CN110545845B - 抗cd33抗体药剂 - Google Patents

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Abstract

提供了抗CD33抗体药剂，包括呈IgG‑scFv形式的抗CD33抗体药剂。还提供了多种方法和与之相关的试剂，包括例如用于检测、预防和/或治疗性处置CD33相关疾病，尤其是白血病诸如AML。

Description

抗CD33抗体药剂
简介
基于抗体的疗法，尤其是在癌症的治疗中，具有很大的发展前景。已开发出许多抗体形式，包括单克隆抗体、鼠科动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、全长抗体、Fab抗体、聚乙二醇化抗体、放射性标记的抗体、药物偶联的抗体、多特异性抗体等。截至2012年，有至少34种治疗性抗体药剂在美国或欧洲获得了销售许可(参见Reichert,mAb 4:3,413,2012年5月/6月，该文献以引用的方式并入本文)。然而，特别有效的抗体药剂的开发仍然是挑战。
发明内容
本公开特别提供了结合人类CD33蛋白的表位的特定的多特异性抗体药剂(例如双特异性抗体药剂)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂)包含人源化抗CD33抗体(诸如人源化M195(在本文中称为huM195))的结合部分。本公开涵盖以下认识：包含结合CD33的结合部分的特定的多特异性抗体药剂具有如本文所述的改善的功能特征。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂包含基于huM195的第一结合部分(即，抗CD33结合部分)和第二结合部分。在一些实施方案中，第二结合部分结合免疫细胞上的药剂。在一些实施方案中，第二结合部分结合T细胞上的药剂(例如，CD3)。在一些实施方案中，第二结合部分与有机化合物或无机化合物相互作用。本公开涵盖以下认识：可以结合CD33和第二药剂的此类多特异性抗体药剂可用于治疗和诊断与CD33相关的疾病，例如表达CD33的癌症。
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含两个相同的免疫球蛋白重链和两个相同的融合多肽。在一些实施方案中，每个融合多肽包含：免疫球蛋白轻链结构域和诸如单链可变片段(scFv)的结合结构域(参见例如图1A)。在一些实施方案中，每个融合多肽包含：融合至轻链的scFv，即scFv-CL1或VHH-CL1，或附接至轻链的任何结合结构域(或它们的部分)。在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含重链，每个重链包含已鉴定为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，融合多肽的轻链部分包含已鉴定为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含重链和融合多肽，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列，其中所述融合多肽的所述轻链部分包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，提供了包含重链的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)，每个重链包含已鉴定为SEQ ID NO:9的序列。在一些实施方案中，融合多肽的轻链部分包含已鉴定为SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，所提供的双特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)包含重链和融合多肽，其中所述重链可变区包含与SEQ IDNO:9至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列，其中所述融合多肽的所述轻链部分包含与SEQ ID NO:10至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含含有scFv的融合多肽，所述scFv结合第二靶标，所述第二靶标融合至免疫球蛋白轻链(或它们的抗原结合部分)(例如，抗CD33轻链)的C-末端。在一些实施方案中，融合多肽还包含接头。
在一些特定实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)或它们的序列可以包含抗CD33可变结构域和至少一个其他结合结构域(例如，用于针对肿瘤细胞毒性而重新靶向T细胞的抗OKT3)或苄基-DOTA-金属结合结构域(例如，C825(用于多步预靶向)或克隆35、CD137(用于与作为激动剂的抗41BB-scFv或与CD137L产生ADCC)、4-1BBL(用于与作为激动剂的4-1BBL产生ADC)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂是包含结合T细胞抗原的scFv的双特异性抗体药剂。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3。在一些实施方案中，双特异性抗体药剂包括人源化OKT3 scFv。在一些实施方案中，融合多肽包含含有已鉴定为SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27中的任一者的序列的scFv。
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含重链，每个重链包含已鉴定为SEQ ID NO:24的序列。在一些实施方案中，所述多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)还包含融合多肽，每个融合多肽包含已鉴定为SEQ ID NO:26的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb药剂)包含特异性结合苄基-DOTA-金属的scFv。在一些实施方案中，特异性结合苄基-DOTA-金属的scFv是C825 scFv。在一些实施方案中，融合多肽包含含有已鉴定为SEQ ID NO:18的序列的scFv。在一些实施方案中，融合多肽包含融合至苄基-DOTA-金属结合性scFv的抗CD33免疫球蛋白轻链序列。在一些实施方案中，抗CD33抗苄基-DOTA融合多肽还包含接头。在一些实施方案中，抗CD33抗苄基-DOTA融合多肽包含已鉴定为SEQ ID NO:19的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含变体Fc区，其中所述变体Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，Fc修饰可以包括但不限于改变效应子功能的修饰。在一些实施方案中，Fc变体包括一个或多个经工程化的糖形，即共价附接至包含Fc区的分子的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学上不同于包含Fc区的母体分子。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含如根据Kabat所编号在CH2结构域中具有N297A突变的Fc区。在一些实施方案中，包含N297A突变的重链缺乏糖基化。在一些实施方案中，包含N297A突变的重链缺乏FcR或C1q结合。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含具有一个或多个选自K322A和D265A的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变和K322A突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变和D265A突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变、D265A突变和K322A突变的Fc区。在一些实施方案中，重链包含已鉴定为SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22中的任一者的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的特征在于与抗原(例如，CD33)二价结合。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb药剂)是四价的，例如与两个不同的抗原二价结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)以在0.1pM至1μM范围内的EC50结合AML细胞系(例如，HL60)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)具有大于典型肾排泄阈值的分子量(例如，大于约70kDa的分子量)。
还提供了编码如本文所述的多特异性抗体药剂中包含的任何或全部多肽序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地与一个或多个调控性元件和/或载体序列(例如，整合和/或复制信号)结合。在一些实施方案中，提供了一种编码人源化抗CD33抗体重链的核酸分子，所述核酸已鉴定为SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，提供了一种编码融合多肽的核酸分子，所述核酸已鉴定为SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，还提供了包含编码本公开的双特异性抗体的核苷酸序列的重组载体。在一些实施方案中，所提供的核苷酸序列和/或载体是分离的。
还提供了包含如本文所述的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞；在一些实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞。在某些实施方案中，宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。特定的示例性原核宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)细胞；特定的示例性真核细胞包括例如COS细胞、CHO细胞(例如，DG44细胞、CHO-S、CHO-K1等)和HEK 293细胞(例如，Expi293F、HEK293T等)。
还提供了用于产生如本文所述的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的技术。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂的产生可以涉及例如在培养基中在允许多特异性结合剂(例如，CD33-BsAb药剂)表达的条件下培养宿主细胞的步骤。可替代地或另外地，在一些实施方案中，所提供的技术涉及从产生多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的宿主细胞的培养基分离多特异性抗体药剂。
本公开还提供了包含多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可用于和/或用于制造药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和药学上可接受的载剂。还提供了制造药物组合物的方法；在一些实施方案中，此类方法可以包括将多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)与药学上可接受的载剂组合和/或调配此类组合以便施用于受试者的步骤。在一些实施方案中，药物组合物被调配为用于肠胃外递送。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗癌症(例如，AML)。
在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：将组合物施用于有需要的受试者，所述施用包括和/或递送多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)是治疗剂。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)是诊断剂。
在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：将组合物施用于有需要的受试者，所述施用包括多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或将多特异性抗体药剂递送至已施用或将施用IL2的受试者，以使得所述受试者接受双特异性抗体药剂和IL2二者。在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：将组合物施用于有需要的受试者，所述施用包括IL2和/或将IL2递送至已施用或将施用多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的受试者，以使得所述受试者接受IL2和多特异性抗体药剂二者。
本文提供了用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)武装和/或活化的T细胞。在一些实施方案中，提供了所述T细胞的群体。在一些实施方案中，提供了包含用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)武装和/或活化的T细胞或T细胞群的组合物。在一些实施方案中，T细胞或T细胞群是用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)武装的。在一些实施方案中，T细胞或T细胞群是用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)活化的。
在一些实施方案中，提供了包含结合结构域的嵌合抗原受体构建体(CAR)，所述结合结构域包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。在一些实施方案中，CAR是第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。在一些实施方案中，CAR还包含跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合结构域(包含本公开的CD33双特异性抗体药剂)、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。本文还提供了表达本公开的CAR的T细胞，即CAR-T细胞。在一些实施方案中，提供了表达CAR的CAR-T细胞群，所述CAR包含结合结构域，所述结合结构域包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。
在一些实施方案中，提供了表达本公开的CAR的自然杀伤(NK)细胞，即CAR-NK细胞。在一些实施方案中，提供了表达CAR的CAR-NK细胞群，所述CAR包含结合结构域，所述结合结构域包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。
在一些实施方案中，提供了可用于治疗或改善受试者的与CD33表达相关的疾病的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了可用于诊断与CD33表达相关的疾病的组合物和方法。在一些实施方案中，与CD33表达相关的疾病是恶性疾病(例如，癌症)。在某些实施方案中，与CD33表达相关的疾病是白血病。白血病可以包括但不限于以下各项中的至少一者：急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括B细胞ALL和T细胞ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病。在某些实施方案中，所提供的组合物和方法可用于治疗和/或诊断急性淋巴细胞白血病(ALL)。在某些实施方案中，所提供的组合物和方法可用于治疗和/或诊断白血病的髓外(EM)表现。
还特别提供了用于治疗、预防和/或诊断受试者的医学病症的技术，其中所述医学病症的特征在于CD33表达。在一些实施方案中，用于治疗、预防或诊断特征在于CD33表达的医学病症的技术包括施用治疗有效量的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。在一些实施方案中，用于治疗、预防或诊断特征在于CD33表达的医学病症的技术包括施用递送治疗有效量的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的组合物。
还特别提供了用于治疗、预防或诊断有需要的受试者的癌症的技术，包括施用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。在一些实施方案中，癌症选自：急性骨髓性白血病、双表型白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓单核细胞白血病、慢性骨髓性白血病的髓性急变和急性淋巴细胞白血病。在一些实施方案中，用于治疗、预防或诊断癌症的技术还包括施用T细胞的制备物。在一些实施方案中，制备物的T细胞是活化的。在一些实施方案中，制备物的T细胞是用本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)武装的。
还特别提供了用于表征多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的技术。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的特征在于结合AML细胞(例如，HL60)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的特征在于体内保留(例如，体内血清半衰期为至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物通过ELISA、免疫组织化学、Biacore结合测定、质谱、等电聚焦(IEF)色谱、蛋白质印迹等来表征。
附图说明
本文包括的图由以下附图组成，仅用于说明目的而不是限制。
图1A描绘了IgG-scFv双特异性抗体药剂形式的示意图。图1B展示了示例性CD33-CD3双特异性抗体药剂的纯化，描绘了针对CD33-CD3 IgG-scFv样品的SE-HPLC色谱图，其中x轴代表保留时间，单位为分钟，y轴代表280nm下的吸光度，单位为mAU。
图2描绘了针对靶标细胞的示例性CD33-CD3 IgG-scFv的FACS免疫染色的图形结果。x轴表示抗体的对数浓度(μg抗体/百万个细胞)，y轴表示MFI。观察到针对来自多种CD33(+)细胞系的细胞的结合：U937、MV-4-11、MOLM13、M-07e，但是未观察到针对不表达CD33的细胞系CD33(-)(诸如MOLT4和CMLT1细胞)的结合。
图3描绘了在各种细胞系中使用示例性CD33-CD3 IgG-scFv进行的T细胞细胞毒性测定的图形结果。在标准4小时51CR释放测定中测试AML细胞系。x轴表示抗体的对数浓度(μg抗体/ml)，y轴表示％细胞毒性。在多种CD33(+)细胞系中观察到大量杀死：THP1、M-07e、U937、SET2和HL60，但是CD33(-)MOLT4不受影响。
图4描绘了在MOLM13 AML细胞系中使用示例性CD33-CD3 IgG-scFv进行的T细胞细胞毒性的图形表示。MOLM13细胞含有FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)内部串联重复(ITD)突变(FLT3/ITD)。x轴表示抗体的对数浓度(μg抗体/ml)，y轴表示％细胞毒性。观察到大量杀死，CD33特异性BsAb裂解性MOLM13细胞的EC50为2.4pM。
图5描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv在针对AML的异种移植小鼠模型中的体内疗效的图形表示。所有小鼠均接受100万个含有萤火虫荧光素酶基因的MOLM13细胞。x轴表示MOLM13注射后的时间(以天计)，y轴表示作为MOLM13细胞负荷的指标的荧光素酶基因表达的“总面积通量”。向下的三角形表示CD33特异性BsAb注射的时间排程，向上的三角形表示ATC注射的时间排程。
图6描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv在针对晚期AML的异种移植小鼠模型中的体内功效的图形表示。在用含有萤火虫荧光素酶基因的MOLM13细胞进行接种后，通过每周静脉内注射1000万个人类ATC持续3周，然后每两周给予CD33-CD3 IgG-scFv持续四周来处理小鼠。x轴表示MOLM13注射后的时间(以天计)，y轴表示作为MOLM13细胞负荷的指标的荧光素酶基因表达的“总面积通量”。向下的三角形表示CD33-CD3IgG-scFv注射的时间排程，向上的三角形表示ATC注射的时间排程。
图7描绘了3种不同剂量的示例性CD33-CD3 IgG-scFv在针对AML的异种移植小鼠模型中的体内功效的图形表示。所有小鼠均接受100万个含有萤火虫荧光素酶基因的MOLM13细胞。用100μg、30μg和10μg的CD33-CD3 IgG-scFv来处理小鼠。x轴表示MOLM13注射后的时间(以天计)，y轴表示作为MOLM13细胞负荷的指标的荧光素酶基因表达的“总面积通量”。向下的三角形表示CD33-CD3 IgG-scFv注射的时间排程，向上的三角形表示ATC注射的时间排程。
图8A和图8B描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv在针对人类AML的异种移植小鼠模型中确定的T细胞介导的根除中的体内效力。向雌性NSG小鼠静脉内移植100万个MOLM13AML细胞。通过生物发光成像来监测肿瘤生长，所述生物发光成像以总通量(单位为p/s)表示。在白血病移植后7天开始，每周注射活化的T细胞(ATC，500-1000万个/剂)一次持续三周。对示例性CD33-CD3IgG-scFv的剂量进行向下滴定(100μg至0.1μg)，所述滴定在每次T细胞施用前一天和后一天实施。为了支持体内T细胞存活，每周皮下注射1000IU IL2 2-3次。合并来自两个独立实验的数据。图8A描绘了通过生物发光成像来监测的肿瘤生长。图8B提供了生物发光成像分析的结果(以总通量(单位为p/s)表示)的图形表示。
图9描绘了与针对人类AML细胞的二价异源二聚体IgG平台(异源二聚体)相比的四价示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)的体外效力。通过4小时铬释放测定来评估在存在四价CD33-CD3 IgG-scFv与针对CD33(+)的二价异源二聚体的情况下人类AML细胞系中的TDCC。
图10描绘了与二价异源二聚体IgG平台(异源二聚体)相比的四价示例性CD33-CD3IgG-scFv(BsAb)的体内功效。向雌性NSG小鼠静脉内移植100万个MOLM13 AML细胞。通过生物发光成像来监测肿瘤生长，所述生物发光成像以总通量(单位为p/s)表示。在白血病移植后七天开始，每周注射活化的T细胞(ATC，500万-1000万个/剂)一次持续三周。在每种T细胞施用前一天和后一天注射示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)或异源二聚体BsAb(各为0.1μg)。为了支持体内T细胞存活，每周皮下施用1000IU IL2两次。
图11描绘了IL2和CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)重定向T细胞的联合治疗的体内功效。向雌性NSG小鼠静脉内移植100万个MOLM13 AML细胞。通过生物发光成像来监测肿瘤生长，所述生物发光成像以总通量(单位为p/s)表示。在白血病移植后7天开始，每周注射活化的T细胞(ATC，500-1000万个/剂)一次持续三周。在每次T细胞施用前一天和后一天施用CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)(10μg)。每周向一组ATC/BsAb接受者施用IL2(皮下施用1000IU)2-3次，而“无IL2”组不接受任何IL2。
图12A、图12B和图12C描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)在淋巴瘤模型中的CD33(+)AML中的功效。图12A-向雌性NSG小鼠皮下移植300万个MOLM13 AML细胞。从白血病注射后七天开始，每周注射外周血单个核细胞(PBMC)(1000-3000万个/剂)一次持续四周。在每次PBMC施用前一天和后一天注射示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)(前3周为50μg/剂，其余为150μg/剂)。不给予小鼠IL2。图12B和图12C-向雌性NSG小鼠皮下移植200万个THP1或100万个HL60 AML细胞。从白血病注射后七天开始，每周注射外周血单个核细胞(PBMC)(1000万个/剂)一次持续四周。在每次PBMC施用前一天和后一天注射示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)(100μg/剂)。不向小鼠施用IL2。
图13描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)与CD33和CD3结合的性质。(A)使用递减剂量的hM195(抗CD33 IgG)、异源二聚体BsAb和示例性CD33-CD3 IgG-scFv，使MOLM13细胞在4C°下反应30min。洗涤细胞并用荧光染料缀合的二抗对细胞进行免疫染色，通过流式细胞术来测定平均荧光强度(MFI)。(B)使MOLM13细胞在37C°或4C°下与1μg/ml hM195(抗CD33 IgG)、异源二聚体IgG BsAb和示例性CD33-CD3 IgG-scFv反应30min、4h或24h。洗涤细胞并在4C°下用荧光染料缀合的二抗对细胞进行免疫染色。在洗涤未结合的抗体后，通过流式细胞术来分析MFI。(C)使用递减剂量的hOKT3(抗CD3 IgG)、异源二聚体BsAb和示例性CD33-CD3 IgG-scFv，使活化的T细胞在4C°下反应30min。洗涤细胞并用荧光染料缀合的二抗对细胞进行免疫染色，通过流式细胞术来测量所分析的MFI。
图14描绘了示例性CD33-CD3 IgG-scFv与CD34(+)CD38(-)造血干细胞的交叉反应性。(A)使用Ficoll-Paque密度梯度离心来纯化脐带血单个核细胞，并用抗人类CD3抗体、CD19抗体、CD38抗体、CD34抗体和示例性CD33-CD3 IgG-scFv来对细胞进行免疫染色。为了从分析中排除T细胞和B细胞，对细胞进行针对CD3(-)和CD19(-)群体的设门。评估不同群体(标记为1至6)的细胞与示例性CD33-CD3 IgG-scFv的结合。(B)使用Miltenyi CD34微珠从脐带血单个核细胞中分离造血干细胞和祖细胞。(C)使用铬释放测定来测试在存在针对纯化的CD34+细胞和MOLM13 AML细胞的示例性CD33-CD3IgG-scFv的情况下ATC(效:靶比＝10)产生的TDCC。
某些定义
在以下描述中，广泛采用了重组DNA和免疫学中所用的许多术语。为了提供对说明书和权利要求的更清楚和一致的理解，提供了以下定义，包括这些术语所给出的范围。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物施用于受试者或系统，以实现作为组合物或包含在所述组合物中的药剂的递送。本领域的普通技术人员将会了解可以在适当情况下用于向受试者(例如人类)施用的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是眼部施用、口服施用、肠胃外施用、局部施用等。在一些实施方案中，施用可以是支气管施用(例如，通过支气管滴注)、面颊施用、真皮施用(它可以是或包括例如向真皮局部施用、真皮内施用、皮内施用、透皮施用等中的一者或多者)、肠内施用、动脉内施用、真皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心室内施用、特定器官内施用(例如肝内施用)、粘膜施用、鼻腔施用、口服施用、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(例如，通过气管内滴注)、阴道施用、玻璃体施用等。在一些实施方案中，施用可以仅涉及单次剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及施加固定数量的剂量。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇性给药(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，分开一段共同时间的单次剂量)给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少所选择的时间段。
亲和力：如本领域中已知，“亲和力”是特定配体(例如，表位)与其配偶体(例如，抗体)结合的紧密度的量度。亲和力可以以不同的方式测量。在一些实施方案中，通过定量测定来测量亲和力。在一些此类实施方案中，结合伴侣浓度可以固定为超过配体浓度，以便模拟生理条件。替代地或另外，在一些实施方案中，可以改变结合伴侣浓度和/或配体浓度。在一些此类实施方案中，可以在可比的条件(例如，浓度)下将亲和力与参考进行比较。
氨基酸：如本文所用，本文所用的术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指可以例如通过一个或多个肽键的形成而被并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然产生的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是以合成方式制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，氨基酸(包括多肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸)与上述通用结构相比可以含有结构修饰。例如，在一些实施方案中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或置换(例如，氨基基团、羧酸基团、一个或多个质子和/或羟基基团的置换)来修饰。在一些实施方案中，相比于含有其他方面相同的未经过修饰的氨基酸的多肽，这种修饰例如可更改含有经过修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，相比于含有其他方面相同的未经过修饰的氨基酸的多肽，这种修饰不显著更改含有经过修饰的氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”可以用于指游离的氨基酸；在一些实施方案中，它可以用于指多肽内的氨基酸残基。
动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指具有任一性别且处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在某些实施方案中，动物易受DV感染。在一些实施方案中，动物可为转基因动物、遗传改造的动物和/或克隆。
抗体：如本文所用的术语“抗体”是指一种多肽，它包括足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件。如本领域中已知，如在自然界中产生的完整抗体是约150kD四聚体试剂，由两条相同的重链多肽(各约50kD)和两条相同的轻链多肽(各约25kD)组成，这些多肽相互结合成通常被称为“Y形”结构的物质。每条重链由至少四个结构域(各长约110个氨基酸)组成：氨基端可变(VH)结构域(位于Y结构的顶端)，接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基端CH3(位于Y的茎的底部)。被称为“转换区(switch)”的一个短区域连接重链可变区与恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接到抗体的其余部分上。这个铰链区中的两个二硫键使完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每条轻链由两个结构域组成：氨基端可变(VL)结构域，接着是羧基端恒定(CL)结构域，这两个结构域通过另一个“转换区”相互隔开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中重链和轻链通过单个二硫键互相连接；另外两个二硫键使重链铰链区互相连接，使得二聚体互相连接并形成四聚体。天然产生的抗体也被糖基化，通常是在CH2结构域上。天然抗体中的每个结构域都具有这样一种结构，其特征在于由两个β片层(例如3、4或5股折叠)按压缩反向平行β桶形式相互填充形成的“免疫球蛋白折叠”。每个可变结构域含有三个被称为“互补决定区”的高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个在某种程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构框架的β片层，而来自重链和轻链的CDR环区则在三维空间中聚在一起，使得它们产生位于Y结构的顶端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合补体系统的元件，并且还结合效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体。如本领域所已知，Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本公开所产生和/或利用的抗体包括糖基化的Fc结构域，包括具有经修饰的或经工程化的这种糖基化的Fc结构域。出于本公开的目的，在某些实施方案中，包含足够的如天然抗体中存在的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物都可以被称为和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生的(例如通过生物体对抗原的反应来产生)，还是通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体；在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体具有表示小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征的恒定区序列。术语“抗体”还包括双特异性抗体和嵌合抗体，以及其他可用的形式。在一些实施方案中，如本文所述的抗体为或包括全长免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分(如抗体片段)。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv等等。在一些实施方案中，抗体是IgG-scFv形式。无论抗体片段的结构如何，它都与一种或多种完整抗体识别的一种或多种相同的抗原结合。例如，M195单克隆抗体片段与M195识别的表位结合。术语“抗体片段”还包括包含抗体的抗原结合结构并且像抗体那样通过与特定抗原结合来形成复合物而发挥作用的任何合成的或基因工程的蛋白质。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离的片段(诸如由重链或轻链的可变区组成的“Fv”片段)、重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区通过肽接头连接)(“scFv蛋白”)和由作为或模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。例如，在一些实施方案中，抗体片段包含母体抗体的重链或轻链中存在的一个或多个，在一些实施方案中全部互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，抗体可缺乏天然产生的情况下将具有的共价修饰(例如聚糖的连接)。在一些实施方案中，抗体可以含有共价修饰(例如聚糖、有效负载[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其他侧基[例如，聚乙二醇等]的连接)。
抗体药剂：如本文所用，术语“抗体药剂”是指特异性结合特定抗原的药剂。在一些实施方案中，该术语涵盖包含足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体药剂包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体药剂可以包含具有小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征的一个或多个恒定区序列。在一些实施方案中，抗体药剂可以包含人源化、灵长类动物源化、嵌合等的一个或多个序列元件，如本领域已知。在多个实施方案中，术语“抗体药剂”用于指一种或多种本领域已知的或开发的构建体或形式，所述构建体或形式用于在替代性呈递中采用抗体结构和功能特征。例如，实施方案，即根据本公开采用的抗体药剂具有选自但不限于以下各项的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，等)；抗体片段，诸如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段以及它们的分离的CDR或组；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或它们的片段)；骆驼抗体；掩蔽的抗体(例如，)；小模块化免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)(“SMIPTM”)；单链或串联双体/>VHH；/>微体；/>锚蛋白重复蛋白或DART；TCR样抗体；/>亲微蛋白；/>和/>在一些实施方案中，抗体可缺乏天然产生的情况下将具有的共价修饰(例如聚糖的连接)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如聚糖、有效负载[例如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其他侧基[例如聚乙二醇等]的连接)。在许多实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包含本领域的技术人员认识的一个或多个结构元件作为互补性决定区(CDR)；在一些实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包含与在参考抗体中存在的CDR基本上相同的至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR在序列上相同或含有在1至5个之间的氨基酸置换。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为所包含的CDR显示出与参考CDR至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为所包含的CDR显示出与参考CDR至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR内的至少一个氨基酸是被缺失、添加或置换，但是所包含的CDR具有在其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR内的1至5个氨基酸被缺失、添加或置换，但是所包含的CDR具有在其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR内的至少一个氨基酸被置换，但是所包含的CDR具有在其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR内的1至5个氨基酸被缺失、添加或置换，但是所包含的CDR具有在其他方面与参考CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包括被本领域的技术人员认识为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方案中，抗体药剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白。
癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中用于指表现出相对异常、不受控制和/或自发生长的细胞，因此它们表现出特征在于对细胞增殖的控制显著丧失的异常生长表型。在一些实施方案中，肿瘤可以为或包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本公开特别鉴定了某些癌症，其中对于这些癌症的教导可以是特别相关的。在一些实施方案中，相关的癌症的特征可以是实体瘤。在一些实施方案中，相关的癌症的特征可以是血液肿瘤。通常，本领域已知的不同类型的癌症的实例包括例如造血系统癌症，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病；肉瘤、黑素瘤、腺瘤、实体组织癌、口腔、咽喉、喉和肺的鳞状细胞癌、肝癌、泌尿生殖系统癌(诸如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌、子宫内膜癌和肾细胞癌)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠癌和神经系统癌症、良性病变(诸如乳头状瘤)等等。在一些实施方案中，相关的血液癌症包括急性骨髓性白血病、双表型白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓单核细胞白血病、慢性骨髓性白血病的髓性急变和急性淋巴细胞白血病。
螯合剂：螯合剂(诸如DTPA、DOTA、苄基-DOTA、TETA或NOTA)可以用于多种情况中的任一种，包括在缀合物中。当螯合剂与本公开的bsAb一起使用时，当螯合剂与非放射性金属(诸如Mn、Fe和Gd)络合时，相同的螯合剂可以用于MRI。大环螯合剂(诸如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N',N”-三乙酸)、DOTA、苄基-DOTA和TETA(对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸))与多种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与Ga、Y和Cu的放射性核素一起使用。
化学治疗剂：本文所用的术语“化学治疗剂”具有其本领域理解的含义，是指一种或多种促细胞凋亡性、细胞抑制性和/或细胞毒性药剂，例如特别包括用于和/或推荐用于治疗一种或多种与不期望的细胞增殖相关的疾病、障碍或病症的药剂。在多个实施方案中，化学治疗剂用于治疗癌症。在一些实施方案中，化学治疗剂可以为或包括一种或多种烷基剂、一种或多种蒽环类药物、一种或多种细胞骨架破坏剂(例如微管靶向剂，诸如紫杉烷、美登素及其类似物)、一种或多种埃博霉素、一种或多种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂HDAC、一种或多种拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)、一种或多种激酶抑制剂、一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物、一种或多种肽抗生素、一种或多种基于铂的药剂、一种或多种类维生素A、一种或多种长春花生物碱、和/或以下一者或多者的一种或多种类似物(即，共有相关的抗增殖活性)。在一些特定实施方案中，化学治疗剂可以为或包括以下一者或多者：放线菌素(Actinomycin)、全反式视黄酸、奥瑞斯他汀(Auiristatin)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、姜黄素(Curcumin)、阿糖胞苷(Cytarabine)、道诺霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、脱氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、伊立替康(Irinotecan)、美登素(Maytansine)和/或它们的类似物(例如，DM1)、双氯乙基甲胺(Mechlorethamine)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、美登木素(Maytansinoid)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)、托泊替康(Topotecan)、戊柔比星(Valrubicin)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)以及它们的组合。在一些实施方案中，化学治疗剂可以用于抗体-药物缀合物的语境中。在一些实施方案中，化学治疗剂是选自以下的抗体-药物缀合物中存在的化学治疗剂：hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、本妥昔单抗维汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)、英妥珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、格巴妥莫单抗维多汀(glembatumomabvedotin)、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗PSMA ADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗马佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)和罗佛珠单抗米他汀(lorvotuzumab mertansine)。在一些实施方案中，化学治疗剂可以是被描述为Govindan等人,TheScientificWorldJOURNAL 10:2070–2089,2010中的一者或多者中描述或讨论的抗体-药物缀合物中所用的化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂可以为或包括以下中的一者或多者：法呢基-硫代水杨酸(FTS)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-羟基丁酰胺(CMH)、雌二醇(E2)、四甲氧基芪(TMS)、δ-三烯生育酚、沙利霉素(salinomycin)或姜黄素。
嵌合抗体：如本文所用，是指氨基酸序列包含第一种类中存在的VH和VL区序列和不同于第一种类的第二种类中存在的恒定区序列的抗体。在许多实施方案中，嵌合抗体具有与人类恒定区连接的鼠VH和VL区。在一些实施方案中，具有连接至非人类恒定区(例如，小鼠恒定区)的人类VH和VL区的抗体称为“反向嵌合抗体”。
可比的：如本文所用，术语“可比的”是指这样的两个或更多个试剂、实体、情况、条件组等：它们可以彼此不相同，但是它们的相似性足以允许在它们之间进行比较，从而本领域的技术人员将会理解：可以根据所观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比的条件、情况、个体或群体组的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少数变化的特征。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定的情况下对于两个或更多个此类药剂、实体、情况、条件集合等需要什么程度的一致性来被认为是可比的。例如，本领域的普通技术人员将会理解，当情况、个体或群体组的特征在于基本上相同的特征的数量和类型足以保证得出合理结论：即在不同的情况、个体或群体组之下或使用不同的情况、个体或群体组所获得的结果或所观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起的或表示那些变化的特征的变化时，这些情况、个体或群体组是彼此可比的。
缀合物：在一些实施方案中，所提供的抗体药剂以缀合物的形式使用。在一些特定实施方案中，可检测的标记(诸如荧光分子)或细胞毒性药剂(诸如重金属或放射性核素)可以缀合至螯合剂(诸如DTPA、DOTA、苄基-DOTA、TETA或NOTA)或合适的肽。例如，可以通过使光活性剂或染料与抗体融合多肽缀合来获得治疗上有用的免疫缀合物。荧光组合物(诸如荧光染料和其他生色团)或染料(诸如对可见光敏感的卟啉)已用于通过将合适的光引向病变来检测和治疗所述病变。在疗法中，这被称为光辐射、光疗法或光动力疗法(Jori等人(编),PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto1985)；van den Bergh,Chem.Britain 22:430(1986))。此外，对于实现光疗法，单克隆抗体已与光活化染料偶联。Mew等人,J.Immunol.130:1473(1983)；作者同上,Cancer Res.45:4380(1985)；Oseroff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8744(1986)；作者同上,Photochem.Photobiol.46:83(1987)；Hasan等人,Prog.Clin.Biol.Res.288:471(1989)；Tatsuta等人,Lasers Surg.Med.9:422(1989)；Pelegrin等人,Cancer 67:2529(1991)。然而，这些早期研究不包括使用内窥镜疗法应用，尤其是使用抗体片段或亚片段。因此，本公开设想了包含光活性剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。
对应于：如本文所用，术语“对应于”可以用于指一种化合物或组合物通过与适当的参考化合物或组合物进行比较而产生的结构元件的位置/同一性。例如，在一些实施方案中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可以被鉴定为对应于适当参考聚合物中的残基。例如，普通技术人员将会理解，为简洁起见，通常使用基于参考的相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基，以使得“对应于”位置190处的残基的氨基酸例如在特定氨基酸链中实际上不一定为第190位氨基酸，而是对应于参考多肽中第190位处存在的残基；本领域的普通技术人员很容易理解如何鉴定“对应的”氨基酸。例如，本领域的技术人员将会了解各种序列比对策略，包括可以用于例如鉴定根据本公开的多肽和/或核酸中的“对应的”残基的软件程序，例如BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。
可检测实体：如本文所用的术语“可检测实体”是指任何可检测的元件、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些实施方案中，单独提供或使用可检测实体。在一些实施方案中，可检测实体与另一种药剂联合(例如，连接)提供和/或使用。可检测实体的实例包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如3H、14C、18F、19F、32P、35S、135I、125I、123I、64Cu、187Re、111In、90Y、99mTc、177Lu、89Zr等)、荧光染料(关于具体的示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等等)、生物发光剂、可光谱解析的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米粒子(例如金、银、铜、铂等)纳米簇、顺磁性金属离子、酶(关于酶的具体实例，参见下文)、比色标记(例如染料、胶体金等等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质。
诊断剂：诊断剂为或包括在施用时可检测的实体。在一些实施方案中，施用与如本文所述的抗体部分(即，抗体或抗体片段，或亚片段)缀合的诊断剂，所述诊断剂用于通过定位含有抗原的细胞来诊断或检测疾病。
剂型：本领域的技术人员将会理解，术语“剂型”可以用于指用于向受试者施用的在物理上离散的活性剂(例如，治疗剂或诊断剂)单位。通常，每个这种单位含有预定数量的活性剂。在一些实施方案中，这个量是适合根据一种给药方案给予的单位剂量的量(或其整个部分)，当对相关群体进行给药时，这种给药方案已被确定为与所期望的或有利的结果相关(即，采用治疗性给药方案)。本领域的普通技术人员理解，施用于特定受试者的治疗性组合物或药剂的总量由一名或多名主治医生来确定，并且可以涉及多个剂型的施用。
给药方案：本领域的技术人员将理解，术语“给药方案”可以用于指单独施用于受试者的一组单位剂量(通常多于一剂)，这些单位剂量通常分开一段时间。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，所述给药方案可以涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，每个剂量在时间上与其他剂量分开。在一些实施方案中，单个剂量彼此分开一段相同长度的时间；在一些实施方案中给药方案包括多个剂量，单个剂量分开至少两个不同的时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量含量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量含量的第一剂量，然后是与第一剂量含量不同的第二剂量含量的一个或多个另外的剂量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量含量的第一剂量，然后是与第一剂量含量相同的第二剂量含量的一个或多个另外的剂量。在一些实施方案中，当在相关群体中施用给药方案时，所述给药方案与期望的或有利的结局相关联(即，是治疗性给药方案)。
效应子功能：如本文所用，是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应物功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及补体介导的细胞毒性(CMC)。在一些实施方案中，效应物功能是在抗原结合之后起作用的功能，独立于抗原结合而起作用的功能，或两者。
效应细胞：如本文所用，是指表达一种或多种Fc受体并且介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞中的一种或多种，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔子和猴子。
表位：如本文所用，包括由免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采取相关的三维构象时，这种化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采取这种构象时，这种化学原子或基团在空间中物理上彼此接近。在一些实施方案中，当抗原采取替代构象(例如是直链的)时，至少一些这种化学原子或基团彼此物理分离。
Fc配体：如本文所用，是指结合抗体的Fc区以形成Fc配体复合物的来自任何生物体的分子，优选地多肽。Fc配体包括但不限于FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16B)、FcγRI(CD64)、FcεRII(CD23)、FcRn、Clq、C3、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体可以包括结合Fc的未被发现的分子。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，则这些聚合物分子(诸如抗体)被视为彼此“同源的”。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相似，则这些聚合物分子被视为彼此“同源的”。
宿主细胞：如本文所用，是指其中已经引入外源性DNA(重组或以其他方式)的细胞。技术人员在阅读本公开内容后将会理解，这种术语不仅指特定的受试者细胞，而且也指这种细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在下一代中发生，所以这样的子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适于表达外源DNA(例如，重组核酸序列)的任何生命王国的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物(例如杂交瘤或四重杂交瘤)。在一些实施方案中，细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核的并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO Kl、DXB-1 1CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、绿猴肾细胞、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如，BHK21)、白血病细胞、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞尔托利氏细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞，以及源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因。
人类：如本文所用，旨在包括处于所有发育阶段的人类。在一些实施方案中，人类是胚胎、胎儿、婴儿、儿童、青少年、成年人或老年人。
人类抗体：如本文所用，旨在包括具有从人类免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，即使抗体(或抗体组分)的氨基酸序列例如在一个或多个CDR中，尤其是在CDR3中包含不由人类种系免疫球蛋白序列编码的残基或元件(例如，包括例如可以(最初)已经通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的序列变化)，所述抗体(或抗体组分)也可以被视为“人类的”。
人源化：“人源化”抗体是其中来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移至人类重链和轻链可变结构域的重组蛋白质。抗体分子的恒定结构域来源于人类抗体的恒定结构域。
同一性：如本文所用的术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，那么认为它们彼此“基本上相同”。两个核酸或多肽序列之间的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如为了最佳比对可在第一和第二序列中的一个或两个中引入空位(gap)，并且为了比较，可以忽略非相同序列)。在某些实施方案中，出于比较目的所比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较相对应的位置处的核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相对应的位置被相同残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，那么分子在那个位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列所共用的相同位置的数量的函数，并且考虑为了两个序列的最佳比对所需引入的空位的数量和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法实现。举例来说，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法确定，所述算法已被并入到ALIGN程序(2.0版)中。在一些示范性实施方案中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。或者，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
免疫缀合物：“免疫缀合物”是抗体组分与有效负载(例如，治疗剂或诊断剂)的缀合物(即，共价连接物)。
免疫调节剂：“免疫调节剂”是当存在时，通常在免疫应答级联中刺激免疫细胞(诸如巨噬细胞，B细胞和/或T细胞)增殖或活化的药剂。如本文所述的免疫调节剂的实例是细胞因子。技术人员将理解，某些白介素和干扰素是刺激T细胞或其他免疫细胞增殖的细胞因子的实例。
体外：如本文所用的术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，是指在多细胞生物体(诸如人类和非人类动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，该术语可以用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统不同)。
分离的：如本文所用，是指(1)在最初产生时(无论在自然中和/或在实验环境中)已经与至少一些所缔合的组分分离的物质和/或实体，和/或(2)已经由人工设计、产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们最初结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的其他组分分开。在一些实施方案中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域的技术人员将理解的，在与某些其他组分(例如一种或多种载剂或赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等))组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，计算不包括此类载剂或赋形剂的物质的分离百分比或纯度。仅举一个示例来说，在一些实施方案中，当a)由于其衍生起源或来源未与在自然中其天然状态下伴随其的一些或全部组分缔合；b)其基本上不含来自与在自然中产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸；c)由来自不是在自然中产生其的物种的细胞或其他表达系统的组分表达或以其他方式与所述组分缔合时，则自然中存在的生物聚合物如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在与天然产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。替代地或另外地，在一些实施方案中，已经经历一种或多种纯化技术的多肽可被认为是“分离的”多肽，分离的程度达到多肽已经与a)其在自然界中与之缔合的其他组分分离；和/或b)其在最初生产时与之缔合的其他组分分离。
接头：如本文所用，用于指将不同元件相互连接的多元件药剂的部分。例如，本领域的普通技术人员认识到，结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常包含在这些结构域之间使这些结构域彼此连接的一段氨基酸。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有通式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可以相同或不同，并且代表通过接头相互缔合的两个结构域。在一些实施方案中，多肽接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供柔性。当工程化本领域已知的多肽(例如，融合多肽)时，可以适当地使用各种不同的接头元件(参见例如Holliger,P.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人,(1994)Structure 2:1 121-1123)。
多特异性：“多特异性”抗体是可以同时结合具有不同结构的至少两个靶标(例如，两个不同抗原、相同抗原上的两个不同表位、或者半抗原和抗原或表位)的抗体。一种特异性可以针对例如B细胞、T细胞、骨髓细胞、血浆细胞或肥大细胞抗原或表位。另一种特异性可以针对相同细胞类型上的不同抗原，例如B细胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74或CD22。多特异性、多价抗体是具有多于一个结合位点的构建体，并且所述结合位点具有不同的特异性。例如，双特异性抗体，其中一个结合位点与抗原的一个表位反应，另一个结合位点与相同或不同抗原的另一个表位反应。
突变体：如本文所用，术语“突变体”是指这样的实体：它显示出与参考实体的显著的结构同一性，但是与参考实体在结构上的不同之处在于与参考实体相比一个或多个化学部分的存在或水平。在多个实施方案中，突变体在功能上也与其参考实体不同。通常，特定的实体是否被适当的视为参考实体的“突变体”是基于它与参考实体的结构同一性程度。如本领域的技术人员应了解，任何生物或化学参考实体都具有某些特征性结构元件。根据定义，突变体是共有一个或多个此类特征性结构元件的独特化学实体。仅举几个例子，小分子可以具有特征性核心结构元件(例如，大环核心)和/或一个或多个特征性侧链部分，以使得小分子的突变体是共有核心结构元件和特征性侧链部分，但是在其他侧链部分方面和/或在核心内存在的键的类型(单键与双键、E与Z等)方面有所不同的突变体，多肽可以具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，所述多个氨基酸在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或有助于特定的生物学功能，核酸可以具有由多个核苷酸残基组成的特征性序列元件，所述多个核苷酸残基在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置。例如，突变体多肽可以因氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价连接至多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施方案中，突变体多肽显示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方案中，突变体多肽不与参考多肽共有至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，突变体多肽共有参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，突变体多肽缺乏参考多肽的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，突变体多肽显示出与参考多肽相比降低水平的一种或多种生物学活性。
患者：如本文使用的，术语“患者”指所提供的组合物施用于其施用或可施用于其的任何生物，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人类。在一些实施方案中，患者患有或易患一种或多种病症或状况。在一些实施方案中，患者展示出病症或状况的一种或多种症状。在一些实施方案中，患者已被诊断有一种或多种病症或状况。在一些实施方案中，障碍或病症为或包括癌症，或一种或多种肿瘤的存在。在一些实施方案中，患者正在接受或已经接受某些疗法，以诊断和/或治疗疾病、病症或状况。
药学上可接受的：如本文使用的，应用于用于配制如本文公开的组合物的载体、稀释剂或赋形剂的术语“药学可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其他成分相容，并且对其接受者无害。
药学可接受的载体：如本文使用的，术语“药学可接受的载体”意指药学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从身体的一个器官或一部分携带或转运到身体的另一个器官或一部分。每种载体必须在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实施包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及药物制剂中采用的其他无毒相容物质。
多肽：如本文所用，是指氨基酸的任何聚合物链。在一些实施方案中，多肽具有在自然中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有在自然中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有经过工程化的氨基酸序列，因为所述氨基酸序列是通过人手的动作来设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方案中，多肽可以包含或仅由天然氨基酸组成，或者包含或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以在多肽的N末端、在多肽的C末端，或其任何组合处包括一个或多个侧基或其他修饰，例如修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自由乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等组成的组(包括它们的组合)。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是直链的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含订书肽。在一些实施方案中，可以将术语“多肽”附加至参考多肽的名称、活性或结构；在这种情况下，其在本文中用于指代共享相关活性或结构的多肽，因此可被认为是同一类别或多肽家族的成员。对于每种这样的类别，本说明书提供和/或本领域的技术人员将会了解氨基酸序列和/或功能已知的类别内的示例性多肽；在一些实施方案中，此类示例性多肽是针对所述多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，一多肽类别或家族的成员显示出与该类别的参考多肽显著的序列同源性或同一性，与该类别的参考多肽共享共有序列基序(例如，特征序列元件)，和/或与该类别的参考多肽共享共同活性(在一些实施方案中以可比较的水平或在指定的范围内)；在一些实施方式中，是与该类别内的所有多肽如此)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示出与参考多肽至少约30％-40％的总体序列同源性或同一性程度，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多和/或包括显示出非常高的序列同一性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的至少一个区(例如，可以在一些实施方案中为或包括特征性序列元件的保守区)。这类保守区域通常涵盖至少3-4个并且经常多达20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区域涵盖至少一个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个连续氨基酸的链段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含或由亲本多肽的片段组成。在一些实施方案中，适用的多肽可以包含多个片段或由多个片段组成，这多个片段中的每一个相对于彼此按不同于相关多肽中所存在的空间排列的空间排列存在于同一个亲本多肽中(例如，在亲本中直接连接的片段在相关多肽中可以在空间上分离或反之亦然，和/或片段在相关多肽中可按不同于亲本中的顺序存在)，使得相关多肽是其亲本多肽的衍生物。
预防(Prevent)或预防(prevention)：当在本文中与疾病、障碍和/或病症的发生一起使用时，是指降低发展疾病、障碍和/或病症的风险和/或延迟疾病、障碍或病症一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或状况的发作已延迟预定的时间段时，预防可视为完全的。
重组的：如本文所用，意指通过重组方式设计、工程化、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体来表达的多肽，从重组的、组合的人类多肽文库分离的多肽(例如，Hoogenboom,TIB Tech 15:62,1997；AzzazyClin.Biochem.35:425,2002；Gavilondo BioTechniques 29:128,2002；HoogenboomImmunology Today 21:371,2000)，从针对人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor Nuc.Acids Res.20:6287,1992；Little Immunology Today12:364,2000；Kellermann Curr.Opin.Biotechnol 13:593,2002；Murphy Proc.Natl AcadSci USA 111:5153,2104)或通过涉及将所选的序列元件彼此剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，在自然中存在一个或多个这样的所选序列元件。在一些实施方案中，此类所选择的序列元件中的一个或多个以计算机模拟来设计。在一些实施方案中，一个或多个此类所选择的序列元件产生自(例如来自天然或合成来源的)已知序列元件的诱变(例如体内或体外)。例如，在一些实施方案中，重组抗体多肽由在所关注的来源生物体(例如人类、小鼠等)的种系中存在的序列组成。在一些实施方案中，重组抗体具有由诱变(例如在体外或体内，例如在转基因动物中)产生的氨基酸序列，使得重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自并与种系VH和VL序列相关，但可能在体内种系抗体库中不天然存在的序列。
回收：如本文所用，是指例如通过例如使用本领域中已知的纯化技术进行分离，使得药剂或实体基本上不含其他先前缔合的组分的过程。在一些实施方案中，从天然来源和/或包含细胞的来源回收药剂或实体。
参考：如本文所用，描述了这样的标准品或对照：其中比较相对于所述标准品或对照来进行。例如，在一些实施方案中，所关注的药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照的测试和/或测定与所关注的测试或测定基本上同时进行。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地在有形介质中体现。通常，如本领域的技术人员所理解，参考或对照在与评估下的那些条件或环境相当的条件或环境下测定或表征。本领域的技术人员将理解提供充分的相似性以证实对特定可能的参考或对照的依赖性和/或与所述参考或对照进行比较的情况。
特异性结合：如本文所用，术语“特异性结合”是指在其中将发生结合的环境中在可能的结合配偶体之间进行区分的能力。与一个特定靶标相互作用的抗体药剂在存在其他潜在靶标时被称为“特异性结合”与所述特定靶标相互作用的靶标。在一些实施方案中，通过检测或测定抗体药剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定抗体药剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定抗体药剂竞争其配偶体与另一个实体之间的替代性相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一定浓度范围内进行此类检测或测定来评估特异性结合。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出所关注的特征或性质的总体或接近总体范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将会理解，生物和化学现象很少(如果有的话)会达到完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”通常是指在施用于生物体时引起所期望的药理学作用的任何药剂。在一些实施方案中，如果药剂在适当群体中展现出统计学上显著的作用，那么所述药剂就被视为治疗剂。在一些实施方案中，适当群体可以是模型生物体群体。在一些实施方案中，适当群体可利用各种准则界定，如特定年龄组、性别、遗传背景、先前存在的临床病况等。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一个或多个症状或特征、延迟它们的发病、降低它们的严重性和/或降低它们的发病率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在对于向人类施用的销售之前已经或需要由政府机构批准的药剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是对于向人类施用需要医学处方的药剂。
治疗有效量：如本文所用，是指施用以产生所需效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗投配方案施用于患有或易患疾病、障碍和/或病症的群体时，足以治疗该疾病、障碍和/或病症的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的发生率和/或严重程度，和/或延迟其发作的量。本领域的普通技术人员将会理解，术语“治疗有效量”事实上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是在施用于需要这种治疗的患者时在相当多数目的受试者中提供特定的所需药理学应答的量。例如，在一些实施方案中，术语“治疗有效量”是指在创造性疗法的语境中当施用于有需要的个体时，将阻断、稳定、减弱或逆转所述个体中出现的癌症支持性过程，或将增强或增加所述个体中的癌症抑制性过程的量。在癌症治疗的语境中，“治疗有效量”是当施用于被诊断患有癌症的个体时，将预防、稳定、抑制或减少个体中的癌症的进一步发展的量。本文所述的组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转了(在治疗性医治中)恶性肿瘤的发展或者有助于实现或延长恶性肿瘤的缓解。施用于个体以治疗个体中的癌症的治疗有效量可以与施用以促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。与大多数癌症疗法一样，本文所述的治疗性方法不应解释为、限于或以其他方式限于对癌症的“医治”；相反，治疗方法涉及“治疗”癌症(即，在患有癌症的个体的健康方面产生所期望的或有利的变化)的所述组合物的使用。这些有益效果在肿瘤学领域是熟练的医疗提供者认可的，并且包括但不限于患者病症的稳定、肿瘤大小的减小(肿瘤消退)、生命功能的改善(例如，癌性组织或器官的功能改善)、进一步转移的减少或抑制、机会性感染的减少、生存能力的提高、疼痛的减少、运动功能的改善、认知功能的改善、能量感觉的改善(活力、不适的减少)、健康感觉的改善、恢复正常食欲、恢复健康的体重增加以及它们的组合。此外，还可以通过以下步骤来评估个体中特定肿瘤的消退(例如，本文所述的治疗的结果)：从肿瘤(诸如胰腺腺癌)部位采集癌细胞样品(例如，在治疗的过程中)，并且测试癌细胞的代谢和信号传导标记物的水平，以监测癌细胞的状态，从而在分子水平上验证癌细胞消退至较少的恶性表型。例如，采用本公开的方法所诱导的肿瘤消退将通过以下各项来表示：发现上文讨论的促血管生成标记物中的任一者的减少、本文所述的抗血管生成标记物的增加、在被诊断为患有癌症的个体中表现出异常活性的代谢途径、胞间信号传导通路或胞内信号传导通路的归一化(即，向不患有癌症的正常个体中存在的状态的改变)。本领域的技术人员应了解，在一些实施方案中，治疗有效量可以按单一剂量配制和/或给予。在一些实施方案中，治疗有效量可以按多个剂量，例如作为给药方案的一部分配制和/或给予。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、再生、抑制特定的疾病、障碍和/或病症(例如，癌症)的一个或多个症状、特征和/或致因、延迟它们的发作、降低它们的严重性和/或降低它们的发病率的任何疗法施用。在一些实施方案中，这种治疗可以是不表现出相关疾病、障碍和/或病症的体征的受试者的治疗，和/或仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期体征的受试者的治疗。可替代地或另外地，此类治疗可为显示出相关疾病、病症和/或状况的一种或多种确定体征的受试者具有的。在一些实施方案中，治疗可为已被诊断为患有相关疾病、病症和/或状况的受试者具有的。在一些实施方案中，治疗可为已知具有一种或多种易感因子的受试者具有的，所述易感因子与相关疾病、病症和/或状况的发展风险增加在统计学上相关。
单位剂量：如本文所用，表述“单位剂量”是指作为单剂量和/或以物理上离散的单位施用的药物组合物的量。在多个实施方案中，单位剂量含有预定数量的活性剂。在一些实施方案中，单位剂量含有整个单剂量的药剂。在一些实施方案中，施用多于一个单位剂量以实现总体单剂量。在一些实施方案中，需要或预期需要施用多个单位剂量，以实现预期的效果。单位剂量可以是例如含有预定数量的一种或多种治疗剂的一定体积的液体(例如，可接受的载剂)、预定量的一种或多种固体形式的治疗剂、含有预定量的一种或多种治疗剂的持续释放制剂或药物递送装置等。应当理解，除一种或多种治疗剂之外，单位剂量还可以以包含任何多种组分的制剂提供。例如，如下文所述，可包括可接受的载体(例如药学可接受的载体)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等。本领域技术人员将理解，在多个实施方案中，特定治疗剂的总体适当每日剂量可以包含一部分或多个单位剂量，并且可以例如由主治医生在合理的医学判断范围内决定。在一些实施方案中，对于任何特定受试者或生物体的具体有效剂量水平可以取决于多种因素，包括所治疗的障碍和所述障碍的严重性；所采用的特定活性化合物的活性；所采用的特定组合物；受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间和所采用的特定活性化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的一种或多种特定化合物组合或同时使用的药物和/或其他疗法，以及医学领域中熟知的类似因素。
载体：如本文所用，是指一种核酸分子，这种核酸分子能够转运其已经连接至的另一种核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指附加DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加DNA区段可以连接到该病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和附加型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们被操作性地连接到的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书，或者如本领域中通常所实现或如本文所述来进行。前述技术和程序一般可根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述执行。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，所述参考文献以引用的方式并入本文用于任何目的。
具体实施方式
免疫疗法为某些类型的癌症提供了一些治疗进展。然而，针对某些癌症的治疗选择和预后仍然是一个持续的挑战。具体而言，患有某些血液癌症(例如，骨髓性白血病)的患者的存活仍不及预期。
CD33
CD33(也称为Siglec-3、SIGLEC3、gp67、p67)是一种结合唾液酸的67kDa质膜蛋白，并且是唾液酸结合Ig相关凝集素(SIGLEC)蛋白质家族的成员。Siglec蛋白被认为参与多种生物学过程，诸如造血、神经元发育和免疫(Vinson,M.等人,1996,出处同上)。研究还表明，Siglec蛋白通过识别唾液酸化的细胞表面聚糖来介导细胞粘附/细胞信号传导(KeIm,S.等人,1996Glycoconj.J.13:913-926；KeIm,S.等人,1998Eur.J.Biochem.255:663-672；Vinson,M.等人,1996J.Biol.Chem.271:9267-9272)。CD33的胞外部分含有两个免疫球蛋白结构域(一个IgV和一个IgC2结构域)。CD33的胞内部分含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。在免疫应答中，CD33可以通过募集一种或多种细胞质磷酸酶来在配体诱导的酪氨酸磷酸化时作为抑制性受体，所述细胞质磷酸酶通过信号传导分子的脱磷酸化来阻断信号转导。
已知CD33在骨髓细胞上表达。还报道了许多恶性细胞上的CD33表达。虽然CD33的靶向已被用于治疗癌症(例如，急性骨髓性白血病)，但是有效的CD33靶向治疗目前仍未面市。
CD33抗体药剂
已经产生了许多靶向CD33的药剂，但是这些药剂具有很多缺点，这些缺点可以包括半衰期较短、体内功能和/或不良反应较差。
吉妥珠单抗奥唑米星(GO,MylotargTM)是连接至N-乙酰基-γ-加利车霉素二甲基酰肼(CalichDMH)的人源化IgG4抗CD33单克隆抗体(Hamann PR等人,Bioconjug Chem13:47-58,2002)。在结合CD33时，GO被内化并且有毒的加利车霉素的释放诱导DNA损伤，最终导致细胞死亡。然而，自从在2000年GO被FDA批准用于治疗CD33+AML起，若干试验报道了异质性临床反应并且获得性耐受性是常见的。
虽然最初，GO与患有AML的患者的改进治疗相关，但是另外的临床试验和上市后评估显示出功效的缺乏和致命的副作用。临床试验的中期分析显示，GO加上化学治疗并不优于单独的化学治疗(Petersdorf S等人,Blood 114:790-790,2009和Petersdorf SH等人,Blood 121:4854-60,2013)。此外，在GO治疗的患者中致命诱导不良反应率更高。作者同上。因此，GO在2010年退市，目前FDA不建议使用GO来治疗AML。
林妥珠单抗(Lintuzumab)是针对CD33的人源化IgG1单克隆抗体。在AML的临床前模型中，林妥珠单抗展示出一些治疗潜力(Sutherland MK等人,MAbs 2:440-8,2010)；然而，就患者的异质性群体而言，IIb期临床试验的结果显示，在患有AML的成年人中，林妥珠单抗和阿糖胞苷的组合并不优于单独的阿糖胞苷(Sekeres MA等人,Haematologica98:119-28,2013)。因此，林妥珠单抗的临床开发在2010年被终止(Laszlo GS等人,Blood Rev28:143-53,2014)。
AVE9633是人源化IgG1抗CD33抗体/美登木素缀合物。作为单一药剂，它在AML患者中具有非常适度的活性。因此，它的临床开发被终止(Laszlo GS等人,Blood Rev28:143-53,2014)。
HuM-195/rGel是与重组白树毒素缀合的人源化抗CD33抗体。在I期临床试验中，它展示出非常适度的临床活性，其中缺氧和低血压作为限制性剂量毒性(Borthakur G等人,Haematologica 98:217-21,2013)。
林妥珠单抗-Ac225(Actimab)是林妥珠单抗的Ac225缀合形式。它在AML的I期临床试验中使用。初步数据显示，在67％的患者中骨髓母细胞减少；然而，未观察到完全缓解，并且观察到4级血小板减少作为剂量限制性毒性(Ravandi F等人,Blood 122:1460-1460,2013)。此外，放射性标记抗体的复杂逻辑增加了它们的缺点。
林妥珠单抗-Bi213是放射性标记的林妥珠单抗的另一种形式。对AML患者进行的I/II期临床试验的结果显示骨髓母细胞显著减少。然而，16％的患者显示出3/4级肝功能异常，10％接受最大耐受剂量的患者因治疗而死亡(Rosenblat TL等人,Clin Cancer Res16:5303-11,2010)。
AMG330是由经由接头连接的抗CD33和抗CD3抗体的scFv组成的双特异性T细胞接合体在体外，AMG330活化和扩增来自AML患者的T细胞。在体内，AMG330可以减缓皮下AML的生长，但是不会导致肿瘤收缩(Aigner M等人,Leukemia27:1107-15,2013)。此外，AMG330拯救了50％注射有人类AML细胞系的小鼠(Friedrich M等人,Mol Cancer Ther13:1549-57,2014)。然而，每日注射抗体持续26天对于临床活性是必要的，这是由于药物的大小较小以及导致体内半衰期缩短。用于治疗难治性/复发性AML患者的I期临床试验(NCT02520427)在暂停之后再次开始招募。药物的连续输注要求患者住院数周是该药剂的缺点。
所提供的抗体药剂
本公开涵盖以下认识：开发作为huM195的变体的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂)将是所期望的。本公开特别提供了此类多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂包含基于huM195的第一结合部分(即，抗CD33部分)和第二结合部分。本公开提供了包含抗CD33部分的特定的多特异性抗体药剂，诸如与单链Fv片段(scFv)的抗体融合体。
本公开涵盖以下认识：至少在一些实施方案中，驱动多克隆细胞毒性T淋巴细胞成为白血病的注射用多特异性抗体药剂(例如，用于肠胃外施用的CD33-BsAb药剂)将是所期望的治疗剂和/或诊断剂。在一些实施方案中，针对此类多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂(BsAb)，诸如CD33-BsAb药剂)设想的一些优点包括：所述药剂可以在普通肿瘤诊所中被患者获取，可以在门诊施用，和/或可以以合理的价格提供。然而，鉴于存在很多可能的BsAb平台(Kontermann R.,MAbs 4,2012)，关于临床最有效的蓝图尚未达成共识。大多数CD33-CD3双特异性抗体构建体关于CD33和CD3是单价的，并且假设如果抗体药剂对于抗CD3是二价的，那么T细胞的非特异性活化在临床上将是禁止的(这据信是至少部分由于细胞因子风暴的诱导)。然而，小鼠OKT3(一种二价小鼠IgG)是第一种FDA批准的单克隆抗体。从1986年起，它已经广泛用于治疗同种异体肾、心脏和肝脏移植之后的器官排斥。在1996年发现它对于移植排斥的预防是安全的。几十年来，它一直在市场上销售，直到最近发现了更有效的药物。单价药剂的一个主要缺点是肿瘤抗原结合亲合力较差。本公开涵盖以下认识：除非单链可变片段(scFv)的亲和力得到显著改善，否则所述片段靶向肿瘤与正常组织的差异将受到影响。
例如，在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)使用IgG-scFv形式。所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可能提供优于目前的CD33抗体药剂的优点。不希望受理论的束缚，设想本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)具有很多所期望的特征。在一些实施方案中，这些所期望的特征可以包括以下各项中的一者或多者：(1)使肿瘤摄取最大化的最佳大小(100-200kd)，(2)与肿瘤靶标二价结合，以维持亲合力，(3)像哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)中的任何IgG(重链和轻链)一样自然组装，可通过标准蛋白A亲和色谱纯化的支架，(4)赋予抗CD3组分功能上单价，从而减少T细胞的非特异性活化的结构排列，(5)在动物模型中具有经证实的肿瘤靶向效率的平台。另外，并且不希望受理论的束缚，设想IgG-scFv形式的本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以克服困扰整个基于T细胞的疗法领域的PD1-PDL1抑制。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-CD3 IgG-scFv)可以经由CD3受体来募集多克隆T细胞。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以在体外以皮摩尔EC50产生抗肿瘤应答。在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb药剂可以在体外诱导显著的(例如，大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％)癌细胞(例如，癌细胞系，诸如AML细胞系)杀死，其中EC50在0.01pM至500nM的范围内。在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb药剂可以在体外诱导显著的(例如，大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％)癌细胞(例如，癌细胞系，诸如AML细胞系)杀死，其中EC50在0.1pM至1nM的范围内。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以根除临床前小鼠模型中的癌症。在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb药剂可以减少临床前小鼠模型中的癌症负荷(例如，癌细胞的存在)80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以根除临床前小鼠模型中的癌症。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以减少临床前小鼠模型中的骨髓性白血病的癌症负荷(例如，癌细胞的存在)80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以根除临床前小鼠模型中的骨髓性白血病。在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb药剂可以减少临床前小鼠模型中的骨髓性白血病的癌症负荷(例如，癌细胞的存在)80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以根除临床前小鼠模型中的骨髓性白血病。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以减少临床前小鼠模型中的骨髓性白血病的癌症负荷(例如，癌细胞的存在)80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)在体内是有效的。如以下实例中所述，示例性CD33双特异性抗体药剂实现了携带人类白血病细胞系的动物的体内治愈，即使在白血病负荷很大的情况下(另参见图5-7)。即使在一般常识预测抗原的快速内吞作用和抗原从肿瘤细胞表面丧失的情况下也与CD33二价结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以减少临床前小鼠模型中的髓外白血病负荷。在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb药剂可以减少临床前小鼠模型中的髓外白血病负荷(例如，癌细胞的存在)40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以减少临床前小鼠模型中的髓外白血病负荷。在某些实施方案中，CD33-CD3 IgG-scFv药剂可以减少临床前小鼠模型中的髓外白血病负荷(例如，癌细胞的存在)40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含融合至IgG1轻链的羧基末端的抗CD3人源化OKT3(huOKT3)单链Fv片段(scFv)。
在一些实施方案中，结合CD33的多特异性抗体药剂是人源化M195抗体。在一些实施方案中，人源化M195抗体包含接枝到人类框架上的具有M195重链CDR序列(CDR1、CDR2和CDR3)的重链可变区，诸如IGHV1-3*01和IGHJ4*01。在一些实施方案中，人源化M195抗体包含接枝到人类框架上的具有M195轻链CDR序列的轻链可变区，诸如IGKV3D11*02和IGKJ4*01。以下提供了示例性人源化M195重链可变区和轻链可变区序列：
SEQ ID NO:1-H1可变区
EVQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQAHGQSLEWIGYIYPY
NGGTGYNQKFKSKATLTVDNSASTAYMEVRSLTSEDTAVYYCARGRPAMDYWG
QGTLVTVSS
SEQ ID NO:2-H2可变区
EVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVRQAHGQSLEWIGYIYPY
NGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWG
QGTLVTVSS
SEQ ID NO:3-L1可变区
EIVLTQSPATLSVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAAS
NQGSGVPARFSGSGSGTDFTLTIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKSEQ ID NO:4-L2可变区
EIVLTQSPATLSVSLGERATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYAASN
QGSGVPARFSGSGPGTDFTLTISSMEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含抗CD33重链，其中所述抗CD33重链可变区包含与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含抗CD33轻链可变结构域，所述结构域包含与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含重链和轻链融合多肽，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列，并且其中所述融合多肽的所述轻链部分包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含融合多肽的重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO:24至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列，并且所述轻链部分包含与SEQ ID NO:26至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
SEQ ID NO:5-H1 cDNA序列(前导序列以下划线表示)
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgaggtgcagctgcagcagtctggacccgaggtcgt
gaagcctggcgcctccgtgaagatctcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacaacatgcactgggtcaagcagg
cccacggccagtccctggaatggatcggctacatctacccctacaacggcggcaccggctacaaccagaagttcaagtccaa
ggccaccctgaccgtggacaactccgcctccaccgcctacatggaagtgcggtccctgacctctgaggacaccgccgtgtact
actgcgccagaggcagacccgccatggactattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcctctgcttctaccaagggccc
atcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttcc
ccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcagg
actctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagc
ccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctga
actcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag
acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat
ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca
aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccg
tgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat
gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
SEQ ID NO:6-H2 cDNA序列(前导序列以下划线表示)
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgaggtgcagctggtgcagtctggacccgaggtcgtg
aagcctggcgcctccgtgaagatctcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacaacatgcactgggtgcgacaggc
ccacggccagtccctggaatggatcggctacatctacccctacaacggcggcaccggctacaaccagaagttcaagtctcgg
gccaccctgaccgtggacaactctgcctctaccgcctacatggaagtgtcctccctgagatccgaggacaccgccgtgtacta
ctgcgccagaggcagacccgccatggactattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtctagcgcttctaccaagggccca
tcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccc
cgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcagga
ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc
cagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaa
ctcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgc
gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaga
caaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatg
gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagc
cccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa
aggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt
gctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat
gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
SEQ ID NO:7-L1 cDNA序列(前导序列以下划线表示)
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgagatcgtgctgactcagtctcctgccaccctgtccg
tgtccctgggccagagagccaccatctcttgcagagcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcatgaactggttcc
agcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacgccgcttccaatcagggctctggcgtgcccgctagattctccgg
ctctggctctggcaccgacttcaccctgaccatccaccccatggaagaggacgacaccgccatgtacttttgccagcagtccaa
agaggtgccctggacctttggcggaggcaccaagctggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccac
cttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcag
tggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactcc
ctgtcctctaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtc
tagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctag
SEQ ID NO:8-L2 cDNA序列(前导序列以下划线表示)
atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgagatcgtgctgactcagtctcctgccaccctgtccg
tgtccctgggcgagagagccaccatctcttgcagagcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcatgaactggttcc
agcagaagcccggccagcctcctcggctgctgatctacgccgcttccaatcagggctctggcgtgcccgctagattctccgga
tctggccctggcaccgactttaccctgaccatctcctccatggaacccgaggacttcgccatgtacttttgccagcagtccaaag
aggtgccctggacctttggcggaggcaccaagctggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccacctt
ccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtg
gaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccct
gtcctccaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtct
agccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctag
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含抗CD33重链，其中所述抗CD33重链可变区由与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码。在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含抗CD33轻链可变结构域，所述结构域由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码。
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含重链和轻链融合多肽，其中所述重链可变区由与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码，并且其中所述融合多肽的所述轻链部分由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码。
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含融合多肽的重链和轻链，所述重链由与SEQ ID NO:23至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码，并且所述轻链部分由与SEQ ID NO:25至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列编码。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂包含单克隆抗CD33抗体，所述单克隆抗CD33抗体包含两个重链和两个轻链。在一些实施方案中，单克隆抗CD33抗体是人源化M195抗体。以下提供了示例性人源化M195重链可变区和轻链序列：
SEQ ID NO:9-重链序列(H2)
EVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVRQAHGQSLEWIGYIYPY
NGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTAVYYCARGRPAMDYWG
QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
SEQ ID NO:10-轻链序列(L2)
EIVLTQSPATLSVSLGERATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYAASN
QGSGVPARFSGSGPGTDFTLTISSMEPEDFAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKRT
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT
EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含重链和轻链融合多肽，其中所述重链包含与SEQ ID NO:9至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列，并且其中所述融合多肽的所述轻链部分包含与SEQ ID NO:10至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂包括单克隆抗体(例如，huCD33单克隆抗体)和scFv。在一些实施方案中，scFv融合(即，共价连接)至单克隆抗体(例如，huCD33单克隆抗体)的轻链。在一些实施方案中，scFv融合至单克隆抗体(例如，huCD33单克隆抗体)的轻链的C-末端。在一些实施方案中，scFv直接融合至单克隆抗体(例如，huCD33单克隆抗体)的轻链的C-末端。在一些实施方案中，scFv经由接头序列共价连接至单克隆抗体(例如，huCD33单克隆抗体)的轻链的C-末端。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂包含两个重链和两个融合多肽。在一些实施方案中，所述两个重链是相同的。在一些实施方案中，所述两个融合多肽是相同的。在一些实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含两个相同的重链和两个相同的轻链融合多肽。此类具有两个相同的重链和两个相同的轻链融合多肽的多特异性抗体药剂将是四价的，并且与每个靶标二价结合(与CD33和第二靶标中的每个二价结合)。在一些实施方案中，融合多肽包含融合至scFv、VHH或融合至任何其他结合结构域的免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，所述融合多肽包含融合至scFv的免疫球蛋白轻链。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂的融合多肽还包含接头。很多接头是本领域已知的，包括例如Gly-Ser接头(例如，GGGGS接头)。在一些实施方案中，融合多肽从N-末端至C-末端包含免疫球蛋白轻链、接头和scFv。接头组成和长度可以适当变化。
在一些特定实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)或它们的序列可以包含抗CD33可变结构域和另一个结合结构域，诸如结合T细胞上的部分(例如，CD3)的结构域、结合有机化合物或无机化合物(例如，苄基-DOTA-金属)的结构域等。在一些特定实施方案中，所提供的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)或它们的序列可以包含抗CD33可变结构域和另一个结合结构域(包括用于针对肿瘤细胞毒性而重新靶向T细胞的抗OKT3)，或苄基-DOTA-金属(C825(用于多步预靶向)，或克隆35、CD137(用于与作为激动剂的抗4-1BB-scFv，或与CD137产生ADCC)、4-1BBL(用于与作为激动剂的4-1BBL产生ADC))。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂是包含抗CD33结合结构域和抗CD3结合结构域的双特异性抗体药剂。在一些实施方案中，抗CD3结合结构域是scFv。以下提供了示例性抗CD3 scFv序列：
SEQ ID NO:11-不具有二硫键的huOKT3 scFv：
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGT
DYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
SEQ ID NO:12-具有5个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTP
GKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPF
TFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:13-具有10个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNW
YQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQW
SSNPFTFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:14-具有15个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSV
SYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATY
YCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:15-具有20个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCS
ASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPE
DIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:16-具有25个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR
VTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTI
SSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:17-具有30个氨基酸的接头的huOKT3 scFv
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGT
DYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
SEQ ID NO:27-具有二硫键的huOKT3 scFv：
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPS
RGYTNYNQKFKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDY
WGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSA
SVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGT
DYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGCGTKLQITR
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含轻链融合多肽，其中所述轻链融合多肽包含与SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27中的任一者至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂是包含抗CD33结合结构域和抗苄基-DOTA结合结构域的双特异性抗体药剂。此类双特异性抗体药剂可以用于例如预靶向放射免疫疗法(PRIT)。在一些实施方案中，双特异性抗体药剂(例如，抗CD33和抗苄基-DOTA药剂)可以用于多步预靶向的第一步骤，然后使用作为清除剂的苄基-DOTA(金属)-葡聚糖来进行血液清除，以及引入苄基-DOTA(金属)缀合的疗法(诸如苄基-DOTA(金属)-放射性金属、苄基-DOTA(金属)-纳米粒子、苄基-DOTA(金属-脂质体、苄基-DOTA(金属)-药物、苄基-DOTA(金属)-DNA、苄基-DOTA(金属)-RNA和苄基-DOTA(金属)-毒素)的第三步骤。由于C825对每种类型的苄基-DOTA-金属偶联物具有不同的亲和力，因此可以精确地控制预靶向的C825对清除剂和苄基-DOTA-配体的亲和力。以下提供了示例性苄基-DOTA scFv融合多肽序列和CD33轻链抗苄基-DOTA scFv融合多肽序列：
SEQ ID NO:18-C825-VH-(G4S)6-VL
SHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSG
GGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDA
WGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTP
PGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSL
IGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG
SEQ ID NO:19-(CD33-VL-CL-(G4S)3-小鼠C825-VH-(G4S)6-VL)
MGWSCIILFLVATATGEIVLTQSPATLSVSLGERATISCRASESVDNYGISFMNWFQ
QKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGPGTDFTLTISSMEPEDFAMYFCQQSKE
VPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGECTSGGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGF
SLTDYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKNQVFLE
MNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASNYANWVQ
EKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGTQTEDEAIYFCALWYS
DHWVIGGGTRLTVLG
在一些实施方案中，本公开的CD33-BsAb包含轻链融合多肽，其中所述轻链融合多肽包含与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19中的任一者至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb药剂)包含变体Fc区，其中所述变体Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，Fc修饰可以包括但不限于改变效应子功能的修饰。在一些实施方案中，Fc变体包括一个或多个经工程化的糖形，即共价附接至包含Fc区的分子的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学上不同于包含Fc区的母体分子。以下提供了具有变体Fc序列的示例性CD33重链：
SEQ ID NO:20-使用特定突变(LALA)来进行Fc沉默的CD33重链
MGWSCIILFLVATATGEVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVR
QAHGQSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTA
VYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:21-使用特定突变(LALA+K322A)来进行Fc沉默的CD33重链
MGWSCIILFLVATATGEVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVR
QAHGQSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTA
VYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:22-使用特定突变(D265A)来进行Fc沉默的CD33重链
MGWSCIILFLVATATGEVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVR
QAHGQSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTA
VYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb药剂)具有经修饰的糖基化位点，优选地不改变抗体的功能，例如靶标结合活性。如本文所用，“糖基化位点”包括抗体中寡糖(即，含有两个或更多个连接在一起的单糖的碳水化合物)将特异性且共价附接至的任何特定氨基酸序列。寡糖侧链通常通过N键或O键与抗体的主链连接。N键连接的糖基化是指寡糖部分至天冬酰胺残基侧链的附接。O键连接的糖基化是指寡糖部分至羟基氨基酸(例如，丝氨酸、苏氨酸)的附接。缺乏某些寡糖(包括岩藻糖和末端N-乙酰葡糖胺)的Fc-糖形hu3F8-H1L1-IgG1n在特定的CHO细胞(以及CHO变体，包括CHO-s、CHO-K1等)中产生，并且表现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施方案中，本公开涵盖通过添加或缺失糖基化位点来改变本公开的抗体的碳水化合物含量的方法。用于改变抗体的碳水化合物含量的方法是本领域熟知的，并且涵盖在本公开内，参见例如美国专利No.6,218,149；EP 0 359 096 B1；美国公开No.US2002/0028486；WO 03/035835；美国公开No.2003/0115614；美国专利No.6,218,149；美国专利No.6,472,511；所有这些专利均以引用的方式整体并入本文。在其他实施方案中，本公开涵盖通过使抗体的一个或多个内源性碳水化合物部分缺失来改变本公开的抗体的碳水化合物含量的方法。在一个具体实施方案中，本公开涵盖通过将位置297从天冬酰胺修饰为丙氨酸来使抗体的Fc区的糖基化位点缺失。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)包含CH2结构域中的N297A突变。在一些实施方案中，N297A突变导致无糖基化，这减少了FcR或C1q结合。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变和K322A突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变和D265A突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体药剂包含重链，所述重链包含含有N297A突变、D265A突变和K322A突变的Fc区。
经工程化的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应物功能。经工程化的糖形可以通过本领域的技术人员已知的任何方法来产生，例如通过使用经工程化的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶(例如DI N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTI11))共表达，通过表达包含各种生物体或来自各种生物体的细胞系中的Fc区的分子，或通过在包含Fc区的分子表达之后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生经工程化的糖形的方法是本领域已知的，并且包括但不限于以下文献中描述的那些：Umana等人,1999,Nat.Biotechnol17:176-180；Davies等人,20017Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人,2002,JBiol Chem 277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473)；美国专利No.6,602,684；美国序列号10/277,370；美国序列号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；POTILLEGENTTMtechnology(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GLYCOMABTMglycosylation engineeringtechnology(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)；这些文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。参见例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等人,2004,JMB,336:1239-49，这些文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。
除本文别处讨论的具体抗体片段之外，本公开的多肽的片段还包括蛋白水解片段，以及缺失片段。
根据本公开使用的多特异性抗体药剂的变体包括具有由于氨基酸置换、缺失或插入而产生的改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术或非天然氨基酸来产生。变体多肽可以包含保守的或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。
另外作为“衍生物”包括在内的是含有二十个标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些多肽。例如，4-羟脯氨酸可以置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可以置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以置换组氨酸；高丝氨酸可以置换丝氨酸；以及鸟氨酸可以置换赖氨酸。
与本文所述的序列基本上相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸置换，以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换是指第一氨基酸被具有与第一氨基酸相似的化学和/或物理性质(例如，电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二氨基酸的替换。保守置换包括一个氨基酸被以下各组内的另一个氨基酸的替换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
当然，技术人员可以进行的氨基酸置换的数量取决于很多因素，包括上文所述的那些因素。一般而言，针对任何给定的多特异性抗体药剂的氨基酸置换、插入或缺失的数量将不大于40个、30个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个，诸如1个-30个或其中的任何范围或值，如本文所述。
对于功能必需的本公开的多特异性抗体药剂中的氨基酸可能通过本领域已知的方法来鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，Ausubel，出处同上,第8章，15；Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989))。后一种程序在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得的突变体分子的生物学活性，例如但不限于至少与CD33结合。对于抗体结合关键的位点还可以通过结构分析(诸如结晶、核磁共振或光亲和标记)来鉴定(Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和de Vos等人,Science255:306-312(1992))。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性抗体药剂可以通过有机部分的共价连接来修饰。这种修饰可以产生具有改善的药代动力学性质(例如，增加的体内血清半衰期)的抗体药剂。有机部分可以是直链或支链亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定实施方案中，亲水性聚合物基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚烷二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸基团或脂肪酸酯基团可以包含约八个至约四十个碳原子。
可以使用合适的方法来制备经修饰的多特异性抗体药剂，诸如通过与一种或多种经修饰的试剂反应。如本文所用的术语“经修饰的试剂”是指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是这样的化学部分或官能团：它可以在适当条件下与第二化学基团反应，从而在经修饰的试剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，诸如甲苯磺酸根、甲磺酸根、卤基(氯基、溴基、氟基、碘基)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等等。可以与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等等。醛官能团可以与含胺分子或含酰肼分子偶联，并且叠氮基团可以与三价亚磷基团反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适的方法是本领域已知的(参见例如Hernanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996))。活化基团可以直接或通过接头部分(例如二价C1-C12基团)键合至有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，其中一个或多个碳原子可以被杂原子(诸如氧、氮或硫)替代。合适的接头部分包括例如四乙二醇、--(CH2)3--、--NH--等等。包含接头部分的经修饰的试剂可以例如通过在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的情况下使单-Boc-烷基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以在游离的胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键来产生。Boc保护基团可以通过用三氟乙酸(TFA)处理来从产物中除去，从而暴露可以与所述的另一个羧酸酯偶联的伯胺，或可以与马来酸酐反应，所得的产物可以环化以产生活化的脂肪酸的马来酰亚胺衍生物。(参见例如Thompson等人,WO 92/16221，该文献的全部教导以引用的方式并入本文。)
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的特征在于与抗原(例如CD33)的高亲和力或亲合力。多特异性抗体药剂对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何合适的方法通过实验来测定。(参见例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions,"载于Fundamental Immunology,Paul,W.E.编,RavenPress:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:NewYork,N.Y.(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量特定抗体-抗原相互作用的亲和力，则所测量的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数的测量优选地使用多特异性抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲剂(诸如本文所述的缓冲剂)来进行。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的特征在于低毒性。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂的特征在于能够长期治疗患者，具有可测量的症状减轻以及低毒性和/或可接受的毒性。低免疫原性或可接受的免疫原性和/或高亲和力，以及其他合适的性质，可以有助于所实现的治疗结果。“低免疫原性”在本文中被定义为在少于约75％或优选地少于约50％的所治疗的患者中产生显著的HAHA、HACA或HAMA反应，和/或在治疗的患者中产生低滴定度(Elliott等人,Lancet 344:1125-1127(1994)，该文献以引用的方式整体并入本文)。
核酸
本公开提供了包含编码本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)以及它们的片段的核苷酸序列的多核苷酸。可以使用本领域已知的分子生物学方法从核酸分子产生如本文所述的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。
在一些实施方案中，核酸构建体包含编码多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的区。在一些实施方案中，此类多特异性抗体药剂将包含VH区和/或VL区。在鉴定和选择表现出期望的结合和/或功能特性的抗体之后，将每个抗体的可变区分离、扩增、克隆和测序。可以对VH和VL核苷酸序列进行修饰，包括编码氨基酸和/或携带限制性位点的核苷酸序列的添加、编码氨基酸的核苷酸序列的缺失，或编码氨基酸的核苷酸序列的取代。抗体和/或抗体组分可以从人类、人源化或嵌合抗体产生。
在适当的情况下，编码如本文所述的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的核酸序列可以被修饰为包含为了在特定细胞类型或生物体中表达而优化的密码子(例如，参见美国专利No.5,670,356和美国专利No.5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并且优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或与全长多肽具有基本上相同活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码抗体组分的遗传物质的编码区的全部或部分可以包含改变的序列以优化针对特定细胞类型(例如，真核或原核细胞)的密码子使用。例如，针对可以如本文所述的人源化重链(或轻链)可变区的编码序列可以被优化以在细菌细胞中表达。或者，编码序列可以被优化以在哺乳动物细胞(例如，CHO)中表达。此类序列可以被描述为密码子优化的序列。
可以通过本领域已知的方法来将本公开的核酸构建体插入表达载体或病毒载体中，并且核酸分子可以可操作地连接至表达对照序列。本公开还提供了包含上述核酸分子中的任一者的载体或它们的片段。上述核酸分子中的任一者或它们的片段可以被克隆至任何合适的载体中，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。载体的选择及其构建方法通常是本领域的普通技术人员已知的，并且在一般技术参考文献中有所描述(通常参见"Recombinant DNA Part D,"Methods in Enzymology,第153卷,Wu和Grossman编,AcademicPress(1987))。所期望的是，载体包含调控序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，视情况而定并且考虑载体是DNA还是RNA，所述调控序列是所述载体所引入的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)特有的。优选地，载体包含宿主的属特有的调控序列。最优选地，载体包含宿主的种特有的调控序列。
除复制系统和所插入的核酸之外，构建体还可以包含一个或多个标记基因，所述标记基因允许选择已转化的或已转染的宿主。标记基因包括杀生物剂耐受性，例如，对抗生素重金属等的耐受性、提供原养型的营养缺陷型宿主中的互补性等等。
合适的载体包括针对增殖和扩增或者针对表达或它们二者而设计的那些载体。例如，克隆载体选自pUC系列、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。还可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo(Clontech)。还可以根据制造商的建议使用TOPO克隆系统(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。
表达载体可以包含可操作地连接至如上文所述的分离的或纯化的核酸分子的天然或非天然启动子。启动子的选择，例如强启动子、弱启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育特异性启动子，在本领域技术的范围内。类似地，如上文所述的核酸分子或它们的片段与启动子的组合也在本领域技术的范围内。
合适的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、基于细小病毒的载体(例如，基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体)和慢病毒载体(诸如基于单纯疱疹(HSV)的载体)。可以使用在例如Sambrook等人,Molecular Cloning,aLaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,New York,N.Y.(1994)中描述的标准重组DNA技术来制备这些病毒载体。
逆转录病毒载体来源于逆转录病毒。逆转录病毒是能够感染多种宿主细胞的RNA病毒。在感染时，逆转录病毒基因组整合进其宿主细胞的基因组，并且与宿主细胞DNA一起复制，从而不断产生病毒RNA和掺入逆转录病毒基因组中的任何核酸序列。因此，当使用逆转录病毒时，可实现一种或多种治疗性因子的长期表达。设想为在基因疗法中使用的逆转录病毒是相对非致病性的，尽管存在致病性逆转录病毒。当采用致病性逆转录病毒(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)或人类T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV))时，必须注意改变病毒基因组以消除对宿主的毒性。另外可以操纵逆转录病毒载体以使病毒成为复制缺陷的。因此，逆转录病毒载体被特别考虑用于体内稳定基因转移。慢病毒载体(诸如基于HIV的载体)是用于基因递送的逆转录病毒载体的示例。与其他逆转录病毒不同的是，已知基于HIV的载体将它们的乘客基因掺入非分裂细胞中，所以可以用于治疗持续形式的疾病。
另外的序列可以添加至此类克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善向细胞的多核苷酸引入。克隆载体、表达载体、衔接子和接头是本领域熟知的。(参见例如Ausubel，出处同上；或Sambrook，出处同上)。
在一些实施方案中，本公开的核酸和载体可以是分离的和/或纯化的。本公开还提供了包含上述分离的或纯化的核酸分子，任选地载体形式的核酸分子的组合物。组合物可以包含如本文另外描述的其他组分。
在一些实施方案中，当核酸分子引入适当的宿主细胞时，这些核酸分子被插入能够表达多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的载体中。适当的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。示例性宿主细胞包括原核生物(例如，大肠杆菌)和真核生物(例如，COS或CHO细胞)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人类Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV 1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，DG44细胞)。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体中的任何一种或多种方法可以用于构建编码在转录/翻译控制信号的控制下的本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的表达载体。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(参见Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等人编,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY)。
抗体药剂的产生
可以通过任何技术来纯化本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)，这允许随后形成稳定的抗体药剂。例如，不希望受理论束缚，可以通过熟知的方法从重组细胞培养物回收和纯化多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)，这些方法包括但不限于蛋白A纯化、蛋白G纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如Colligan,CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1章、第4章、第6章、第8章、第9章和第10章，每个文献均以引用的方式整体并入本文。
本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)包含天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组产生程序中所用的宿主，本公开的抗体药剂可以是糖基化的或可以是非糖基化的，其中糖基化是优选的。这些方法在很多标准实验室手册在有所描述，诸如Sambrook,出处同上,第17.37节-第17.42节；Ausubel,出处同上,第10章、第12章、第13章、第16章、第18章和第20章,Colligan,Protein Science,出处同上,第12章-第14章，所有文献均以引用的方式整体并入本文。
纯化的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)可以通过例如ELISA、ELISPOT、流式细胞术、免疫细胞学、BIACORETM分析、SAPIDYNE KINEXATM动力学排除测定、SDS-PAGE和蛋白质印迹，或通过HPLC分析以及通过本文所公开的许多其他功能测定来表征。在整个本专利申请中引用的所有引用参考文献(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容均据此明确地以引用的方式并入。
抗体药剂组合物
本公开的组合物(例如，递送多特异性抗体药剂诸如CD33-BsAb的组合物)可以包括包含至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的任何合适的和有效量的组合物或药物组合物，用于将所提供的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)递送至需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。
本公开的组合物(例如，递送多特异性结合剂诸如CD33-BsAb的组合物)还可以包含任何合适的辅助剂中的至少一种，诸如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等等。药学上可接受的辅助剂是优选的。制备这种无菌溶液的非限制性实例和方法是本领域熟知的，例如但不限于Gennaro编,Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,Mack Publishing Co.(Easton,Pa.)1990。可以以常规方式选择适用于本领域熟知的或如本文所述的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)、片段或变体组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载剂。
可用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，它们可以以单独或组合方式存在，包括以单独或1-99.99重量％或体积％组合的方式存在。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白(诸如人类血清白蛋白(HSA))、重组人类白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等。代表性氨基酸/抗体组分(它们还可以发挥缓冲作用)包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本公开的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等等。在某些实施方案中，适用于本公开的碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
组合物(例如，递送多特异性抗体药剂诸如CD33-BsAb的组合物)还可以包含缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是从有机酸或有机碱制备的盐。代表性缓冲剂包含有机酸盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸，葡糖酸，碳酸，酒石酸，琥珀酸，乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或三羟甲基氨基甲烷磷酸盐缓冲剂。用于本发明组合物的优选的缓冲剂是有机酸盐，诸如柠檬酸盐。
另外，本公开的组合物(例如，递送多特异性结合剂诸如CD33-BsAb的组合物)可以包含聚合物赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯尔(ficoll)(聚合物糖)、葡萄糖结合剂(dextrate)(例如，环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如“TWEEN 20”和“TWEEN80”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
适用于包含多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)、它们的部分或变体的组合物的这些和其他已知的药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如列于"Remington:The Science&Practice of Pharmacy",第19版,Williams&Williams,(1995)和"Physician'sDesk Reference",第52版,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)中，这些文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。优选的载剂或赋形剂材料是碳水化合物(例如，糖和糖醇)和缓冲剂(例如，柠檬酸盐)或聚合物剂。
在一些实施方案中，包含多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的组合物是稳定调配的。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的稳定制剂可以包括含有盐水或选定的盐的磷酸盐缓冲剂，以及含有防腐剂的保存溶液和制剂，以及适用于药物或兽医用途的多用途保存制剂。保存制剂含有至少一种已知的或任选地选自以下中的至少一者的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如，氯化镁六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或者它们在水性稀释剂中的混合物。如本领域中已知，可以使用任何合适的浓度或混合物，诸如0.001％-5％，或其中的任何范围或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或其中的任何范围或值。非限制性实例包括无防腐剂、0.1％-2％间甲酚(例如，0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.1％-3％苄醇(例如，0.5％、0.9％、1.1％、1.5％、1.9％、2.0％、2.5％)、0.001％-0.5％硫柳汞(例如，0.005％、0.01％)、0.001％-2.0％苯酚(例如，0.05％、0.25％、0.28％、0.5％、0.9％、1.0％)、0.0005％-1.0％一种或多种对羟基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.02％、0.05％、0.075％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、0.9％、1.0％)等等。
如上文所述，在一些实施方案中，本公开提供了一种制品，所述制品包括包装材料和至少一个小瓶，所述小瓶包含含有适当的缓冲剂和/或防腐剂的至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的溶液，任选地在水性稀释剂中的溶液，其中所述包装材料包括表明这种溶液可以保存1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时、18小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时或更长的时间的标签。本公开还提供了一种制品，所述制品包括包装材料、第一小瓶(包含冻干的至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂))和第二小瓶(包含指定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释剂)，其中所述包装材料包括标签，所述标签提供了在水性稀释剂中复原至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)，以形成可以保存二十四小时或更长的时间的溶液的说明。
在一些实施方案中，水性稀释剂还包含药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂可以选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或者它们的混合物。配制中所用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。这些浓度取决于所选的防腐剂，并且是技术人员容易测定的。
其他赋形剂(例如，等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂)可以任选地添加至稀释剂中。等渗剂(诸如甘油)通常以已知的浓度使用。可以添加生理耐受的缓冲剂以提供改善的pH控制。制剂可以覆盖宽泛的pH范围，诸如从约pH4至约pH10，优选的范围为从约pH5至约pH9，最优选的范围为约6.0至约8.0。在一些实施方案中，本公开的制剂具有约6.8和约7.8之间的pH。在一些实施方案中，缓冲剂包括磷酸盐(诸如磷酸钠)缓冲剂，尤其是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
可以任选地将其他添加剂(诸如药学上可接受的增溶剂，如Tween 20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇))或者非离子表面活性剂(诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80或者泊洛沙姆184或泊洛沙姆188、多元醇、其他嵌段共聚物和螯合剂(诸如EDTA和EGTA))添加至制剂或组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料容器来施用制剂，则这些添加剂可以是特别有用的。药学上可接受的表面活性剂的存在可以减少组合物中的蛋白质(例如，CD33-BsAb药剂)聚集的倾向。
在一些实施方案中，本公开的制剂可以通过包括将至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)与防腐剂(选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或者它们在水性稀释剂中的混合物)混合的过程来制备。在水性稀释剂中混合至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)和防腐剂可以使用常规溶解和混合程序来进行。在一些实施方案中，合适的制剂的制备可以包括例如将已测定量的溶于缓冲溶液的至少一种抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)与溶于缓冲溶液的所期望的防腐剂组合，所述抗体药剂和防腐剂的数量足以提供所期望浓度的蛋白质和防腐剂。本领域的普通技术人员将认识到该过程的变化。例如，组分添加的顺序，是否使用另外的添加剂，制备制剂的温度和pH都是可以针对所用的浓度和施用方式而优化的因素。
在一些实施方案中，制剂以透明溶液或以两个小瓶提供给患者，这两个小瓶包括一个含有冻干的至少一种多特异性抗体试剂(例如，CD33-BsAb药剂)的小瓶，所述小瓶与第二小瓶一起在水性稀释剂中复原，所述第二小瓶含有水、防腐剂和/或赋形剂，诸如磷酸盐缓冲剂和/或盐水以及选定的盐。
在一些实施方案中，制品(包括多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂))包括包装材料。在一些实施方案中，除监管机构要求的信息之外，包装材料还提供了可以使用产品的条件。在一些实施方案中，包装材料提供了多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)的复原说明。
在一些实施方案中，针对肠胃外施用来调配组合物。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb药剂)与药学上可接受的肠胃外媒介物一起调配为联合或单独提供的溶液剂、混悬剂、乳剂或冻干粉末剂。此类媒介物的实例是水、盐水、林格氏(Ringer)溶液、葡萄糖溶液和1％-10％人类血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物(诸如不挥发性油)。媒介物或冻干粉末剂可以含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。在一些实施方案中，通过已知的或合适的技术对制剂进行灭菌。
本公开还特别提供了用于表征多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的技术。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的特征在于结合AML细胞(例如，HL60)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物的特征在于体内保留(例如，体内血清半衰期为至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长)。在一些实施方案中，多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)和/或包含所述多特异性抗体药剂的组合物通过ELISA、免疫组织化学、Biacore结合测定、质谱、等电聚焦(IEF)色谱、蛋白质印迹等来表征。
应用
本公开提供了如本领域中已知的或如本文所述的使用本公开的至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)来调节、治疗或诊断细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种CD33相关疾病的技术。
本文提供的任何多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)均可用于治疗方法。例如，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)可以用作免疫治疗剂，例如用于癌症的治疗。
本公开包括用于调节、治疗或诊断细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种恶性疾病的方法，所述恶性疾病包括但不限于以下中的至少一者：多发性骨髓瘤、白血病、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括B细胞ALL和T细胞ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、恶性肿瘤的副肿瘤综合征/高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关的骨吸收、癌症相关的骨痛；癌症转移的抑制；癌症恶病质的改善；以及炎性疾病(诸如系膜增生性肾小球肾炎)的治疗等等。在某些实施方案中，所提供的组合物和方法可以用于治疗白血病的髓外(EM)表现。此类方法可以任选地通过在此类多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的施用之前、同时或之后施用放射疗法、抗血管生成剂、化学治疗剂、法呢基转移酶抑制剂等等来组合使用。
对于在治疗方法中使用，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)将以与良好医学实践一致的方式调配、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用排程以及从业医生已知的其他因素。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)。在一些实施方案中，将包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的组合物以药学上可接受的形式施用于所述个体。在一些实施方案中，将要治疗的疾病是增殖性障碍。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，如果将要治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。“个体”可以是哺乳动物，包括人类。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)可以用于诊断受试者中的特征在于CD33表达的医学病症的方法。
任何这些方法可以任选地包括将有效量的包含至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的至少一种组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理、诊断和/或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。
在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的治疗方法：将有效量的包含和/或递送多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的组合物施用于已施用或将施用IL2的受试者，以使得所述受试者接受多特异性抗体药剂和IL2二者。在一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：将包含和/或递送IL2的组合物施用于已施用或将施用多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)的受试者，以使得所述受试者接受IL2和多特异性抗体药剂二者。
本公开的任何方法可以包括用于治疗CD33介导的障碍或特征在于CD33表达的障碍的方法，所述方法包括将有效量的包含至少一种本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)组合物或药物组合物施用于需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这种方法可以任选地另外包括用于治疗此类免疫疾病的共施用或联合疗法，其中本公开的所述至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)、它们的指定部分或变体的施用还包括在它们施用之前、同时和/或之后施用至少一种另外的药剂。
本公开的任何方法可以包括用于诊断特征在于CD33表达的疾病或障碍的方法，所述方法包括将有效量的包含本公开的至少一种多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的组合物或药物组合物施用于细胞、组织、器官、动物或患者。
基于T细胞的疗法
用于破坏肿瘤细胞的方法包括诱导选择性靶向免疫效应细胞(诸如自然杀伤细胞毒性(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))、攻击和破坏肿瘤细胞的免疫应答。CTL构成免疫系统的最有效的效应细胞，然而它们不能被常规治疗性抗体的Fc结构域介导的效应子机制活化。
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)可以结合第一结合结构域(结合靶细胞上的表面抗原)，并且结合第二结合结构域(结合T细胞受体(TCR)复合物的活化、不变组分)，近年来已引起人们的关注。不希望受理论的束缚，设想了这种抗体药剂同时结合它们的两个靶标将迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，从而引起任何细胞毒性T细胞的活化和靶细胞的后续裂解。因此，免疫应答可以重定向至靶细胞，并且与靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性无关，这与正常的MHC限制性CTL活化有关。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)活化患者中存在的T细胞。
CTL是靶向肿瘤的理想效应子，因为它们可以转运到肿瘤部位，它们可以在那里增殖和释放细胞因子，随后募集先天炎性或免疫细胞，以触发其他体内免疫应答，包括抗肿瘤CTL和B细胞的新克隆(体内疫苗接种作用)的开发，过去接受过继性T细胞疗法的成年患者的免疫评估最明显。(Thakur A等人,Cancer Immunol Immunother 60:1707-20,2011)。例如，在用HER2-BsAb武装的ATC治疗之后，检测针对患者中的乳腺癌和淋巴瘤的疫苗接种作用，包括抗乳腺癌CTL、抗乳腺癌抗体、血清Th1细胞因子模式和大于基线的IL-12水平。(LumLG等人,Bone Marrow Transplant 49:73-9,2014；Lum LG等人,Biol Blood MarrowTransplant 19:925-33,2013；Grabert RC等人,Clin Cancer Res12:569-76,2006)。
BsAb武装的T细胞
在一些实施方案中，提供了用本公开的多特异性抗体药剂(例如，抗CD3×抗靶抗原，包括BsAb和BiTE抗体药剂)来活化和/或武装活化的T细胞(ATC)的方法。这种武装的ATC将MoAb(例如，huM195)的靶向特异性与非MHC限制性穿孔素/粒酶介导的T细胞的细胞毒性组合在一起。BsAb或BiTE可以在输注至患者之前离体武装已扩增的活化T细胞。该策略将每个ATC转换为特定的CTL(Thakur和Lum,2010,Curr Opin Mol Ther 12,340-349；Grabert等人,2006,Clin Cancer Res 12,569-576)。
双特异性抗体药剂允许通过HLA非限制性CD3介导的活化而不是T细胞的抗原特异性HLA限制性TCR来进行T细胞的靶向接合以及它们的效应子功能的开发。对CD3和肿瘤抗原(诸如CD-19、HER-2NEU或CEA)具有特异性的某些双功能单克隆抗体的研究展示了这些抗体将细胞毒性T细胞与表达另一种靶向抗原的肿瘤细胞连接的能力(Bargou等人,2008,Science 321,974-977；Topp等人,2009,Blood(ASH Annual Meeting Abstracts)114,840；Kiewe等人,2006,Clin Cancer Res 12,3085-3091；Lutterbuese等人,2009,J Immnother32,341-352)。一旦两种抗体受体接合，即引发针对肿瘤细胞的细胞毒性T细胞反应。T细胞反应涉及在T细胞受体和肿瘤细胞之间形成细胞毒性突触，以及穿孔素和粒酶介导的肿瘤细胞凋亡诱导(Offner等人,2006,Mol Immunol 43,763-771；Brischwein等人,2006,MolImmunol 43,1129-1143)。CD3的接合还活化了T细胞，诱导增强抗肿瘤作用的效应细胞因子的增殖和产生(Brischwein等人,2006,出处同上；Brischwein等人,2007,J Immunother30,798-807)。令人惊讶的是，活化的T细胞使抗细胞凋亡蛋白c-FLIP上调，这保护它们免受在T细胞活化期间产生的TNF和Fas配体的细胞毒性作用的伤害(Dreir等人,2002,Int JCancer 100,690-697)。结果，T细胞反应被放大。结果，双功能抗体的皮克水平可以在体外(Lutterbuese等人,2009,出处同上；Brandl等人,2007,Cancer Immunol Immunother 56,1551-1563)和体内发挥显著的抗肿瘤作用，如临床前动物模型，尤其是CD3/CD19双特异性在B细胞淋巴瘤和ALL(Topp等人,2009,出处同上；Kiewe等人,2006,出处同上)的治疗中的初始临床试验的结果所示。已经假设，所诱导的T细胞反应还可以募集初始T细胞，并且刺激肿瘤部位处的肿瘤特异性T细胞的产生(Koehne等人,2002,Blood 99,1730-1740)。除T淋巴细胞之外，双特异性抗体药剂还可以用于重新靶向其他效应细胞。这些效应细胞包括NK细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、表达CD33的细胞、组织或器官的间充质干细胞、神经干细胞和其他干细胞。当组织是肿瘤时，这些效应细胞可以用于杀死或沉积蛋白质(例如，细胞因子、抗体、酶或毒素)、放射性同位素，以进行诊断或进行疗法。当组织是正常器官时，效应细胞可以类似地用于递送蛋白质或同位素，以进行诊断或进行疗法。
本公开涵盖以下认识：本公开的特定多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)可以用于武装活化的T细胞(ATC)。在一些实施方案中，用于武装ATC的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)还可以包含结合T细胞抗原的表位的结构域。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3。在一些实施方案中，结合T细胞抗原的表位的结构域是人源化OKT3scFv。
在一些实施方案中，提供了用于产生用本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)武装的T细胞群的方法。本领域中已知的用于武装T细胞的标准方法可以在本公开的上下文中使用。可以通过本领域已知的各种测定来测量本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的生物学活性。生物学活性可以包括例如T细胞增殖的诱导、T细胞中的信号传导的诱导、T细胞中的活化标记物的表达的诱导、T细胞的细胞因子分泌的诱导、靶细胞(诸如肿瘤细胞)裂解的诱导、肿瘤消退的诱导和/或存活的改善。在一些实施方案中，T细胞群包含在0.001ng至100ng/106个细胞毒性免疫细胞范围内的武装剂量的本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)。
在一些实施方案中，提供了包含用本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)武装的T细胞群的组合物。不希望受理论的束缚，设想了本公开的多特异性抗体药剂的施用与活化的T细胞(ATC)的施用组合可以增强治疗性反应。在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)与ATC组合施用。在一些实施方案中，使用多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的治疗包括递送多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的组合物的施用和递送ATC的组合物的施用。
基于PBMC的疗法
在一些实施方案中，本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)与外周血单个核细胞(PBMC)的制备物组合施用。在一些实施方案中，PBMC是同种异体的。在一些实施方案中，PBMC是同系的。在一些实施方案中，使用多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的治疗包括递送多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb)的组合物的施用和递送PBMC的组合物的施用。
CD33-嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞
嵌合抗原受体技术的出现(Sadelain M等人,Cancer Discov 3:388-98,2013)迅速扩展了抗CD33重定向基因修饰的T细胞的治疗性研究。目前有至少三项临床试验正在研究CD33靶向的CAR-T：NCT02958397(骨髓性恶性肿瘤)、NCT02944162(AML)、NCT01864902(AML)治疗潜力。然而，许多关注与CAR-T疗法相关。例如，对于HER-2CAR-T疗法，最初观察到来自脱靶效应的毒性。(Morgan RA等人,Mol Ther 18:843-51,2010)。HER2-CAR修饰的T细胞的一个一致性优点是观察到它克服了抗原表达的低水平。骨肉瘤是一个很好的实例，其中表达水平一直是有争议的(Thomas DG等人,Clin Cancer Res 8:788-93,2002)，并且发现CAR修饰的T细胞对限于局部的和转移性异种移植物(Ahmed N等人,Mol Ther 17:1779-87,2009)并且对骨肉瘤肿瘤起始细胞非常有效。(Rainusso N等人,Cancer Gene Ther 19:212-7,2012)。正如BsAb武装的T细胞那样，在T细胞输注之前，细胞减少性高剂量化疗对于针对CAR修饰的T细胞的有意义的临床反应是必要的。
虽然细胞减少的使用肯定会促进输注T细胞的植入和扩增，但是为了重新尝试T细胞输注目的而进行重复细胞减少是不可行的，并且无法达到靶向疗法的目的。除了毒性之外，用于淋巴细胞疗法的细胞收获、处理、储存、运输和产物释放调节在逻辑上和财务上仍然是挑战，尤其是当必须对细胞进行基因修饰时。考虑到医疗保健的预算缩减，为了使该疗法在目前的药物市场中生存下来，需要大度降低目前的每名患者2万美元的标价签。即使在成本不是限制因素的情况下，尽管输注了数十亿个这些细胞，T细胞存活和归巢也不是最佳的。考虑到在发现肿瘤之前T细胞表面上的CD3抗原的周转、BsAb的连续破碎和T细胞的耗减，BsAb武装的T细胞的细胞裂解效率也不是最佳的。BsAb武装的T细胞和CAR修饰的T细胞二者都不是免疫抑制性肿瘤微环境的例外情况，其中Treg、肿瘤相关巨噬细胞和骨髓性抑制细胞相互联合，从而破坏它们的抗肿瘤性质。对于用于武装T细胞的化学缀合的BsAb，由于产物异质性、聚集体形成和后续的免疫原性，尤其是在使用小鼠OKT3的情况下，药物制造是一个挑战。此外，CAR修饰的T细胞受到相同的免疫抑制性约束，这些约束使T细胞循环，包括来自PD-L1表达的失能，这是BsAb中不存在的局限性。
然而，就CAR-T疗法被认为是有用的和/或适当的而言，设想了这种疗法可以通过本公开的多特异性抗体药剂(例如，CD33-BsAb，诸如抗CD33 Ig抗CD3 scFv试剂)来增强。
在一些实施方案中，提供了包含结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述结合结构域包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。在一些实施方案中，CAR是第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。在一些实施方案中，CAR还包含跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合结构域(包含本公开的CD33双特异性抗体药剂)、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。本文还提供了表达本公开的CAR的T细胞，即CAR-T细胞。在一些实施方案中，提供了表达CAR的CAR-T细胞群，所述CAR包含结合结构域，所述结合结构域包含本公开的多特异性抗体药剂(例如，双特异性抗体药剂，诸如CD33-BsAb)。
本发明的其他特征将在以下对示例性实施方案的描述的过程中变得显而易见，所述实施方案是为了说明本发明而给出的，而并非旨在限制本发明。
实施例
本发明将通过以下非限制性实施例进一步说明。提出这些实施例以帮助理解本发明，但是这些实施例不旨在且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括本领域(分子克隆技术等)的普通技术人员熟知的常规方法的详细描述。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1–示例性CD33-BsAb的构建
本实施例描述了对CD33和CD3具有特异性的和呈IgG-scFv形式的示例性双特异性抗体药剂的产生。根据M195的重链和轻链的CDR与人类框架(分别地，对于VH，IGHV1-3*01–IGHJ4*01，对于VL，IGKV3D-11*02–IGKJ4*01)的同源性，通过将这些CDR接枝到人类IgG1框架上来产生人源化M195单克隆抗体。从两条重链和两条轻链设计，在DG44细胞中基因合成和表达huM195的四种型式。示例性重链和轻链可变结构域氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3-4。
构建了具有IgG-scFv形式的示例性CD33-BsAb(BiClone 133)抗体药剂(图1A)。对应于SEQ ID NO:9的人源化抗CD33重链和对应于SEQ ID NO:10的人源化抗CD33轻链被用于构建示例性CD33-BsAb药剂。示例性CD33-BsAb药剂可以包含含有具有N297A突变的hIgG1Fc的恒定区。N297A突变被提出用于除去Fc区的糖基化。以下提供了来自示例性CD33-BsAb的重链的DNA和蛋白质序列。
SEQ ID NO:23-BiClone133重链DNA序列：(前导序列重链以下划线表示)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGCGAGGT
GCAGCTGGTGCAGTCTGGACCCGAGGTCGTGAAGCCTGGCGCCTCCGTGAAGA
TCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTG
CGACAGGCCCACGGCCAGTCCCTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCTACAA
CGGCGGCACCGGCTACAACCAGAAGTTCAAGTCTCGGGCCACCCTGACCGTGG
ACAACTCTGCCTCTACCGCCTACATGGAAGTGTCCTCCCTGAGATCCGAGGAC
ACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCAGACCCGCCATGGACTATTGGGGCCA
GGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTTCTACCAAGGGCCCCTCTGTGTTTCC
TCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGTGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCC
TCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCT
CTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGTCTAGCGGCCTGTAC
TCCCTGTCCTCCGTCGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTAC
ATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGG
AACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAA
CTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCT
GATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACG
AGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAA
CGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTG
TCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGT
GCGCCGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAG
GCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCAGGG
ACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTAC
CCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA
CAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCA
AGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCC
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAG
CCCCGGCAAA
SEQ ID NO:24-BiClone133重链氨基酸序列：(前导序列重链以下划线表示)
MGWSCIILFLVATATGEVQLVQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVR
QAHGQSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSRATLTVDNSASTAYMEVSSLRSEDTA
VYYCARGRPAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
构建包含融合多肽的示例性CD33-BsAb抗体药剂，所述融合多肽具有人源化抗CD33轻链，所述轻链被延伸为包含C-末端Gly-Ser接头(例如，(G4S)3)，然后是对第二部分具有亲和力的scFv，例如包含人源化OKT3 scFv的CD3。以下提供了来自示例性CD33-BsAb的融合多肽的DNA和蛋白质序列。
SEQ ID NO:25-BiClone133轻链DNA序列(前导序列轻链以下划线表示)
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGCGAGAT
CGTGCTGACTCAGTCTCCTGCCACCCTGTCCGTGTCCCTGGGCGAGAGAGCCA
CCATCTCTTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGACAACTACGGCATCTCCTTCATG
AACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTCGGCTGCTGATCTACGCCGC
TTCCAATCAGGGCTCTGGCGTGCCCGCTAGATTCTCCGGATCTGGCCCTGGCA
CCGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCATGGAACCCGAGGACTTCGCCATGTACT
TTTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTG
GAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGA
CGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCT
ACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGG
CAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCC
TGTCCTCCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTAC
GCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCTTTCAA
CCGGGGCGAGTGCACTAGTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGA
GGGGGAGGATCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGGCGGAGTGGTGCAGC
CTGGCAGATCCCTGAGACTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCCGG
TACACCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGTGCCTGGAATGGATCGG
CTACATCAACCCCTCCCGGGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACC
GGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCGCCTTTCTGCAGATGGAC
TCCCTGCGGCCTGAGGATACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGGTACTACGACGA
CCACTACTCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCCTGTGACAGTGTCATCTG
GTGGCGGAGGAAGTGGGGGAGGCGGATCAGGTGGTGGTGGATCAGGCGGGG
GAGGTTCAGGGGGTGGCGGTTCTGGGGGAGGGGGCTCTGATATTCAGATGACT
CAGAGCCCTTCCAGCCTGAGCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTGACAATTACCTG
CTCTGCCTCCTCCTCCGTGTCTTACATGAATTGGTATCAGCAGACCCCTGGGAA
GGCTCCTAAGCGGTGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCCA
GCAGGTTTTCTGGCTCCGGCAGCGGCACAGATTATACCTTCACCATCAGCTCC
CTGCAGCCAGAAGATATCGCTACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCCTCCAACCC
TTTCACCTTCGGCTGCGGCACAAAGCTGCAGATCACAAGA
SEQ ID NO:26-BiClone133轻链氨基酸序列(前导序列轻链以下划线表示)
MGWSCIILFLVATATGEIVLTQSPATLSVSLGERATISCRASESVDNYGISFMNWFQ
QKPGQPPRLLIYAASNQGSGVPARFSGSGPGTDFTLTISSMEPEDFAMYFCQQSKE
VPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW
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KAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTF
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编码示例性重链和示例性融合多肽二者的DNA是密码子优化的，并且被插入哺乳动物表达载体中，转染至CHO-S细胞，并选择高表达的稳定克隆。从摇瓶中收集上清液并在蛋白A亲和色谱上纯化。
示例性CD33 BsAb的生物化学纯度分析如图1B所示。在多次冷冻和解冻循环之后，SDS-PAGE和SEC-HPLC表明示例性CD33 BsAb仍然是稳定的(数据未示出)。
示例性CD33-BsAb的一些优点包括：
避免了胞啃作用和非特异性网状内皮去除：示例性CD33-BsAb通过其Fc结构域中的点突变(N297A)来发生无糖基化。因此，消除了与CD16(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA)的非特异性结合。可以设想，这避免了CD3胞啃作用，所述胞啃作用可能对T细胞是有害的。在不存在FcR结合的情况下，对BsAb的竞争更少，因此向T细胞和肿瘤细胞的BsAb定量递送更多。这还与K322A突变一起，消除了补体结合。在不存在与Fc的结合以及不存在补体活化的情况下，细胞因子释放综合征大大减少。
易于亲和纯化：示例性CD33-BsAb对蛋白A和蛋白G具有完整的亲和力，因此在制造期间易于纯化。
实施例2–示例性CD33-BsAb的体外活性
本实施例描述了呈IgG-scFv形式的示例性CD33-BsAb的体外活性。具体而言，本实施例描述了示例性CD33-BsAb抗体药剂特异性结合CD33表达细胞以及介导细胞特异性T细胞杀死的能力。
CD33-BsAb(Biclone 133)结合T细胞
通过FACS免疫染色来测试示例性CD33-BsAb抗体药剂与靶细胞的结合。CD33-BsAb(Biclone 133)结合CD33(+)AML细胞系U937、MV-4-11、MOLM13和M-07e，但不结合CD33(-)白血病细胞系MOLT4和CMLT1(图2)。
CD33-BsAb介导白血病抗原特异性T细胞细胞毒性
为了评估示例性CD33-BsAb抗体药剂是否可以重定向T细胞，从而杀死白血病细胞，在标准4小时51Cr释放测定中测试针对CD33(+)AML细胞的T细胞细胞毒性。当存在CD33-BsAb(Biclone 133)时，观察到AML细胞系被基本上杀死，EC50低至1.1pM(对于HL60 AML细胞)。CD33(-)白血病细胞未受影响(图3)。
CD33-BsAb重定向具有FLT3/ITD突变的人类白血病细胞系的T细胞杀死
有充分的文献证明，具有FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)内部串联重复(ITD)突变(FLT3/ITD)的患者的预后较差。在儿童AML中，这些突变的负面影响更为明显(Levis M,Leukemia 17:1738-52,2003)。为了评估示例性CD33-BsAb抗体药剂是否可以使T细胞重定向具有FLT3/ITD突变的AML，使用含有该突变的MOLM13 AML细胞系。如图4所示，CD33特异性BsAb裂解MOLM13细胞，EC50为2.4pM。
实施例3–示例性CD33-BsAb的体内活性
本实施例描述了呈IgG-scFv形式的示例性CD33-BsAb的体内活性。具体而言，本实施例描述了示例性CD33-BsAb抗体药剂在AML的异种移植模型中的功效。
在人源化小鼠中CD33-BsAb对含有FLT3/ITD突变的人类AML细胞的功效
对于体内疗法研究，使用NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠。将小鼠随机分为5组，所有小鼠都接受100万个含有萤火虫荧光素酶基因的MOLM13细胞：1.未处理；2.仅CD33-BsAb；3.仅活化的T细胞(ATC)；4.ATC(iv，静脉内注射)/CD33-BsAb；以及5.ATC(ip，腹膜内注射)/CD33-BsAb。当建立白血病时，在第6天开始治疗。小鼠每周接受1000万个ATC的注射持续三周。在T细胞注射之前一天和之后一天施用BsAb(100ug/小鼠)。为了支持体内T细胞生长，每周两次皮下施用1000IU白介素-2。每周进行生物发光成像以评估白血病负荷。如图5所示，在存在BsAb的情况下施用ATC治疗白血病小鼠。ATC的腹膜内施用和静脉内都有效。重要的是，ATC或BsAb的单独施用不能抑制肿瘤生长。当不再能够通过成像检测到肿瘤信号时，通过完全尸检来评估小鼠。未检测到留下白血病细胞。
在人源化小鼠中CD33-BsAb对晚期人类AML的功效
为了研究CD33-BsAb是否可以治疗晚期AML，给NSG小鼠接种100万个MOLM13白血病细胞。从白血病注射后7天开始，通过每周静脉内注射1000万个人类ATC持续3周来治疗小鼠，在白血病注射后28天，通过每周注射100ug/剂的BsAb 2次持续四周来治疗小鼠。如图6所示，在BsAb施用后迅速治疗白血病。
在人源化小鼠中低剂量的CD33-BsAb对人类AML的功效
为了研究低剂量的BsAb的治疗效果，NSG小鼠接受100万个MOLM13 AML细胞。6天后，将小鼠随机分为4组。1.仅ATC；2.ATC/BsAb 100μg/小鼠；3.ATC/BsAb30μg/小鼠；以及4.ATC/BsAb 10μg/小鼠。腹膜内注射ATC。为了支持体内T细胞生长，每周两次皮下施用1000IU白介素-2。当建立白血病时，在第6天开始治疗。小鼠每周接受1000万个ATC的注射持续三周。在T细胞注射之前一天和之后一天施用BsAb(如上所述的不同剂量)。每周进行生物发光成像以评估白血病负荷。如图7所示，仅治疗接受BsAb和ATC二者的小鼠，而在仅ATC组中白血病会生长。重要的是，即使10ug BsAb也与100ug抗体一样有效。
所以，示例性CD33-BsAb展示出令人惊讶的体内功效。例如，示例性CD33-BsAb实现了携带人类白血病细胞系的动物的体内治愈，即使在白血病负荷很大的情况下。此外，示例性CD33-BsAb的PK与IgG的相似。这可以降低治疗剂量，减少注射频率(参见图7)。
针对人类AML的示例性CD33-BsAb在非常低的剂量下在体内是有效的。
为了测试示例性CD33-BsAb抗体药剂(CD33-CD3 IgG-scFv)的体内效力，通过静脉内注射携带FMS样酪氨酸激酶内部串联重复(FLT3-ITD)突变的荧光素酶(+)MOLM13AML细胞来建立NSG小鼠的异种移植物。用抗CD3/CD28包被的微珠来活化人类外周血T细胞，持续7天，并从白血病移植后七天开始每周注射一次，持续三周。将在每次T细胞施用之前一天和之后一天注射的示例性CD33-CD3 IgG-scFv的剂量从100μg/剂向下滴定至0.01μg/剂。虽然示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)或T细胞单独的注射不会引起显著的抗肿瘤作用，但是示例性CD33-BsAb抗体药剂(BsAb)的所有测试浓度与人类T细胞组合能够抑制白血病生长，包括0.1μg/剂BsAb的最低浓度与人类T细胞的组合。值得注意的是，在存在人类T细胞的情况下(正如最高浓度那样)，1μg/剂BsAb是能够治愈的(参见，图8A和图8B)。因此，这些数据证实，与T细胞组合施用的示例性CD33-BsAb抗体药剂(CD33-CD3 IgG-scFv)可以在宽泛的浓度范围内有效地减少体内癌症负荷。虽然使用小鼠模型对给药进行了描绘，但是本领域的技术人员已知的标准方法可以用于将动物研究扩展至人类，例如计算调整剂量的方法等。
实施例4–CD33-BsAb的四价提高了效力
本实施例分析了效价对示例性双特异性抗体药剂CD33-CD3 IgG-scFv的效力的作用。虽然已经设计出具有不同生物学性质的双特异性抗体平台，并且一些平台甚至已经进入临床，但是仍然需要有效的T细胞接合疗法(Wu Z,Cheung NV.T cell engagingbispecific antibody(T-BsAb):from technology to therapeutics.PharmacolTher.2017)。然而，与大多数双特异性抗体平台不同的是，本公开涵盖以下认识：四价(2+2)IgG(L)-scFv双特异性抗体可以具有有利的特征。示例性CD33-CD3 IgG-scFv具有两个针对靶细胞上的CD33的结合臂和两个针对T细胞上的CD3的结合臂。为了研究效价的相关性，使用受控Fab臂交换方法来产生二价(1+1)基于IgG的CD33-CD3双特异性抗体药剂(“异源二聚体”)。(Labrijn AF,Meesters JI,Priem P等人,Controlled Fab-arm exchange for thegeneration of stable bispecific IgG1.Nat Protoc.2014；9(10):2450-2463)。_ENREF_2该CD33-CD3异源二聚体由两个针对CD3(huOKT3)和CD33(huM195)的半IgG分子组成，这两个半IgG分子优先配对形成IgG异源二聚体双特异性抗体。为了比较示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)和异源二聚体的效力，在杀死测定中使用THP1和MOLM13细胞。如图9所示，示例性CD33-CD3 IgG-scFv介导的THP1和MOLM13 AML细胞的TDCC的效力比异源二聚体介导的大12倍。然后，在体内比较示例性CD33-CD3 IgG-scFv(BsAb)和对应的异源二聚体。将MOLM13细胞静脉内移植到NSG小鼠中，在第六天用极低剂量的BsAb(0.1μg/小鼠/剂)+活化的T细胞进行处理。通过生物发光(以总通量(单位为p/s)表示)来监测肿瘤生长。虽然T细胞和异源二聚体的组合在肿瘤抑制方面相对无效，这与单独T细胞组高度相似，但是示例性CD33-CD3IgG-scFv(BsAb)+T细胞显著减缓了白血病生长(图10，A和B)。总体而言，这些数据支持四价IgG(L)-scFv相对于对应的二价IgG异源二聚体而言具有增强的效力。
实施例5–示例性CD33-BsAb与IL2的共施用改善了功效
本实施例分析了示例性双特异性抗体药剂CD33-CD3 IgG-scFv与细胞因子IL2组合施用的作用。由于活化的T细胞在存在IL2的情况下进行培养，因此测试了在T细胞施用之后IL2的进一步施用是否能够改善功效。结果显示，经由示例性CD33-CD3 IgG-scFv重定向的T细胞在存在IL2的情况下具有改善的抗白血病作用，这表明该细胞因子对体内T细胞功能具有有利的作用(图11)。
实施例6–示例性CD33-BsAb对髓外白血病的功效
本实施例证实了示例性双特异性抗体药剂在治疗甚至是难以治疗的肿瘤中的功效。髓外白血病(EM-白血病)目前是很难有效治疗的。EM-白血病包括很多通常会引起治疗困境的临床上显著的现象。骨髓性肉瘤(MS)和皮肤白血病(LC)代表两种EM白血病表现。EM累及的基本分子机制尚不清楚，并且EM累及的预后意义尚未完全了解。所以，很难确定对患有EM-白血病(诸如MS或LC)的患者的最佳治疗。
通过皮下移植MOLM13细胞来产生EM-白血病模型。从白血病移植后七天开始每周一次腹膜内注射新鲜的人类PBMC，并且在每次T细胞施用之前一天和之后一天注射示例性双特异性抗体药剂。在该模型中，PBMC在浸润皮下肿瘤部位之前必须通过血流从腹膜腔转运。在未经治疗的或单独PBMC对照组中，肿瘤在白血病移植后的前四周内迅速增长，超过了需要对动物实施安乐死的体积2000mm3。在治疗组中，在初始急速生长后，在用PBMC和示例性双特异性抗体药剂二者治疗的动物(PBMC/BsAb组)中产生快速消退(图12A)。为了测试示例性双特异性抗体药剂对其他AML异种移植物的功效，皮下注射THP1和HL60细胞系，并且在一周后用含有或不含有示例性双特异性抗体药剂(BsAb)的PBMC进行治疗。示例性双特异性抗体药剂重定向的PBMC显著减缓了白血病生长，而单独的PBMC只有最小的或没有抗肿瘤作用(图12B和图12C)。
实施例7–CD33内化不损害CD33-BsAb功能
本实施例记录了本文提供的某些CD33-BsAb的令人惊讶的内化、功效和(有限)副作用特征。
CD33是内化的，并且将在抗体结合后损害效应细胞的接合。虽然该现象对于抗体-药物缀合物是有利的，但是可以使CD33双特异性抗体药剂变得无效。此外，一般认为必须维持对CD33(例如，BiTE或异源二聚体)的单价，因为CD33的交联可以加速其内吞作用。因此，评估了效价对内吞率的作用。在37C°或4C°下用huM195(对CD33二价)(示例性CD33-CD3IgG-scFv(对CD33二价))或异源二聚体对MOLM13 AML细胞进行染色(延迟内化)。在4C°下，虽然CD33-CD3 IgG-scFv与CD33的结合和huM195与CD33的结合是相当的，但是异源二聚体与CD33的结合几乎少两倍(图13，A)。在37C°下，huM195和异源二聚体二者均在染色后的前4小时内导致CD33的内化，虽然huM195的内化比异源二聚体的更强(图13B)。在相同的条件下，示例性CD33-CD3 IgG-scFv的行为与异源二聚体相同，结果完全出乎意料。有趣的是，示例性CD33-CD3 IgG-scFv与CD3的结合比huOKT3与CD3和异源二聚体与CD3的结合弱27倍和2.5倍(图13，C)。虽然预期示例性CD33-CD3 IgG-scFv与CD3的这种低结合会降低细胞因子释放综合征的可能性，但是出乎意料的是，据发现示例性四价CD33-CD3 IgG-scFv在TDCC中比异源二聚体更有效(图9)。在体内T细胞施用前一天注射示例性CD33-CD3 IgG-scFv。在这些条件下，预期会发生内化；然而，体内抗AML作用仍然很强，这表明残留的CD33表面表达(对于MOLM13细胞系为20％)足以发挥示例性CD33-CD3 IgG-scFv的抗白血病功能。
实施例8–CD33不在脐带血造血干细胞(HSC)上表达
CD33被认为是骨髓谱系特异性标志物，并且用抗CD33抗体的治疗可能会损害长期造血功能，这可能会限制治疗潜力。(Hauswirth AW,Florian S,Printz D等人,Eur J ClinInvest.2007；37(1):73-82&Taussig DC,Pearce DJ,Simpson C等人,Blood.2005；106(13):4086-4092)。当用示例性抗CD33 BsAb对脐带血CD34+细胞进行染色时(图14，A)，几乎所有CD34(+)CD38(-)HSC都是阴性的，而所有CD34(+)CD38(+)造血祖细胞(HPC)都是阳性的。即使对于HPC，CD33的表达也比骨髓细胞上的表达低20倍以上。在标准铬释放测定中测试从脐带血分离的CD34(+)细胞对TDCC的灵敏度。与示例性CD33-CD3 IgG-scFv裂解的MOLM13细胞相比，CD34(+)群体对TDCC相对不灵敏(图14，B)。在高浓度(1μg/ml)示例性CD33-CD3 IgG-scFv下观察到的低水平杀死(<5％)可以是残留的CD34(-)CD33(+)群体产生的，(该群体上的CD33表达大于CD34(+)CD38(+)造血祖细胞上的CD33表达(图14，C)。
因此，这些数据证实，本公开的示例性CD33-CD3 IgG-scFv表现出强大的体外和体内功效，具有可以为治疗上有利的出乎意料的特征和性质。
等同形式
除非明确指明相反，否则说明书和权利要求中的冠词“一个”和“一种”应理解为包括复数指代物。在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本发明包括这样的实施方案，其中该组的正好一个成员存在于、用于或以其他方式与给定的产物或过程有关。本发明还包括这样的实施方案，其中多于一个或整个组成员存在于、用于或以其他方式与给定的产物或过程相关。此外，应当理解的是，本发明涵盖所有的变化，组合和置换，其中来自一个或多个列出的权利要求的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等被引入到从属于相同的基础权利要求的另一个权利要求(或相关的任何其他权利要求)中，除非另外指出或者除非对于本领域的普通技术人员来说显而易见会出现矛盾或不一致。在要素以列表的形式呈现的情况下(例如以马库什组或类似形式)，应该理解的是，要素的每个子组也被公开，并且任何要素都可以从组中移除。应当理解，通常，在本发明或本发明的多个方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，本发明的某些实施方案或本发明的多个方面由这些元素、特征等组成或基本上由这些元素、特征等组成。为了简单的目的，这些实施方案在每种情况中都没有在此用许多单词具体阐述。还应该理解的是，本发明的任何实施方案或方面可以明确地从权利要求书中排除，而不管在说明书中是否列举了特定的排除。为了描述本发明的背景并提供关于本发明实践的附加细节而在此引用的出版物、网站和其他参考材料由此以引入方式入。

Claims (30)

1.一种双特异性抗体药剂，所述双特异性抗体药剂包含两个相同的免疫球蛋白重链和两个相同的融合多肽，其中每个重链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的重链可变结构域序列，以及其中每个融合多肽包含：
(i)免疫球蛋白轻链，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的轻链可变结构域序列，和
(ii)单链可变片段，
其中所述重链和所述融合多肽轻链结合至CD33，并且其中所述融合多肽单链可变片段结合至CD3。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述重链各自包含已鉴定为SEQ IDNO:9的序列。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述融合多肽轻链包含已鉴定为SEQID NO:10的轻链序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述单链可变片段融合至所述免疫球蛋白轻链的C-末端。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述融合多肽还包含接头。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述融合多肽包含含有已鉴定为SEQID NO:11-SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27中的任一者的序列的单链可变片段。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述重链包含具有一个或多个选自K322A和D265A的突变的Fc区。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述重链各自包含已鉴定为SEQ IDNO:24的序列。
9.根据权利要求1所述的双特异性抗体药剂，其中所述融合多肽各自包含已鉴定为SEQID NO:26的序列。
10.一种编码权利要求1所述的双特异性抗体药剂的分离的核酸，其中所述分离的核酸是单一分子，其编码所述免疫球蛋白重链和所述融合多肽；或者是两个单独的分子，一个编码所述免疫球蛋白重链和另一个编码所述融合多肽。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中编码所述免疫球蛋白重链的核酸序列具有SEQ ID NO:23所示的序列以及编码所述融合多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:25所示的序列。
12.一种重组载体，所述重组载体包含根据权利要求10或权利要求11所述的分离的核酸。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求12所述的重组载体。
14.一种用于产生根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂的方法，所述方法包括以下步骤：在允许所述抗体或其片段表达的条件下在培养基中培养根据权利要求13所述的宿主细胞，以及从所述培养基分离所述抗体或其片段。
15.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求15所述的组合物，并且还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
17.一种根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂在制备用于治疗有需要的受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自：急性骨髓性白血病、双表型白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓单核细胞白血病、慢性骨髓性白血病的髓性急变和急性淋巴细胞白血病。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗还包括施用活化的T细胞的制备物。
19.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗还包括施用IL2。
20.一种T细胞，所述T细胞用根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂武装。
21.一种T细胞群，所述T细胞群用根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂武装。
22.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求21所述的T细胞群。
23.一种嵌合抗原受体，其包含结合域，所述结合域包含根据权利要求1至权利要求9中任一项所述的双特异性抗体药剂。
24.一种嵌合抗原受体-T细胞，其表达根据权利要求23所述的嵌合抗原受体。
25.一种群体，其特征在于所述群体包含根据权利要求24所述的嵌合抗原受体-T细胞。
26.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求25所述的嵌合抗原受体-T细胞的群体。
27.一种嵌合抗原受体-NK细胞，其表达根据权利要求23所述的嵌合抗原受体。
28.一种群体，其特征在于所述群体包含根据权利要求27所述的嵌合抗原受体-NK细胞。
29.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求28所述的嵌合抗原受体-NK细胞的群体。
30.一种根据权利要求22、权利要求26和权利要求29中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自：急性骨髓性白血病、双表型白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓单核细胞白血病、慢性骨髓性白血病的髓性急变和急性淋巴细胞白血病。
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