６７．８１、６６．７４、６５．２５、６１．３６、５７．４６、５７．１０、５１．２６、４９．８８、３５．６８、３０．９２、２９．６７、２８．２０、２４．９０、２２．６０、２０．６４。

ＬＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値６９４．２、計算値６９４．２８２３。

（化合物２５の調製）
化合物２４（８４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．０当量）、１，３−ジメチルバルビツール酸（９５ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、５．０当量）およびパラジウム（０）テトラキス（トリフェニルホスフィン（１ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ、１ｍｏｌ％））を用い、化合物１０の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の固体の形態で化合物２５（４９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、収率：６２％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝７．７８（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、７．３０（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１Ｈ）、５．５１（ｄｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、５．４３（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２−５．２６（ｍ、１Ｈ）、５．１３−４．９８（ｍ、４Ｈ）、４．２４−４．１９（ｍ、１Ｈ）、４．１６−４．１０（ｍ、１Ｈ）、４．０８−４．０３（ｍ、１Ｈ）、３．２６−３．１９（ｍ、１Ｈ）、３．１８−３．１２（ｍ、１Ｈ）、３．０６−３．０１（ｍ、１Ｈ）、２．９３（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、３Ｈ）、２．８２−２．６８（ｍ、１Ｈ）、２．６１−２．５１（ｍ、１Ｈ）、２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、１．９８（ｓ、３Ｈ）、１．７９−１．７５（ｍ、１Ｈ）、１．６１−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．４２−１．２０（ｍ、３Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．３４、１７０．２２、１７０．１６、１６９．４２、１５６．２３、１４８．９３、１４１．２６、１３３．３０、１３３．２０、１２４．５９、１１９．７４、１００．７７、７１．４７、７０．５７、６７．８６、６６．７７、６５．２８、６１．３９、５５．５５、５５．１２、４６．８０、３６．００、３０．５６、２６．３０、２４．３５、２０．７２、２０．７０、２０．６２。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値６５４．２４８４、計算値６５４．２５０４。

（化合物２６の調製）
化合物２５（２５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１１（２１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（３３μＬ、０．１９ｍｍｏｌ、５．０当量）を用い、化合物１２の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物２６（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、収率：２７％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）＝１０．６５−１０．３２（ｍ、１Ｈ）、８．２７−８．１４（ｍ、１Ｈ）、８．０６−７．９０（ｍ、１Ｈ），７．８６−７．６７（ｍ、３Ｈ）、７．５７−７．４６（ｍ、１Ｈ）、７．４６−７．３４（ｍ、１Ｈ）、７．３４−７．２１（ｍ、１Ｈ）、７．１１−７．０３（ｍ、１Ｈ）、５．５６−５．４９（ｍ、１Ｈ）、５．４６（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、５．１３−４．９８（ｍ、２Ｈ）、４．９８−４．６７（ｍ、１Ｈ）、４．５５（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、４．３１−３．９７（ｍ、４Ｈ）、３．９３−３．７８（ｍ、１Ｈ）、３．２８−３．０３（ｍ、２Ｈ）、３．０１−２．８８（ｍ、３Ｈ）、２．１９（ｓ、３Ｈ）、２．１２（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．７８−１．２３（ｍ、６Ｈ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌｓ）：δ（ｐｐｍ）＝１７０．４１、１７０．３０、１７０．２５、１６９．５２、１６０．５３、１５６．４９、１５３．１０、１４９．１５、１４７．５２、１４１．３２、１３９．２９、１３５．２９、１３３．３１、１３２．９２、１３２．２８、１３０．７９、１２９．７９、１２７．８７、１２６．０９、１２５．４９、１２５．１３、１２４．４５、１２４．３８、１２２．５５、１１９．８３、１１４．２８、１００．８４、７１．５４、７０．６７、６７．９４、６６．８２、６５．９９、６１．４２、４０．７８、２９．８３、２９．４６、２６．６８、２５．４０、２０．７８、２０．７０、２０．５４、１９．０４。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値９８６．２２１９、計算値９８６．２２６０。

（化合物２７の調製）
化合物２６（１０ｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびナトリウムメトキシド（２．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、３．５当量）を用い、化合物１３の調製に用いた方法と同様の方法で、白色の粉末の形態で化合物２７（３．５７ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、収率：４３％）を得た。

ＲＭＮスペクトルは分解能が低すぎるため有用ではない。

ＨＲＭＳ：ＥＳＩ：［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 実測値８１８．１８３８、計算値８１８．１８３８。

〔実施例４〕
本発明に係るプローブ１３、２１および２７を、蛍光リーダー用に設計されたマルチウェルマイクロプレート内のin vitro媒体中で、標的酵素β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２３；「ｂ−ｇａｌ」；市販）とインキュベートすることによって評価した。プローブは、以下の基準を用いて評価した：
酵素活性の存在（「オン」）によって生じる高い蛍光強度の検出、
標的酵素を含まない試料における蛍光の完全な欠如（「オフ」）の検出（固有蛍光なし）、
水性媒体中のｐＨ７でのプローブの強さを実証する、経時的なプローブの加水分解の欠如の検出（偽陽性シグナルなし）、
最大シグナルに迅速に到達することを可能にする酵素活性の存在に対する応答速度の検出、
２スペーサープローブの改善速度の検出、
蛍光リーダーによる長時間の照射下で生成される固体発蛍光団の高い光安定性の検出。

これらの結果を、環化型スペーサー（２８）を含む先行技術（出願ＷＯ２０１４／０２０２８５の１に記載の化合物Ｉ）からのプローブで得られたものと比較した：

（蛍光の検出のためのプロトコル）
５０μＭ〜１ｍＭの濃度範囲の溶液を得るために、１０ｍＭプローブを含むＭｅＯＨ親溶液をＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈した。これらの各溶液１０μＬを、８０μＬのＰＢＳを含む９６ウェルブラックプレートに添加し、３７℃で加熱した後、精製した酵素を添加した。最終プローブの濃度は、５μＬ〜１００μＬの範囲であった。次いで、プレートを３７℃（または２５℃）でインキュベートし、蛍光リーダー（ＥｎＳｐｉｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；取得波長：λｅｘ＝３５５ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）によって経時的に蛍光を測定した。得られた曲線は、２反復の平均である。

（結果）
得られた結果を図２および３に示す。

プローブ２８と比較して、一対の除去／環化スペーサーを含む本発明に係るプローブ１３は標的酵素（偽陽性シグナル）の非存在下でのプローブの高い安定性を保存しながら、より大きな応答速度の利点を得ることを可能にする。したがって、同じ温度、ｐＨおよび濃度条件下で、プローブ１３は、スペーサーのペアに基づいて、単一のスペーサーのみを含むプローブ２８の酵素応答よりも５倍速い酵素応答を有する。さらに、酵素の非存在下では、プローブ１３は１５時間を超えて安定であり、測定可能な蛍光を生成しない。

本発明に係るプローブ２１および２７は標的酵素の非存在下（偽陽性シグナルの欠如）でのプローブの高い安定性を保存しながら、より迅速な応答時間から利益を得ることを可能にする。

プローブ２１を、５μＭ、１０μＭ、２５μＭおよび５０μＭの異なる濃度で試験した。測定される蛍光は、プローブの濃度に比例する。蛍光は、プローブの５μＭ含有量で検出することができる。

〔実施例５〕
Ｂ−グルコシダーゼを分泌しない（Ａ）、または分泌する（Ｂ）、酵母菌株培養物の上清を、この酵素活性に応答する本発明に係るプローブ２１に添加した。これを行うために、ハイグロマイシン耐性を提供するプラスミドを有し、分泌されるβ−グルコシダーゼに対する発現カセットを有するか、または有しない、酵母細胞を２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する５ｍＬのＹＰＤリッチ培地（１０ｇのＢａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｄｉｆｃｏ、１０ｇのＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｄｉｆｃｏ、２０ｇのグルコース、２０ｇのＢａｃｔｏ Ａｇａｒ、ｑｓｐ １Ｌ蒸留水）中で、８６時間、３０℃で培養した。次いで、培養物を、２０℃の斜板ＴＳ−５．１−５００中、Ａｌｌｅｇｒａ ２５Ｒ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ）で４０００回転／分で遠心分離し、２０μＬの上清を採取し、さらに、プローブ基質５０μＭを含む１８０μＬのＰＢＳ１Ｘ水溶液に添加した。続いて、混合物を均質化し、３７℃で３０分間インキュベートした。この混合物１０μＬを顕微鏡のスライドガラスとカバーガラスとの間に置き、３４０ｎｍ励起フィルターおよび５２５ｎｍ発光フィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察した。

ＺｅｉｓｓのＡＸ１０顕微鏡で浸潰して１００倍に拡大し、図４に示す写真を得た。

蛍光析出物（白い点）が明確に現れ、これにより、ハイスループットイメージング（自動分割化および定量化）での使用を予測することが可能になる。

〔実施例６〕
微生物培養培地中のセルラーゼ活性の検出速度を、β−グルコシダーゼを分泌する酵母細胞培養物の上清（「上清」）または分泌しない酵母細胞培養物の上清（「対照」）の酵素活性を、ＭＩＴＨＲＡＳ ＬＢ ９４０デバイス上で光学的に読み取ることによって評価した。

酵母培養は、２０μＬの上清が得られるまで、実施例５に記載のプロトコルに従って行う。次いで、この上清を、不透明なバックグラウンドマイクロプレートウェル中の、５０μＭの本発明に係るプローブ２１を含む１８０μＬのＰＢＳ１Ｘ溶液に添加する。プローブを３４０ｎｍに励起し、５３５ｎｍでの発光を収集した後、シグナルの読み取りをＭＩＴＨＲＡＳ ＬＢ ９４０デバイス上で経時的に実行する。

図５に示される結果は、本発明が４５分のインキュベート後の上清に分泌されるグリコシダーゼ活性を検出することが可能であることを示す。そして、シグナルは３時間４５分のインキュベート後で最大となり、そのシグナル対ノイズの比が約５５ｎｍであることを示す。

本発明に係るスペーサーのペアを必要とする式（Ｉ）化合物を用いた分解機構を示す図である。 ３７℃（濃度：１０μＭ）での、実施例１および３のプローブ１３および２７、ならびに従来技術のプローブ２８についての固体状態の蛍光の進化曲線である。 ３７℃（濃度：０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、および５０μＭ）での実施例２のプローブ２１についての固体状態の蛍光の進化曲線を表す。 微生物によって産生されるセルラーゼ活性を制御する光シグナルを表す。 微生物培養培地におけるセルラーゼ活性の検出速度を表すグラフである。

Claims (26)

1. 式（Ｉ）の化合物：
   

   

   
   式中：
   すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
   Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合の切断後に得られるＨＯＲ１が、ＥＳＩＰＴと呼ばれる、励起状態における分子内のプロトンの移動をもたらす発蛍光団のクラスに属するものであり、
   Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、以下のいずれかで定義され：
   Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、およびＲ４は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
   あるいはＲ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、並びに、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に、水可溶化基で置換され得る脂肪族複素環を形成し、
   あるいはＲ２は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、並びに、Ｒ３およびＲ４は互いに結合し、それらが結合する炭素原子とともに、脂肪族炭素環を形成し、
   Ｒ５およびＲ６は同一または異なり、互いに独立して、水素原子、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１０）アリールを表し、
   Ｒ７は水素原子、または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシの中から選択される基であり、
   Ｒ８は水素原子または置換もしくは非置換の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基、またはＤ１−Ｄ２−Ｄ３基であり：
   Ｄ１はトリアゾリルまたは−ＣＨ_２−トリアゾリル基を表し、
   Ｄ２は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニレンまたは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレン基であってＯまたはＮの中から選択される１個以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る基、２価のグリコシル基、−Ｏ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’）ｎ−または−Ｎ−（ＣＨＲ−ＣＨＲ’−Ｏ）ｎ−基であってｎは１〜２０で変動する整数であり、ＲおよびＲ’は同一または異なり、ＲおよびＲ’が同時にＣＨ_３はない条件でＨまたはＣＨ_３である基、アミノ酸またはペプチドで、あるいはこれらの基の組み合わせであり、
   Ｄ３は、エステル結合もしくはアミド結合を形成するカルボン酸官能基を含むことによってＤ２に結合した、マレイミドカプロイルモチーフ、アミノ酸、ペプチド、葉酸、抗体または抗体フラグメントを表し、
   Ｒ９およびＲ’９は、同一または異なり、水素原子、またはハロゲン原子、もしくは−ＮＯ_２、−ＣＮから選択される基、もしくは抗体を表すＡｂを含む−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−Ａｂから選択される基などの電子求引基を表し、
   Ｖは酸素原子または硫黄原子を表し、
   Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
   ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
   または、ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ’１０を表し、
   または、ＸはＣＲ１０を表し、Ｙは窒素原子を表し、そして、ＺはＯＲ０を表し、
   または、Ｘは窒素原子を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そして、ＺはＲ１０を表し：
   Ｒ０は、アノマー炭素原子によって式（Ｉ）の分子の残部に結合したグリコシル基を表し、そして
   Ｒ１０およびＲ’１０は、同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール、もしくは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシなどの電子供与基を表す。
2. Ｒ３が水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、好ましくは水素原子であり、並びに、Ｒ２およびＲ４が互いに結合し、ｍ＝３、４または５である−（ＣＨ_２）ｍの鎖を形成することを特徴とする、請求項１に記載の化合物（Ｉ）。
3. Ｒ３が水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、好ましくは水素原子であり、並びに、Ｒ２およびＲ４が互いに結合し、Ｒ２からＲ４に向かう方向に−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＲ１１−ＣＨ_２−鎖を形成し、Ｒ１１が水素原子または−（Ｌ）ｎ−ＧＰを表し、ｎが０または１に等しく、Ｌは連結アームであり、およびＧＰがヒドロ可溶化基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物（Ｉ）。
4. Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、例えばメチルまたはエチルを表すことを特徴とする、請求項１に記載の化合物（Ｉ）。
5. Ｒ１が置換または非置換の１つ以上の芳香環を含む芳香族基であり、当該環が、窒素原子、酸素原子または硫黄原子から選択される１つ以上のヘテロ原子および／またはＣ＝Ｏカルボニルの形態の１つ以上の炭素原子を含み得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
6. Ｒ１が、式（Ａ１）による−ＯＲ１を有する芳香族基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
   

   

   
   式中：
   Ｘ２は酸素原子であり、Ｘ１は−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＳＨ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、−Ｏ−フェニル、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは−ＮＨ−フェニル、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルまたは−Ｓ−（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール基であり、前記アルキルおよびフェニル基は置換または非置換であり得るか、
   または、Ｘ２は窒素原子を表し、置換または非置換の（Ｃ５〜Ｃ２４）ヘテロアリールを形成するＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合するかのいずれかであり、
   

   

   
   は、例えば、フェニル、ナフチル基、および：
   

   

   
   の中から選択される置換または非置換の（Ｃ５〜Ｃ２４）アリールまたは（Ｃ５〜Ｃ２４）ヘテロアリールを表し、
   前記基は置換されていても置換されていなくてもよく、
   Ｘ３は、Ｓ、ＯまたはＮＲｄを表し、Ｒｄは、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、
   そして好ましくは−ＯＲ１がフェノキシ型であり、以下の好ましい構造（Ａ２）または（Ａ３）の１つと対応し：
   

   

   
   式中：
   Ｔは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル−または−Ｎ（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール）−であり、
   Ｒｅは水素原子または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲｈなどの電子求引性炭素置換基であり、Ｒｈは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲｅは−ＣＯＮＲｉＲｊであり、ＲｉとＲｊは同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲｅは−ＣＦ_３、または２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イル基であり、
   Ｒｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲｋＲｌ、−ＮＨＲｋまたは−ＯＲｋであり、ＲｋおよびＲｌは同一または異なり、それぞれ独立して（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基であり、
   または、ＲｅおよびＲｆが互いに結合して、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る、飽和または不飽和、置換または非置換の４つまたは５つの員を含む炭化水素鎖を形成し、
   Ｒｇは、水素、Ｂｒ、Ｃｌ、ＩまたはＦ原子であり、
   

   

   
   式中、
   Ｔ’は−ＮＨ_２、−ＯＨ、（Ｃ５〜Ｃ２４）アリール基、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、−ＳＨ、−ＮＨＲ’ｇ、−ＯＲ’ｇ、−ＮＲ’ｇＲ’ｈまたは−ＳＲ’ｇであり、Ｒ’ｇおよびＲ’ｈは同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはアリール基であり、
   Ｒ’ｅは水素原子または−ＣＮもしくは−ＣＯＯＲ’ｉのような電子求引性炭素置換基であり、Ｒ’ｉは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲ’ｅは−ＣＯＮＲ’ｊＲ’ｋであり、Ｒ’ｊおよびＲ’ｋは同一または異なり、水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、あるいはＲ’ｅは−ＣＦ_３または２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−イミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ピリミジノン−２−イルもしくはキナゾリノン−２−イル基であり、
   Ｒ’ｆは水素、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ化物原子、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＲ’ｌＲ’ｍまたは−ＯＲ’ｌであり、Ｒ’ｌおよびＲ’ｍは同一または異なり、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し、
   またはＲ’ｅおよびＲ’ｆは互いに結合して、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって割り込まれ得る、飽和または不飽和、置換または非置換の４または５員を含む炭化水素鎖を形成する。
7. Ｒ１が、以下の式（Ａ４）または（Ａ５）の１つによる−ＯＲ１を有する芳香族基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
   

   
8. Ｒ０が、グリコシダーゼの触媒作用によって化合物（Ｉ）の残部から切断可能であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
9. Ｒ０がＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ；Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ；α−アミラーゼ；α−アラビノフラノシダーゼ、α−アラビノシダーゼ；β−セロビオシダーゼ；β−キトビオシダーゼ；α−ガラクトシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；α−グルコシダーゼ；β−グルコシダーゼ；β−グルクロニダーゼ；α−マルトシダーゼ；α−マンノシダーゼ；β−マンノシダーゼ；β−キシロシダーゼ；β−Ｄ−フコシダーゼ；α−Ｌ−フコシダーゼ、β−Ｌ−フコシダーゼ；Ｌ−イズロニダーゼまたはセルラーゼの中から選択されるグリコシダーゼの作用下で切断可能である基であり；そして、Ｒ０は、同一または異なり、ガラクトシル、グルコシル、マンノシル、グロシル、アロシル、アルトロシル、イドシル、タロシル、フコシル、フルクトシル、アラビノシル、リキソシル、リボシル、キシロシル、グルクロニルおよびＮ−アセチル−ヘキソサミニルの中から選択されるアノマー炭素原子によって結合するモノグリコシル化基、またはこれらのモノグリコシル化基のいくつか、例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜６個から構成されるポリグリコシル化基であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
10. Ｒ５およびＲ６が同一であり、水素原子を表すことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
11. Ｒ７が水素原子または（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、好ましくは水素原子を表すことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
12. Ｒ８が水素原子を表すことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
13. Ｖが酸素原子を表すことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
14. Ｘ、ＹおよびＺが以下であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そしてＺはＯＲ０を表し、
    またはＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ０を表し、そしてＺはＲ’１０を表し、Ｒ１０、Ｒ’１０およびＲ０は請求項１、８および９のいずれか１項に定義されるとおりである。
15. 基Ｒ９またはＲ’９の少なくとも１つがハロゲン原子、−ＮＯ_２基、または−ＣＮ基、好ましくは−ＮＯ_２基を表し、そして、好ましくはＲ９が水素原子を表し、Ｒ’９がハロゲン原子、−ＮＯ_２基または−ＣＮ基、好ましくは−ＮＯ_２基を表すことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
16. Ｒ１０、および該当する場合にはＲ’１０が同一であり、水素原子を表すことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
17. 式（Ｉａ）の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    

    

    
    式中、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ０およびＶは請求項１〜１３に定義されるとおりである。
18. 式（Ｉｂ）の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    

    

    
    式中、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ’９、Ｘ、ＹおよびＺは請求項１、５〜９および１４〜１６に定義されるとおりである。
19. 式（Ｉｃ）の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    

    

    
    式中、すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、Ｒ０およびＲ１は請求項１〜５および９に定義されるとおりである。
20. ヒトにおけるグリコシダーゼのin vivoでの検出のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
21. グリコシダーゼのin vitroまたはex vivoでの検出のための方法であって、以下の工程を含む方法：
    前記グリコシダーゼを含有すると考えられる試料を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）と接触させる工程、
    ＯとＲ０との間の共有結合を切断し、続いて、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１結合を切断し、ＨＯＲ１の放出をもたらすことによって蛍光析出物の形成を可能にするために適切な条件を適用する工程、および、
    蛍光析出物の定量的または定性的な分析を行う工程。
22. 前記蛍光析出物の分析が、以下の工程を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法：
    蛍光析出物の吸収波長の光を発生させることができる光源に蛍光析出物を曝露する工程と、
    得られた析出物の蛍光を検出する工程。
23. 式（ＩＩ）の化合物：
    

    

    
    式中：
    すべての割合の光学異性体の混合物の形態、または光学異性体の濃縮された形態で、
    Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９およびＶは請求項１〜４および８〜１６のいずれか１項に定義されるとおりであり、
    Ｒ１２は水素原子またはアミン官能基保護基を表し、
    Ｘ、ＹおよびＺは以下のいずれかであり：
    ＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＲ’１０を表し、そしてＺはＯＲ’０を表し、
    またはＸはＣＲ１０を表し、ＹはＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ’１０を表し、
    またはＸはＣＲ１０を表し、Ｙ’は窒素原子を表し、そしてＺ’はＯＲ’０を表し、
    またはＸは窒素原子を表し、Ｙ’はＣＯＲ’０を表し、そしてＺはＲ１０を表し、
    Ｒ’０はすべてのアルコール官能基が保護基によって保護されているＲ０基を表し、Ｒ０、Ｒ１０およびＲ’１０は請求項１および１４〜１６のいずれか１項に定義されるとおりである。
24. Ｒ１２が水素原子を表すことを特徴とする、請求項２３に記載の化合物（ＩＩ）。
25. Ｒ１２がアミン保護基、好ましくはアリル基、またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオロフェニレメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルまたは２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルなどのカルバメートを表すことを特徴とする、請求項２３に記載の化合物（ＩＩ）。
26. 以下の工程を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の調製プロセス：
    請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の化合物（ＩＩ）を入手できる工程、
    下記式の化合物（ＩＩＩ）を入手できる工程であって、
    

    

    
    前記Ｒ１は請求項５、７のいずれか１項の定義のとおりであり、Ｍは脱離基であって具体的にはハロゲン原子、特に塩素原子である基、イミダゾリル基またはパラニトロフェノキシを表し、好ましくはＭがパラニトロフェノキシルを表す工程、
    前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応により化合物（ＩＶ）を得る工程であって、前記化合物（ＩＶ）は以下の構造を有し：
    

    

    
    式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ’９、Ｖ、Ｘ、Ｙ’およびＺ’は請求項１〜１６および２３のいずれか１項に定義されるとおりである工程、
    前記化合物（Ｉ）を得るために前記化合物（ＩＶ）のＲ’０基に存在するアルコール官能基を脱保護する工程。
    
    

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