CN116867806A - 人cd33抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种抗CD33的抗体及其制备方法和应用。所述抗CD33抗体与CD33蛋白具有高度亲和力，因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。

Description

人CD33抗体及其用途
本申请要求于2021年2月10日提交中国专利局、申请号为202110182902.1、发明名称为“人CD33抗体及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本发明属于生物工程、生物医药领域；涉及人CD33抗体，编码其的核酸，抗体制备方法，含有所述抗体的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。
背景技术
在1980年代早期，Andrews等人将CD33鉴定为骨髓性白血病的标记(Blood 62，24-132，1983)。CD33是在包括骨髓性白血病细胞在内的髓系细胞上特异性表达的细胞表面抗原。其为唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(涎免凝集素，sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)家族的最小成员。CD33分子量为67kDa，由364个氨基酸组成的I型跨膜受体蛋白。其N-端位于胞外，末端氨基酸组成一个保守的V-set免疫球蛋白样结构域和一个可变的C2-set结构域，其中V-set与唾液酸特异性识别并结合；胞质尾端有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和一个ITIM样结构，通过与酪氨酸磷酸酶结合向胞内传递抑制性信号，从而达到调节细胞生长的目的。CD33分子中的ITIM序列与其他Siglec不同，其酪氨酸前面的疏水氨基酸被亮氨酸和苏氨酸取代。对其一级结构分析可知，各种生物中CD33分子具有高度保守性。
CD33在早期多谱系造血祖细胞及骨髓单核细胞前体上表达。在多潜能造血干细胞中无表达(Andrews等人，Journal of Experimental Medicine169,1721-1731,1989)。其表达在成熟粒细胞上下调，但保留于巨噬细胞、单核细胞及树突细胞上(Andrews等人，Blood62，24-132，1983)。除骨髓单核细胞性细胞外，Valent等人发现CD33亦可在人类肥大细胞及血液嗜碱性粒细胞上表达(Blood15,73(7):1778-85,1989)。
CD33结合唾液酸的细胞外结构域参与细胞与细胞之间的黏着。细胞内免疫受体酪氨酸基抑制基元(ITIM)赋予细胞抑制信号，从而影响增生及细胞存活。对CD33的实际信号传导路径尚缺乏了解，但von Gunten等人认为其涉及ITIM及ITIM样基序及酪氨酸磷酸酶的募集(Ann.N.Y.Acad.Sci.1143:61-82,2008)。Brinkman-Van der Linden等人已经定义鼠类CD33同源基因，但其与人类CD33的功能可比性仍受到质疑(Mol Cell Biol.,23(12):4199-206,2003)。人类CD33对正常及恶性白细胞的功能作用仍未知。
若干出版物已阐述CD33是70％至100％测试患者在原代AML及CML细胞上表达的稳定的细胞表面标记(Plesa等人，Cancer112(3),572-80,2007；Hauswirt等人，Eur J ClinInvest.Jan73-82,2007；Scheinberg等人，Leukemia，第3卷，440-445,1989)。CD33在恶性髓系母细胞(其代表白血病患者的外周血及骨髓中的大多数恶性细胞)及白血病干细胞(即骨髓中的相对较少数量的低分化细胞，其特征在于其能自我更新并维持白血病纯系 层级)上表达，而仅在部分正常的造血干细胞表达低水平的CD33。在炎症及免疫应答过程中，CD33可调控白细胞的功能，因此CD33是治疗急性髓系白血病的理想靶点。
纳米抗体(Nanobody，Nb)是一种只含有单个结构域的基因工程抗体。1993年比利时科学家Hamers-Casterman C在骆驼血液中发现一种只含重链不含轻链的天然重链抗体(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,et al.Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature.363(6428):446–8(1993))，重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力。克隆骆驼体内重链抗体的可变区后，得到的仅由一个重链可变区组成的单域抗体(single domain antibody，sdAb)，称为纳米抗体或VHH抗体(variable heavy chain domain of a heavy chain antibody)。纳米抗体不仅分子量只是普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易，肿瘤组织穿透性高，且容易偶联其它分子。因此纳米抗体技术在治疗性抗体领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供能够结合人CD33的抗体或抗原结合片段，编码其的核酸、载体、细胞，抗体或抗原结合片段的制备方法，含有所述抗体或抗原结合片段的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。
在第一个方面，本发明提供了一种特异性结合CD33的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
(1)所述CDR1可选自SEQ ID NO：29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、226、227；
(2)所述CDR2可选自SEQ ID NO：30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、229、230；
(3)所述CDR3可选自SEQ ID NO：31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、228；
各个CDR1、CDR2和CDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码；
优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，所述CDR1、CDR2和CDR3分别包含选自SEQ ID NO:11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的CDR1、CDR2和CDR3；
优选地，根据KABAT、Chothia或IMGT编号系统，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3：
(1)所述CDR1选自SEQ ID NO：29、83、137，所述CDR2选自SEQ ID NO：30、84、138，所述CDR3选自SEQ ID NO：31、85、139；
(2)所述CDR1选自SEQ ID NO：32、86、140，所述CDR2选自SEQ ID NO：33、87、141，所述CDR3选自SEQ ID NO：34、88、142；
(3)所述CDR1选自SEQ ID NO：35、89、143、226、227，所述CDR2选自SEQ ID NO：36、90、144，所述CDR3选自SEQ ID NO：37、91、145；
(4)所述CDR1选自SEQ ID NO：38、92、146，所述CDR2选自SEQ ID NO：39、93、147，所述CDR3选自SEQ ID NO：40、94、148；
(5)所述CDR1选自SEQ ID NO：41、95、149，所述CDR2选自SEQ ID NO：42、96、150、229，所述CDR3选自SEQ ID NO：43、97、151、228；
(6)所述CDR1选自SEQ ID NO：44、98、152，所述CDR2选自SEQ ID NO：45、99、153，所述CDR3选自SEQ ID NO：46、100、154；
(7)所述CDR1选自SEQ ID NO：47、101、155，所述CDR2选自SEQ ID NO：48、102、156，所述CDR3选自SEQ ID NO：49、103、157；
(8)所述CDR1选自SEQ ID NO：50、104、158，所述CDR2选自SEQ ID NO：51、105、159，所述CDR3选自SEQ ID NO：52、106、160；
(9)所述CDR1选自SEQ ID NO：53、107、161，所述CDR2选自SEQ ID NO：54、108、162、230，所述CDR3选自SEQ ID NO：55、109、163；
(10)所述CDR1选自SEQ ID NO：56、110、164，所述CDR2选自SEQ ID NO：57、111、165，所述CDR3选自SEQ ID NO：58、112、166；
(11)所述CDR1选自SEQ ID NO：59、113、167，所述CDR2选自SEQ ID NO：60、114、168，所述CDR3选自SEQ ID NO：61、115、169；
(12)所述CDR1选自SEQ ID NO：62、116、170，所述CDR2选自SEQ ID NO：63、117、171，所述CDR3选自SEQ ID NO：64、118、172；
(13)所述CDR1选自SEQ ID NO：65、119、173，所述CDR2选自SEQ ID NO：66、120、174，所述CDR3选自SEQ ID NO：67、121、175；
(14)所述CDR1选自SEQ ID NO：68、122、176，所述CDR2选自SEQ ID NO：69、123、177，所述CDR3选自SEQ ID NO：70、124、178；
(15)所述CDR1选自SEQ ID NO：71、125、179，所述CDR2选自SEQ ID NO：72、126、180，所述CDR3选自SEQ ID NO：73、127、181；
(16)所述CDR1选自SEQ ID NO：74、128、182，所述CDR2选自SEQ ID NO：75、129、183，所述CDR3选自SEQ ID NO：76、130、184；
(17)所述CDR1选自SEQ ID NO：77、131、185，所述CDR2选自SEQ ID NO：78、132、186，所述CDR3选自SEQ ID NO：79、133、187；
(18)所述CDR1选自SEQ ID NO：80、134、188，所述CDR2选自SEQ ID NO：81、 135、189，所述CDR3选自SEQ ID NO：82、136、190；或，
(19)与上述(1)～(18)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:11～28或193～223中的CDR1、CDR2和CDR3序列组合；或，其包含与上述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
在一些实施例中，优选地，所述抗体或抗原结合片段其与人CD33结合的解离常数(KD)不大于100nM；与猴CD33结合的解离常数(KD)不大于100nM。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：191所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段为：(1)嵌合抗体或其片段；(2)人源化抗体或其片段；或，(3)全人源抗体或其片段。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素 (doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes)。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、或细胞因子。
在第二个方面，本发明提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合CD33以外的抗原或结合与第一方面所述抗体或抗原结合片段不同的CD33表位的抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，优选地，所述CD33以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CS32B；PD-1；PD-2；PD-L1；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；MSLN；HER2；HER3；HSA；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
在一些实施例中，优选地，所述多特异性抗体可为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
在第三个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含任选自第一方面所述抗体或抗原结合片段。
在第四个方面，本发明提供一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体，或包含编码第三方面所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第五个方面，本发明提供能够编码上述第一方面抗体或抗原结合片段，第二方面所述多特异性抗体，或第三方面所述的嵌合抗原受体的分离的核酸片段。
在第六个方面，本发明提供包含第五方面所述分离的核酸片段的载体。
在第七个方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述第六方面所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第八个方面，本发明还提供一种抗体或抗原结合片段、或多特异性抗体的制备方法，所述方法包括培养上述第七方面所述细胞，以及在适合的条件下分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
在第九个方面，本发明还提供一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码第三方面所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达第三方面所述CAR。
在第十个方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免 疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第十一个方面，本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物。所述肿瘤优选骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。
在第十二个方面，本发明提供一种任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。
在第十三个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品。
在第十四个方面，本发明提供一种体外抑制表达CD33细胞增殖或迁移的方法，其特征在于，在任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段与CD33之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段接触。
术语和定义：
除非另外说明，本发明所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本发明中明确定义的术语，则该术语的含义以所述定义为准。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
本文术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必然发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着抗体重链可变区可以但不必须存在；存在时，可以是1个，2个或3个。
本文术语“CD33”是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(涎免凝集素，sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)家族的最小成员。分子量为67kDa，由364个氨基酸组成的I型跨膜受体蛋白。其N-端位于胞外，末端氨基酸组成一个保守的V-set免疫球蛋白样结构域和一个可变的C2-set结构域，其中V-set与唾液酸特异性识别并结合；胞质尾端有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和一个ITIM样结构，通过与酪氨酸磷酸酶结合向胞内传递抑制性信号，从而达到调节细胞生长的目的。CD33分子中的ITIM序列与其他Siglec不同，其酪氨酸前面的疏水氨基酸被亮氨酸和苏氨酸取代。对其一级结构分析可知，各种生物中CD33分子具有高度保守性。术语“CD33”包括任何人类和非人类动物物种的CD33蛋白，并且具体地包括人类CD33以及非人类哺乳动物的CD33。
本文术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10 -7M或更低、约10 -8M或更低、约1×10 -9M或更低、约1×10 -10M或更低、1×10 -11M或更低或1×10 -12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
本文术语“抗原结合分子”按最广义使用，是指特异性结合抗原的分子。示例性地，抗原结合分子包括但不限于抗体或抗体模拟物。“抗体模拟物”是指能够与抗原特异性结合，但与抗体结构无关的有机化合物或结合域，示例性地，抗体模拟物包括但不限于affibody、affitin、affilin、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、核酸适体或Kunitz型结构域肽。
本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性。本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。
本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分 为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
本文术语“重链抗体”是指已知在骆驼科物种中天然存在的第二种类型的抗体，该抗体天然缺失轻链和CH1恒定区。重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)由共价二硫键连接的两条重链组成。HCAb中每条重链的一端具有可变结构域。为将它们与骆驼科动物“常规”抗体重链的可变结构域(VH)区分开，HCAb的可变结构域被称为“VHH”。VHH结构域与VH结构域完全不同，它们由骆驼科动物基因组中的不同基因区段编码。
本文术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用，是指克隆重链抗体的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见：Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8；Muyldermans的综述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74：277-302，2001)；以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab) 2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段； (V)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546,1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；(ix)由VHH和CH2、CH3组成的重链抗体片段；以及(x)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是通过独立的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过接头接合，该接头能够使其制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242:423-426,1988以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
本文术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
本文术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。
本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。
本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。示例性地，所述“抗原结合片段”和“抗体片段”可以为单域抗体。
本文术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的 可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定义方式的氨基酸残基的重叠(overlap)和子集。
本文术语“Kabat编号系统”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统， 其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
本文术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地，人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此,通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域，可选地，在此基础上还可包含完整或部分铰链区，但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”，knob)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”，hole)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的，此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此 的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文术语“百分比(％)序列一致性”与“百分比(％)同一性”可以互换使用，是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
本文术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
本文术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本发明的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行 化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
本文术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本文术语“宿主细胞”是指细胞中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，以及表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。宿主细胞在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
本文术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
本文术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、牛、绵羊、马和野牛等。
本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度 减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
附图说明
下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案。
图1.人CD33-V-his、CD33-C2-his蛋白样品SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测结果：1-hCD33-V-his(非还原)；2-hCD33-V-his(还原)；3-hCD33-C2-his(非还原)；4-hCD33-C2-his(还原)；M-marker。
图2A.ELISA检测对照抗体与人CD33-his蛋白的结合反应。
图2B.ELISA检测对照抗体与人CD33-V-his蛋白的结合反应。
图2C.ELISA检测对照抗体与人CD33-C2-his蛋白的结合反应。
图3.SGN-33抗体检测U937细胞CD33表达量的FACS结果。
图4.人CD33蛋白转染的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果。
图5.猴CD33蛋白转染的HEK293T细胞FACS筛选检测结果。
图6A.ELISA检测人CD33蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况。
图6B.FACS检测人CD33蛋白免疫后羊驼血清抗体效价情况。
图7A、7B.ELISA检测VHH抗体与人CD33-his蛋白的结合反应。
图8A、8B.FACS检测VHH抗体与CHO-K1-人CD33的结合反应。
图8C、8D.FACS检测VHH抗体与U937的结合反应。
图9A、9B.ELISA检测VHH抗体与鼠CD33-His蛋白的结合反应。
图9C、9D.ELISA检测VHH抗体与猴CD33-His蛋白的结合反应。
图10A、10B.FACS检测VHH抗体与HEK293T-猴CD33的结合反应。
图11A、11C.ELISA检测VHH抗体与人CD33-V-his蛋白的结合反应。
图11B、11D.ELISA检测VHH抗体与人CD33-C2-his蛋白的结合反应。
图12A、12B.竞争性ELISA方法检测VHH抗体之间的抑制率。
图13A、13B.VHH抗体与Biotin-C33B904的ELISA竞争。
图14.VHH抗体的抗原表位分类。
图15A～15E.ELISA检测VHH人源化抗体与人CD33-his蛋白的结合反应。
图16A～16E、FACS检测VHH人源化抗体与CHO-K1-人CD33的结合反应。
图17A～17E、FACS检测VHH人源化抗体与U937的结合反应。
图18A～18E、ELISA检测VHH人源化抗体与鼠CD33-his蛋白的结合反应。
图18F～18J、ELISA检测VHH人源化抗体与猴CD33-his蛋白的结合反应。
图19A～19E、FACS检测VHH人源化抗体与HEK293T-猴CD33的结合反应。
图20A～20E、ELISA检测VHH人源化抗体与人CD33-V-his蛋白的结合反应。
图20F～20J、ELISA检测VHH人源化抗体与人CD33-C2-his蛋白的结合反应。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，本文中附图是为了举例说明本发明的一些优选的实施方案，然而，可以理解，本发明并不限于所公开的特定实施方案或看作对本发明范围的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：对照抗体制备、CD33蛋白制备
1.1对照抗体制备
CD33蛋白胞外有一个保守的V-set免疫球蛋白样结构域和一个可变的C2-set结构域，SGN-33和C33B904是识别人CD33的抗体，其中SGN-33的抗原结合表位位于V-set domain，C33B904的抗原结合表位位于C2-set domain。SGN-33的重链可变区和轻链可变区序列根据专利US 9453046获得，C33B904的重链可变区和轻链可变区序列根据专利US20190382481A1获得。将识别人CD33的抗体SGN-33的VH和VL以及人IgG1Fc按照从N端到C端的顺序连接，其中VH和VL之间通过3个GGGGS连接子连接，形成scFv-hFc的形式；将识别人CD33的抗体C33B904的VH和VL形成人IgG1的完整抗体形式。对应的氨基酸序列信息如下表1所示，斜体下划线表示抗体可变区序列。将其对应的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)，并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填 料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB,1M NaCl(pH 7.2)进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存。
表1.抗人CD33的抗体SGN-33和C33B904抗体序列信息
1.2人CD33-V-his和人CD33-C2-his蛋白的制备
编码人CD33蛋白的胞外区(ECD，extra-cellular domain)氨基酸序列Asp 18-His 259蛋白购自ACROBiosystems(货号：CD3-H5226)，命名为人CD33-his。
将编码带his标签的人CD33-V结构域(domain)Pro19-Ser135(SEQ ID NO：4)氨基酸序列和C2结构域(domain)Pro145-Gln228(SEQ ID NO：5)氨基酸序列的核苷酸序列分别克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，对应的氨基酸序列信息如下表2所示。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)并 使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人CD33蛋白V结构域和C2结构域的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap TMExcel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人CD33蛋白，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米滤膜无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的人CD33蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图1所示。
对上述CD33蛋白应用识别不同表位的阳性对照抗体进行ELISA检测，阴性对照抗体hIgG1为针对Hen Egg Lysozyme鸡卵溶菌酶的抗体anti-hel-hIgG1(购自百英，货号：B117901)。检测结果如表3-5以及图2A-2C所示，SGN-33和C33B904均能结合人CD33-his蛋白，SGN-33能结合人CD33-V-his蛋白，而C33B904能结合人CD33-C2-his蛋白，检测结果与文献报道的结合表位一致，说明已经制备获得具有上述结合活性的蛋白。
表2.人CD33蛋白胞外区、V-domain以及C2-domain氨基酸序列
表3.ELISA检测对照抗体与人CD33-his蛋白的结合反应
表4.ELISA检测对照抗体与人CD33-V-his蛋白的结合反应
表5.ELISA检测对照抗体与人CD33-C2-his蛋白的结合反应
实施例2:内源表达细胞株的鉴定和过表达细胞株的制备
2.1内源性表达CD33细胞株的鉴定
将U937细胞在T-25细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次。用含人Fc Block(购自BD，货号：564220)的缓冲液孵育15分钟，用SGN-33抗体作为一抗，APC标记的二抗(购自Biolegend，货号：409306)，用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果。分析结果如表6以及图3所示，U937细胞可与SGN-33结合。
表6.内源细胞系U937细胞的FACS检测结果
2.2 CHO-K1稳转人CD33单克隆细胞株的制备
编码人CD33全长氨基酸序列(NCBI：XP_011525834.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)。对CHO-K1细胞系(购自中国科学院上海生命科学研究院)进行质粒转染( 3000 Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含10μg/ml puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用SGN-33抗体作为一抗，Alexa Fluor 647标记的二抗(Jackson，货号：109605088)在流式细胞仪FACSAriaII(BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分单克隆进行扩增。对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。
具体选择结果如表7和图4所示，IgG亚型对照为人IgG对照。表7说明，已经制得一系列人CD33阳性表达的CHO-K1单克隆细胞系。图4中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。图4的结果说明，CHO-K1-人CD33B8、CHO-K1-人CD33B11以及CHO-K1-人CD33C8为人CD33高水平表达细胞株。
表7.人CD33蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
2.3HEK293T稳转猴CD33细胞株的制备
编码猴CD33全长氨基酸序列(NCBI：XP_014980179.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体(购自Thermofisher scientific)并制备质粒。对HEK293T细胞系用 HD(Promega，货号：#E2311)进行质粒转染后，在含10μg/ml puromycin的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。NB147为人CD33蛋白免疫羊驼后从血清中制得的多抗(由实施例3制得)，以NB147作为阳性对照对扩增后的克隆经流式细胞分析法进行筛选，选择长势较好、荧光强度较高的多克隆细胞系继续扩大培养并液氮冻存，如表8和图5所示，HEK293T细胞株经流式细胞分析显示经过puromycin筛选后过表达猴CD33的单一阳性细胞峰，可用于检测抗体的交叉活性。
表8.猴CD33蛋白的HEK293T稳转细胞系FACS检测结果
实施例3：针对CD33的单域抗体VHH的筛选
3.1羊驼的免疫和血清效价检测
选取两只羊驼(Llama)进行免疫，每只羊驼免疫四次，每次间隔3周，第一次，第二次免疫使用人CD33(Asp18-His259)-Pol-his蛋白购自ACROBiosystems(货号：CD3-H5226)，第三次免疫使用人CD33(Asp18-His259)-Fc(Pro100-Lys330)蛋白购自ACROBiosystems(货号：CD3-H5257)，第四次免疫使用实施例2中制备的CHO-K1-人CD33-B8。第三次免疫后和第四次免疫后采集外周血并分离血清，用酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞实验(FACS)检测血清中针对人CD33(hCD33)的抗体效价和特异性，结果如图6A-6B和表9所示。表9说明，经人CD33免疫的羊驼的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在五百九十万左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第三次(TB2，2nd-bleeding)和第四次(TB3，3rd-bleeding)免疫后第七天的羊驼血清，表中的数据为OD450nm值。NB147羊驼血清可以结合鼠CD33蛋白，可以作为后续交叉反应实验的阳性对照抗体。
表9.ELISA检测hCD33蛋白免疫后羊驼血清抗体效价
3.2文库的构建
采集七次免疫后的羊驼外周血共100mL；使用淋巴细胞分离液分离PBMC，并使用RNAiso Plus试剂(Takara，货号：#9108/9109)试剂提取总RNA，使用PrimeScript TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，货号：6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区核酸片段：
第一轮PCR：
上游引物：CTTGGTGGTCCTGGCTGC(SEQ ID NO：6)
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO：7)
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作为模板，
上游引物(SEQ ID NO：8)：
下游引物-1(SEQ ID NO：9)：
下游引物-2(SEQ ID NO：10)：
回收目标单域抗体核酸片段，并使用限制性内切酶SfiI(NEB，货号：R0123S)将其克隆进入噬菌体展示用载体pcomb3XSS(来自四川阿帕克生物科技有限公司)中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1(来自四川阿帕克生物科技有限公司)中，构建针对CD33的单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为3.4×10 9。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR。结果显示插入率达到100％。
3.3针对CD33单域抗体的淘选
用人CD33-Llama-Fc融合蛋白(ACROBiosystems，货号：CD3-H5259)0.5μg/孔包被平板，4℃放置过夜，第二天用3％BSA-PBS 37℃封闭1h后，加入100μl噬菌体展示文库，37℃孵育1h，之后用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次，以洗掉不结合的噬菌体。最后加入100μL Gly-HCl洗脱液，洗脱下来特异性结合CD33的噬菌体从而富集阳性的克隆。
3.4噬菌体酶联免疫方法筛选特异性单个阳性克隆
淘选后，将获得的CD33结合阳性的噬菌体感染空白大肠杆菌并铺板。随后挑选96个单菌落分别扩增培养。用CD33-his蛋白包被平板4℃过夜，将噬菌体培养上清加入，37℃孵育1小时。洗涤之后加入TMB显色液显色，于450nm波长测光密度。挑选CD33-his 阳性克隆进行测序。对测序结果使用MOE软件进行分析，根据VHH编码蛋白氨基酸序列构建进化树，根据序列相似性剔除在进化树上距离较近的序列后，筛选获得18个克隆，其序列的CDRs分别用KABAT、Chothia或IMGT软件分析，对应的序列信息如下表10所示。随后进行单域抗体的生产鉴定。
表10.筛选获得的VHH单域抗体序列信息
实施例4：VHH单域抗体的制备
4.1VHH单域抗体的表达纯化
由泰州市百英生物科技有限公司将VHH可变区序列重组到包含信号肽和人IgG1Fc(人IgG1Fc序列如SEQ ID NO：191，铰链区序列如SEQ ID NO：192)的表达载体BI3.4-huIgG1中，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将表达载体按照PEI(购自Polysciences，货号：24765-1)说明书瞬时转染HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有 限公司)并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下连续培养5天，离心去除细胞成分，获得含VHH单域抗体的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A层析柱(蛋白A填料AT Protein A Diamond和层析柱BXK16/26均购自博格隆，货号分别为：AA0273和B-1620)，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗后再用20mM PB，1M NaCl，pH 7.2进行清洗，最后使用pH3.4的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集从蛋白A层析柱上洗脱下来的带Fc标签的抗体，用1/10体积的pH8.0的1M Tris中和，用PBS在4℃条件透析过夜，透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存。
人IgG1Fc的序列(SEQ ID NO：191):
铰链区序列(SEQ ID NO:192)：EPKSADKTHTCPPCP
实施例5：VHH单域抗体的鉴定
5.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH抗体与CD33蛋白的结合
为了检测VHH-Fc与人CD33蛋白的结合活性，将人CD33-his蛋白(购自ACROBiosystems，货号：CD3-H5226)用PBS稀释到终浓度2μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBS洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入100nM梯度稀释的VHH-Fc抗体或阴性对照抗体50μl每孔。37℃孵育2小时后，用PBS洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma，货号：A0170)，37℃孵育1小时后，用PBS洗板5次。加入TMB底物50μl每孔。室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0N HCl)50μl每孔。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值，VHH-Fc与hCD33-his的ELISA结果如图7A、7B和表11、表12所示，表11、表12说明，纯化后的抗体均能与人CD33的蛋白在ELISA水平结合。其中IgG对照为hIgG1，表中的数据为OD450nm值。
表11.ELISA检测VHH-Fc抗体与人CD33蛋白的结合反应
表12.ELISA检测VHH-Fc抗体与人CD33蛋白的结合反应
5.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与不同CD33表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，对于贴壁细胞CHO-K1吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，然后用胰酶消化细胞，终止消化后用PBS缓冲液洗涤细胞2次；对于悬浮细胞U937直接离心弃去培养基上清，细胞沉淀用PBS洗涤2次,用含人Fc Block(购自BD，货号：564220)的缓冲液孵育15分钟。对上一步的细胞进行细胞计数后将细胞沉淀用[PBS+2％(w/w)BSA]封闭液重悬至2×10 6细胞每毫升，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，加入VHH-Fc抗体待测样品每孔50μl，冰上孵育2小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl Alexa Flour 488标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A-11013)，冰上孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤5次用FACS(FACS CantoTM，购自BD公司)检测和分析结果，得到细胞的平均荧光强度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50。分析结果如表13、14以及图8A-8D所示，VHH抗体均可结合U937细胞和CHO-K1-hCD33-B8细胞表面的人CD33蛋白(图8A-8D)，而与阴性细胞不结合。
表13.FACS检测VHH-Fc抗体与U937和CHO-K1-人CD33细胞的结合反应
表14.FACS检测VHH-Fc抗体与U937和CHO-K1-人CD33细胞的结合反应
实施例6：VHH-Fc抗体的种属交叉结合活性检测
6.1 ELISA检测VHH-Fc抗体与不同种属CD33蛋白的结合
为检测VHH-Fc抗体的种属交叉活性，将商品化的鼠CD33(Sino Biological，货号：90303-C08H)和猴CD33(Sino Biological，货号：50712-M08H)分别包被ELISA板，按照实施例5.1的方法进行ELISA检测。VHH-Fc抗体与鼠CD33的ELISA结果如图9A-9B和表15、16所示，VHH-Fc抗体与猴CD33的ELISA结果如图9C、9D和表17、18所示。 其中IgG对照为hIgG1，表中的数据为OD450nm值。仅S006-NB146-69能够与鼠CD33蛋白良好结合，S006-NB146-132、S006-NB146-173与鼠CD33蛋白弱结合。除S006-NB146-60、S006-NB147-225外，VHH-Fc均能够与猴CD33蛋白结合；图9D中SGN-33不与猴CD33蛋白结合。
表15.ELISA检测VHH-Fc抗体与鼠CD33蛋白的结合反应
表16.ELISA检测VHH-Fc抗体与鼠CD33蛋白的结合反应
*：NB147羊驼血清从1：100开始进行10倍浓度梯度稀释。
表17.ELISA检测VHH-Fc抗体与猴CD33蛋白的结合反应
表18.ELISA检测VHH-Fc抗体与猴CD33蛋白的结合反应
6.2 FACS检测VHH-Fc抗体与猴CD33重组细胞系的结合
将HEK293T-猴CD33细胞系按照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如表19、20以及图10A-10B所示，除了S006-NB147-60和S006-NB147-225外，其余VHH-Fc抗体与HEK293T-猴CD33细胞均有结合活性，而与HEK293T细胞无结合活性。
表19.FACS检测VHH抗体与HEK293T-猴CD33细胞系的结合反应
表20.FACS检测VHH抗体与HEK293T-猴CD33细胞系的结合反应
实施例7：CD33抗体亲和力测定
7.1 VHH-Fc抗体与人CD33-his蛋白亲和力测定
使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获人CD33 VHH-Fc抗体。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的CD33抗原蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的重组人CD33-his持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。VHH-Fc抗体与人CD33-his蛋白的结合速率(Kon)、解离速率(Koff)及结合亲和力(KD)如表21、22所示，其中 抗体C33B904和SGN-33作为阳性对照。如表21、22所示，VHH-Fc抗体与人CD33的亲和力都优于1.40E-07M。
表21.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与人CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-1 1.95E+05 4.38E-05 2.24E-10
S006-NB146-3 2.49E+03 6.28E-06 2.52E-09
S006-NB146-17 1.19E+05 2.18E-05 1.83E-10
S006-NB146-20 4.12E+05 3.77E-04 9.17E-10
S006-NB146-39 1.79E+05 2.95E-05 1.65E-10
S006-NB146-40 1.46E+03 1.23E-05 8.39E-09
S006-NB146-46 1.98E+05 3.39E-05 1.71E-10
S006-NB146-60 1.49E+05 1.50E-04 1.01E-09
S006-NB146-132 1.31E+05 6.96E-05 5.31E-10
S006-NB147-225 2.93E+04 5.29E-04 1.80E-08
C33B904 2.60E+05 4.08E-05 1.57E-10
SGN-33 7.02E+05 5.57E-03 7.93E-09
表22.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与人CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-16 6.01E+04 2.24E-03 3.73E-08
S006-NB147-25 1.41E+05 1.58E-04 1.12E-09
S006-NB146-69 6.71E+04 3.26E-03 4.86E-08
S006-NB146-139 2.97E+05 4.01E-03 1.35E-08
S006-NB146-150 5.22E+04 7.33E-03 1.40E-07
S006-NB146-173 7.25E+04 1.72E-03 2.38E-08
S006-NB146-181 5.54E+04 2.87E-03 5.18E-08
S006-NB147-220 1.81E+05 4.97E-04 2.75E-09
C33B904 4.79E+05 7.44E-05 1.55E-10
7.2 VHH-Fc与猴CD33-his蛋白亲和力测定
按照实施例7.1的方法对VHH-Fc抗体与猴CD33(Sino Biological，货号：50712-M08H)蛋白进行亲和力测定。如表23、24所示，其中S006-NB146-20，S006-NB146-39，S006-NB146-46，与猴CD33的亲和力优于1.0E-09M。
表23.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与猴CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-1 2.49E+05 2.68E-04 1.08E-09
S006-NB146-3 1.08E+04 1.63E-04 1.51E-08
S006-NB146-17 1.13E+05 1.28E-04 1.13E-09
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-20 9.02E+05 4.95E-04 5.48E-10
S006-NB146-39 5.90E+05 6.98E-05 1.18E-10
S006-NB146-40 1.39E+03 2.56E-04 1.83E-07
S006-NB146-46 5.84E+05 9.36E-05 1.60E-10
S006-NB146-132 2.16E+05 3.62E-04 1.67E-09
C33B904 1.29E+06 6.32E-04 4.92E-10
表24.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与猴CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-16 1.40E+05 1.54E-02 1.10E-07
S006-NB147-25 4.06E+05 2.34E-03 5.76E-09
S006-NB146-69 1.67E+05 1.19E-03 7.15E-09
S006-NB146-139 9.25E+05 2.78E-02 3.01E-08
S006-NB146-150 1.54E+05 6.40E-03 4.16E-08
S006-NB146-173 1.55E+05 4.24E-03 2.74E-08
S006-NB146-181 7.28E+04 1.98E-03 2.72E-08
S006-NB147-220 6.08E+05 1.48E-03 2.43E-09
C33B904 1.01E+06 4.97E-04 4.94E-10
实施例8：抗体抗原结合表位(epitope)分析
8.1抗体抗原结合区域的鉴定
CD33蛋白胞外有一个保守的V-set免疫球蛋白样结构域(V-domain)和一个可变的C2-set结构域(C2-domain)，V-domain位于远膜端，C2-domain位于近膜端，SGN-33的抗原结合表位位于V-domain，C33B904的抗原结合表位位于C2-domain。为了鉴定VHH抗体的抗原结合表位分布，按照实施例5.1中的ELISA方法，分别包被人CD33-V-his(远膜端)和人CD33-C2-his(近膜端)对VHH抗体进行远膜端和近膜端分类，如图11A-11D和表25所示，可以将VHH抗体分为两类：
表25.ELISA方法对VHH抗体进行远膜端和近膜端表位分类
8.2抗体抗原结合表位竞争实验(epitope binning)
采用竞争性ELISA方法对VHH抗体与已知表位的对照抗体进行表位分类。按照实施例5.1的方法将2μg/mL的抗体包被ELISA板，人CD33-his蛋白从30μg/mL开始进行梯度稀释，计算出EC80(表26-27)。将2μg/mL的抗体包被ELISA板，加入25μg/mL待检测的抗体后，再加入每个待检测抗体对应的EC80浓度的人CD33-his蛋白，孵育2h，用PBS洗5次后加入HRP标记的anti-His(购自金斯瑞，货号：A00612)抗体孵育1小时，洗板5次。加入TMB底物50μL每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μL每孔。用ELISA读板机(Insight，购自PerkinElmer)读取OD 450nm数值，根据OD 450nm数值，利用公式计算出抗体相互之间的竞争率，结果如图12A-12B所示，竞争率的数值越高，表示两个抗体的抗原表位越是接近。
表26.VHH抗体对应的人CD33-his蛋白EC80值
抗体名称 EC80(μg/mL)
S006-NB146-1 0.08
S006-NB146-3 0.12
S006-NB146-17 0.09
S006-NB146-20 0.07
S006-NB146-39 0.06
S006-NB146-40 0.10
S006-NB146-46 0.07
S006-NB146-60 0.05
S006-NB146-132 0.06
S006-NB147-225 0.09
C33B904 0.03
SGN-33 0.08
表27.VHH抗体对应的人CD33-his蛋白EC80值
抗体名称 EC80(μg/mL)
S006-NB146-16 0.09
S006-NB147-25 0.03
抗体名称 EC80(μg/mL)
S006-NB146-69 1.50
S006-NB146-139 0.02
S006-NB146-150 0.37
S006-NB146-173 0.15
S006-NB146-181 0.25
S006-NB147-220 0.02
C33B904 0.04
SGN-33 0.03
8.3 VHH-Fc抗体与Biotin-C33B904的竞争实验
按照实施例5.1的方法将2μg/mL的人CD33-his蛋白包被ELISA板，Biotin-C33B904抗体从15μg/mL开始进行梯度稀释，计算出EC80(0.18μg/ml)。将2μg/mL的人CD33-his蛋白包被ELISA板，待检测的VHH抗体从40μg/mL起始，以1：2稀释七个浓度，加入ELISA板，再加入EC80浓度的Biotin-C33B904抗体，孵育2h，用PBS洗5次后加入HRP标记的anti-Streptavidin(购自Sigma，货号：S2438)抗体孵育1小时，洗板5次。加入TMB底物50μL每孔，室温孵育10分钟后，加入终止液(1.0M HCl)50μL每孔。用ELISA读板机(Insight，购自PerkinElmer)读取OD 450nm数值，再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，绘制曲线。结果如图13A-13B和表28、29所示。
表28.VHH-hFc抗体与Biotin-C33B904的竞争结果
表29.VHH-hFc抗体与Biotin-C33B904的竞争结果
根据以上两种竞争方法的结果以及和两个截短蛋白的结合实验将VHH抗体进行分类，结果如图14所示，S006-NB146-1、S006-NB146-39、S006-NB146-46、S006-NB146-132、S006-NB147-25、S006-NB147-220与C33B904(结合表位在C2 domain)存在竞争，归为一类；S006-NB147-225能和人CD33-C2-his蛋白结合但和C33B904不存在竞争；S006-NB146-16、S006-NB146-69、S006-NB146-139、S006-NB146-150、S006-NB146-173、S006-NB146-181能和人CD33-C2-his蛋白结合且与C33B904存在不完全竞争，因此判断属于C2 domain但与C33B904表位不完全相同；S006-NB146-60和SGN-33均能和人CD33-V-his蛋白结合，归为一类；S006-NB146-3、S006-NB146-17、S006-NB146-20、S006-NB146-40既不能结合人CD33-C2-his蛋白，也不能结合人CD33-V-his蛋白，归为一类(空间构象)。
实施例9:CD33 VHH单域抗体的人源化
9.1 CD33 VHH单域抗体的人源化设计
比对IMGT(http://imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，挑选与CD33 VHH单域抗体同源性高的重链可变区种系基因IGHV3-7*01和IGHJ3*01作为模板，将CD33 VHH单域抗体S006-NB146-17，S006-NB146-39，S006-NB146-60，S006-NB146-132，S006-NB146-173，S006-NB147-225的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。将框架区序列中关键氨基酸回复突变为单域抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力。对抗体存在易发生化学修饰的位点(例如DD,NSS)进行点突变以消除修饰风险。相较于重链模板IGHV3-7*01，羊驼抗体S006-NB146-39的FR3序列中缺失两个氨基酸77N、78A，在S006-NB146-39人源化抗体中去除这两个新引入的氨基酸(NA)。具体突变设计参见表30-35。
表30.S006-NB146-17的人源化抗体突变设计
注：S39G表示将第39位S突变成G，其它依此类推，氨基酸的编号为自然顺序编号。
表31.S006-NB146-39的人源化抗体突变设计
注：F27I表示将第27位F突变成I，其它依此类推，del77N表示将第77位N删除，del78A表示将第78位A删除，氨基酸的编号为自然顺序编号。
表32.S006-NB146-60的人源化抗体突变设计
VHH名称 框架区突变 CDR区突变 CDR区定义方式
S006-NB146-60-H3 V37H/G44Q/L45R/W47L/N50S/Y58 无 IMGT
S006-NB146-60-H4 V37H/G44Q/L45R/W47L/N50S/Y58N/I69M/L78V 无 IMGT
S006-NB146-60-H5 V37H/G44Q/L45R/W47L/N50S/Y58N/N73D 无 IMGT
S006-NB146-60-H6 V37H/G44Q/L45R/W47L/N50S/Y58N/N73D/D72N 无 IMGT
S006-NB146-60-H7 V42H/G49Q/L50R/W52L/N55S/Y66N/R95K/A96P 无 IMGT
注：V37H表示将第37位V突变成H，其它依此类推，氨基酸的编号为自然顺序编号。
表33.S006-NB146-132的人源化抗体突变设计
注：V36Y表示将第36位V突变成Y，其它依此类推，氨基酸的编号为自然顺序编号。
表34.S006-NB146-173的人源化抗体突变设计
注：V37Y表示将第37位V突变成Y，其它依此类推，氨基酸的编号为自然顺序编号。
表35.S006-NB147-225的人源化抗体回复突变设计
VHH名称 回复突变 CDR区突变 CDR区定义方式
S006-NB147-225-H5 L4V/R95L/A96P/V101T/W118Q/M123Q 无 Kabat
注：L4V表示将第4位L突变成V，其它依此类推，氨基酸的编号为自然顺序编号。
9.2 S006-NB146-17人源化抗体可变区具体序列
S006-NB146-17-H1：
S006-NB146-17-H2：
S006-NB146-17-H3：
S006-NB146-17-H4：
S006-NB146-17-H5：
S006-NB146-17-H6：
S006-NB146-17-H7：
S006-NB146-17-H8：
S006-NB146-17-H9：
9.3 S006-NB146-39人源化抗体可变区具体序列
S006-NB146-39-aH8：
S006-NB146-39-aH9：
S006-NB146-39-aH10：
S006-NB146-39-aH11：
S006-NB146-39-aH12：
S006-NB146-39-aH13：
S006-NB146-39-aH15：
9.4 S006-NB146-60人源化抗体可变区具体序列
S006-NB146-60-H3：
S006-NB146-60-H4：
S006-NB146-60-H5：
S006-NB146-60-H6：
S006-NB146-60-H7：
9.5 S006-NB146-132人源化抗体可变区具体序列
S006-NB146-132-aH1：
S006-NB146-132-aH2：
S006-NB146-132-aH3：
S006-NB146-132-aH5：
9.6 S006-NB146-173人源化抗体可变区具体序列
S006-NB146-173-H2：
S006-NB146-173-H3：
S006-NB146-173-H4：
S006-NB146-173-H5：
S006-NB146-173-H6：
9.7 S006-NB146-225人源化抗体可变区具体序列
S006-NB147-225-H5：
9.8 CD33 VHH单域抗体的人源化模板序列
人源化重链模板IGHV3-7*01：
人源化重链模板IGHJ3*01：WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:225)。
9.9 CD33人源化抗体的CDR区序列(表36-表41)
表36.S006-NB146-17人源化抗体VHH序列的IMGT分析结果
表37.S006-NB146-39人源化抗体VH序列的Kabat分析结果
表38.S006-NB146-60人源化抗体VH序列的IMGT分析结果
表39.S006-NB146-132人源化抗体VH序列的Kabat分析结果
表40.S006-NB146-173人源化抗体VH序列的kabat分析结果
表41.S006-NB147-225人源化抗体VH序列的kabat分析结果
9.10 CD33 VHH人源化抗体的制备
将本实施例前述VHH人源化抗体的可变区序列重组到包含信号肽和人IgG1Fc的表达载体BI3.4-huIgG1中，并按实施例4.1所述方法制备获得人源化VHH-Fc抗体。
实施例10:VHH-Fc人源化抗体鉴定
10.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VHH-Fc人源化抗体与CD33蛋白的结合
参照实施例5.1所述方法检测VHH-Fc人源化抗体与人CD33蛋白的结合活性。VHH人源化抗体与hCD33-his的ELISA结果如图15A-图15E所示，结果表明，VHH人源化抗体均能与人CD33的蛋白在ELISA水平结合。
10.2流式细胞实验(FACS)检测VHH-Fc人源化抗体与不同CD33表达细胞的结合
参照实施例5.2所述方法检测VHH-Fc人源化抗体与不同CD33表达细胞的结合。分析结果如图16A-16E和17A-17E所示，表明VHH人源化抗体均可结合CHO-K1-人CD33-B8细胞和U937细胞表面的人CD33蛋白。另外，VHH人源化抗体均与阴性细胞Jurkat和CHO-K1空细胞不结合。
实施例11:VHH-Fc人源化抗体的种属交叉结合活性检测
11.1 ELISA检测VHH-Fc人源化抗体与不同种属CD33蛋白的结合
按照实施例5.1的方法进行ELISA检测。VHH-Fc人源化抗体与鼠CD33的ELISA结果如图18A-18E所示，VHH-Fc人源化抗体与猴CD33的ELISA结果如图18F-18J所示。除S006-NB146-132的人源化抗体以外，其他人源化抗体基本不与鼠CD33结合，除S006-NB146-60和S006-NB147-225以外的人源化抗体均与猴CD33结合。
11.2 FACS检测VHH-Fc人源化抗体与猴CD33重组细胞系的结合
将HEK293T-猴CD33细胞系按照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如图19A～图19E所示，除S006-NB146-60和S006-NB147-225的人源化抗体外，其余人源化抗体与HEK293T-猴CD33细胞均有结合活性。
另外，经检测，所有人源化抗体均与作为阴性对照的HEK293T细胞无结合活性。
实施例12:CD33抗体亲和力测定
12.1 VHH-Fc人源化抗体与人CD33-his蛋白亲和力测定
参照实施例7.1所述方法检测VHH-Fc人源化抗体与人CD33-his蛋白的结合速率(Kon)、解离速率(Koff)及结合亲和力(KD)如表15所示，仅检测部分人源化抗体，其中抗体C33B904和SGN-33作为阳性对照。如表42所示，已检测的VHH-Fc人源化抗体与人CD33的亲和力优于1.61E-07M。
表42.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与人CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-17 1.18E+05 2.34E-05 1.98E-10
S006-NB146-17-H1 2.34E+04 3.76E-03 1.61E-07
S006-NB146-17-H2 4.87E+04 1.03E-04 2.11E-09
S006-NB146-17-H3 7.30E+04 9.69E-05 1.33E-09
S006-NB146-17-H4 7.83E+04 6.68E-05 8.53E-10
S006-NB146-17-H5 7.73E+04 7.11E-05 9.20E-10
S006-NB146-17-H6 7.49E+04 4.47E-05 5.98E-10
S006-NB146-17-H7 7.16E+04 7.60E-05 1.06E-09
S006-NB146-17-H8 7.17E+04 7.69E-05 1.07E-09
S006-NB146-17-H9 7.32E+04 8.86E-05 1.21E-09
S006-NB146-60 1.25E+05 1.47E-04 1.18E-09
S006-NB146-60-H3 1.86E+04 5.07E-04 2.72E-08
S006-NB146-60-H4 4.32E+04 1.51E-04 3.49E-09
S006-NB146-60-H5 1.48E+04 8.17E-04 5.53E-08
S006-NB146-60-H6 1.17E+04 8.15E-04 6.98E-08
S006-NB146-60-H7 1.85E+04 4.25E-04 2.29E-08
S006-NB147-225 8.19E+04 2.33E-04 2.84E-09
S006-NB147-225-H5 3.59E+04 4.98E-04 1.39E-08
S006-NB146-132 1.31E+05 6.96E-05 5.31E-10
S006-NB146-132-aH1 3.17E+05 1.42E-03 4.50E-09
S006-NB146-132-aH2 5.37E+05 2.80E-04 5.21E-10
S006-NB146-132-aH3 4.77E+05 2.94E-04 6.17E-10
S006-NB146-132-aH5 6.88E+05 2.34E-04 3.41E-10
S006-NB146-39-aH8 2.04E+05 9.00E-04 4.42E-09
S006-NB146-39-aH9 2.55E+05 1.34E-03 5.25E-09
S006-NB146-39-aH10 1.99E+05 7.85E-05 3.95E-10
S006-NB146-39-aH11 2.80E+05 1.51E-04 5.38E-10
S006-NB146-39-aH12 2.08E+05 1.50E-03 7.21E-09
S006-NB146-39-aH13 2.31E+05 1.95E-03 8.43E-09
S006-NB146-39-aH15 1.58E+05 9.10E-04 5.77E-09
S006-NB146-173 1.85E+05 1.79E-03 9.68E-09
S006-NB146-173-H5 9.99E+04 6.11E-03 6.12E-08
S006-NB146-173-H6 2.14E+05 1.63E-03 7.60E-09
C33B904 8.28E+05 6.54E-05 7.90E-11
SGN-33 7.02E+05 5.57E-03 7.93E-09
12.2 VHH-Fc与猴CD33-his蛋白亲和力测定
按照实施例7.2的方法对VHH-Fc抗体与猴CD33(Sino Biological，货号：50712-M08H)蛋白进行亲和力测定。如表43所示，VHH-Fc人源化抗体与猴CD33的亲和力都优于1.0E-07M。
表43.SPR(biacore)检测VHH-Fc抗体与猴CD33的亲和力
抗体名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
S006-NB146-39-aH8 3.71E+05 1.77E-02 4.78E-08
S006-NB146-39-aH9 4.34E+05 1.85E-02 4.26E-08
S006-NB146-39-aH10 3.65E+05 8.29E-04 2.27E-09
S006-NB146-39-aH11 5.34E+05 1.45E-03 2.72E-09
S006-NB146-39-aH12 3.77E+05 2.65E-02 7.02E-08
S006-NB146-39-aH13 3.83E+05 2.35E-02 6.14E-08
S006-NB146-39-aH15 3.08E+05 1.71E-02 5.57E-08
S006-NB146-173-H5 1.52E+05 1.44E-02 9.51E-08
S006-NB146-173-H6 3.23E+05 5.20E-03 1.61E-08
C33B904 1.11E+06 6.26E-04 5.65E-10
实施例13:抗体抗原结合区域的鉴定
按照实施例8中的ELISA方法，分别包被人CD33-V-his(远膜端)和人CD33-C2-his(近膜端)对VHH人源化抗体进行远膜端和近膜端分类，如图20A-20J和表44所示，可以将VHH人源化抗体分为以下几类。
S006-NB146-17分子人源化后抗体既不能结合人CD33-C2-his蛋白，也不能结合人CD33-V-his蛋白，与母克隆表位一致属于空间构象；S006-NB146-60分子人源化后抗体能和人CD33-V-his蛋白结合，结合表位属于V domain；S006-NB147-225分子人源化后抗体能和人CD33-C2-his蛋白结合，结合表位属于C2 domain；S006-NB146-39分子人源化后抗体只有S006-NB146-39-aH10和S006-NB146-39-aH11能和人CD33-C2-his蛋白结合，结合表位属于C2 domain；S006-NB146-173分子人源化后抗体除了S006-NB146-173-H2，其余均与母克隆一致属于C2 domain；S006-NB146-132分子人源化后抗体能和人CD33-C2-his蛋白结合，结合表位属于C2 domain。
表44.ELISA方法对VHH抗体进行远膜端和近膜端表位分类

Claims (27)

  1. 特异性结合CD33的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含：CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3具有选自以下的任意序列组合或者与所述序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合：
    (1)所述CDR1可选自SEQ ID NO：53、107、161、29、32、35、38、41、44、47、50、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、164、167、170、173、176、179、182、185、188、226、227；
    (2)所述CDR2可选自SEQ ID NO：230、54、108、162、30、33、36、39、42、45、48、51、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、165、168、171、174、177、180、183、186、189、229；
    (3)所述CDR3可选自SEQ ID NO：55、109、163、31、34、37、40、43、46、49、52、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、166、169、172、175、178、181、184、187、190、228；
    各个CDR1、CDR2和CDR3为根据KABAT、Chothia或IMGT的通行分析方法编码；
    优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
  2. 权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述CDR1、CDR2和CDR3分别包含选自SEQ ID NO:11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的CDR1、CDR2和CDR3；
    优选地，根据KABAT、Chothia或IMGT编号系统，
    (1)所述CDR1选自SEQ ID NO：53、107、161，所述CDR2选自SEQ ID NO：54、108、162、230，所述CDR3选自SEQ ID NO：55、109、163；
    (2)所述CDR1选自SEQ ID NO：32、86、140，所述CDR2选自SEQ ID NO：33、87、141，所述CDR3选自SEQ ID NO：34、88、142；
    (3)所述CDR1选自SEQ ID NO：35、89、143、226、227，所述CDR2选自SEQ ID NO：36、90、144，所述CDR3选自SEQ ID NO：37、91、145；
    (4)所述CDR1选自SEQ ID NO：38、92、146，所述CDR2选自SEQ ID NO：39、93、147，所述CDR3选自SEQ ID NO：40、94、148；
    (5)所述CDR1选自SEQ ID NO：41、95、149，所述CDR2选自SEQ ID NO：42、96、150、229，所述CDR3选自SEQ ID NO：43、97、151、228；
    (6)所述CDR1选自SEQ ID NO：44、98、152，所述CDR2选自SEQ ID NO：45、99、153，所述CDR3选自SEQ ID NO：46、100、154；
    (7)所述CDR1选自SEQ ID NO：47、101、155，所述CDR2选自SEQ ID NO：48、102、156，所述CDR3选自SEQ ID NO：49、103、157；
    (8)所述CDR1选自SEQ ID NO：50、104、158，所述CDR2选自SEQ ID NO：51、105、159，所述CDR3选自SEQ ID NO：52、106、160；
    (9)所述CDR1选自SEQ ID NO：29、83、137，所述CDR2选自SEQ ID NO：30、84、138，所述CDR3选自SEQ ID NO：31、85、139；；
    (10)所述CDR1选自SEQ ID NO：56、110、164，所述CDR2选自SEQ ID NO：57、111、165，所述CDR3选自SEQ ID NO：58、112、166；
    (11)所述CDR1选自SEQ ID NO：59、113、167，所述CDR2选自SEQ ID NO：60、114、168，所述CDR3选自SEQ ID NO：61、115、169；
    (12)所述CDR1选自SEQ ID NO：62、116、170，所述CDR2选自SEQ ID NO：63、117、171，所述CDR3选自SEQ ID NO：64、118、172；
    (13)所述CDR1选自SEQ ID NO：65、119、173，所述CDR2选自SEQ ID NO：66、120、174，所述CDR3选自SEQ ID NO：67、121、175；
    (14)所述CDR1选自SEQ ID NO：68、122、176，所述CDR2选自SEQ ID NO：69、123、177，所述CDR3选自SEQ ID NO：70、124、178；
    (15)所述CDR1选自SEQ ID NO：71、125、179，所述CDR2选自SEQ ID NO：72、126、180，所述CDR3选自SEQ ID NO：73、127、181；
    (16)所述CDR1选自SEQ ID NO：74、128、182，所述CDR2选自SEQ ID NO：75、129、183，所述CDR3选自SEQ ID NO：76、130、184；
    (17)所述CDR1选自SEQ ID NO：77、131、185，所述CDR2选自SEQ ID NO：78、132、186，所述CDR3选自SEQ ID NO：79、133、187；
    (18)所述CDR1选自SEQ ID NO：80、134、188，所述CDR2选自SEQ ID NO：81、135、189，所述CDR3选自SEQ ID NO：82、136、190；或，
    (19)与上述(1)～(18)序列组合相比具有1、2、3或更多个氨基酸插入、缺失和/或替换的序列组合；优选地，所述替换为保守氨基酸的替换。
  3. 权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:11～28或193～223中的CDR1、CDR2和CDR3序列组合。
  4. 根据权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含与所述CDR1、CDR2和/或CDR3相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
  5. 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示VHH结构域中的FR区相比发生至多15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变 的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
  6. 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列；可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列相比具有至少80、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；或，可选地，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：11～28或193～223任一项所示序列相比发生至多20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个突变的序列；所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸的替换。
  7. 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其与人CD33结合的解离常数(KD)不大于100nM；与猴CD33结合的解离常数(KD)不大于100nM。
  8. 根据权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区，更优选具有如SEQ ID NO：191所示氨基酸序列；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
  9. 根据权利要求1～8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为：
    (1)嵌合抗体或其片段；
    (2)人源化抗体或其片段；或，
    (3)全人源抗体或其片段。
  10. 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes)。
  11. 根据权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签、或细胞因子。
  12. 一种多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合CD33以外 的抗原或结合与权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段不同的CD33表位的抗体或抗原结合片段。
  13. 根据权利要求12的多特异性抗体，其特征在于，所述CD33以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CS32B；PD-1；PD-2；PD-L1；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；MSLN；HER2；HER3；HSA；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
  14. 根据权利要求12或13的多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体可为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
  15. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段。
  16. 一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达权利要求15所述的嵌合抗原受体，或包含编码权利要求15所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
  17. 一种分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述多特异性抗体，或权利要求15所述的嵌合抗原受体。
  18. 一种载体(vector)，其特征在于，所述载体包含权利要求17所述的核酸片段。
  19. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求18所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
  20. 一种制备权利要求1～11任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求12～14任一项所述多特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求19所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
  21. 一种制备权利要求16所述免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求15所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求15所述CAR。
  22. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体；或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
  23. 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体；或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品；或权利要求22所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。
  24. 一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物；所述肿瘤优选骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。
  25. 权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物，其特征在于，用于预防和/或治疗肿瘤；所述肿瘤优选骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。
  26. 一种试剂盒，其包含权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求12～14任一项所述的多特异性抗体，或权利要求16所述免疫效应细胞，或权利要求17所述的核酸片段，或权利要求18所述载体，或权利要求20～21任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求22所述药物组合物。
  27. 一种体外抑制表达CD33细胞增殖或迁移的方法，其特征在于，在权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段与CD33之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与权利要求1～11任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
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